Metoda ekspresji i oczyszczania białka eIF4E jako białka fuzyjnego z reduktazą dihydrofolianową

Dorota Kubacka

Gosh P.,Cheng J., Chou T,Jia Y., Avdulov S., Bitterman P.B., Polunovsky V.A., Wagner C.R.„Expression, purification and characterization of recombinant mouse translation initiation factoe eIF4E as a dihydrofolate reductase (DHFR) fusion protein” Protein Expression and Purification 60 (2008) 132-139

Funkcje eukariotycznego czynnika translacyjnego 4E – eIF4E

inicjacja translacji zależnej od kapu

eksport wybranych mRNA z jądra do cytoplazmy

inicjacja translacji wielu wirusowych VPg-mRNA

Goodfellow at al., (2008) Int J Biochem Cell Biol 40, 2675-80

Mechanizmy regulacji inicjacji translacji

Sonenberg at al., (2009) Cell 136, 731-745

Obszary badań związane z regulacją inicjacji translacji mRNA

• negatywne zmiany ilości i aktywności inicjacyjnych czynników translacyjnych, regulatorowych czynników translacji, tRNA

zmiany chorobotwórcze(nowotworowe)

mechanizm uczenia się i pamięci

proces starzenia sięnieprawidłowy rozwój organizmu

…

• poznanie mechanizmów regulacyjnych inicjacji translacji

Peptydy i białka pełniące rolę etykietek

Zalety i wady etykietek

Zalety:• ułatwiają oczyszczenie rekombinowanych białek• zwiększają wydajność ekspresji białka (np.: GST, MBP, NusA, Ubiquitin)• ułatwiają zwijanie się białka( np.: SUMO)• zwiększają rozpuszczalność białka( np.: MBP, NusA, SET)• wysoka specyficzność do ligandu • niskie koszty złoża (np.: GST, MBP, His6)• …

Wady: • powodują zmianę konformacji białka• obniżają wydajność ekspresji białka• wysokie koszty złoża• …

Enzymy stosowane w procesie usuwania etykietek

Metody ekspersji i oczyszczania białka eIF4E

• oczyszczanie obecnego w supernatancie eIF4E na kolumnie m7GDP-agarose/m7GTP-Sepharoseo elucja: m7GTP lub wysokim stężeniem solio wydajność: do 2.5 mg z 1L kultur bakterii indukcja prowadzona w 15ºC – 7-10 mg z 1L kultur bakterii

• oczyszczanie nierozpuszczalnej frakcji białka eIF4Eo denaturacja w 6 M GdnHCl o renaturacja w procesie 1 stopniowej dializyo wydajność: 100 – 200 mg z 1L kultur bakterii

• oczyszczanie GST-eIF4Eo denaturacja w 6 M GdnHCl o renaturacja poprzez 20 krotne szybkie rozcieńczenie frakcji zdenaturowanejo oczyszczanie GST-eIF4E na kolumnie z glutathion-Sepharoseo wydajność: 200 –500 mg z 1L kultur bakterii

Fuzyjne białko DHFR-eIF4E

Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

Cel pracy: uzyskanie czystego, w pełni funkcjonalnego, wolnego od kapu białka eIF4E

DHFR – reduktaza dihydrofolianowa

• 18 kDa białko • przeprowadza reakcje redukcji kwasu dihydrofoliowego do kwasu tetrahydrofoliowego

Ekspresja białka DHFR(L54F)-eIF4E

• gospodarz: E. Coli BL21(DE3) plac I Tuner

• 3.5h indukcja 0.2 mM IPTG w 37°C przy OD600= 0.4

MWIPTG +- +

SN pellet

DHFR(L54F)-eIF4E

Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

DHFR – reduktaza dihydrofolianowa

Metotreksat

• inhibitor DHFR, hamuje syntezę kwasów nukleinowych• wiąże się z DHFR 10 tys. razy silniej niż kwas foliowy • stosowany jako lek min. w chorobach nowotworowych

Metotreksat – jeden z inhibitorów reduktazy dihydrofolianowej

Wiązanie białka do kolumny : pH 6.0Warunki elucji DHFR-eIF4E: 10 mM KH2PO4, 0.1 mM K2EDTA, 1 M KCl, 1 mM DTT, pH 9.0, 3 mM kwas foliowy

Oczyszczanie białka DHFR-eIF4E na kolumnie MTX-agarose

Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

Oczyszczanie białka eIF4E

• oczyszczanie DHFR-eIF4E na kolumnie DEAE• dializa DHFR-eIF4E do buforu aktywności enzymatycznej dla Trombiny: 50 mM Tris, pH 8.0, 0.1 M NaCl, 2.5 mM CaCl2 • proces cięcia sekwencji białkowej linkera przez Trombinę w ciagu 20h, 4 °C• oczyszczanie eIF4E na kolumnie jonowymiennej DEAE

Wydajność: ~2.5 mg białka eIF4E z 2L hodowli

Elucja prowadzona gradientem soli 0 - 0.4 M KCl w buforze: 20 mM Tris, 1mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.4

Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

Aktywność białka eIF4E i DHFR-eIF4E

FE – intensywność florescencji białka bez kapuFEL – intensyność fluorescencji białka z kapemET – całkowite stężenie enzymuLT – całkowite stężenie liganduKD – stała dysocjacji wiązania białko-kap

Warunki pomiaru: 50 mM Hepes pH 7.2, 100 mM KCl, 1mM DTT, 0.5 mM Na2EDTA, T = 22 °C, λwzb = 280 nm, λobs = 342 nm

Aktywność rekombinowanego białka eIF4E i DHFR-eIF4E w inicjacji translacji

• translacja in vitro mRNA lucyferazy Renilla w lizacie z retikulocytów króliczych

Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60, 132-139

Zalety i wady opracowanego systemu ekpsresyjnego

zalety• oczyszczanie fuzyjnego białka DHFR(L54F)-eIF4E na kolumnie MTX-agarose

• złoże jest stabilne, • wysoka pojemność złoża ~80 mg/ml• wysoka selektywność metotreksatu (MTX) • niskie koszty

• zależność wiązania białka DHFR(L54F) z metotreksatem od pH; wiązanie – pH = 6.0, elucja – pH ~ 9 • brak kontaktu z kapem• białko nie jest renaturowane• białko meIF4E zachowuje swoja aktywność

wady• docelowe białko może być niestabilne w wybranych warunkach pH

Zastosowanie eDHFR-eIF4E w żywych komórkach

• TMP – trimetoprim – syntetyczny inhibitor bakteryjnej reduktazy dihydrofolianowej • TMP wykazuje wysoką specyficzność do eDHFR w porównaniu ze ssaczym białkiem DHFR• funkcje taga pełnią fluorescencyjne pochodne trimetoprimu

reduktaza dichyrofolianowa z E. coli

Miller at al., (2005) Nature Methods 2 (4), 255-257

Fluorescencyjne pochodne trimetoprimu

Calloway at al., (2007) ChemBioChem 8, 767-774

TMP_fluoresceina

TMP_hexachlorofluoresceina

Linia komórek U2OS (human osteosarcoma cell)• znakowanie białkiem GFP zlokalizowanym jądrowo• znakowanie białkiem eDHFR : TMP_hexachlorofluoresceina zlokalizowanym w błonie komórkowej

Selektywne znakowanie w żywych komórkach

Calloway at al., (2007) ChemBioChem 8, 767-774