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MALDI-TOF-MSによる
イメージング質量分析アプリケーション
イメージング ?
イメージング(英: imaging)とは、試料の情報を様々な方法で測定して画像化・視覚化すること。あるいはそれに用いられる技術。レントゲン写真はX線イメージングの一例です。
「~イメージング」と記述して、応用の方法によって区別する場合があります。情報技術や医療分野でよく用いられます。
コンピュータ断層撮影(CT)
核磁気共鳴画像法(MRI/MRS)
陽電子放出断層撮影(PET)
MALDI-IMS Research use only
MALDI-IMS Research use only
試料の質量電荷比を求めるときに使用される分析法である。
高電圧をかけた真空中で試料をイオン化すると、静電力によって試料は装置内を飛行する。飛行しているイオンを電気的・磁気的な作用等により質量電荷比に応じて分離し、その後それぞれを検出することで、質量電荷比を横軸、検出強度を縦軸とするマススペクトルを得ることができる。
(出典:「質量分析法」 2009年8月8日 (土) 15:39 UTC ウィキペディア日本語版)
質量分析法とは、
MALDI-IMS Research use only
Imaging mass spectrometry(IMS)イメージング質量分析
MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization )SIMS (Secondary Ion Mass Spectrometry)
DESI (desorption electrospray ionization)
等のイオン源を搭載した質量分析計を用いタンパク質、ペプチド、代謝物、バイオマーカーや薬物の分布を可視化します。
MALDI-IMS
MALDI-IMS Research use only
MALDIによるイオン化の原理
MatrixとSampleの混合結晶
H+
脱離およびイオン化(プロトン化)
LASER
LASERによるMatrixの励起
ソフトなイオン化多価イオンを生成しづらい
Modified from: Lottspeich, Zorbas, eds“Bioanalytik”, Spektrum Akademischer Verlag, 1998and M.Stoeckli et al. Analytical BioChemistry 311 (2002)33-39
分子量で色分け2Dで表示
組織切片全体を分割して測定
DriftAcc
+ + ++ + +
MALDI-IMS Research use only
Imaging mass spectrometry(IMS)イメージング質量分析
Principle of MALDI Tissue Imaging
2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000
200 µm pixels
m/z
MALDI-IMS
• XYピクセル状にスペクトルを取得します
• 各シグナルは異なる物質を示します (タンパク質、ペプチド、薬物、代謝物など・・・・)
• 各物質の分布は分子イメージに再構築されます
Research use only
MALDI-MS
MALDIイメージングの原理
MALDI-IMS Research use only
MALDI-TOF MS
MALDI-TOF/TOF MS
タンパク質
ペプチド
脂質
薬物(低分子)既知物質
selected reaction monitoring(SRM)
MALDI-TOF MSの特徴
高感度・高分解能測定レンジが広い!
MALDI-Imaging 機種選択
catchfreeze
cryosection-15~-20 °C
CutOCTが無い部分をスライス
MALDI-IMS
OCT compound
Research use only
MALDIイメージング用凍結切片調製
MALDI-IMS Research use only
● クライオミクロトーム(Leica等)
● 凍結組織包埋剤 (OCTコンパウンド 等)
● 冷媒(ドライアイス等)
● 溶媒殺菌用アルコール、エタノール、リン酸緩衝液、milliQ水 等
● 組織洗浄用溶媒洗浄溶媒1 :70% エタノール水(1%グリセロール含有)洗浄溶媒2 :70% エタノール水洗浄溶媒3 :100% エタノール
● Coplin Jar 、シャーレ 等
● ITOコートスライドガラス:Glass Slides for MALDI Imaging : Part No. 237001
● スライドガラスアダプタ ターゲット:MTP slide-adapter II : Part No. 235380
● ドライヤー
● 真空乾燥器
Glass Slides for MALDI Imaging Part No. 237001
MTP slide-adapter II Part No. 235380
MALDIイメージング用凍結切片調製-備品例
• 凍結組織OCT compoundを使用しない
• クライオミクロトーム凍結切片 10 ~ 20 µm (10~12μmが適当)
• 導電性スライドガラス(凍結)に保持(#237001 Glass Slides for MALDI Imaging :BDAL)
• 真空乾燥
MALDI-IMS Research use only
MALDIイメージング用凍結切片調製-薄切
切片作成後の処理方法例
• 5分間真空乾燥(脳の場合は45分)切片をスライドガラス表面に固定します
• *70%EtOH(シャーレ等)で15から30秒洗浄-1回目
• *70%EtOH(シャーレ等)で15から30秒洗浄-2回目
• *96%EtOHもしくはpure EtOH(シャーレ)で15秒洗浄
• 真空乾燥
• 保存
長期保存の場合は、アルミホイル等で包み冷凍する
*注意•Neuropeptide等のペプチドを測定する場合は、各ステップを短時間で行う•薬物および脂質を測定する場合は、洗浄ステップを行わずに測定する
“Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation” Schwartz SA, Reyzer ML, Caprioli RM, J. Mass Spectrom. (2003); 38(7): 699-708
MALDI-IMS Research use only
MALDIイメージング用凍結切片調製-洗浄
Acquire mass
spectra
DropletsSpray
coating
m/z 18 388
ImagingProfiling
+ + ++ + +
Protein images
MALDI-IMS Research use only
マトリックス添加方法
液滴内部では、非局在化が発生します
大きな液滴: 良質なスペクトルが得られますが空間分解能は低下します
MALDI-IMS Research use only
MALDIイメージング - マトリックススプレー
エアーブラシ
スプレーの微調整が可能良好のコーティングが可能マトリックス消費量:約1ml
洗浄および使用頻度によりメッキ部分から銅が溶出し、銅アダクトピークが検出される場合がある酸に弱い
TLC-Sprayer
ガラス製であるために銅アダクトの心配が無い
スプレーの微調整が困難一度に多量のマトリックスを消費するマトリックス消費量:約10ml
乾燥窒素圧縮空気(オイルレス)
MALDI-IMS Research use only
マトリックス溶液スプレー
テフロンコーティングスプレーチャンバー
スプレーヘッド
光学センサー内蔵
スプレーヘッドとマトリックスリザーバー
コンパクトな装置タッチパネル式コンピュータ内臓
MALDI-IMS Research use only
ピンホールの開いた薄いメタルシート
マトリックスリザーバー
ピエゾ素子
ミスト
•振動気化法によるマトリックスエアロゾルの生成
• ノズル、ガスを必要としません
• ソフトな重力による液滴の添加最適な湿度コントロール
ImagePrep スプレーヘッド
MALDI-IMS Research use only
ImagePrepマトリックスミストの生成
∅ 20µm
max 50µm
0
10
20
30
40
50
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Diameter [µm]
Fre
quen
cy o
f Occ
urre
nce
[%]
100 µm
MALDI-IMS Research use only
液滴のサイズ分布
典型的なスプレーサイクルの散乱光強度
time
scat
tere
d lig
ht
inte
nsi
ty
MALDI-IMS Research use only
光学センサー
dryw
et
Time [min]0 15 30
thick thinscat
tere
d lig
ht in
tens
ity
MALDI-IMS Research use only
マトリックス調製工程の例
ImagePrep (50µm crystals) マニュアルスプレー
50 µm
Sinapinic acid (20g/l in 50%
acetonitrile)
MALDI-IMS Research use only
結晶形の例
脳のTICスペクトル(全スペクトルの総和)
2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000
•低バックグラウンド
• 500-800 ピークを検出
MALDI-IMS Research use only
スペクトルのクオリティー
ペプチド・タンパク質領域
MALDI-IMS
MALDI-IMS Research use only
アルツハイマー
モデルマウス脳
空間分解能:50 µm
Sample by courtesy of:Matthias RiemenschneiderNeurochemistry and
Neurogenetics,Dept. of Psychiatry and
PsychotherapyKlinikum rechts der Isar,Munich
MALDI-IMS Research use only
ImagePrepデータ例
MALDI-IMS Research use only
空間分解能:50μmアルツハイマーマウス脳のイメージングMS
Richard Caprioli, Vanderbilt Univ. TN-USAMALDI-IMS Research use only
マウス脳切片から得られたイメージ各イメージはそれぞれ異なる分子量を可視化 (前データセットの約1/5)
MALDI-IMS Research use only
fleximaging(Imaging MSソフト)とClinProTools(統計解析ソフト)の連携
ROI 1
ROI 2
ROI 3
ROI 4
MALDI-IMS Research use only
主成分分析&クラスタ解析
MALDI-IMS
質量分析/プロテオミクススペシャリスト
臨床医/病理学者
腫瘍
Research use only
ガン研究におけるMALDIイメージング
腫瘍部位
• 組織サンプルにおけるタンパク質の局在分布は、有用な情報が含まれています
• 右図は、組織サンプル中に腫瘍部位が存在する模式です
MALDI-IMS Research use only
ガン研究におけるMALDIイメージング
MALDI-IMS
LC-MS/MS
Research use only
腫瘍部位を切り取り、ショットガン解析によりマーカータンパク質を解析すれば良い!!!
質量分析/プロテオミクススペシャリスト
ガン研究におけるMALDIイメージング
MALDI-IMS
LC-MS/MS
Research use only
腫瘍部位を切り取り、ショットガン解析によりマーカータンパク質を解析!!!
同定されたタンパク質 : 1000種類
???
質量分析/プロテオミクススペシャリスト
ガン研究におけるMALDIイメージング
• 現実は右図のような単純なモデルでは表現できません
• 単純なモデルでは不十分です
正常組織
腫瘍部位
MALDI-IMS Research use only
ガン研究におけるMALDIイメージング
浸潤性の腫瘍細胞
カルシノ―マ インサイチュ(初期段階の腫瘍)
悪性新生物 (前ガン細胞)
上皮細胞
リンパ球の浸潤
炎症
結合組織
腫瘍は、複合的な細胞集団で構成されています:
腫瘍幹細胞(*)
異なるステージ
異なるクローン
腫瘍の周辺環境(ストローマ)が、腫瘍そのものに影響します:
腫瘍内微小環境
分子生物学的に見た細胞の分化
MALDI-IMS Research use only
病理学者の目で見ると・・・
MALDI-IMS
腫瘍
Research use only
ガン研究におけるMALDIイメージング
Deininger, S., Ebert, M., Fütterer A., Gerhard M., Röcken, C. (2008) J. Proteome Res. 7(12), 5230-5236
Connective Tissue
Tumor Clone 1
Tumor Clone 2
Inflammation
Research use onlyMALDI-IMS Research use only
階層クラスタリング
Milk duct
正常
上皮細胞
カルシノ―マインサイチュ
浸潤性腫瘍細胞
腫瘍細胞(上皮細胞由来)
MALDI-IMS Research use only
ヒト乳がん
ガン部位
1mm
MALDI-IMS Research use only
乳がんのMALDIイメージング
組織 凍結切片 マトリックス添加 MALDI質量分析
H&E 染色
Research use onlyMALDI-IMS
MALDIイメージングワークフロー顕微鏡画像と統合
ペプチド・タンパク質の同定
MALDI-IMS
MALDI-IMS Research use only
Groseclose et al., J. Mass Spectrom. 42, 254-262 (2007)
Tissue Section
MALDI-IMS Research use only
組織から直接タンパク質の同定
MALDI-IMS
• トリプシンで処理を行うことでスペクトルパターンが大きく変化。トリプシン消化物ペプチドのシグナルが多数観測。
• 任意のシグナルを選択し、TOF/TOFによるLIFT測定を行うことで得られるMS/MSフラグメンテーションスペクトルをデータベース検索(MASCOT)することによって組織切片からの直接タンパク同定が可能。
m/z750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
a.u.
m/z750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
a.u.
平均スペクトル m/z 2141(MBP)を可視化
トリプシン処理
未処理
Research use only
トリプシン処理 vs. 未処理
MALDI-IMS
m/z200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Abs. Int. * 1000a T P V V H Fb D E N P V V H F F K Ny R P T V I N K F F H V N E D Q T
73.865a 1
T
174.773y 1
229.684b 2
271.702y 2
344.628b 3
372.656y 3
473.611b 4
471.700y 4
559.678a 5
587.640b 5
584.743y 5
656.727a 6
684.694b 6
P
698.806y 6
755.813a 7
783.757b 7
826.888y 7
854.906a 8
882.855b 8
973.971y 8
991.911a 9
1019.887b 9
H
1121.061y 9
1138.985a 10
1166.872b 10
1258.131y 10
1314.424b 11
1357.223y 11
1443.138b 12
1556.282b 13
1553.384y 13
1641.939a 14
I
1667.452y 14
1796.514y 15
1911.835y 16
1967.675b 17
2040.678y 17
2094.526a 18
R
2140.902y 18
QD y17b3
NP y14b6
PV y13b7
VH y11b9
HF y10b10
FF y9b11
FK y8b12
DEN y16b5
ENP y15b6
NPV y14b7
VHF y11b10
HFF y10b11
FFK y9b12
FKN y8b13
KNI y7b14
QDEN y17b5
NPVV y14b8
FFKN y9b13
DENPV y16b7
HFFKN y10b13
FFKNI y9b14
PVVHFF y13b11
VVHFFK y12b12
VHFFKN y11b13
HFFKNI y10b14
VVHFFKN y12b13
VHFFKNI y11b14
NPVVHFFK y14b12
HFFKNIVT y10b16
NPVVHFFKN y14b13
MASCOT Score: 123
トリプシン処理
未処理
Research use only
例) m/z 2141 Myelin Basic Protein
• MALDIイメージングと LC-MALDIの統合アプローチ
• FFPE(ホルマリン固定)組織および巨大タンパク質の解析が可能
MALDI-IMS Research use only
ImageIDTM ワークフロー
MALDI-IMS Research use only
空間的プロテオミクス
低分子・脂質領域
MALDI-IMS
MALDI-IMS Research use only
空間分解能:20μm
MALDI-IMS Research use only
MALDI Imaging - 脂質の分布
MALDI-IMS Research use only
Different lipid species in mouse brain measured at a spatial resolution of 10 µm on an ultrafleXtreme.
from: Chaurand P et al.
Sublimation of new matrix candidates for high spatialresolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.
Anal Chem. 2012;84(4):2048-54
Lipid Imaging at 10μmSmartbeam laser: Industry-leading performance in MALDI imaging at 2 kHz
低分子薬物
MALDI-IMS
MALDI-IMS Research use only
MALDI-IMS
光学イメージ
薬物 代謝物 1
代謝物 2
代謝部 3
MALDIイメージングは、薬物イメージングのための放射性標識を必要とせず、薬剤と代謝物を区別することができます
Research use only
ラット全身:薬物・代謝物のイメージング
MALDI-IMS Research use only
SRM (Selected Reaction Monitoring)によるImagingMS
構造は異なるが分子量が同じ物質
イオンセレクタで標的イオンを選択しMS/MS測定MS/MS
MS/MS2MS/MS1
m/z
interest peaks
MS
イメージングの結果各物質の分布が明確に表示される
SRMにより最も選択的なモニタリングが可能となる
MALDI-IMS Research use only
MALDIイメージングの新機能SRM (Selected Reaction Monitoring)
MALDI-IMS Research use only
FAST-SRM Imaging
プリカーサ、プロダクトイオンを入力
自動的に最適なリフレクタ電圧が算出される
MALDI-IMS Research use only
FAST-SRM設定
MALDI-IMS Research use only
100mg/kg p.o. 2h 100mg/kg p.o. 6h
Control 20mg/kg p.o. 2h 20mg/kg p.o. 2h
100mg/kg p.o. 2h 100mg/kg p.o. 6h
Control 20mg/kg p.o. 2h 20mg/kg p.o. 6h
100mg/kg p.o. 2h 100mg/kg p.o. 6h
Control 20mg/kg p.o. 2h 20mg/kg p.o. 6h
100mg/kg p.o. 2h 100mg/kg p.o. 6h
Control 20mg/kg p.o. 2h 20mg/kg p.o. 6h
OLZ(m/z 313)
N-desmethyl metabolite (m/z 299) オーバーレイ
Research use onlyサンプル提供 : 京都府立医科大学 池川雅哉 先生
オランザピン(OLZ)MS-IMS
control
8mg/kg p.o. 2h
20mg/kg p.o. 2h
100mg/kg p.o. 2h
MALDI-IMS Research use only
オランザピン(OLZ)SRM-IMS(m/z 313->256)
MALDI-IMS Research use only
ハードディスク表面潤滑剤の直接質量分析
CH2CF2 OCF2 OCF2CF2 OCF2CH2 O CH2OCH2 CHOH
CH2OHCH
HOCH2
HO m n
CH2CF2 OCF2 OCF2CF2 OCF2CH2 O CH2OCH2 CHOH
CH2CH
HOCH2
HO m n
CH2 CHOH
CH2OHO
末端基の異なる2種類の混合物
潤滑剤の分子構造
60
使い捨てターゲット用アダプタ
に
SEM用カーボンテープ
で貼付
準備:ターゲットプレートへのマウント
61
塗布前溶液からの通常測定 ハードディスクからの直接測定
sample 1
PFPE A:Bmix ratio
100 : 0
sample 2
PFPE A:Bmix ratio
98 : 2
sample 3
PFPE A:Bmix ratio
79 : 21
sample 4
PFPE A:Bmix ratio
0 : 100
BS01_NaTFA 0:D13 MS
0
1000
2000
3000
4000
5000
Inte
ns.
[a.u
.]
BS02_NaTFA 0:F14 MS
0
1000
2000
3000
4000
Inte
ns.
[a.u
.]
BS04_NaTFA 0:I14 MS
0
2000
4000
6000
8000
Inte
ns.
[a.u
.]
BS06_NaTFA 0:L14 MS
0.2
0.4
0.6
0.8
4x10
Inte
ns.
[a.u
.]
1000 1500 2000 2500 3000m/z
Mn; 1849.7Mw; 1919.7
Mn; 1969.9Mw; 2038.1
Mn; 2065.0Mw; 2124.3
Mn; 2078.0Mw; 2133.9
BS01Disk_NaTFA 0:E16 MS
0
250
500
750
1000
Inte
ns.
[a.u
.]
BS02Disk_NaTFA 1:C14 MS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
4x10
Inte
ns.
[a.u
.]
BS04Disk_NaTFA 0:C15 MS
0
2000
4000
6000
8000
Inte
ns.
[a.u
.]
BS06Disk_NaTFA 1:C15 MS
2000
4000
Inte
ns.
[a.u
.]1000 1500 2000 2500 3000
m/z
Mn; 1748.2Mw; 1825.0
Mn; 1988.1Mw; 2080.4
Mn; 2069.8Mw; 2150.9
Mn; 2086.8Mw; 2168.7
実際の工業部品上の単分子膜からでも通常測定と同様の測定が可能
予備実験:通常測定との比較
数平均分子量
0
1000
500
1500
No.1 No.2 No.3 No.4
末端基
Bの比率
(%)
0
40
20
60
No.1 No.2 No.3 No.4
Endgroup A
Endgroup B
CH2CF2 OCF2 OCF2CF2 OCF2CH2 O CH2OCH2 CHOH
CH2OHCH
HOCH2
HO m n
CH2CF2 OCF2 OCF2CF2 OCF2CH2 O CH2OCH2 CHOH
CH2CH
HOCH2
HO m n
CH2 CHOH
CH2OHO
No.1 大量生産開始時No.2 大量生産終了時No.3 No.2原料溶液成分調整後大量生産(2回目)開始時No.4 No.3を用いた大量生産(2回目)後
ディスクサンプル直接測定
原料溶液
実験1:ハードディスクメディア大量生産時の変化
B
C D E F
A
2mm 2mm 2mm 2mm
2mm
m/z 1375.1(Mono)
m/z 1383.1(Bis)
m/z 1673.5(Mono)
m/z 1680.5(Bis)
A; ハードディスク表面写真; 赤枠・・・劣化試験領域/黄枠・・・測定範囲B; 平均スペクトル(約1500スペクトル分)C; m/z 1375.1を可視化, D; m/z 1383.1を可視化E; m/z 1673.5を可視化, F; m/z 1680.5を可視化
実験2:劣化試験後評価(Imaging MS)
MALDI-IMS
www.bruker.com
Research use only