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• “A cromatografia é uma técnica usada para a separação dos
componentes de uma amostra, os quais se distribuem em duas
fases, uma estacionaria e a outra móvel. A fase estacionaria
pode ser um sólido, um liquido retido sobre um sólido ou um
gel. A fase móvel pode ser líquida ou gasosa.” (IUPAC)
• Essa técnica se destaca devido sua praticidade em realizar a
separação, identificação e quantificação das espécies químicas.
2
• Passagem da fase móvel sobre a fase estacionária:
componentes seletivamente retidos na fase
estacionária.
• A separação depende da interação dos componentes
da mistura com a fase móvel e com a fase
estacionária.
• Diferentes velocidades ao passarem pela fase
estacionária.
3
• Processo cromatográfico comparado a um grupo de abelhas e
moscas sobrevoando certa região.
• Ao passarem por uma flor, espera-se que:
4
Fase estacionária Analito
5
• Para mesma mistura simples, a troca de fase estacionária
pode ser suficiente para alterar a ordem de eluição de
componentes da mistura.
Fase estacionária Analito
• O nome deriva das palavras gregas “chrom” (cor) e
“graphe” (escrever), embora o processo não dependa da
cor, exceto para facilitar a identificação dos componentes
separados.
6 http://artn.highforum.net/t858p30-2-atividade-abstracionismo-rauschenberg
• Foi criada pelo botânico russo Mikhail S. Tswett no
inicio do século XX.
7
Mikhail Semenovich Tswett (1872 – 1919)
http://cromatografialiqui
da.com.br/claetswett.htm
• Seu primeiro trabalho de cromatografia foi em 1903 pela
Sociedade de Cientistas Naturais de Varsóvia, no qual
estudava pigmentos de folhas extraído de plantas.
• Em seu livro, Tswett justificou a separação da seguinte
maneira:
8
"Uma vez que as diferentes substâncias
apresentarem diferentes constantes, irão
consequentemente, mover-se com diferentes
velocidades de deslocamento ao longo do fluxo
e assim, serão separadas como zonas de
adsorção independentes."
• As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando os seguintes critérios:
- Forma física do sistema cromatográfico (Cromatografia em Coluna e Cromatografia Planar);
- Fase móvel empregada (Cromatografia Gasosa, Cromatografia
Líquida, Cromatografia Supercrítica);
- Fase estacionária utilizada (Sólidas, Líquidas e Quimicamente Ligadas);
- Modo de separação (adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou
misturas desses mecanismos).
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Cromatografia
Planar Líquido
Fase Ligada
CCD
Sólido CCD
Líquido CP
Em coluna
Gás
Líquido CGL
Sólido CGS
Fase Ligada CGFL
Fluído Supercrítico
Líquido CSS
Sólido CSFL
Líquido
Líquido CLL
Sólido
CLS
CE
Fase Ligada
CLFL
CTI
CB
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Tipos de Cromatografia
• Consiste na separação dos componentes de uma mistura sólido-líquido onde a fase móvel (líquida) migra sobre uma camada delgada de adsorvente retido em uma superfície plana (fase estacionária - sólida).
• O processo de separação está fundamentado, principalmente no fenômeno de adsorção.
• Vantagens: • Facilidade na execução
• Versatilidade
• Baixo custo
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• Na adsorção as moléculas do analito unem-se à superfície
do adsorvente (fase estacionária - sólida). As forças que
unem a molécula à superfície são as interações
moleculares.
• Sequência das intensidades de interações:
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Ligação de Hidrogênio > Dipolo – Dipolo > Forças de London
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Moléculas
Polares
Dipolo-Dipolo:
Moléculas polares que
não apresentam H
ligados a F, O ou N.
Ligação de
Hidrogênio:
H ligado a
F, O ou N.
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Moléculas Apolares FORÇAS DE DISPERSÃO DE LONDON
Afastadas = Não
existe atração
Aproximação = Indução
Atração
• Sílica (SiO2): é o adsorvente mais utilizado em CCD.
18
• É empregada na
separação de compostos
lipofílicos como aldeídos,
alcalóides, terpenóides e
esteróides, usando o
mecanismo de adsorção.
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-
40422005000300030&script=sci_arttext
• Alumina (Al2O3): A alumina é geralmente empregada na
separação de compostos lipofílicos e, pelo fato de poder
ser preparada com características ácida, neutra e
alcalina, é bastante útil na separação de substâncias que
apresentam variações dessas características.
19
http://www.cempeqc.iq.unesp.br/Jose_Eduardo/Cromatografia%20em%20Camada%20Delgada.pdf
• Trata-se da porção do sistema, geralmente contendo uma
substância polar ou apolar, catiônica ou aniônica, podendo ser
um sólido puro ou um gel.
• Na prática, a fase estacionária será a sílica.
20 Autoria: J. Cavalheiro, Alberto – Métodos Analíticos de Separação – Aula 3 - CCD
21
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422005000300030&script=sci_arttext
• Eliminar impurezas (substâncias aderidas, água)
• 110°C na estufa por 10 minutos.
• A fase móvel é o solvente ou uma mistura de solventes que é
usada para eluir uma mistura e promover a separação dos seus
componentes.
22
23 http://www3.uma.pt/jcmarques/docs/qaii/QAII03TLC2007JCM.pdf
• Mostrar que dois compostos são idênticos.
• Determinar o número de componentes em uma mistura.
• Verificar a eficiência de uma separação.
• Monitorar o andamento de uma reação.
24
• Dissolver a amostra em um solvente volátil, a
evaporação do solvente ajuda a manter as manchas
formadas menores, facilitando a separação.
• É importante ressaltar que a solução não deve
ser muito diluída, pois exige um grande volume
de amostra, aumentando assim as manchas na placa.
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• Para a aplicação da amostra na placa, utiliza-se micropipetas, micro seringas, tubos capilares de vidro ou aplicadores automáticos.
• As manchas devem ser aplicadas 1,5 a 2,0 cm acima da borda inferior e devem ficar no mínimo 1cm da superfície do eluente na cuba;
• As microgotas deverão ser aplicadas no centro das faixas riscadas na placa.
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Capilar com a amostra
Ponto de Aplicação
• O nível do solvente colocado na cuba deverá ficar abaixo dos pontos de aplicação das amostras.
• Papel de filtro: utilizado para facilitar a saturação da cuba, que é indispensável para boa migração das substâncias.
• Durante ascensão do solvente, deixar cuba fechada para que a atmosfera esteja saturada pelo vapor do solvente, isso é importante pois se aberto o sistema o solvente irá se evaporar para saturar a atmosfera e equilibrar o sistema liquido-gasoso, podendo produzir variações nos resultados.
28
• http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cr
omatografia_FINAL/cromatografia.swf
• http://www.lapeq.fe.usp.br/labdig/animacoes/papel
_ani.php
30
• Em alguns casos de separação cromatográficas, os
compostos são incolores.
• Para revelá-los, três métodos existentes são
utilizados: físicos, químicos, biológicos e enzimáticos.
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• Físicos:
• Luz ultravioleta
• Adsorventes impregnados com reagentes fluorescentes
• Biológicos e enzimáticos:
• Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para
tornar a mancha visível.
• Tipos de reveladores biológicos:
• Antibióticos
• Enzimas
• Substratos
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• Químicos:
• Consiste em utilizar reveladores químicos que, em ao
reagir com as substâncias da amostra, as tornam
coloridas e visíveis.
• Alguns tipos de reveladores químicos:
• Revelador universal: vapores de iodo
• Compostos fenólicos: FeCl3
• Saponinas, terpenos e esteróides: anisaldeído sulfúrico
33
• Vapores de Iodo: iodo reage com compostos
orgânicos para formar complexos amarelados ou
castanhos
• Pontos amarronzados (temporários).
34 Foto obtida da prática realizada na disciplina Química Orgânica Experimental – Licenciatura 2013
• Raio UV: substâncias fluorescentes misturadas à sílica
durante a preparação das placas, possibilitando a
revelação dos compostos em câmaras de luz
ultravioleta. A SÍLICAGEL 60 PF254 já contém a
substância fluorescente de fábrica.
35
Foto obtida da prática realizada na disciplina Química Orgânica Experimental – Licenciatura 2013
• Sob condições bem estabelecidas, um dado composto
sempre percorre uma distância fixa em relação à
distância percorrida pelo solvente.
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AMOSTRA
D d 10,0 cm
7,3 cm
3,6 cm
0,8 cm
Rf = d/D 1,00
0,00 (ORIGEM)
0,73
0,36
0,08
Rf = fator de retenção
D = distância percorrida pela FM
d = distância percorrida pela mancha
Origem = ponto de aplicação da
amostra
Autoria: J. Cavalheiro, Alberto – Métodos
Analíticos de Separação – Aula 3 - CCD
• Nas mesmas condições experimentais – Rf é uma
constante para um dado composto.
• Usado para auxiliar na identificação de uma
substância.
• Muitos compostos têm o mesmo Rf, assim como
diferentes compostos tem p.f. iguais.
• Melhor resolução cromatográfica 0,2 > Rf > 0,8.
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38
Substância Etanol Ácido acético
Densidade (g/mL) 0,789 1,049
Ponto de Fusão (ºC) -114,1 16,7
Ponto de Ebulição (ºC) 78,37
118
Toxicidade Causa náusea, vômito e
depressão
Se ingerido causa vômito,
diarreia e colapso circulatório
Primeiros
Socorros
Olhos e Pele: Lavar com água em abundância. Inalação:
Exposição ao ar fresco. Ingestão : Não induzir vômito.
Diagrama de Hommel
Estrutura Molecular
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Substância Diclorometano 1,2-dicloroetano
Densidade (g/mL) 1,326 1,257
Ponto de Fusão (ºC) -25 -40
Ponto de Ebulição (ºC) 39,75 83-84
Toxicidade
Causa fadiga, náusea,
irritação nos olhos e na
cabeça.
Depressão do sistema nervoso
central
Primeiros
Socorros
Olhos e Pele: Lavar com água em abundância. Inalação:
Exposição ao ar fresco. Ingestão : Atenção em caso de vômitos,
beber muita água
Diagrama de Hommel
Estrutura Molecular
40
Substância Metanol Acetato de Etila
Densidade (g/mL) 0,7866
0,902
Ponto de Fusão (ºC) -97,8 -83
Ponto de Ebulição (ºC) - 77
Toxicidade
Dermatite, dor de cabeça,
náusea, vômitos, anorexia.
Irritação nos olhos, pele, nariz
e garganta
Primeiros
Socorros
Olhos e Pele: Lavar com água em abundância. Inalação:
Exposição ao ar fresco. Ingestão : Não induzir o vômito.
Diagrama de Hommel
Estrutura Molecular
41
Substância Cafeína Ácido
Acetilsalicílico Acetaminofenol
Densidade
(g/mL)
1,23
- 1,293
Ponto de Fusão
(ºC) 238 152 170,5
Ponto de
Ebulição
(ºC)
-
- -
Toxicidade
Estimulante do
sistema nervoso
central
[Antitérmico] [Antitérmico]
Estrutura
Molecular
• http://www.cempeqc.iq.unesp.br/Jose_Eduardo/Blog2013/Apostila%20QOEXP%20LIC%202009-2.pdf– acessada em 19/11/2013.
• PAVIA, D.L.; LAMPMAN, G.M.; KRIZ, G.S.; ENGEL, R.G.. Química Orgânica Experimental: Técnicas de pequena escala. Editora Bookman, São Paulo, 2009. 880p
• Seminário CCD, Química Orgânica Experimental 2012. Lívia Saraiva, Nicole Pedroso.
• Cavalheiro, A.J. – Métodos Analíticos de Separação – Aula 3 - CCD
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Solução de 1,2-dicloroetano e ácido acético
12:1
Transferir a solução para uma
cuba cromatográfica (béquer)
até atingir 1,5 cm de altura
(Aproximadamente 5,0 mL)
Colocar uma folha de papel de
filtro da altura da cuba, tampa-
la e deixar saturar até que
toda a folha esteja umedecida
com a fase móvel
Triturar o comprimido
5,0 mL de etanol e
Dicloroetano (1:1)
Aplicar as 4 soluções (uma em cada coluna e no mínimo 1 cm acima da
superfície do solvente) na placa ativada
Riscar a placa (sentido
longitudinal) em 4
colunas deixando 2 cm
em cada extremidade
Cuba Saturada
Cromatograma
0,1g de cafeína 0,1g de ácido acetilsalicílico 0,1g de p-acetoaminofenol 1 comprimido (amostra)
4 tubos de ensaio (1 para cada
padrão e amostra)
3 soluções padrão e amostra
Placa Aplicada
Placa de Vidro com Sílica
Placa Riscada
Placa Ativada
Revelar com UV
Fluxograma – Cromatografia em Camada Delgada
Colocar a placa aplicada na cuba
(rapidamente para evitar evaporação) e
aguardar a fase móvel atingir o limite
traçado (O limite deverá ser traçado somente
quando o solvente atingir a altura desejada
...
1ª Etapa 2ª Etapa
3ª Etapa
Poderá ser feita uma placa com aplicação dos
3 padrões a da mistura dos padrões (para
verificar efeito de matriz no cromatograma)