1

Pendahuluan

Analisis sel diperlukan untuk mengetahui berapa jumlah sel yang terdapat

dalam suatu sampel. Jumlah sel atau kerapatan sel dalam suatu sampel perlu

diketahui agar dapat digunakan dalam penentuan perlakuan terhadap sampel,

seperti misalnya konsentrasi nutrisi yang diperlukan.

Salah satu metode analisis sel adalah dengan menggunakan

spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan metode analisis sel tidak langsung

yang menggunakan variabel yang diukur oleh alat spektrofotometer untuk

menentukan konsentrasi sel dalam suatu larutan sampel. Topik analisis sel dengan

metode spektrofotometri ini yang diangkat oleh penulis dalam makalah ini.

2

1. Pengertian Analisis Sel dengan Spektrofotometer

Analisis sel dengan spektrofotometer merupakan metode analisis sel yang

didasarkan oleh pengukuran sinar monokromatis oleh suatu larutan berwarna

dengan panjang gelombang tertentu . Spektrofotometer merupakan suatu alat yang

dgunakan untuk mengukur transmitansi dan absorbansi suatu larutan sampel.

Teknik analisis spektrofotometer berdasarkan atas interaksi radiasi

elektromagnetik dengan komponen atom atau molekul yang menghasilkan

fenomena yang dipakai sebagai parameter analisisnya. Dalam melakukan analisis

sel dengan perangkat spektrofotometer, terdapat dua jenis analis yang digunakan,

yaitu Optical Density (OD) dan absorbansi.

Pada metode absorbansi, seberkas sinar diarahkan ke larutan yang

mengandung sel. Setiap spektrofotometer dikalibrasi secara bebas untuk

memperkirakan konsentrasi mikroba. Korelasi dari absorbsi terhadap berat kering

sangat baik untuk endapan larutan bakteri dan hubungan tersebut tidak bergantung

pada ukuran sel. Akan tetapi jika konsentrasi endapan terlalu tinggi maka korelasi

tersebut (absorpsi terhadap berat kering) tidak berlaku.

Metode analisis spektrofotometer dengan Optical Density (OD) dapat

digunakan untuk mengukur konsentrasi dari bakteri dalam suatu endapan. Ketika

cahaya melewati endapan sel maka cahaya tersebuat akan dihamburkan. Semakin

banyak hamburan yang dihasilkan menunjukkan bahwa jumlah bakteri juga

semakin banyak. Metode OD pada tipe sel tertentu memerlukan panjang

gelombang tertentu pula yang berhubungan dengan fasa yang berbeda dari

pertumbuhan bakteri.

2. Prinsip Dasar Analisis Spektrofotometri

Setiap unit panjang larutan akan menyerap cahaya yang melewatinya.

Banyaknya cahaya yang diserap atau absorbansi bergantung pada seberapa besar

konsentrasi larutan atau seberapa banyak jumlah zat dalam larutan. Hubungan ini

menjadi dasar metode analisis spektrofotometri. Hubungan dasar ini dapat ditulis

dalam bentuk persamaan Lambert Beer. Persamaan Lambert Beer adalah:

3

di mana A adalah absorbansi

Io dan I adalah intensitas

E adalah absorpivitas molar

l adalah panjang kuvet

c adalah konsentrasi larutan

Metode spektrofotometri ini digunakan untuk menghitung jumlah sel

dalam suatu sampel secara tidak langsung. Instrumen spektrofotometer

memancarkan cahaya monokromatik dengan panjang gelombang tertentu agar

melewati larutan berisi sel dalam wadah transparan (kuvet). Karena sel tidak

bergerak, cahaya yang dapat melewati kuvet berisi sel akan semakin sedikit

dengan semakin besarnya densitas sel. Spektrofotometer digunakan juga

untukmengukur absorbansi cahaya.

Gambar 2.1. Kuvet yang digunakan

dalam spektrofotometri Gambar 2.2. Spektrofotometer

Gambar 2.3. Diagram sederhana spektrofotometri

4

Untuk mengetahui optical density (kerapatan) sel dalam suatu larutan,

perlu dibuat beberapa larutan standar agar kurva kalibrasi dapat diplot. Larutan

standar adalah larutan-larutan berisi sel yang sudah diketahui kerapatannya.

Larutan-larutan standar ini kemudian diukur absorbansinya terhadap panjang

gelombang tertentu. Selanjutnya, data absorbansi dan kerapatan larutan standar

diplot pada grafik. Kurva yang dihasilkan disebut kurva kalibrasi. Dari kurva

kalibrasi dapat diperoleh persamaan garis. Persamaan garis ini digunakan untuk

menghitung kerapatan larutan asal.

Contoh análisis menggunakan metode spektrofotometri adalah sebagai

berikut:

1. Pertama-tama larutan standar perlu disiapkan. Larutan standar disiapkan

dengan pelarutan berseri (serial dilution). Akan diperoleh sejumlah larutan

dengan faktor pelarutan berbeda-beda. Larutan-larutan ini dituang ke

dalam kuvet.

2. Kemudian, perlu juga disiapkan blanko yang hanya merupakan aquades

dan menuangkannya dalam kuvet.

3. Selanjutnya, sampel yang tidak diketahui optical density-nya disiapkan

dan dituang ke dalam kuvet.

4. Instrumen spektrofotometer diatur agar memancarkan cahaya yang

memiliki panjang gelombang dengan absorbansi tertinggi oleh sel yang

dianalisis.

5. Kuvet berisi blanko ditempatkan ke dalam spektrofotometer untuk menja

di pembanding. Spektrofotometer dikalibrasi menurut absorbansi blanko

5

6. Absorbansi larutan-larutan standar dan sampel diukur menggunakan

spektrofotometer

Berikut adalah contoh data yang diperoleh dalam analisis sel

menggunakan spektrofotometer:

Dilution Factor Absorbance

1.00 1.275

0.50 0.665

0.25 0.246

0.125 0.092

0.0625 0.033

Tabel 2.1. Data percobaan spektrofotometri

Gambar 2.4. Grafik hasil plot data percobaan

6

Dari percobaan dan data yang diperoleh, didapatkan persamaan garis:

y = 1,3541x - 0,0625

Nilai y dapat disubstitusikan dengan nilai absorbansi larutan sampel. Dengan

sedikit kalkulasi dari persamaan di atas, dapat diperoleh nilai faktor pelarutan

sampel. Akhirnya, kerapatan optik sel dalam sampel dapat diperoleh.

3. Komponen Alat Spektrofotometri

Terdapat beberapa komponen penting dalam alat spektrofotometer.

Beberapa komponen ini yaitu:

1. Sumber cahaya digunakan sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer,

haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi.

Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak dan infra merah

dekat dengan panjang gelombang 350-2500nm adalah sebuah lampu pijar

dengan kawat rambut terbuat dari walfram (bungsten). Sedangkan lampu

hidrogen dan lampu deuterium digunakan untuk sumber pada daerah

ultraviolet dan radiasi yang dihasilkan mempunyai panjang gelombang

180-350nm.

2. Monokromator : berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu

mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi

cahaya monokromatis.

Komponen-komponen monokromator yaitu :

• Celah untuk masuknya radiasi polikromatir dari sumber radiasi

• Lensa/ sermin untuk menyerap chaya

• Pendispersi cahaya yang berupa prisma atau grating yang dapat

memecah radiasi menjadi komponen-komponen panjang

gelombang

7

• Lensa/cermin pemfokus chaya atau celah keluar

3. Kuvet adalah kuarsa atau silika untuk radiasi UV dan gelas biasa atau

kuarsa untuk radiasi sinar tampak. Tebal kuvet bervariasi dari 1-10cm.

Kuvet merupakan wadah dari sampel berupa cairan yang telah diatur

takarannya hingga dapat terbaca oleh spektrofotometer. Biasanya sampel

yang digunakan adalah sampel yang digunakan adalah sampel berwarna

yang mudah menyerap sinar yang dipancarkan oelh sumber cahaya.

4. Detektor fungsinya adalah mengabsorpsi foton yang menumbuknya dan

mengubahnya menjadi kuantitas yang dapat diukur seperti arus listrik atau

perubahan suhu. Sebagian besar detektor mengubah energi foton menjadi

sinyal listrik yang segera mengaktifkan meteran / recorder.

Syarat detector :

• Sensitivitas tinggi sehingga daya radiasi yang kecil dapat terdeteksi

• Waktu respon yang singkat

• Stabil

• Sinyal elektronik yang dihasilkan mudah diperkuat sehingga

dipakai untuk mengoperasikan alat pembaca hasil pengukuran

Macam-macam detektor yaitu photovoltaic, phototube, diode array,

penguat (amplifier) yang berfungsi untuk memperbesar arus yang

dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca oleh indikator. Indikator

dapat berupa recorder atau komputer.

8

Gambar 3.1. Komponen instrumen pada spektrofotometer

Jenis-jenis Spektrofotometer

Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu spektrofotometer single

beam dan spektrofotometer double-beam. Perbedaan kedua jenis spektrofotometer

ini hanya pada pemberian cahaya, dimana pada single-beam, cahaya hanya

melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai absorbansi dari

larutan yang dimasukan. Berbeda dengan single-beam, pada spektrofotometer

double-beam, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan dengan larutan yang

diinginkan dalam satu kali proses yang sama. Suatu spektrofotometer tersusun

dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi

untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan

absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding.

Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan

mengukur absorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument

mempunyai beberapa keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan

mengurangi biaya yang ada merupakan keuntungan yang nyata. Beberapa

instrumen menghasilkan single-beam instrument untuk pengukuran sinar ultra

violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190 sampai 210

nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).

9

Gambar 3.2. Spektrofotometer Single Beam Instrument

Double-beam instrument dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang

190 sampai 750 nm. Double-beam instrument dimana mempunyai dua sinar yang

dibentuk oleh potongan cermin yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar.

Sinar pertama melewati larutan blangko dan sinar kedua secara serentak melewati

sampel, mencocokkan fotodetektor yang keluar menjelaskan perbandingan yang

ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat pembaca (Skoog, DA,

1996).

Gambar 3.3. Spektrofotometer Dual Beam Instrument

10

4. Perkembangan Metode Analisis

Perkembangan metode analisis spektrofotometri dimulai pada tahun 1729.

Pada tahun tersebut, Bouger merumuskan hubungan antara absorpsi dari radiasi

monokromatik dan panjang jalan melalui medium yang menyerap. Berkurangnya

tenaga radiasi tiap satuan ketebalan medium penyerap sebanding dengan tenaga

radiasi. Lambert pada tahun 1768 juga merumuskan hal yang sama seperti

Bouger. Setelah itu pada tahun 1814, Fraunhofer menciptakan spektrokop, dan

menemukan 574 garis-garis gelap (garis-garis serapan atom) dalam spektrum

matahari. Spektrofotometri serapan atom adalah perkembangan dari spektroskopi

pancaran nyala. Selanjutnya, pada tahun 1859 Beer merumuskan hubungan antara

konsentrasi jenis zat penyerap dan besarnya absorpsi. Metode ini hanya dapat

digunakan dengan tepat hanya untuk radiasi monokromatik dan sifat macam zat

yang menyerap ditetapkan di atas jangkau konsentrasi yang bersangkutan

Thomas Engelmann melakukan percobaan spektrum aksi untuk

fotosintesis pada tahun 1883. Percobaan ini dilakukan dengan menerangi alga

berfilamen dengan cahaya yang telah dilewatkan dengan prisma, kemudian

memaparkan segmen alga yang berbeda ke panjang gelombang cahaya yang

berbeda. Setelah itu, A. Walsh dari Australia pada tahun 1955

memanfaatkan prinsip serapan atom pada bidang analisis. Hingga pada tahun

1960-an teknik serapan atom pun berkembang.

Namun terjadi kesalahpahaman untuk para ilmuwan, peneloti, serta

pabrik-pabrik industri. Mereka menganggap bahwa metode absorpsi atomik

sangatlah tepat dan meninggalkan metode spektroskopi pancaran nyala.

Spektroskopi pancaran nyala memang tidak lagi merupakan suatu sumber eksitasi,

akan tetapi masih dapat diharapkan untuk pengaruh-pengaruh yang berhubungan

dengan penguapan dan disosiasi.

Terdapat 3 metode dalam spektrofotometer, yaitu :

11

a. Metode standar tunggal

Metode ini sangat praktis sebab hanya menggunakan satu larutan standar

yang telah diketahui konsentrasinya. Absorbsi larutan standar dan absorbsi

larutan sampel diukur dengan Spektrometri. Konsentrasi larutan sampel

dapat dihitung, dengan mengukur Absorbansi larutan sampel dan standar.

b. Metode kurva kalibrasi

Membuat larutan dengan berbagai konsentrasi dan absorbansi dari larutan.

Lalu membuat grafik antara konsentrasi dengan absorbansi tersebut

diukur dengan AAS. Kemudian, absorbansi larutan sampel yang telah

diukur diintrapolasikan ke dalam persamaan garis lurus menggunakan

regresi linear.

c. Metode adisi standar

Kesalahan yang disebabkan oleh perbedaan kondisi lingkungan sampel

dan standar dapat diminimalisir

Selain 3 metode di atas, terdapat metode konvensional. Metode

konvensional yaitu metode yang eksitasinya bergantung pada temperatur apabila

eksitasi dilakukan secara termal. Sumber dari eksitasi termal tidak selalu spesifik.

5. Contoh-contoh Analisis Sel Oleh Teknik Spektrofotometri

Spektrofotometri UV-Vis adalah metode analisis spektroskopi yang

memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm)

dan sinar tampak (380-780 nm) dengan menggunakan spektrofotometer. Guna

spektrofotometer UV-Vis adalah untuk menghitung jumlah sel mikroorganisme.

Panjang gelombang untuk sinar ultraviolet antara 200-400 nm sedangkan panjang

gelombang untuk sinar tampak/visible antara 400-750 nm. Spektrofotometri

elektromagnetik monokromatik, yang diserap zat.

Spektrofotometer pada dasarnya terdiri atas serapan panjang adalah

gelombang pengukuran tertentu yang sumber sinar monokromator, tempat sel

12

untuk zat yang diperiksa, detektor, penguat arus dan alat ukur atau

pencatat.Larutan yang berwarna akan menyerap panjang gelombang sinar tertentu.

Setiap larutan akan menyerap panjang gelombang tertentu secara maksimal.

Semakin banyak zat terlarut akan menyerap panjang gelombang tertentu lebih

besar. Dengan demikian perbedaan serapan sinar menunjukkan intensitas zat

terlarut yang diukur. Ada hubungan antara penyerapan sinar atau panjang

gelombang tertentu denan konsentrasi larutan. Besarnya sinar diserap larutan

disebut Optical Density (OD) atau nilai Absorbansi (Suyitno, 2008).

Sebagian sinar yang tidak terserap merupakan sinar yang dilewatkan

(transmit), disebut nilai transmitan (Suyitno, 2008). Biasanya dinyatakan dalam

persen (%) yaitu menggunakan rumus :

T = Is/Io.

Nilai absorbansi merupakan negatif dari log transmitansinya.

OD [A] = - log T

Nilai A (absorbansi) atau Optical density memiliki hubungan linier dengan

konstanta (k), tebal larutan yang dilalui (b) dan konsentrasi (Suyitno,

2008). Hubungan itu dapat dinyatakan dalam persamaan berikut :

A = k. b. c

Pada percobaan ini hanya akan dilakukan kuantifikasi sel menggunakan

spektrofotometer saja, sedangkan hemasitometer tidak dilakukan dalam percobaan

kali ini.

Prinsip kerja dari spektrofotometer adalah apabila ada sebuah berkas

cahaya akan jatuh pada suatu medium homogen, sebagian sinar yang masuk akan

dipantulkan dengan sudut yang berbeda-beda, ada sebagian lagi yang diserap oleh

medium yang dilalui oleh berkas cahaya itu dan sisanya akan diteruskan. Nilai

yang diperoleh adalah nilai tidak diserap maupun yang tidak dipantulkan oleh

medium, dan selanjutnya dinamakan nilai absorbansi atau Optical Density (OD).

13

Hukum Beer menyatakan bahwa absorbansi cahaya pada spektrofotometer

berbanding lurus dengan konsentrasi dan ketebalan bahan atau medium. Dengan

hukum Beer itu dapat disimpulkan bahwa nilai OD yang terukur sebanding

dengan jumlah sel yang ada dalam kultur yang diujikan dalam spektrofotometer.

Contoh Kasus

Pada percobaan kali ini juga dilakukan pendekatan untuk menghitung

jumlah sel Saccharomyces cerevisiae dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 600 nm. Pada panjang gelombang tersebut, dapat teramati nilai

absorbansi berbeda untuk setiap konsentrasi sampel.

Serial dilution atau pengenceran berseri dilakukan agar didapatkan

konsentrasi berbeda dari sampel , sehingga didapatkan nilai absorbansi berbeda

pula dari analisis menggunakan spektrofotometer. Dengan nilai absorbansi yang

berbeda tersebut, kurva baku dapat dibuat, untuk kemudian dicari persamaan

kurva bakunya. Persamaan kurva baku tersebut selanjutnya dapat dijadikan

sebagai formulasi untuk menentukan konsentrasi bakteri yang tidak diketahui.

Untuk menghitung jumlah sel Saccharomyces cerevisiae digunakan

beberapa jenis metode perhitungan, antara lain :

1. Penghitungan mikroskopis langsung, elektronik sel counter seperti

misalnya Coulter counter,

2. Metode kimiawi untuk mengetahui massa sel atau penyusun seluler

3. Pengukuran turbidimetri untuk peningkatan massa sel

4. Penghitungan total koloni pada cawan yang menggunakan metode

pengenceran seri-agar cawan.

14

Kesimpulan

Analisis sel menggunakan spektrofotometri merupakan bentuk analisis sel

tidak langsung dengan mengandalkan pengukuran absorbansi atau optical density.

Data yang diperoleh diolah menggunakan persamaan Lambert-Beer. Beberapa

komponen penting dalam spektrofotometri adalah sumber cahaya, monokromator,

kuvet, dan detektor. Metode-metode yang digunakan adalah standar tunggal,

kurva kalibrasi, adisi standar, serta metode konvensional. Salah satu aplikasi

metode analisis dengan spektrofotometri adalah dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis.

15

Daftar Pustaka

Campbell. 2002. Biologi. Jakarta: Erlangga

Underwood, Day. 1993. Analisa Kimia Kuantitatif,. Jakarta: Erlangga

Harvey. 2000. Modern Analytical Chemistry. USA: The McGraw-Hill

Companies, Inc.