Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Tiến Lung

SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA

SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI

TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2013

BÌAĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI


---------------------






Hà Nội – 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI


---------------------





Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60.42.0114


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Lai Thành

Hà Nội – 2013

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cố GS.TS.

Nguyễn Mộng Hùng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Trung

tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, người đã sáng lập nên phòng thí nghiệm nơi tôi

học tập và làm việc hơn năm năm qua. Trong những ngày tháng ít ỏi được làm việc

cùng thầy, tôi đã học hỏi được rất nhiều điều, không chỉ kiến thức, thao tác thực

hiện thí nghiệm mà cả sự kiên trì, tìm tòi, chịu khó. Thầy đã truyền cho tôi niềm

đam mê nghiên cứu về công nghệ tế bào động vật, đặc biệt là trong lĩnh vực công

nghệ tế bào gốc.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Lai Thành, người thầy đã hướng dẫn

tôi thực hiện cả khóa luận tốt nghiệp Đại học và luận văn cao học. Thầy đã rất tận

tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm làm việc giúp tôi hoàn

thành những nghiên cứu này. Trong quá trình làm việc, tôi luôn nhận được những

lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy để có thể thực hiện tốt nghiên cứu của mình.

Không những vậy, trong cuộc sống, tôi cũng luôn nhận được sự giúp đỡ của thầy.

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, học viên và sinh viên phòng Công nghệ Tế

bào Động vật, đặc biệt là CN. Đinh Duy Thành đã chỉ dẫn, giúp đỡ trong thời gian

tôi thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô công tác tại bộ môn Sinh học Tế

bào cũng như các thầy cô trong Khoa Sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến

thức cơ sở để tôi có thể thực hiện được luận văn cũng như vận dụng trong công việc

sau này.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

Enzyme và Protein – trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Viện Công nghệ Sinh học –

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm

Thụy Phương – Viện Chăn nuôi Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành

luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm, động

viên tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp.

Cuối cùng, nghiên cứu của tôi được thực hiện dựa trên kinh phí hỗ trợ từ đề

tài thuộc Trung tâm Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội “Sử dụng kỹ

thuật FISH để kiểm tra sự hội nhập của gen IL–6 phân lập từ người trong tế bào gốc

phôi gà chuyển gen” do TS. Nguyễn Lai Thành làm Chủ nhiệm đề tài. Tôi xin chân

thành cảm ơn Trung tâm cũng như Chủ nhiệm đề tài.

Hà Nội, tháng 12 năm 2013


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm i

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

Chương 1 – TỔNG QUAN ...................................................................................... 3

1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ................................................................................ 3

1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào........................................... 3

1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen ................................................ 5

1.1.3. Những ứng dụng của gà chuyển gen ................................................10

1.2. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) ............................12

1.2.1. Nguyên lý........................................................................................12

1.2.2. Đầu dò cho phản ứng lai ..................................................................13

1.2.3. Ưu điểm của kỹ thuật FISH .............................................................18

1.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật FISH ...........................................................19

1.3. INTERLEUKIN 6 Ở NGƯỜI ....................................................................22

1.3.1. Giới thiệu ........................................................................................22

1.3.2. Chức năng .......................................................................................23

1.3.3. Những ứng dụng lâm sàng ...............................................................24

1.3.4. Gen mã hóa IL–6 ở người................................................................25

Chương 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................26

2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT .............................................26

2.1.1. Đối tượng – vật liệu nghiên cứu ......................................................26

2.1.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao ...............................................................29

2.1.3. Thiết bị nghiên cứu .........................................................................29

2.1.4. Hoá chất sử dụng .............................................................................30

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................................32

2.2.1. Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH..............32

2.2.2. Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người .......................34

2.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) ..................................38

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................40

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm ii

3.1. TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

PCR ........................................................................................................40

3.1.1. Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 6 ............................................40

3.1.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR ................................................46

3.1.3. Kết quả tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR .................................49

3.2. THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI .....50

3.2.1. Phân lập và nhân nuôi tế bào gốc phôi gà ........................................50

3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phôi gà chuyển gen .........................52

3.2.3. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR ....54

3.3. KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs ................55

3.4. THẢO LUẬN ...........................................................................................57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................61

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62

PHỤ LỤC................................................................................................................ A

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục hình minh họa

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm iii

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA

Hình 1. Chu trình tái bản của retrovirus và cách thức sản xuất vector retrovirus ...... 4

Hình 2. Mô hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà ................................ 8

Hình 3. Quy trình của kỹ thuật FISH ..................................................................... 12

Hình 4. Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng ........... 14

Hình 5. Vị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở kỳ trung gian .................. 19

Hình 6. Kiểu nhân phổ của nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy ............... 21

Hình 7. Một số ảnh hưởng của IL–6 trong cơ thể ................................................... 23

Hình 8. Cấu trúc vector pLenti6/V5–DEST Gateway (ViraPower) của

Invitrogen ............................................................................................... 27

Hình 9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ............................................................................. 32

Hình 10. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với cADN của gen IL–6 ......... 42

Hình 11. Kết quả xác định vị trí tương đồng giữa cADN và mARN gen IL–6 ....... 43

Hình 12. Kết quả kiểm tra vị trí chèn của gen IL–6 trên vector .............................. 44

Hình 13. Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của đầu dò trên vector .............................. 45

Hình 14. Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp giữa đầu dò với hệ gen gà bằng

BLASTn ................................................................................................. 46

Hình 15. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi và nồng độ ion Mg2+ tới hiệu

suất phản ứng PCR .................................................................................. 47

Hình 16. Kết quả giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR và so sánh với

trình tự đầu dò theo lý thuyết................................................................... 48

Hình 17. Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò ...................................... 49

Hình 18. cESCs 24 giờ nuôi cấy in vitro sau khi phân lập ...................................... 51

Hình 19. cESCs nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi ........................................................ 52

Hình 20. Đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới sự sinh trưởng của cESCs ............ 53

Hình 21. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen ................................. 54

Hình 22. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào qua các lần cấy chuyển ............... 55

Hình 23. Kết quả lai FISH trên tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người ............ 56

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục bảng

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Một số chất đánh dấu huỳnh quang và thuốc nhuộm sử dụng trong

FISH ....................................................................................................... 15

Bảng 2. Vai trò của một số yếu tố chính của vector pLenti6/V5–DEST Gateway .. 28

Bảng 3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài ............................... 29

Bảng 4. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài .................................... 29

Bảng 5. Các hóa chất được sử dụng trong đề tài .................................................... 30

Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp của mồi IL–6... 33

Bảng 7. Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs ................................................... 35

Bảng 8. Thành phẩn phản ứng PCR phát hiện gen chuyển trong tế bào.................. 37

Bảng 9. Kết quả thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3 ........................... 41

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Bảng ký hiệu và chữ viết tắt

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm v

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Viết đầy đủ

ADN Acid deoxyribonucleic

ARN Acid ribonucleic

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BSA Bovine serum albumin

cESCs Chicken Embryonic Stem Cells

cADN Complementary ADN

CMV Cytomegalovirus

DAPI 4',6–diamidino–2–phenylindole

DIG Digoxigenin

DNase Deoxyribonuclease

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FBS Fetal Bovine Serum

FISH Fluorescence in situ hybridization

HIV Human Immunodeficiency Virus

IL–6 Interleukin – 6

LTR Long Terminal Repeats

NCBI National Center for Biotechnology Information

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PGCs Primordial germ cells

RNase Ribonuclease

SDS Sodium dodecyl sulfate

SSC Saline – sodium citrate buffer

SSCs Spermatogonial Stem Cells

Ta Annealing template

Tm Melting temperature

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm 1

MỞ ĐẦU

Sử dụng động vật chuyển gen để sản xuất các loại protein dược phẩm là

hướng đi đã được quan tâm từ lâu. Trong lĩnh vực này, gia cầm chuyển gen đang

được chú ý đến với một số lợi thế vượt trội so với động vật có vú như thời gian tạo

dòng ngắn, trứng có môi trường vô trùng tự nhiên, thành phần protein lòng trắng

trứng đơn giản nên dễ tách sản phẩm chuyển gen,…. Tính đến nay, nhiều protein

dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên cứu tạo ra từ gà chuyển gen, trong đó

một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể đơn dòng miR24

điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và interferon α–2a có

trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu. Những nghiên cứu về gà

chuyển gen gần đây tập trung chủ yếu vào phương pháp thông qua các tế bào gốc

phôi, với ưu điểm là lựa chọn được ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển

mong muốn trước khi tiêm chúng vào phôi nhận, do đó tiết kiệm được thời gian

cũng như chi phí cho quá trình sàng lọc cơ thể chuyển gen từ bố mẹ khảm.

Để tạo động vật chuyển gen hiệu quả thì cần phải có các hệ thống vector đủ

mạnh để chuyển được gen mong muốn với hiệu suất cao, duy trì ổn định trong cơ

thể vật chủ. Hệ thống được sử dụng thường xuyên nhất dựa vào retrovirus (virus

ARN) trong đó sử dụng các enzyme của bản thân và bộ máy phiên mã trong tế bào

chủ để sao chép hệ gen của chúng, sau đó tích hợp nó vào nhiễm sắc thể vật chủ

trong quá trình phân bào. Gần đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus đã

được coi như một công cụ hứa hẹn trong chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu

điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả năng chèn gen vào tế bào không phân chia,

loại vector này đặc biệt hiệu quả đối với tế bào gốc phôi do loại tế bào này rất khó

chuyển gen bằng các phương pháp khác.

Trong quá trình tạo động vật chuyển gen, các bước sàng lọc tế bào hay cơ thể

mang gen mong muốn đóng vai trò rất quan trọng. Gen chuyển cần được cài vào

ADN trong nhân tế bào để đảm bảo di truyền cho thế hệ sau qua con đường sinh sản

hữu tính, đồng thời phải được duy trì bền vững qua nhiều thế hệ động vật. Ngoài ra,

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu


gen chuyển phải nằm ở vị trí thích hợp: trong vùng ADN hoạt động, không chèn

vào giữa gen cấu trúc hay các vùng ADN giữ chức năng điều hòa,... Vì vậy, các kỹ

thuật nhằm xác định vị trí gen trong bộ nhiễm sắc thể đã được phát triển, trong số

đó ít tốn kém và dễ thực hiện nhất là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence

in situ hybridization – FISH). Cơ sở của kỹ thuật FISH dựa trên sự bắt cặp chính

xác giữa giữa ADN đích và đầu dò đánh dấu huỳnh quang có trình tự tương đồng.

Đây là một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và

chẩn đoán nhằm phát hiện những bất thường trên nhiễm sắc thể, nghiên cứu cấu

trúc và chức năng tế bào, lập bản đồ kiểu nhân, xây dựng hệ thống phát sinh loài,...

Có thể nói FISH là cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học

hiện đại, kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực

quan từ kính hiển vi.

Ở Việt Nam, một số bệnh viện lớn như Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương

Quân đội 108, Bệnh viên Nhi Trung ương,... đã sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán

một số bệnh di truyền ở người. Tuy nhiên trong nghiên cứu cơ bản, việc ứng dụng

nó còn rất hạn chế. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc sử dụng để đánh giá sự

chèn gen ngoại lai vào hệ gen của tế bào động vật. Mặt khác, trong những nghiên

cứu trên, đầu dò sử dụng đều là các sản phẩm thương mại, hoặc được tự thiết kế

nhưng đặt tổng hợp tại các hãng nổi tiếng, chưa tự tổng hợp tại phòng thí nghiệm sử

dụng chúng.

Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá về tiềm năng ứng

dụng vector chuyển gen lentivirus đối với tế bào gốc phôi gà, sử dụng kỹ thuật

FISH để phát hiện vị trí gen chuyển IL–6 trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen, từ

đó tạo tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc. Nghiên cứu này

cũng góp phần phát triển kỹ thuật FISH trong nghiên cứu cơ bản ở Việt Nam.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan


Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ

1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào

1.1.1.1. Chuyển gen sử dụng vector virus

Các hệ thống chuyển gen hiệu quả nhất hiện nay khai thác tiềm năng của

virus động vật đã tiến hóa hàng triệu năm qua. Những vector virus được tạo ra bằng

cách thay thế một hoặc một số gen của chúng bằng gen mong muốn. Ưu điểm của

hệ thống chuyển gen sử dụng virus là hiệu suất chuyển gen khá cao và ổn định. Tuy

nhiên, chúng có nhược điểm về độ an toàn, cũng như phản ứng miễn dịch của vật

chủ loại bỏ tác nhân virus. Những nhược điểm này đang dần được khắc phục trong

những vector tái bản thiếu thế hệ mới [58].

Đối với gia cầm, chuyển gen bằng retrovirus và lentivirus thu được nhiều

thành công nhất trừ trước đến nay. Retrovirus có vật chất di truyền là ARN, mang

ba gen chính là gag (mã hóa kháng nguyên kết hợp nhóm), env (mã hóa protein vỏ)

và pol (mã hóa enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase và enzyme hội nhập

intergrase). Sau khi thâm nhiễm vào tế bào chủ (đang trong giai đoạn phân chia),

ARN phiên mã ngược thành ADN, từ đó hợp nhất với ADN tế bào chủ, trở thành

một bộ phận ổn định và hoạt động như các gen khác trong tế bào, có thể di truyền

lại cho các thế hệ sau. Nhờ tín hiệu đóng gói tương thích (), ARN phiên mã từ hệ

gen virus kết hợp trở lại với các protein virus (đều được tạo ra nhờ bộ máy tổng hợp

của tế bào chủ), tạo nên các hạt virus mới (Hình 1A). Khi thiết kế vector, người ta

chỉ sử dụng tín hiệu và hai trình tự dài lặp lại ở hai đầu (long terminal repeat –

LTR), gen chuyển được chèn vào giữa hai LTR này. Vector cần có một dòng tế bào

đóng gói chứa retorvirus cải biến, có khả năng tạo ra các protein virus nhưng không

có tín hiệu (Hình 1B). Nhờ vậy, các hạt virus mới được sinh ra chỉ chứa vector

chuyển gen quan tâm, không có khả năng tạo nên các virus khác [5, 72, 74]. Gần

đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus cũng được sử dụng rộng rãi trong



chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả

năng thâm nhiễm vào tế bào không phân chia [58, 74].

Hình 1. Chu trình tái bản của retrovirus và cách thức sản xuất vector retrovirus

Chu trình tái bản của retrovirus (hình trái): Virus xâm nhập vào tế bào chủ, sử dụng

enzyme phiên mã ngược để tổng hợp ADN từ ARN của mình; ADN này hội nhập vào hệ

gen tế bào, sử dụng bộ máy tổng hợp của tế bào để phiên mã thành ARN và dịch mã tạo

các protein virus; các protein này đóng gói ARN lại tạo thành các hạt virus mới và giải

phóng vào môi trường. Khi sản xuất vector retrovirus (hình phải), vector đóng gói mang

các gen mã hóa protein virus nhưng không có tín hiệu đóng gói (–), nên vector tạo thành

chỉ chứa cấu trúc gen chuyển trong vector retrovirus (chứa tín hiệu đóng gói +) [72].

1.1.1.2. Chuyển gen không dùng virus

Việc chuyển gen không sử dụng virus trên tế bào động vật đã được thực hiện

từ cách đây hơn 40 năm, chúng có ưu điểm về độ an toàn, không gây miễn dịch và

đơn giản, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn nhiều so với khi sử dụng virus. Những

phương pháp được sử dụng nhiều hiện nay bao gồm các phương pháp vật lý (vi



tiêm, xung điện, súng bắn gen,...) hoặc sử dụng hóa chất (calcium phosphate,

DEAE–dextran, liposome,...) [77].

Phương pháp vật lý được sử dụng thường xuyên nhất là sử dụng xung điện

(electroporation). Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên đặc điểm màng tế bào hoạt

động như một tụ điện không cho dòng điện đi qua. Người ta sử dụng hiệu điện thế

cao gây sốc trong một thời gian ngắn làm tăng tạm thời điện thế màng tế bào lên

xấp xỉ 1V. Kết quả là xảy ra sự tái tổ chức các thành phần trên màng một cách đáng

kể, tạo ra những kênh vận chuyển nước hoặc các lỗ. ADN thẩm thấu vào trong tế

bào qua đó [34, 66]. Phương pháp này có những ưu điểm như chuyển gen hiệu quả,

áp dụng được với đa số các loại tế bào, có thể tiến hành với mô còn nguyên vẹn

[77]. Tuy nhiên, xung điện ảnh hưởng lớn tới khả năng sống sót và sinh trưởng của

tế bào (sự chuyển nhiễm tối ưu có thể đạt được trong điều kiện gây chết tới 50% số

lượng tế bào) [61, 77].

Các phương pháp hóa học đều có bản chất là sự liên kết giữa phần mang điện

tích dương của hóa chất sử dụng với gốc phosphate âm của bộ khung acid nucleic,

hình thành phức hệ đại phân tử (polyplex). Phức hệ này được đưa vào trong tế bào

chủ yếu bằng con đường thực bào. Vì vậy, phương thức này có ưu điểm là không

ảnh hưởng lớn tới tế bào, tuy nhiên thao tác thực hiện tương đối phức tạp, đồng thời

nhiều loại tế bào khó chuyển nhiễm bằng những hóa chất này. Kết tủa calcium

phosphate và DEAE–dextran được sử dụng sớm nhất và hiện nay vẫn còn phổ biến,

ngoài ra còn nhiều loại hóa chất khác như các phân tử polycationic (dendrimers

polyamidoamine), polypeptide (polylysine, polyornithine, các dạng kết hợp giữa

chúng) và polyethylenimine [77].

1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen

1.1.2.1. Vi tiêm trực tiếp ADN vào đĩa phôi giai đoạn sớm

Vi tiêm ADN ngoại lai vào nhân nguyên của trứng mới thụ tinh là phương

pháp đầu tiên được sử dụng để tạo động vật có vú chuyển gen và hiện nay vẫn rất

phổ biến. Trên gà, phương pháp này cũng thu được thành công nhất định: Love và



cộng sự vi tiêm trực tiếp ADN vào hợp tử, thu được bảy cá thể gà chuyển gen sống

sót đến khi trưởng thành, trong đó 3,4% gà con thế hệ tiếp theo nhận gen chuyển từ

một cơ thể gà trống thu được [53]. Tuy vậy, phương pháp này bộc lộ rất nhiều

nhược điểm. Trước hết, phương pháp này không thể thao tác với số lượng lớn, do

mỗi ngày chỉ có một quả trứng rụng và việc kích thích siêu bài noãn ở gà khó hơn

nhiều so với ở động vật có vú. Thêm vào đó, để thu được mỗi trứng mới thụ tinh,

người ta phải giết một con gà mái, đồng thời trứng sau vi tiêm phải được bao bọc

trong lớp lòng trắng và vỏ đá vôi như tự nhiên để có thể phát triển [18, 51].

Các nhà nghiên cứu đã thay đổi phương pháp này phù hợp với gia cầm bằng

cách tiếp cận hai giai đoạn: đĩa phôi của trứng chưa ấp (giai đoạn X theo hệ thống

phân chia của Eyal–Giladi, Kochav [41]) và phôi sau khoảng 55–72 giờ ấp (giai

đoạn 17–20 theo hệ thống phân chia của Humberger và Hamilton [27]). Kwon và

cộng sự tạo gà chuyển gen mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lá cây tăng

cường (Enhanced Green Fluorescence Protein – EGFP) bằng cách vi tiêm vector

retrovirus vào đĩa phôi giai đoạn X, trong đó nhiều bộ phận như đầu, chi, mắt và

một số nội tạng đều biểu hiện EGFP [43]. Nhóm nghiên cứu của Kamihira đã chứng

minh gen chuyển có khả năng biểu hiện cao khi được tiêm vào phôi 55–60 giờ ấp.

Họ tiêm vector retrovirus chứa các gen mã hóa chuỗi đơn Fv và Fc của globulin

miễn dịch G1 của người vào phôi gà, tạo được gà chuyển gen biểu hiện protein này

trong huyết thanh và lòng trắng trứng (khoảng 5,6 mg/ml) [36]. Ở Việt Nam, năm

2010, Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cộng sự cũng đã báo cáo về việc tạo gà chuyển

gen bằng phương pháp vi tiêm vector vào đĩa phôi giai đoạn X, trong đó gen chuyển

được phát hiện trong máu gà con sinh ra bằng phương pháp PCR [2].

1.1.2.2. Chuyển gen qua tinh trùng

Đây là phương pháp dựa trên khả năng của tinh trùng có thể lưu giữ ADN

ngoại sinh và chuyển nó vào trứng trong quá trình thụ tinh. Tinh trùng được ủ trực

tiếp với ADN trần, ngoài ra người ta có thể tăng cường hiệu quả quá trình này bằng

cách sử dụng xung điện hay các chất hóa học như liposome, calcium phosphate,



DEAE–dextran. Tinh trùng mang ADN được thụ tinh nhân tạo, thụ tinh trong ống

nghiệm hay có thể được tiêm trực tiếp vào trứng. Lợi thế lớn nhất của phương pháp

này là hiệu quả chuyển gen cao, giá thành thấp, dễ thực hiện [39, 47].

Sử dụng phương pháp này, năm 2000, Harel-Markowitz và cộng sự đã tạo

được gà chuyển gen mã hóa EGFP và hormone kích thích nang trứng (follicle

stimulating hormone – FSH) của người, trong đó tinh trùng được ủ với plasmid và

một loại liposome là Lipofectamine®. ADN ngoại lai đã được phát hiện trong mẫu

mô gan, da, tim và bạch huyết bằng kỹ thuật PCR, cũng như được chứng minh biểu

hiện bằng RT–PCR và miễn dịch phóng xạ [28]. Mới nhất, năm 2013, nhóm nghiên

cứu của Samoylov đã tạo gà chuyển gen mã hóa nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch

cầu hạt (Granulocyte Colony–Stimulating Factor – gcsf) của người, sử dụng

Lipofectamin® 2000 để tăng hiệu quả hấp thu ADN của tinh trùng. Kết quả có

33,3% gà con sinh ra mang gen chuyển mong muốn, với hàm lượng protein gcsf

trong huyết thanh đạt khoảng 50–220 pg. Sử dụng những gà trống này thụ tinh nhân

tạo với gà mái bình thường đã thu được 37,5% gà con thế hệ tiếp theo mang gen

chuyển [73]. Ở Việt Nam, Lê Thị Tuyết và cộng sự đã công bố nghiên cứu chuyển

gen qua tinh trùng ở gà năm 2010, trong đó phát hiện được gen chuyển ở nhiều mô,

cơ quan khác nhau của gà con thế hệ tiếp theo [10].

1.1.2.3. Chuyển gen thông qua trung gian tế bào

Các phương pháp trên đều có nhược điểm là gen chuyển được tích hợp ngẫu

nhiên vào nhiễm sắc thể của phôi, do đó không đánh giá sớm được ảnh hưởng của

vị trí chèn gen đến sức sống của gà con sinh ra. Gần đây, người ta sử dụng các tế

bào nuôi cấy in vitro làm trung gian cho quá trình tạo gà chuyển gen, nhờ đó sàng

lọc ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển ở vị trí mong muốn, giảm thời gian

cũng như chi phí đánh giá và chọn lọc kiểu hình cơ thể biến đổi di truyền [6, 88].

Những loại tế bào được quan tâm gồm: tế bào gốc phôi, tế bào sinh dục nguyên

thủy và tế bào gốc tinh nguyên bào (Hình 2).



Hình 2. Mô hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà

Các tế bào gốc phôi (ESCs) hoặc tế bào sinh dục nguyên thủy (PGCs) thu nhận từ phôi

được chuyển nhiễm với vector mang gen mong muốn, những tế bào mang gen chuyển được

sàng lọc và vi tiêm trở lại phôi nhận, từ đó thu được gà khảm. Phương pháp tương tự cũng

được tiến hành với tế bào gốc tinh nguyên bào (SSCs) thu nhận từ tinh hoàn gà trống,

những tế bào mang gen chuyển được tiêm trở lại vào tinh hoàn gà trống đã triệt sản [51].



Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ESCs) là những tế bào đa tiềm

năng chưa biệt hoá, trong điều kiện thích hợp có khả năng biệt hóa thành tất cả các

loại tế bào có nguồn gốc từ ba lá phôi. Bên cạnh đó, ESCs có khả năng tự duy trì và

nhân lên trong thời gian dài. Vì vậy chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong việc tạo

động vật chuyển gen [4, 46]. Năm 1990, Petitte đã lần đầu tiên tạo được gà khảm

bằng phương pháp vi tiêm các tế bào đĩa phôi vào phôi giai đoạn X [68]. Đến năm

2006, Wang đã chuyển gen thành công vào ESCs bằng liposome và vector virus. Sử

dụng các tế bào này tiêm vào phôi nhận, nhóm nghiên cứu đã thu được gà con mang

gen chuyển ở hầu hết các mô cơ thể với một bản sao duy nhất. Tuy nhiên, sự đóng

góp của các tế bào biến đổi di truyền vào dòng tinh là không thể hoặc hiệu suất rất

thấp [92]. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc ESCs sau khi nuôi cấy quá một

tuần có thể đóng góp vào dòng sinh dục của gà khảm, có thể việc nuôi cấy in vitro

đã làm ESCs mất dần khả năng này [51]. Ở Việt Nam, năm 2012, Nguyễn Lai

Thành và cộng sự cũng đã chuyển gen vào ESCs sử dụng vector lentivirus, sau khi

tiêm chúng vào phôi nhận đã thu được gà con mang gen ở mô ruột. Tuy vậy các

phôi được vi tiêm thường chết ở giai đoạn sớm của quá trình phát triển, chỉ có 10%

trong số đó nở thành gà con, có thể do gen chuyển chèn vào những vị trí gen hoạt

động, ảnh hưởng tới sức sống của phôi [6].

Một cách tiếp cận khác là hướng đến các tế bào sinh dục nguyên thủy

(Primordial Germ Cells – PGCs). Đây là những tế bào đầu dòng của trứng và tinh

trùng, có thể tìm thấy trong liềm mầm phôi giai đoạn 7–10 (sau 23–38 giờ ấp), sau

đó chúng lưu thông trong mạch máu phôi, đến các vị trí sau này hình thành tuyến

sinh dục trưởng thành [62]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng PGCs sau khi

nuôi cấy in vitro vẫn có thể hội nhập được vào phôi nhận, đóng góp vào quá trình

tạo trứng và tinh trùng. Van de Lavoir và cộng sự đã phân lập PGCs từ mạch máu

phôi, chuyển gen và nuôi cấy trong thời gian dài (lên tới 209 ngày) vẫn có thể đóng

góp vào sự hình thành các tế bào sinh dục khi được tiêm vào phôi giai đoạn X [87].

Tuy nhiên, việc thu nhận PGCs từ máu của phôi gà gặp nhiều khó khăn do chúng

chiếm tỷ lệ rất thấp (0,05% tổng số tế bào máu) [65]. Một số nhóm nghiên cứu khác



đã tìm cách phân lập loại tế bào này từ các tuyến sinh dục phôi. Shiue và cộng sự đã

thu nhận PGCs từ phôi 5,5 ngày ấp (giai đoạn 28). Những tế bào này trải qua 281

ngày nuôi cấy vẫn duy trì các đặc điểm đặc trưng, và khi được tiêm vào động mạch

chủ lưng của phôi 2,5 ngày ấp (giai đoạn 17) vẫn có khả năng tạo thành gà khảm

dòng sinh dục [81]. Motono và cộng sự cũng đã hoàn thiện phương pháp tạo gà

chuyển gen bằng PGCs thu nhận từ phôi 2,5 và 5,5 ngày ấp, trong đó chứng minh

rằng khả năng truyền lại gen chuyển của gà mái khảm tốt hơn so với gà trống [60].

Ngoài ra, một số phòng thí nghiệm đã hướng đến sử dụng tế bào gốc tinh

nguyên bào (Spermatogonial Stem Cells – SSCs) làm trung gian cho quá trình

chuyển gen. SSCs mang những đặc điểm đặc trưng của tế bào gốc đa tiềm năng,

chiếm khoảng 0,33–0,44% số lượng tế bào trong tinh hoàn gà con 4 tuần tuổi,

0,029–0,072% ở gà trưởng thành 24 tuần tuổi [35]. Sử dụng những tế bào này tiêm

vào ống sinh tinh của gà nhận, người ta đã thu được gà trống khảm trong tinh hoàn

với hiệu suất lên tới 50% [67]. Sự phát triển của phương pháp này giúp giảm thiểu

đáng kể thời gian tạo gà chuyển gen, minh chứng là thời gian từ khi chuyển nhiễm

vector vào tế bào cho đến khi gà khảm thế hệ tiếp theo được nở ra chỉ khoảng 38–

45 ngày (tiêm vào gà trưởng thành) cho đến 137–188 ngày (tiêm vào gà con) [49].

1.1.3. Những ứng dụng của gà chuyển gen

1.1.3.1. Tạo mô hình nghiên cứu y – sinh học

Gà được coi là hệ thống thử nghiệm quan trọng trong các lĩnh vực sinh học

phát triển, miễn dịch học, vi sinh vật học. Nhiều khám phá có ý nghĩa sinh học

mang tính lịch sử (ví dụ như virus có khả năng gây nên khối u, hay các tế bào B là

một nhóm nhỏ của tế bào lympho) được phát hiện lần đầu tiên ở gà [16]. Các dòng

gà chuyển gen có thể sử dụng để khám phá chức năng của nhiều gen trong quá trình

phát triển phôi thai của động vật có vú nói chung. Năm 2006, nhóm nghiên cứu

thuộc Đại học Sheffield (Anh) đã đánh giá khả năng bất hoạt gen của các ARN can

thiệp (iARN) trên mô hình phôi gà. Kết quả, các iARN có khả năng làm im lặng

một số gen trong khu vực đặc hiệu của hệ thống thần kinh phôi, với hiệu suất đạt



trên 90% [20]. Năm 2010, McGrew và cộng sự đã chứng minh một trong những yếu

tố kiểm soát biểu hiện gen ở chuột nằm trên locus chuỗi nhẹ myosin 1/3 (myosin

light chain 1/3 – MLC1/3) có khả năng hoạt động ở phôi gà. Yếu tố này có thể điều

khiển sự biểu hiện của gen lacZ trong sợi cơ xương tương tự như ở chuột. Đây là

một minh chứng cho thấy các yếu tố kiểm soát biểu hiện của một số gen trong quá

trình phát triển có thể tương đồng giữa các loài, chúng có thể hoạt động trong mô

hình phát triển tương đương [56].

1.1.3.2. Sản xuất protein tái tổ hợp

Việc sử dụng động vật có vú (bò, cừu, dê,…) chuyển gen làm “lò phản ứng

sinh học” đã sản xuất được nhiều protein dược liệu từ sữa, như –1 antitrypsin,

calcitonin, interleukin–2, erithropoeietin,… Sản lượng sản phẩm thu được từ động

vật có vú rất ấn tượng, đối với bò là khoảng 8.000 lít sữa, với lượng protein tái tổ

hợp có thể lên tới 40 kilogam mỗi năm [33].

Gần đây, gà chuyển gen được quan tâm hơn với nhiều lợi thế. Thứ nhất,

chúng có thời gian tạo dòng ngắn, chi phí chăn nuôi cũng thấp hơn so với các động

vật có vú khác. Thứ hai, trứng gà rất giàu protein, trong đó hơn một nửa (54%)

được tạo bởi sự biểu hiện của gen duy nhất ovalbumin, do đó dễ dàng sản xuất

lượng lớn protein tái tổ hợp với độ tinh khiết cao. Thứ ba, trứng gà chứa nhiều chất

ức chế protease tự nhiên và môi trường vô trùng tạo điều kiện lý tưởng cho việc ổn

định hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp. Ngoài ra, mô hình glycosyl hóa nhiều

protein ở người giống với gà hơn động vật có vú, đồng thời một số protein gây độc

cho động vật có vú có thể được tạo ra ở gà [18, 52].

Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên

cứu tạo ra từ mô hình này, như chuỗi đơn Fv và Fc của globulin miễn dịch G1 [36],

hormone kích thích nang trứng (FSH) [28], nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch cầu

hạt (gcsf) [73],... Một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể

đơn dòng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và

interferon α–2a có trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu [52].



1.2. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH)

1.2.1. Nguyên lý

Cũng như các kỹ thuật lai acid nucleic khác, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

(Fluorescence In Situ Hybryzation – FISH) dựa trên đặc tính biến tính và hoàn

nguyên của acid nucleic [85]. Trong phản ứng lai, sự tương đồng trình tự giữa đầu

dò và ADN đích cho phép chúng kết hợp chính xác với nhau tạo thành phức hệ lai.

Tín hiệu huỳnh quang gắn trên đầu dò được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh

quang, cho phép phát hiện và xác định vị trí của gen đích trên mẫu nghiên cứu

(Hình 3) [94].

Hình 3. Quy trình của kỹ thuật FISH



Mẫu phân tích (máu ngoại vi, tế bào nuôi cấy, tiêu bản cố định mô,...) được

biến tính ADN và ủ với đầu dò đánh dấu có trình tự đặc hiệu. ADN cạnh tranh

(thường sử dụng ADN tinh trùng cá hồi) và thêm vào hỗn hợp lai nhằm giảm liên

kết không đặc hiệu giữa đầu dò và ADN đích. Sau khi lai và rửa nguyên liệu thừa,

mẫu được phát hiện trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua kháng thể thứ cấp đặc hiệu

gắn huỳnh quang [15, 94].

1.2.2. Đầu dò cho phản ứng lai

1.2.2.1. Đầu dò đánh dấu trực tiếp và gián tiếp

Những nghiên cứu đầu tiên về kỹ thuật lai tại chỗ được công bố vào cuối

những năm 1960, đều sử dụng đầu dò đánh dấu phóng xạ (32P, 35S, 3H), tuy nhiên

các chất phóng xạ có nhiều nhược điểm về độ an toàn, thời gian và chi phí tiến

hành. Từ những năm 1980, sau thí nghiệm lai sử dụng đầu dò ADN gắn biotin và

kháng thể đánh dấu huỳnh quang của Langer và Safer, các chất đánh dấu huỳnh

quang đã dần thay thế các chất phóng xạ. Đầu dò huỳnh quang thể hiện một số ưu

điểm nổi bật hơn hẳn so với loại đầu dò phóng xạ: độ bền và độ an toàn cao, ít gây

hại với môi trường và con người, kết quả lai thu được chính xác, đánh dấu được với

nhiều loại thuốc nhuộm phát xạ tại những bước sóng khác nhau cho phép phát hiện

nhiều trình tự đích chỉ với một lần lai. Đặc biệt, sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang

thu được tín hiệu ở chính xác vị trí bắt cặp, trong khi các đầu dò phóng xạ có thể chỉ

cho phép quan sát được tín hiệu trong ảnh chụp nhiễu xạ cách vị trí bắt cặp một

khoảng nhất định. Có hai loại đầu dò huỳnh quang theo phương pháp phát hiện vị

trí lai: trực tiếp và gián tiếp [59].

Trong phương pháp gián tiếp, các phân tử đánh dấu (như biotin, digoxigenin

– DIG, dinitrophenol) được gắn vào đầu dò, sau đó mẫu lai được phát hiện bằng

kháng thể thứ cấp đánh dấu huỳnh quang tương ứng. Hệ thống phổ biến nhất hiện

nay sử dụng biotin (Hình 4), được phát triển bởi David Ward và cộng sự từ năm

1981 [44]. Đầu dò gắn biotin sau phản ứng lai được phát hiện bởi nhiều thuốc thử

khác nhau, thường sử dụng nhất là streptavidin và avidin do chúng có khả năng liên



kết với biotin tốt nhất (trong đó streptavidin được ưa thích hơn do điểm đẳng điện

gần như trung tính giúp giảm liên kết không đặc hiệu [59]. Ngoài hệ thống sử dụng

biotin, các đầu dò gắn DIG (Hình 4) cũng thường xuyên được sử dụng. DIG là

steroid có nguồn gốc duy nhất từ hoa và lá của một số thực vật chi Digitalis (như D.

purpureaand, D. lanata), do đó kháng thể kháng DIG hầu như không gắn kết với

các vật liệu sinh học khác. Trong lai FISH, các kháng thể kháng DIG có thể được

kết hợp với alkaline phosphatase, peroxydase, Rhodamine,… [31]. Phương pháp sử

dụng đầu dò gián tiếp có ưu điểm là tạo ra các tín hiệu huỳnh quang cường độ cao,

nhưng chúng gặp bất lợi khi cần thêm bước ủ để liên kết phức hệ lai và kháng thể

thứ cấp gắn huỳnh quang [59].

Hình 4. Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng

Đối với phương pháp trực tiếp, các phân tử báo cáo được gắn trực tiếp vào

đầu dò và từ đó có thể quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ngay sau phản ứng

lai mà không cần thêm bước ủ kháng thể thứ cấp. Những chất huỳnh quang thường

được sử dụng trong trường hợp này là các hợp chất thuộc các nhóm coumarin,

fluorescein, rhodamine và cyanine (Bảng 1). Ưu điểm của phương pháp này là thao

tác đơn giản hơn phương pháp gián tiếp, hiện tượng nhiễu nền thấp. Tuy nhiên, tín



hiệu thu được có cường độ yếu hơn. Người ta có thể cái tiến bằng cách sử dụng

thêm kháng thể thứ cấp gắn chất phát huỳnh quang mạnh, khi đó nó không khác

phương pháp phát hiện gián tiếp như đã trình bày ở trên [59].

Bảng 1. Một số chất đánh dấu huỳnh quang và thuốc nhuộm sử dụng trong FISH

Huỳnh quang Ex (nm) Em (nm)

Các chất đánh dấu

7–Amino–4–methylcoumarin–3–acetic acid, NHS (AMCA) 354 411 7–Diethylaminocoumarin–3–carboxylic acid, NHS 432 472 Pacific Blue™ , NHS 416 451 Fluorescein–5/6–isothiocyanate (FITC) 494 519 Tetramethylrhodamine–5/6–isothiocyanate (TRITC) 544 572 Oregon Green® 488 isothiocyanate 493 520 Rhodamine Green™ carboxylic acid, NHS 504 532 Alexa Fluor® 488 494 519 Alexa Fluor® 568 577 602 Alexa Fluor® 594 590 615 Texas Red® sulfonyl chloride 587 602 Cy3™ 550 570 Cy5™ 649 670 Các thuốc nhuộm ADN 4',6–Diamidino–2–phenylindole (DAPI) 367 452 Propidium iodide (PI) 543 614

Ex: đỉnh hấp thụ; Em: đỉnh phát quang; NHS: N–Hydroxysuccinimidyl Ester

Gần đây, người ta có thể sử dụng kết hợp nhiều đầu dò gắn các chất huỳnh

quang khác nhau, từ đó thu được nhiều tín hiệu khác nhau trên cùng một mẫu lai.

Phương pháp này được ứng dụng hiệu quả khi phân tích kiểu nhân sinh vật [59].



1.2.2.2. Các phương pháp đánh dấu đầu dò

Ba phương pháp thông dụng được sử dụng để đánh dấu đầu dò là dịch

chuyển điểm đứt (nick translation), kéo dài mồi ngẫu nhiên (random primed) và

PCR. Cả ba phương pháp này đều sử dụng hoạt tính enzyme để gắn deoxyribo–

nucleotide triphosphate đánh dấu lên phân tử đầu dò.

Phương pháp dịch chuyển điểm đứt

Phương pháp dịch chuyển điểm đứt sử dụng đồng thời hoạt tính của hai loại

enzyme là ADN polymerase và DNase. Đầu tiên, DNase I tạo ra một điểm đứt trên

phân tử ADN làm bộc lộ đầu 3’–OH. Điểm đứt được dịch chuyển dần nhờ hoạt tính

5’ – 3’ exonuclease của enzyme ADN polymerase I. Trong khi đó, enzyme ADN

polymerase I bám vào đầu 3’–OH và tổng hợp kéo dài chuỗi nhờ hoạt tính 5’ – 3’

polymerase Klenow của nó. Trong suốt quá trình tổng hợp, nucleotide đánh dấu

được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng sẽ thay thế một trong số các phân tử dNTP và

được cài nhập vào sợi ADN đang được tổng hợp, kết quả là tạo thành phân tử đầu

dò được đánh dấu. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong đánh dấu đầu

dò cho FISH, với ưu điểm là tạo ra được đầu dò có kích thước tối ưu bằng cách điều

chỉnh nồng độ DNase. Phản ứng đánh dấu thực hiện tối ưu trong 60–90 phút, với

kích thước đầu dò khoảng 200–500 bp [21, 22, 59].

Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên

Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên (còn được gọi là đánh dấu

oligo) dựa trên phản ứng lai của hexanucleotide với sợi ADN khuôn nhờ hoạt tính

kéo dài chuỗi của tiểu đơn vị Klenow thuộc enzyme ADN polymerase I. Bước đầu

tiên của phương pháp là gây biến tính ADN tạo ra sợi đơn, sau đó cho các đoạn

hexanucleotide bắt cặp ngẫu nhiên với ADN khuôn, các đoạn này được dùng như

mồi cho đoạn Klenow của ADN polymerase I tổng hợp kéo dài ADN, với nguyên

liệu là các nucleotide đánh dấu [22, 93]. Đầu dò thu được có kích thước tối ưu trong

khoảng 200–1000 bp, với lượng từ 30–70 ng (với 10 ng mẫu ban đầu, ủ trong 1 giờ)

đến 2,10–2,65 mg (3 mg mẫu ban đầu, ủ 20 giờ). Nhược điểm lớn của phương pháp



này là khó kiểm soát kích thước đầu dò, do đó tín hiệu thu được yếu và thường bị

nhiễu. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn được lựa chọn với mục đích phát hiện các

gen đơn bản trong hệ gen bằng kỹ thuật Southern blot [22, 59, 93].

Phương pháp PCR

Các deoxynucleotide gắn huỳnh quang có thể được enzyme ADN Taq

polymerase sử dụng như một cơ chất phản ứng trong PCR, tạo ra các phân tử ADN

được đánh dấu. Phương pháp này vừa có độ đặc hiệu, độ nhạy cao hơn các phương

pháp đánh dấu khác, vừa cho phép tạo ra đầu dò với hiệu suất lớn (lên tới một triệu

bản sao sau 20 chu kỳ phản ứng). Hơn nữa, với phương pháp PCR, người sử dụng

có thể kiểm soát kích thước đầu dò thông qua vị trí đầu 5’ của cặp mồi dùng trong

phản ứng, nhờ đó tạo ra đầu dò có kích thước tối ưu phù hợp với mục đích thí

nghiệm (thông thường kích thước đầu dò tổng hợp theo phương pháp này khoảng

200–600 bp) [19, 59].

1.2.2.3. Các loại đầu dò

Một số loại đầu dò thường sử dụng là đầu dò đặc hiệu locus, đầu dò trình tự

lặp lại và đầu dò toàn bộ nhiễm sắc thể.

Đầu dò đặc hiệu locus được tạo ra từ một phần của gen và được sử dụng để

phát hiện một vùng nhất định trên nhiễm sắc thể. Vị trí của gen đích trên nhiễm sắc

thể được xác định thông qua phản ứng lai của nhiễm sắc thể với đầu dò [23]. Kích

thước đầu dò thay đổi thùy theo tính chất của vector nhân bản, từ plasmid (1 – 10

kb) cho đến PAC, BAC, YAC (80 kb – 1 Mb). Đầu dò này đặc biệt hiệu quả cho

việc phát hiện các tái cấu trúc nhiễm sắc thể như chuyển đoạn, đảo đoạn hay mất

đoạn. Sử dụng các đầu dò cho các vị trí khác nhau với các màu huỳnh quang khác

nhau, người ta dễ dàng phát hiện các hiện tượng bất thường này [26, 37].

Đầu dò trình tự lặp lại trên nhiễm sắc thể được tạo thành từ các trình tự lặp

lại ở tâm động hoặc đầu mút. Ví dụ như đầu dò đầu mút nhiễm sắc thể (với trình tự

oligonucleotide TTAGGG lặp lại nhiều lần) có khả năng liên kết với tất cả các

nhiễm sắc thể trong tế bào [37]. Đầu dò bắt cặp với các trình tự lặp lại đặc trưng



trên từng nhiễm sắc thể thường xuyên được sử dụng hơn, với việc sử dụng các màu

huỳnh quang khác nhau để nhuộm các nhiễm sắc thể khác nhau. Loại này đặc biệt

thích hợp cho việc phát hiện các trường hợp đơn nhiễm (monosomy), tam nhiễm

(trisomy) và các dị bội khác [57].

Đầu dò toàn bộ nhiễm sắc thể là tập hợp các đầu dò nhỏ hơn, lai với các trình

tự khác nhau dọc theo chiều dài của cùng một nhiễm sắc thể, nhờ đó, có thể nhuộm

màu toàn bộ nhiễm sắc thể. Hình ảnh phân tích nhiễm sắc thể cho phép phân biệt

các nhiễm sắc thể dựa trên màu sắc của chúng. Phương pháp này thể hiện tính ưu

việt hơn hẳn so với phương pháp lập bản đồ kiểu nhân dựa vào mô hình nhuộm

băng truyền thống, đặc biệt là cho việc phân tích tính bất thường nhiễm sắc thể [54,

55]. Người ta có thể sử dụng tới 24 màu huỳnh quang để đánh dấu các nhiễm sắc

thể, từ đó phát triển hai kỹ thuật FISH độc lập nhau là đa màu (Multiplex FISH –

M-FISH) và kiểu nhân phổ (Spectral Karyotyping – SKY). Đây đều là những kỹ

thuật đột phá, thường xuyên được sử dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu [12, 38].

1.2.3. Ưu điểm của kỹ thuật FISH

Kỹ thuật FISH được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và chẩn đoán

điều trị. Nó có thể được ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh với các khiếm khuyết

nhiễm sắc thể có khả năng di truyền, phát hiện sau sinh các thay đổi di truyền,

nghiên cứu về khối u, cấu trúc và chức năng tế bào,... Một lợi thế nữa từ kỹ thuật

FISH là cho phép quan sát từng nhiễm sắc thể trên kiểu nhân, qua đó nhận dạng

được từng gen, nhiễm sắc thể và các bất thường di truyền [90, 91]. FISH cũng được

ứng dụng để xác định vị trí cài nhập của gen chuyển trong hệ gen tế bào chủ mà

không đòi hỏi tách chiết ADN hệ gen cũng như không cần nuôi cấy thêm [29, 79].

Kỹ thuật FISH được xem như cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di

truyền học hiện đại, nó kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và

sự quan sát trực quan từ kính hiển vi. Độ nhạy cao, độ đặc hiệu và tốc độ tiến hành

là những ưu điểm nổi bật đã giúp FISH trở thành công cụ hữu hiệu trong các nghiên

cứu cơ bản cũng như chẩn đoán và điều trị [12, 26, 37].



1.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật FISH

1.2.4.1. Ứng dụng trong phân tích kiểu nhân

Hệ thống nhận dạng nhiễm sắc thể dựa trên kỹ thuật FISH có thể được sử

dụng cho mục đích phân tích kiểu nhân. Phản ứng lai có thể tiến hành với một tập

hợp các đầu dò khác nhau bằng một hệ thống chất phát huỳnh quang cho những phổ

màu khác nhau, vì vậy có thể phát hiện đồng thời tất cả các nhiễm sắc thể trong hệ

gen. So với các phương pháp phân tích kiểu nhân truyền thống, chi phí các xét

nghiệm FISH chỉ bằng một nửa trong khi thời gian tiến hành thí nghiệm nhanh hơn.

Vì vậy, FISH nhanh chóng trở thành một công cụ quan trọng và hữu ích cho việc

phân tích kiểu nhân, phục vụ cho các nghiên cứu di truyền học tế bào [50, 79].

Năm 1996, hai nhóm nghiên cứu độc lập công bố các nghiên cứu phân tích

kiểu nhân sử dụng kỹ thuật FISH với 24 màu huỳnh quang, chính là hai kỹ thuật M-

FISH và SKY [78, 82]. Ứng dụng các kỹ thuật này, người ta đã xác định được các

chuyển đoạn không tương hỗ, tái sắp xếp lại nhiễm sắc thể trong các tế bào ung thư

[76]. Đặc biệt, M-FISH cũng lần đầu tiên chứng minh được ở kỳ trung gian trong

quá trình phân bào, các nhiễm sắc thể không phân bố ngẫu nhiên mà mỗi chiếc

chiếm một vị trí nhất định trong nhân tế bào (Hình 5) [13, 83].

Hình 5. Vị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở kỳ trung gian

(A) Tín hiệu huỳnh quang thu được từ các đầu dò đánh dấu đặc hiệu với 24 nhiễm sắc thể

(các cặp 1–22, nhiễm sắc thể giới tính X và Y); (B) Vị trí chính xác của các nhiễm sắc thể

ở pha G0, các vùng đen trong nhân không bắt màu huỳnh quang là khu vực của nhân con.



Với các góc độ chụp khác nhau, người ta có thể xây dựng được vị trí không gian ba chiều

của các nhiễm sắc thể. Kết quả được phân tích trên nguyên bào sợi người [13, 83].

1.2.4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc nhiễm sắc thể

FISH là một kỹ thuật mạnh mẽ được sử dụng trong việc phát hiện các bất

thường nhiễm sắc thể như thể dị bội, mất đoạn hay chuyển đoạn [30, 89].

Hiện tượng chuyển đoạn đầu tiên được phát hiện bằng kỹ thuật FISH gây

bệnh ở người là chuyển đoạn giữa cánh dài nhiễm sắc thể số 9 và cánh ngắn nhiễm

sắc thể số 22, tạo nên nhiễm sắc thể Philadelphia. Đột biến này có liên quan mật

thiết với bệnh bạch cầu nguyên bào tủy mãn tính (chronic myelogenous leukemia –

CML), 95% những người mắc bệnh gặp bất thường này [71] (một tỷ lệ nhỏ bệnh

nhân được phát hiện hiện tượng chập ba nhiễm sắc thể số 8 [26]). Tuy nhiên chuyển

đoạn này không phải đặc hiệu để chẩn đoán CML, do nó cũng chiếm một tỷ lệ nhỏ

gây nên bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính (acute lymphoblastic leukaemia

– ALL). Bệnh này cũng lần đầu tiên được phát hiện nhờ kỹ thuật FISH, trong đó

gần 25% các trường hợp bệnh liên quan đến chuyển đoạn giữa cánh ngắn nhiễm sắc

thể 12 và cánh dài nhiễm sắc thể 21 [26]. Ngoài ra, còn rất nhiều các bất thường

nhiễm sắc thể cũng được phát hiện nhờ kỹ thuật FISH như một số dạng ung thư, vô

sinh, hội chứng Down, Prader – Willi, Angelman, Velocardiofacial,… [75].

Ở Việt Nam, trong vài năm trở lại đây, một số bệnh viện lớn như bệnh viện

Trung ương Quân đội 108, Bạch Mai, Nhi Trung ương,… cũng đã đẩy mạnh ứng

dụng kỹ thuật này để chẩn đoán ung thư và một số hội chứng giai đoạn trước sinh.

Trong giai đoạn 2004–2006, nhóm nghiên cứu thuộc ĐH Y Dược TP. HCM đã

nghiên cứu 1302 thai phụ có nguy cơ sinh con dị bội nhiễm sắc thể, phát hiện 136

trường hợp với nhiều dạng khác nhau như chập ba nhiễm sắc thể 13 (hội chứng

Patau), chập ba nhiễm sắc thể 18, chập ba nhiễm sắc thể 21 (hội chứng Down), XO,

XXX và XXY [3]. Năm 2008, khoa Di truyền và Sinh học phân tử – bệnh viện Nhi

Trung ương cũng đã ứng dụng kỹ thuật này để phát hiện một số bất thường trên tế

bào lympho B nuôi cấy in vitro như mất đoạn q11–13 ở nhiễm sắc thể 15 gây hội



chứng PraderWilli, mất đoạn q11 ở nhiễm sắc thể X ở bệnh nhân Turner hay mất

đoạn trên nhiễm sắc thể 22 [8]. Nhóm nghiên cứu này cũng phối hợp với khoa Sản,

bệnh viện Bạch Mai chẩn đoán trước sinh các hội chứng Patau, Down từ tế bào dịch

ối của thai 17–25 tuần [9]. Những nghiên cứu này đều sử dụng đầu dò huỳnh quang

được thiết kế và tổng hợp bởi các hãng uy tín như Vysis, Kreatech, thu được kết quả

khả quan và chính xác, phù hợp với những phân tích nhiễm sắc thể khác.

Hình 6. Kiểu nhân phổ của nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy

(A) Các nhiễm sắc thể được phân tích với 24 màu huỳnh quang, những nhiễm sắc thể bất

thường được đánh dấu mũi tên; (B) Những bất thường được làm rõ với số chỉ nguồn gốc

chuyển đoạn; (C) Các nhiễm sắc thể được sắp xếp lại thành kiểu nhân tế bào [76] .



1.2.4.3. Ứng dụng trong nghiên cứu tiến hóa và phân loại sinh vật

So với các kỹ thuật vi sinh vật học truyền thống, kỹ thuật FISH cho thấy ưu

điểm nổi bật trong các nghiên cứu xác định sự có mặt của vi sinh vật cũng như định

loại chúng. FISH có thể được sử dụng trực tiếp trên mẫu nghiên cứu để xác định sự

hiện diện và hoạt tính của các vi sinh vật gây bệnh. Phương pháp này cho kết quả

nhanh chóng mà không đòi hỏi các thao tác cấy chuyển và lựa chọn điều kiện nuôi

cấy đặc hiệu cho từng chủng vi sinh vật, nhất là với những vi sinh vật chưa được

định loại. Nhờ vậy, FISH được sử dụng nhiều trong lĩnh vực sinh thái học vi khuẩn,

xác định vi sinh vật, với đầu dò thường được thiết kế ở trong vùng gen ARN

ribosome 16S [14, 91]. Việc so sánh các trình tự ADN lặp lại bằng kỹ thuật FISH

cũng cung cấp các bằng chứng về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài [91].

Ở Việt Nam, Viện Nghiên cứu Hải sản (Hải Phòng) cũng đã sử dụng phương

pháp này để định loại nhanh hai loài tảo giáp độc hại là Alexandrium affine và

Alexandrium pseudogonyaulax ở vùng biển nước ta [7]. Ngoài ra, một số báo cáo

định loại vi sinh vật cũng đã được công bố. Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật này

trong nghiên cứu cơ bản vẫn còn khá hạn chế.

1.3. INTERLEUKIN 6 Ở NGƯỜI

1.3.1. Giới thiệu

Interleukin 6 (IL–6) là một protein miễn dịch thuộc họ hematopoietin

[80].Nó được gọi bằng nhiều cái tên khác nhau, như interferon–ß2 (IFN–ß2), nhân

tố kích thích tế bào B–2 (B Cell Stimulatory Factor 2 – BSF–2), nhân tố tăng trưởng

tế bào gan (Hepatocyte Growth Factor – HGF), nhân tố biệt hóa tế bào T độc

(Cholinergic differentiation factor – CDF), interleukin–HP1 (IL–HP1), chất cảm

ứng bạch cầu hạt đơn nhân loại 2 (monocyte-granulocyte inducer type 2 – MGI-

2),… và gần đây nhất (năm 1988) là interleukin 6 (IL–6) [80].

Phân tử IL–6 bao gồm một chuỗi protein chứa 184 acid amin, được sản xuất

bởi các tế bào T, đại thực bào, tế bào nội mô. IL–6 được giải phóng để đáp ứng với

sự nhiễm trùng, bỏng, các chấn thương và sự hình thành khối u. Nó đóng vai trò



quan trọng trong cảm ứng protein giai đoạn cấp tính, cũng như trong sự biệt hóa và

tăng trưởng của tế bào B và T. IL–6 có thể tác động trực tiếp lên tế bào, trung hòa

tác động của các cytokin khác, và là yếu tố tương tác với glucocorticoid [40, 80].

1.3.2. Chức năng

IL–6 có nhiều dạng phân tử khác nhau, mỗi dạng có một chức năng đặc

trưng khi được tiết ra bởi các tế bào khác nhau trong các điều kiện riêng biệt (kích

hoạt thông qua các tác nhân khác nhau) [80]

Hình 7. Một số ảnh hưởng của IL–6 trong cơ thể

IL–6 kích thích sản xuất các protein phản ứng (CRP), amyloid A, fibrinogen, hepcidin,

trong khi làm giảm tổng hợp albumin và cytochrome P450 trong tế bào gan. IL–6 tăng

cường tổng hợp globulin miễn dịch trong các tế bào B hoạt động cũng như sự biệt hóa tế

bào TH17 và T độc từ tế bào T nguyên phát. Trong tủy xương, IL–6 kích thích sự trưởng

thành của tế bào nhân khổng lồ thành tiểu cầu và kích hoạt tế bào gốc tạo máu. IL–6 cũng

hoạt động trên các tế bào nguyên bào sợi hoạt dịch để sản xuất thụ thể kích hoạt của phối

tử NF–κB (RANKL) và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), nhằm thúc đẩy sự

biệt hóa của hủy cốt bào và mạch máu. IL–6 cũng kích thích các nguyên bào sợi da để sản



xuất collagen, kích thích sự tăng trưởng của một số loại tế bào như các tế bào gian mạch,

u tủy, u tương bào [86].

IL–6 trong các tế bào có thể dẫn đến sự sao chép một loạt các protein thông

qua cả ba con đường dẫn truyền tín hiệu chính: protein kinase C, cAMP / protein

kinase A và con đường giải phóng canxi. Khi được tiết ra bởi các tế bào T, đại thực

bào, tế bào nội mô, IL–6 đóng vai trò kích thích hệ thống miễn dịch đáp ứng lại tổn

thương, đặc biệt là bỏng và các tổn thương khác dẫn đến viêm. Thêm vào đó nó còn

tham gia chống lại các tác nhân bên ngoài xâm nhập. IL–6 cũng được tiết ra từ tế

bào cơ và tăng lên trong quá trình co cơ. Trong quá trình vận động, nó hoạt động

như một hormone huy động cơ chất ngoại bào và tăng cường phân phát cơ chất.

Mặt khác, interleukin này cũng được tiết ra bởi các nguyên bào xương đóng vai trò

kích thích sự hình thành xương. Nó có liên quan đến nhiều bệnh như tiểu đường,

Alzheimer, ung thư tuyến tiền liệt và rất nhiều bệnh khác. IL–6 được biết đến với

các tác động quan trọng trong sự tạo máu và hình thành tế bào máu, đóng vai trò là

nhân tố sinh trưởng của các tế bào lai trong sản xuất kháng thể, các tế bào đa u

tủy,... [40].

1.3.3. Những ứng dụng lâm sàng

Những hiểu biết về chức năng của IL–6 có thể được áp dụng trong điều trị

lâm sàng. IL–6 được tìm thấy với một số lượng lớn và trên thực tế, được sản xuất

bởi các mô hoạt dịch của các bệnh nhân viêm khớp dạng thấp. Trong trường hợp

này, nó gây cảm ứng làm tăng sản xuất kháng thể trong tế bào B. Thông qua nhiều

nghiên cứu, người ta phát hiện ra rằng các bệnh nhân viêm gan tự miễn có sự giảm

mức độ biểu hiện IL–6, cùng với đó là sự giảm mức độ biểu hiện interleukin 1 (IL–

1), yếu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factors – TNF) loại β. Dữ liệu này cho

thấy IL–6 đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của các bệnh này [80, 84].

IL–6 có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như: cảm ứng hình thành tế

bào tiền thân tạo máu trong môi trường sánh, thay thế lớp tế bào nuôi trong việc tạo

tế bào lai giữa chuột và người, biệt hóa in vitro tế bào TH17 [40, 42].



1.3.4. Gen mã hóa IL–6 ở người

Protein IL–6 được mã hóa bởi gen IL–6 định vị tại locus 7 trên cánh ngắn

nhiễm sắc thể 21 (7p21) trong hệ gen người. Gen này gồm 5 intron và 5 exon, còn

được gọi với những tên khác như BSF2, HGF, HSF, hoặc IFNB2) [80, 84]. Một số

nghiên cứu gần đây đã chuyển gen mã hóa IL–6 người vào chuột để đánh giá ảnh

hưởng của cytokine này đến một số cơ quan trong cơ thể [48, 63].

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 2 – Phương pháp nghiên cứu


Chương 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT

2.1.1. Đối tượng – vật liệu nghiên cứu

Gà Lương Phượng (Gallus gallus domesticus)

Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu này là gà Lương Phượng Gallus

gallus domesticus được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm Thụy Phương,

Viện Chăn nuôi Quốc gia. Trứng gà Lương Phượng là nguồn nguyên liệu được sử

dụng để phân lập tế bào gốc phôi gà (chicken Embryonic Stem Cells – cESCs).

Nguyên bào sợi thai chuột

cESCs có thể duy trì in vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được đặc tính đa

tiềm năng với sự có mặt của lớp tế bào nuôi (feeder cells), những tế bào này vừa là

giá thể, đồng thời cung cấp các nhân tố tăng trưởng giúp cESCs tăng sinh không

biệt hóa. Chúng tôi sử dụng nguyên bào sợi thai chuột đã bất hoạt phân bào làm tế

bào nuôi cESCs. Dòng tế bào này là sản phẩm của đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà

Nội “Đánh giá hiệu quả chuyển gen cecropin của vector chuyển gen transposon trên

dòng tế bào chuột nuôi cấy (Mus Musculus)”, mã số QG 09.18.

Gen mã hóa Interleukin – 6 (IL–6) phân lập từ người

Trong nghiên cứu này, gen IL – 6 người được chuyển vào cESCs. cADN của

gen có kích thước 639 bp với trình tự như sau:

1–

51–

101–

151–

201–

251–

301–

351–

ATGAACTCCT TCTCCACAAG CGCCTTCGGT CCAGTTGCCT TCTCCCTGGG

GCTGCTCCTG GTGTTGCCTG CTGCCTTCCC TGCCCCAGTA CCCCCAGGAG

AAGATTCCAA AGATGTAGCC GCCCCACACA GACAGCCACT CACCTCTTCA

GAACGAATTG ACAAACAAAT TCGGTACATC CTCGACGGCA TCTCAGCCCT

GAGAAAGGAG ACATGTAACA AGAGTAACAT GTGTGAAAGC AGCAAAGAGG

CACTGGCAGA AAACAACCTG AACCTTCCAA AGATGGCTGA AAAAGATGGA

TGCTTCCAAT CTGGATTCAA TGAGGAGACT TGCCTGGTGA AAATCATCAC

TGGTCTTTTG GAGTTTGAGG TATACCTAGA GTACCTCCAG AACAGATTTG

– 50

–100

–150

–200

–250

–300

–350

–400



401–

451–

501–

551–

601–

AGAGTAGTGA GGAACAAGCC AGAGCTGTGC AGATGAGTAC AAAAGTCCTG

ATCCAGTTCC TGCAGAAAAA GGCAAAGAAT CTAGATGCAA TAACCACCCC

TGACCCAACC ACAAATGCCA GCCTGCTGAC GAAGCTGCAG GCACAGAACC

AGTGGCTGCA GGACATGACA ACTCATCTCA TTCTGCGCAG CTTTAAGGAG

TTCCTGCAGT CCAGCCTGAG GGCTCTTCGG CAAATGTTG

–450

–500

–550

–600

Vector chuyển gen

Vector được sử dụng để chuyển gen là pLenti6/V5–DEST (có nguồn gốc

lentivirus), trong đó gen IL–6 người cùng trình tự dẫn được đưa vào thay thế đoạn

ADN giữa hai vị trí attR1–attR2 trên vector gốc. Đây là sản phẩm của đề tài cấp nhà

nước “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen tạo ra động vật sản xuất protein

dược liệu” (mã số KC.04.04/06–10). Vector cũng được sử dụng để tổng hợp đầu dò

huỳnh quang cho phản ứng FISH.

Hình 8. Cấu trúc vector pLenti6/V5–DEST Gateway (ViraPower) của Invitrogen



Bảng 2. Vai trò của một số yếu tố chính của vector pLenti6/V5–DEST Gateway

Yếu tố (vị trí – base) Vai trò

– HIV–1 5’ LTR (230–410) – Cho phép đóng gói virus và phiên mã ngược

của mARN virus

– Tín hiệu đóng gói HIV–1 (521–565) – Tín hiệu đóng gói virus

– Yếu tố đáp ứng Rev HIV–1 (RRE)

(1075–1308)

– Tín hiệu rời nhân phụ thuộc yếu tố Rev của

mARN virus chưa ghép nối

– CMV promoter (1809–2392) – Cho phép biểu hiện gen quan tâm

– Trình tự attR1 và attR2 (2440–

2564, 4020–4144)

– Trình tự ADN tái tổ hợp từ thực khuẩn thể

cho phép nhân dòng tái tổ hợp của gen quan

tâm từ vector nhân dòng Gateway®

– Gen kháng chloramphenicol

(CamR) (2673–3332)

– Cho phép sàng lọc số lượng plasmid

– Gen ccdB (3674–3979) – Cho phép lựa chọn âm tính plasmid

– V5 epitope (4197–4238) – Cho phép phát hiện protein dung hợp tái tổ

hợp bằng kháng thể kháng V5

– SV40 promoter và origin

(4293–4602)

– Cho phép biểu hiện cao các điểm đánh dấu

lựa chọn và tái bản ngoài nhân trong tế bào

biểu hiện mạnh kháng nguyên T lớn SV40

– Gen kháng blasticidin (blast)

(4724–5122)

– Cho phép sàng lọc trên tế bào động vật có vú

– ΔU3/HIV–1 (5208–5261)

và HIV–1 3’ LTR (5262–5442)

– Cho phép đóng gói virus nhưng tự bất hoạt

5’LTR cho các mục đích an toàn sinh học

– Tín hiệu polyadenyl hóa của SV40

(SV40 PA) (5514–5645)

– Tín hiệu chấm dứt phiên mã và gắn đuôi

polyadenin của mARN

– Gen kháng ampicillin (6603–7463) – Cho phép sàng lọc plasmid ở E. coli

– pBR322 origin (7608–8281) – Cho phép tái bản hiệu quả cao và duy trì ở E.

coli



2.1.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao

Các dụng cụ và vật tư cần thiết để làm các thí nghiệm trong đề tài được liệt

kê ở Bảng 3.

Bảng 3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài

Tên dụng cụ, vật tư Hãng sản xuất/ Xuất xứ Mã sản phẩm

Bộ vi phẫu Stainless –

Đĩa nuôi cấy tế bào 35x10mm Corning 3294

Đầu tip 10, 200, 1000µl Corning 4840, 4844, 4862

Pipet nhựa 2, 5, 10ml Corning 4486, 4487, 4488

Ống ly tâm 15, 50ml Corning 430053, 430290

Ống ly tâm 1,7 ml Sorenson BioScience® 53550-937

Ống PCR 0,2 ml Sorenson BioScience® 14229-856

Buồng đếm hồng cầu Thomas Scientific 5971K10

Giấy parafilm Trung Quốc –

Lam kính, phiến kính, đĩa petri thủy tinh Trung Quốc –

2.1.3. Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị nghiên cứu cần thiết cho đề tài được liệt kê trong Bảng 4.

Bảng 4. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài

Tên thiết bị Hãng sản xuất/ Xuất xứ

Model/ Mã sản phẩm

Kính hiển vi soi ngược Carl Zeiss Axiovert S100

Kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss Axioplan2

Máy ly tâm tách mẫu Hettich Zentrifugen EBA 21



Máy ly tâm tế bào Labnet Spectrafuge 6C

Máy nhân gen tốc độ cao Bio–Rad PTC-200 DNA Engine Cycler

Máy soi gel Cleaver Scientific UV Transilluminator

Máy lắc vi khuẩn Sartorius OS–20

Tủ an toàn sinh học cấp hai Esco AC2–4E1

Tủ lạnh Daewoo VR–180

Tủ nuôi cấy tế bào Sanyo MCO–18AIC

Bể ổn nhiệt Faalin –

Máy giải trình tự ADN Applied Biosystems

Applied Bio-systems® 3130

Máy định lượng ADN, ARN và protein Eppendorf Biophotometer Plus

Tủ ấm Binder ED 53

Nồi hấp khử trùng Hirayama HV85

Nguồn điện di Bio–Rad ALS1296

Pipetman 10, 200, 1000 µl Gilson P10, P200, P1000

2.1.4. Hoá chất sử dụng

Các hoá chất sử dụng trong đề tài được liệt kê trong Bảng 5.

Bảng 5. Các hóa chất được sử dụng trong đề tài

Tên hóa chất Hãng sản xuất/ Xuất sứ Mã sản phẩm

Tris BioBasic TB0196

RNase A solution Fermentas K0729

Opti–MEM® Gibco 22600–043

Penicillin/Streptomycin Gibco 15140



Non–essential amino acid Gibco 11140–050

Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190–250

Sodium pyruvate Gibco 11360–070

Leukemia inhibitory factor (LIF) Gibco A12635A

Agarose Invitrogen 15510–019 ChromaTide® Alexa Fluor® 568–5–dUTP Invitrogen C11399

Sodium dodecyl sulfate (SDS) Invitrogen 15525-017

Formamide Merk K26368484 932

Taq polymerase New England Biolab M0267L

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Prolabo M169 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9281

DNA Isolation Kit for Cells and Tissues Roche 11 814 770 001

Bovine serum albumin (BSA) Roche 735 078

Boric acid SBS GB1

dNTP SBS 122707

Dextran sulfat Sigma D8906

ADN sợi đơn (từ tinh trùng cá hồi) Sigma D9156

Ethidium bromide Sigma E7637

Fetal bovine serum (FBS) Sigma F9665

Tween 20 Sigma P5927

Pepsin Sigma P7000

Trypsin Sigma T4799

100bp DNA ladder TaKaRa 3407A



2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chúng tôi xây dựng quy trình thí nghiệm như Hình 9.

Hình 9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.2.1. Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH

2.2.1.1. Phương pháp thiết kế cặp mồi tổng hợp đầu dò

Cặp mồi tổng hợp đầu dò bắt cặp với gen IL–6 được thiết kế dựa trên trình tự

cADN của gen bằng chương trình thiết kế mồi trực tuyến Primer3.

Đánh giá độ đặc hiệu (theo lý thuyết) của cặp mồi: các cặp mồi đã thiết kế được

kiểm tra khả năng tổng hợp sản phẩm với vector chuyển gen và hệ gen gà Gallus

gallus domesticus bằng công cụ tìm kiếm BLAST (Basic Local Alignment

Search Tools) tại cơ sở dữ liệu NCBI (National Centre Biotechnology Infomatic).



2.2.1.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR tổng hợp đầu dò

Trong nghiên cứu này, để xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR,

chúng tôi tiến hành chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp và nồng độ Mg2+ của phản ứng.

Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 6.

Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp của mồi IL–6

Thành phần Nồng độ phản ứng

dATP, dTTP, dCTP, dGTP 0,25 mM

MgCl2 1 – 4 mM

IL6F primer 0,5 mM

IL6R primer 0,5 mM

Taq DNA polymerase 0,1 U/µl

PCR buffer 1 X

Khuôn tổng hợp 0,5 ng/µl

Chu kỳ nhiệt: 94oC trong 7 phút trước chu kỳ đầu tiên

35 chu kỳ biến tính 94oC trong 30 giây

gắn mồi ở gradient nhiệt độ 45–55oC trong 30 giây

tổng hợp 72oC trong 30 giây

72oC trong 7 phút sau chu kỳ cuối cùng

Đánh giá hàm lượng ADN được tổng hợp: (1) điện di sản phẩm PCR trên gel

agarose 1,5%, nhuộm với Ethidium bromide 10 µg/ml trong 10 phút và quan sát

trên máy soi gel, (2) tinh sạch sản phẩm PCR và đo hàm lượng sản phẩm bằng

máy định lượng ADN Biophotometer Plus (Eppendorf).

Đánh giá độ chính xác trình tự của sản phẩm: Sản phẩm PCR được giải trình tự

trên hệ thống Applied Biosystems® 3130 Genetic Analyzer, phân tích bằng phần

mềm BioEdit nhằm đánh giá mức độ tương đồng của sản phẩm PCR với trình tự

đầu dò theo thiết kế.



2.2.1.3. Phương pháp tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR

Thành phần phản ứng PCR: Tương tự các thành phần trong Bảng 6, trong đó

nồng độ Mg2+ được sử dụng theo nồng độ tối ưu đã xác định, nồng độ dTTP

giảm xuống 0,17 mM, bổ sung Alexa Fluor® 568–5–dUTP sao cho nồng độ cuối

cùng là 0,08 mM.

Chu kỳ nhiệt:

94oC trong 7 phút trước chu kỳ đầu tiên


gắn mồi theo nhiệt độ tối ưu trong 60 giây

tổng hợp 72oC trong 60 giây và thêm 2 giây sau mỗi chu kỳ


Kiểm tra sản phẩm: Lấy 3 µl sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1,5%, sau

đó quan sát trực tiếp dưới máy soi mà không nhuộm Ethidium bromide.

Sản phẩm sau tổng hợp được tinh sạch bằng Kit Wizard® SV Gel & PCR Clean–

Up System (Promega) để sử dụng cho phản ứng lai FISH.

2.2.2. Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người

2.2.2.1. Phương pháp phân lập tế bào gốc từ đĩa phôi giai đoạn X

cESCs được phân lập từ đĩa phôi giai đoạn X theo phương pháp của Horiuchi

và cộng sự [32]:

Chuẩn bị giấy tách phôi từ giấy lọc với đường kính trong 0,5 cm, đường kính

ngoài 1,0 cm.

Khử trùng vỏ trứng bằng cồn 70o.

Dùng kéo cắt lớp vỏ đá vôi ở đầu to của quả trứng, tách bỏ phần lòng trắng.

Đưa khối noãn hoàng vào đĩa petri, di chuyển đĩa sao cho phôi nằm ở mặt trên.

Đặt giấy tách phôi lên sao cho bao quanh đĩa phôi.

Dùng kéo cắt quanh viền giấy, tách lấy phôi và chuyển sang đĩa petri có chứa

nước muối sinh lý.

Rửa bằng PBS 2–3 lần để làm sạch noãn hoàng.



Huyền phù hóa tế bào bằng 2 ml môi trường nuôi cấy (thành phần được trình bày

trong Bảng 7), chuyển vào đĩa 35 mm đã phủ gelatin (6–8 phôi/đĩa).

Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, 5% CO2, độ ẩm 90%.

Kiểm tra và thay môi trường cho tế bào 24 giờ sau khi phân lập.

Bảng 7. Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs

Tên hóa chất Nồng độ

Fetal bovine serum 10% (v/v)

Leukemia inhibitor factor 2000 U/ml

Huyết thanh gà 1% (v/v)

Non–essential amino acid 100 μM

β–mercaptoethanol 100 μM

Sodium pyruvate 1 mM

Sodium bicarbonate 45 mM

Penicillin 100 U/ml

Streptomycin 100 μg/ml

Opti–MEM® Thêm đến đủ lượng cần pha

2.2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào tế bào gốc phôi gà

Khi tế bào sinh trưởng đạt khoảng 80–90% bề mặt đĩa nuôi cấy thì có thể tiến

hành chuyển gen.

Lấy đĩa tế bào ra khỏi tủ nuôi cấy, vệ sinh đĩa bằng cồn 70o.

Loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa bằng PBS.

Thêm 0,5 ml Trypsin/EDTA 0,25% vào mỗi đĩa, ủ ở 37oC trong 5 phút.

Bất hoạt trypsin bằng 1 ml môi trường Opti–MEM® + 5% FBS.

Ly tâm ở 200 g trong 10 phút.

Loại bỏ dịch nổi, huyền phù hóa tế bào lắng đáy bằng 0,5 ml Opti–MEM®.



Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, pha loãng bằng Opti–MEM® sao cho đạt

nồng độ 0,5x106 tế bào/ml.

Chuyển huyền phù tế bào sang các ống ly tâm 15 ml (1 ml/ống).

Thêm 107 hạt virus vào mỗi ống (trung bình 20 virus/tế bào).

Ủ ở 37oC trong 15 phút.

Ly tâm 800 g trong 30 phút.

Loại bỏ hoàn toàn dịch nổi.

Huyền phù hóa tế bào lắng đáy bằng 2 ml môi trường nuôi cấy.

Chuyển huyền phù vào đĩa nuôi cấy 35 mm chứa sẵn lớp tế bào nuôi, nuôi ở tủ

37oC, 5% CO2.

Tiến hành thay môi trường sau 24 giờ kể từ khi chuyển gen bằng virus. Những

ngày tiếp theo thay môi trường 2 ngày/lần.

2.2.2.3. Phương pháp cấy chuyển tế bào gốc phôi gà

Khi tế bào sinh trưởng đạt khoảng 80–90% bề mặt đĩa nuôi cấy thì có thể tiến

hành cấy chuyển.

Lấy đĩa tế bào ra khỏi tủ nuôi cấy, vệ sinh đĩa bằng cồn 70o.

Loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa bằng PBS.

Thêm 0,5ml Trypsin/EDTA 0,25% vào mỗi đĩa nuôi cấy, ủ ở 37oC trong 5 phút.

Bất hoạt trypsin bằng 1 ml môi trường Opti–MEM® + 5% FBS.

Ly tâm ở 200 g trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.

Huyền phù hóa tế bào ở đáy bằng 4 ml môi trường nuôi cấy.

Chia đều huyền phù vào hai đĩa nuôi cấy mới chứa sẵn lớp tế bào nuôi, nuôi ở tủ

37oC, 5% CO2.

2.2.2.4. Phương pháp kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào

cESCs sau chuyển gen được phân tích PCR nhằm kiểm tra sự có mặt của gen

chuyển trong tế bào. Cặp mồi IL6–F và IL6–R đã thiết kế ở trên được sử dụng để

khuếch đại đoạn ADN 289 bp của gen IL–6. Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN 321 bp



trong gen ribosome 18S (18S–For: GTC GGC GTC CAA CTT CTT; 18S–Rev:

CGA TCC GAG GAC CTC ACT) cũng được sử dụng làm chứng nội. Các bước

thực hiện như sau:

Thu tế bào cần phân tích, tách ADN hệ gen bằng bộ sản phẩm DNA Isolation Kit

for Cells and Tissues (Roche) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 8.

Bảng 8. Thành phẩn phản ứng PCR phát hiện gen chuyển trong tế bào

Thành phần Nồng độ

Nhân gen 18S Nhân gen IL–6

dATP, dTTP, dCTP, dGTP 0,25 mM 0,25 mM

MgCl2 3 mM 3 mM

18S–For primer 0,5 mM

18S–Rev primer 0,5 mM

IL6–F primer 0,5 mM

IL6–R primer 0,5 mM

Taq DNA polymerase 0,1 U/µl 0,1 U/µl

PCR buffer 1 X 1 X

Khuôn tổng hợp 2 ng/µl 2 ng/µl

Chu kỳ nhiệt: 94oC trong 7 phút trước chu kỳ đầu tiên


gắn mồi ở nhiệt độ tối ưu trong 30 giây

tổng hợp 72oC trong 30 giây


Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% ở 100 V, 400 mA trong 40 phút.



Nhuộm bản gel điện di bằng Ethidium bromide 10 g/ml trong 10 phút, tráng

nước rồi quan sát và chụp ảnh, phân tích kết quả.

2.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

Chuẩn bị hóa chất:

Đệm SSC (Saline – sodium citrate buffer) 20X: Hòa tan 87,6 gam sodium

chloride và 44,1 gam sodium citrate trong 450 ml nước cất, thêm nước đến đủ

500 ml, chuẩn pH bằng HCl cho đến khi đạt pH 7.

Đệm SSC 2X.

Dung dịch RNase nồng độ 100 µg/ml pha trong SSC 2X.

Ethanol lạnh ở các nồng độ 70%, 80%, 90%, 95%, 100%.

Hybridization Buffer: formamide 50% (v/v), SDS 0,1% (w/v), dextran sulfate

10% (w/v), đầu dò 5 ng/µl, ADN sợi đơn tinh trùng cá hồi 300 ng/ml, pha trong

SSC 2X.

Wash Buffer: formamide 20% (v/v) pha trong SSC 0,1X.

Detection Buffer: Tween 20 nồng độ 0,2% (v/v) pha trong SSC 4X.

Blocking Buffer: BSA 5% (w/v) pha trong Detection Buffer.

Dung dịch HCl 10mM.

Pepsin 40 U/ml pha trong HCl 10 mM.

DAPI 2 µg/ml pha trong PBS.

Xử lý tế bào trước khi lai:

Thu tế bào bằng cách xử lý trypsin và ly tâm, huyền phù hóa trong PBS với nồng

độ cuối cùng là 2x106 tế bào/ml.

Chuyển huyền phù tế bào lên lam kính đã xử lý ethanol (20 µl huyền phù/lam),

trải đều tế bào lên diện tích khoảng 20x20 mm trên lam.

Định hình bằng dung dịch cố định (methanol và acetic acid với tỷ lệ tương ứng

3:1) trong 1 phút, để khô tự nhiên.

Ủ mẫu với 200µl dung dịch RNase 100 µg/ml trong 1 giờ ở 37oC.



Rửa hai lần qua SSC 2X, mỗi lần 5 phút.

Xả nhanh qua HCl 10 mM.

Ủ lam kính với 200 μl pepsin trong 10 phút ở 37oC.

Xả nhanh qua nước cất khử ion.

Loại nước bằng dãy nồng độ cồn 70%, 80%, 90%, 95% (mỗi lần 2 phút) và

100% (5 phút).

Để khô bằng cách đưa vào tủ ấm 60oC trong 60 phút, hoặc để qua đêm ở nhiệt độ

phòng.

Tiến hành lai:

Biến tính Hybridization Buffer ở 70oC trong 10 phút, chuyển nhanh lên đá.

Chuyển 15µl dung dịch lai lên vị trí cần lai trên lam kính, đậy lamen nhựa, gắn

keo để tránh bay hơi dung dịch.

Biến tính lam ở 70oC trong 5 phút.

Lai ở 65oC qua đêm, lắc trên máy lắc với tốc độ 50 vòng/phút.

Hạ dần nhiệt độ xuống 37oC, để ổn định mẫu ở 37oC trong 1 giờ.

Phát hiện

Rửa lam qua SSC 2X để loại bỏ lamen nhựa.

Rửa hai lần bằng Wash Buffer ở 40oC, mỗi lần 5 phút.

Rửa lần lượt qua SSC 0,1X và 2X ở 40oC, mỗi lần 10 phút.

Đưa lam kính về nhiệt độ phòng.

Cân bằng tiêu bản trong Detection Buffer với thời gian 5 phút.

Ủ lam với Blocking Buffer trong 20–30 phút.

Rửa lại bằng SSC 2X trong 5 phút.

Nhuộm DAPI trong 10 phút.

Rửa lại bằng cách xả từ từ qua PBS.

Gắn lamen và phân tích kết quả trên kính hiển vi huỳnh quang.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận


Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR

3.1.1. Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 6

3.1.1.1. Kết quả thiết kế cặp mồi bằng chương trình Primer3

Nhằm tổng hợp và đánh dấu đầu dò cho phản ứng FISH, ba phương pháp

thường được sử dụng là dịch chuyển điểm đứt (nick translation), kéo dài mồi ngẫu

nhiên (random primed) và PCR. Phương pháp PCR được lựa chọn trong nghiên cứu

này với những ưu điểm như độ đặc hiệu, độ nhạy cao hơn, hiệu suất tổng hợp lớn,

đồng thời dễ dàng kiểm soát kích thước đầu dò [59]. Trong phản ứng PCR, mồi

(primer) đóng vai trò quyết định, là nơi enzyme Taq polymerase bám và tổng hợp

sợi ADN mới dựa trên trình tự mạch khuôn. Độ đặc hiệu của cặp mồi phụ thuộc vào

nhiều yếu tố như kích thước, nhiệt độ tách mồi, thành phần nucleotide,... Kích thước

mồi thường từ 18–30 nucleotide, có thể dài hơn hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào độ

dài đoạn gen đích. Tỷ lệ GC tối ưu của mồi thường được lựa chọn trong khoảng 50-

60% để đảm bảo sự liên kết bền vững với ADN khuôn. Nhiệt độ biến tính (melting

temperature – Tm) thể hiện độ bền cấu trúc sợi đôi giữa mồi và ADN đích, có giá trị

tối ưu trong khoảng 52–58oC, tỷ lệ thuận với thành phần GC. Mồi được lựa chọn

cũng cần đảm bảo không tạo thành cấu trúc bậc hai (tự cuộn gấp), không tự bắt cặp

cũng như không bắt cặp với mồi khác (dimer hóa), không lặp lại các base cùng loại

nhiều hơn ba lần liên tiếp. Khoảng cách giữa hai mồi trên chuỗi đích (độ dài đoạn

được khuếch đại) tương đối ngắn, thường không vượt quá 2kb [11, 17].

Chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu với cADN của gen IL–6 người

sử dụng chương trình Primer3 – một trong những chương trình thiết kế mồi tương

đối dễ sử dụng và tốt nhất hiện nay [11]. Độ dài đoạn khuếch đại được giới hạn

trong khoảng 300 bp để đánh dấu huỳnh quang với cường độ đủ phát hiện dưới kính

hiển vi quang học. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng PCR như

đã nêu trên đều được xem xét đến. Kết quả đã thu được năm cặp mồi có thể được sử

dụng để tổng hợp đầu dò được trình bày trong Bảng 9. Cặp mồi thứ nhất (có chất



lượng tốt nhất theo đánh giá của chương trình Primer3) được lựa chọn để tiếp tục

nghiên cứu.

Bảng 9. Kết quả thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3

STT Trình tự Tm (oC)

% GC

Vị trí bắt cặp

Kích thước sản phẩm

1 F: TGC TCC TGG TGT TG 46,2 57,1 53–67

289 R: TTC ACC AGG CAA GT 44,6 50,0 327–341

2 F: CTG CTC CTG GTG TTG 48,1 60,0 52–67


3 F: GCT CCT GGT GTT GC 48,1 64,3 54–68


4 F: GCT GCT CCT GGT GT 47,4 64,3 51–65


5 F: CTC CTT CTC CAC AAG C 48,9 56,2 6–22


3.1.1.2. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu mồi

Kiểm tra độ đặc hiệu với cADN của gen IL–6

Chúng tôi sử dụng công cụ Nucleotide – BLAST (BLASTn) để đánh giá độ

đặc hiệu (về lý thuyết) của cặp mồi được lựa chọn. Công cụ này cho phép tìm kiếm

các chuỗi ADN gần giống nhất với trình tự mà người dùng chỉ định.

Trình tự được chỉ định có nguồn gốc từ hệ gen người (Homo sapiens), thông

tin mARN thể hiện cặp mồi kiểm tra được thiết kế dựa trên trình tự cADN của gen

IL–6. “Score” là số điểm tương đồng giữa hai trình tự so sánh và “Expect” thể hiện

số lượng các trình tự khác tương đồng với mồi được kiểm tra. Hai thông số này

thường được quan tâm khi kiểm tra cặp mồi khuếch đại trình tự trong hệ gen: nếu

“Score” càng cao và “Expect” càng thấp thì mức độ đặc hiệu càng cao. Trong

nghiên cứu của chúng tôi, hai giá trị này không có ý nghĩa đánh giá vì cặp mồi được



sử dụng cho gen chuyển IL–6 người trong tế bào gà. Cả hai mồi đều cho mức độ

tương đồng đạt 100% (Identities = 14/14), trong đó mồi IL6–F cùng chiều (Strand =

Plus/Plus) còn mồi IL6–R ngược chiều (Strand = Plus/Minus) với trình tự mARN

(Hình 10).

Hình 10. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với cADN của gen IL–6

Thông tin về vị trí liên kết của mồi với trình tự chỉ định cho thấy vị trí bắt

cặp của các mồi IL6–F và IL6–R với mARN lần lượt là 169–182 và 444–457 trên

phân tử mARN. Mặt khác, cADN bắt cặp ở vị trí 117–755 của mARN (Hình 11).

Từ đây, có thể xác định được vị trí bắt cặp của cặp mồi với cADN tương ứng là 53–

67 (IL6–F) và 327–341 (IL6–R).

Kết quả kiểm tra hoàn toàn phù hợp với dự tính khi thiết kế bằng Primer3.

Như vậy cặp mồi được thiết kế có độ đặc hiệu và độ nhạy cao với gen chuyển IL–6.

Với cặp mồi này, đoạn đầu dò tổng hợp được có trình tự như sau:

1–

51–

101–

151–

201–

251–

TGCTCCTGGT GTTGCCTGCT GCCTTCCCTG CCCCAGTACC CCCAGGAGAA

GATTCCAAAG ATGTAGCCGC CCCACACAGA CAGCCACTCA CCTCTTCAGA

ACGAATTGAC AAACAAATTC GGTACATCCT CGACGGCATC TCAGCCCTGA

GAAAGGAGAC ATGTAACAAG AGTAACATGT GTGAAAGCAG CAAAGAGGCA

CTGGCAGAAA ACAACCTGAA CCTTCCAAAG ATGGCTGAAA AAGATGGATG

CTTCCAATCT GGATTCAATG AGGAGACTTG CCTGGTGAA –289

– 50

–100

–150

–200

–250



Hình 11. Kết quả xác định vị trí tương đồng giữa cADN và mARN gen IL–6

cADN bắt cặp ở vị trí 117–755 của mARN. Các mồi IL6–F và IL6–R bắt cặp ở các vị trí

169–182 và 444–457 trên phân tử mARN, tương ứng với các vị trí 53–67 và 327–341 của

phân tử cADN.

Kiểm tra khả năng bắt cặp của trình tự đầu dò (theo lý thuyết) với vector

chuyển gen

Trong nghiên cứu này, gen IL–6 người được chuyển nhiễm vào tế bào gốc

phôi gà thông qua vector pLenti6/V5–DEST (Gateway). Khi vector được đưa vào



trong tế bào và hoạt động, toàn bộ phân đoạn ADN nằm giữa 2 trình tự LTR được

chèn vào nhiễm sắc thể tế bào đích. Vì vậy, đầu dò được tổng hợp phải bắt cặp với

vector tại vị trí duy nhất nằm trong gen IL–6 để đảm bảo tính đặc hiệu trong phản

ứng lai FISH.

Hình 12. Kết quả kiểm tra vị trí chèn của gen IL–6 trên vector

Vector mang gen chuyển có kích thước 7722 nucleotide. Trình tự cADN

được kiểm tra với trình tự vector để xác định vị trí cài nhập của gen vào vector bằng

công cụ BLASTn, kết quả cho thấy gen IL–6 được chèn ở vị trí 2485 – 3123 của

vector (Hình 12). Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của đầu dò (tổng hợp từ cặp



mồi đã thiết kế) với vector chuyển gen chứng minh đầu dò bắt cặp vector ở vị trí

duy nhất 2537–2835 của vector (Hình 13). Như vậy đoạn đầu dò chỉ tương đồng với

trình tự gen chuyển mà không có khả năng bắt cặp với bất kỳ trình tự nào khác trên

vector.

Hình 13. Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của đầu dò trên vector

Đầu dò bắt cặp vector ở vị trí duy nhất 2537–2835 trên vector chuyển gen, nằm trong gen

chuyển IL–6 (2485 – 3123 của vector).

Kiểm tra khả năng bắt cặp của đầu dò với hệ gen tế bào gà

Phản ứng lai huỳnh quang sử dụng đầu dò được thực hiện với tế bào gốc

phôi gà (chicken Embryonic Stem Cells – cESCs), vì vậy để đảm bảo tính đặc hiệu

thì yêu cầu với đầu dò là không bắt cặp với hệ gen gà. Kết quả kiểm tra bằng

BLASTn cho thấy đầu dò được tổng hợp từ cặp mồi lựa chọn đáp ứng được yêu cầu

đó (Hình 14).

Những kết quả về mặt lý thuyết ở trên đã cho thấy cặp mồi được lựa chọn

hoàn toàn phù hợp cho mục đích phát hiện gen chuyển IL–6 người trong hệ gen gà.

Cặp mồi đều có kích thước 14 bp, đặc hiệu với cADN của gen, đoạn ADN được

khuếch đại dài 289 bp, bắt cặp với vector tại vị trí duy nhất nằm trong gen chuyển



và không tương đồng với hệ gen gà. Cặp mồi này được đặt tổng hợp tại hãng

Intergrated DNA Technologies (IDT – Hàn Quốc) để phục vụ cho những nghiên

cứu tiếp theo.

Hình 14. Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp giữa đầu dò với hệ gen gà

bằng BLASTn

3.1.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR

Trong nghiên cứu này, hai thông số được tối ưu hóa là nhiệt độ bắt cặp mồi

và nồng độ ion Mg2+. Nhiệt độ bắt cặp mồi (Annealing template – Ta) là nhiệt độ

cho phép mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn, thường lớn hơn nhiệt độ biến tính

mồi (Tm) khoảng 5 – 10oC. Cặp mồi được thiết kế có Tm = 44,6–46,2oC nên chúng

tôi tiến hành thử nghiệm với các giá trị Ta trong khoảng 45oC – 55oC. Thông số

được tối ưu hóa thứ hai là nồng độ Mg2+, có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Taq

DNA polymerase, từ đó ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của phản ứng. Nồng độ Mg2+

cao làm tăng độ đặc hiệu nhưng lại làm giảm hiệu suất phản ứng, trong khi giá trị

này thấp làm tăng sản phẩm không đặc hiệu. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên

khoảng nồng độ Mg2+ từ 1,00 – 4,00 mM (các phản ứng PCR thường sử dụng trong

khoảng này).

Đánh giá hiệu suất phản ứng PCR

Các mẫu sản phẩm PCR được định lượng ADN khuếch đại bằng máy đo

Biophotometer Plus (Eppendorf). Kết quả phân tích thể hiện trên Hình 15 (xem



thêm Phụ lục 1). Khi nồng độ Mg2+ tăng dần (1,00–3,25 mM), lượng sản phẩm

được khuếch đại càng nhiều, nhưng khi nồng độ Mg2+ lên quá cao (4,00 mM) thì

phản ứng PCR bị ức chế, lượng sản phẩm thu được ít hơn. Nhiệt độ gắn mồi Ta =

49,3oC cho kết quả khuếch đại ADN tốt nhất trong các nhiệt độ được thử nghiệm.

Trong tất cả các mẫu sản phẩm PCR, mẫu được tổng hợp với nồng độ Mg2+ 3,25

mM và Ta = 49,3oC có hàm lượng ADN cao nhất (1.445 ± 253 ng/μl).

Hình 15. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi và nồng độ ion Mg2+ tới hiệu suất

phản ứng PCR

Thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn. Mẫu được tổng hợp ở điều kiện Ta = 49,3oC, Mg2+

3,25 mM có hàm lượng ADN lớn nhất (1.445 ± 253 ng/μl).

Đánh giá độ chính xác trình tự của sản phẩm PCR

Ngoài việc thu được lượng sản phẩm lớn, yêu cầu quan trọng trong việc tổng

hợp đầu dò là đoạn được khuếch đại phải đảm bảo có trình tự chính xác. Vì vậy

chúng tôi thu một số mẫu sản phẩm PCR có hàm lượng ADN được khuếch đại khác

nhau để tiến hành giải trình tự nucleotide: nồng độ Mg2+ 1,75 mM và 3,25 mM, mỗi

nồng độ đó chọn hai mẫu với Ta có giá trị 45,9oC và 49,3oC. Kết quả được phân tích

bằng chương trình BioEdit và so sánh với trình tự gốc sử dụng chương trình Ape

plasmid editor – APE.



Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy các sản phẩm PCR đều có trình tự

tương đồng cao với trình tự đầu dò theo lý thuyết. Mặc dù vậy, các mẫu đó cho mức

độ tín hiệu khác nhau khá rõ rệt: sản phẩm tổng hợp ở nồng độ Mg2+ 3,25 mM, Ta =

49,3oC cho tín hiệu rõ nét nhất, độ nhiễu thấp; các mẫu còn lại có độ nhiễu cao hơn

hoặc tín hiệu không rõ bằng, trong đó sản phẩm tổng hợp ở nồng độ Mg2+ 3,25 mM,

Ta = 49,3oC (Hình 16, xem thêm Phụ lục 2).

Hình 16. Kết quả giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR và so sánh với trình tự đầu dò theo lý thuyết

(A) Kết quả giải trình tự nucleotide các mẫu sản phẩm PCR ở một số điều kiện tổng hợp

khác nhau; (B) Kết quả so sánh các trình tự đó với trình tự đầu dò theo lý thuyết.



Từ những phân tích trên, kết hợp kết quả tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR,

chúng tôi xác định nhiệt độ gắn mồi 49,3oC và nồng độ Mg2+ 3,25 mM là điều kiện

tốt nhất cho phản ứng khuếch đại với cặp mồi đã thiết kế. Sản phẩm PCR thu được

có hàm lượng ADN cao, trình tự nucleotide chính xác so với trình tự khuôn mẫu,

đáp ứng được yêu cầu làm đầu dò cho phản ứng lai FISH.

3.1.3. Kết quả tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR

Đầu dò được tổng hợp bằng phương pháp PCR trong đó thành phần phản

ứng được bổ sung thêm Alexa Fluor® 568–5–dUTP (phát huỳnh quang màu đỏ) sao

cho tỷ lệ dUTP : dTTP = 2:1. Trong phản ứng PCR, giai đoạn tổng hợp ở 72oC

được cài đặt diễn ra trong 60 giây ở chu kỳ đầu tiên và tăng thêm 2 giây sau mỗi

chu kỳ để tăng hiệu quả gắn dUTP (mang cấu trúc Alexa Fluor® 568 khá cồng

kềnh). Sản phẩm sau khi điện di được quan sát dưới máy soi gel Cleaver UV

Transilluminator mà không nhuộm Ethidium bromide, kết quả thể hiện ở Hình 17.

Hình 17. Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò

(–) Đối chứng âm; (1),(3) khuôn tổng hợp là vector chuyển gen; (2) khuôn tổng hợp là

ADN hệ gen gà. Sản phẩm chạy ở giếng (3) được tổng hợp với dNTP bổ sung Alexa

Fluor® 568–5–dUTP và không nhuộm Ethidium bromide trước khi điện di.

Kết quả điện di cho thấy chỉ có một băng duy nhất với kích thước 289 bp

(xấp xỉ băng 300 bp của thang chuẩn) được khuếch đại khi sử dụng khuôn là vector



pLenti6/V5–DEST đã chèn gen IL–6 (giếng 1), ngoài ra không phát hiện được bất

kỳ băng nào khác khi sử dụng khuôn là ADN hệ gen gà (giếng 2). Kết quả này chỉ

ra tính đặc hiệu của cặp mồi được chúng tôi thiết kế. Bên cạnh đó, mẫu tổng hợp sử

dụng Alexa Fluor® 568–5–dUTP thu được băng duy nhất có kích thước tương

đương và độ sáng đủ quan sát bằng mắt thường mà không thông qua các thuốc

nhuộm đặc hiệu (giếng 3), chứng tỏ sản phẩm đã được đánh dấu với cường độ

huỳnh quang tương đối lớn (Hình 17). Sản phẩm này sau đó được tinh sạch bằng

Kit Wizard® SV Gel & PCR Clean–Up System (Promega) để chuẩn bị cho những

nghiên cứu tiếp theo.

3.2. THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI

3.2.1. Phân lập và nhân nuôi tế bào gốc phôi gà

Động lực chính thúc đẩy việc phân lập và nuôi cấy cESCs là hy vọng rằng

chúng có thể được sử dụng để tạo ra gia cầm chuyển gen nhằm tận dụng ưu thế của

việc tạo lượng lớn protein albumin trong lòng trắng trứng. Năm 1970, Marzullo là

người đầu tiên chuyển cESCs tới đĩa phôi khác và chỉ ra rằng sau 14 ngày ấp, một

số tế bào đã hợp nhất vào phôi nhận. Hai thập kỷ sau, Petitte và cộng sự đã chứng

minh rằng kỹ thuật đó có thể được sử dụng nhằm tạo ra các cơ thể khảm dòng sinh

dục [68].

Chúng tôi tiến hành phân lập cESCs từ đĩa phôi giai đoạn X (0 giờ ấp) theo

phương pháp của Horiuchi và cộng sự [32] (ở giai đoạn này phôi chứa khoảng

40.000–60.000 tế bào, đây là những tế bào gốc đa tiềm năng). Tế bào sau khi phân

lập được huyền phù hóa bằng môi trường nuôi cấy và chuyển vào các đĩa nuôi cấy

đường kính 35 mm đã phủ gelatin (khoảng 0,3 x 106 tế bào/đĩa), duy trì trong tủ ấm

37oC, 5% CO2, độ ẩm 90%. Sau 24 giờ nuôi cấy, cESCs đã bám dính tốt vào đáy

đĩa nuôi cấy và kết hợp với nhau thành quần lạc ESC với những đặc điểm hình thái

đặc trưng: tế bào tròn, nhân lớn, chiếm hầu hết tế bào chất, các tế bào liên kết không

chặt chẽ với nhau. cESCs lúc này là tập hợp của ba loại tế bào có kích thước khác



nhau: lớn, trung bình và nhỏ (Hình 18). Những đặc điểm này tương đồng với các

công bố trước đây về cESCs nhân nuôi in vitro [64, 69, 88].

Hình 18. cESCs 24 giờ nuôi cấy in vitro sau khi phân lập

Trong những điều kiện nuôi cấy cụ thể, bổ sung các yếu tố tăng trưởng

(Bảng 7) cũng như có sự góp mặt của lớp tế bào nuôi, cESCs có khả năng duy trì in

vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được đặc điểm đa tiềm năng [45, 64]. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nguyên bào sợi thai chuột (đã bị bất hoạt phân

bào bằng Mitomycin C 10 μg/ml) để nuôi cấy cESCs. Những nghiên cứu trước đây

trên thế giới cũng như tại phòng thí nghiệm của chúng tôi đã chứng minh loại tế bào

này có khả năng hỗ trợ ESCs tốt nhất [1, 24, 69]. Khi đó cESCs có xu hướng xâm

lấn xuống dưới lớp tế bào nuôi và bám trực tiếp vào bề mặt đĩa nuôi cấy (Hình 19),

điểm này khá tương đồng với kết quả nghiên cứu trước đây của Pettite và cộng sự

[69]. Hiện tại chúng tôi đã duy trì được cESCs qua 28 ngày nuôi cấy với ba lần cấy

chuyển mà vẫn giữ được những đặc điểm của tế bào gốc phôi. Việc duy trì cESCs

in vitro trong thời gian dài mà vẫn giữ được trạng thái đa tiềm năng có ý nghĩa lớn

trong việc hình thành cơ thể khảm khi tiêm chúng vào phôi nhận, tiền đề cho việc

tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc.



Hình 19. cESCs nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi

(A) Nguyên bào sợi thai chuột đã bất hoạt phân bào trước khi được sử dụng làm tế bào

nuôi; (B) Quần lạc cESCs ở lần cấy chuyển thứ hai (F2) sinh trưởng trên lớp tế bào nuôi.

3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phôi gà chuyển gen

Trong nghiên cứu này, vector có nguồn gốc lentivirus là pLenti6/V5–DEST

(Gateway) đã chèn gen IL–6 người được lựa chọn sử dụng. Khi tế bào sinh trưởng

có độ che phủ trên 90% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy thì được thu nhận để thực hiện

chuyển gen. Những tế bào này được phân tách bằng trypsin và thu nhận bằng ly

tâm, sau đó được ủ cùng các hạt virus (trung bình 20 virus/tế bào). Tế bào sau



chuyển gen được cấy vào đĩa nuôi cấy đường kính 35 mm (có sẵn lớp tế bào) với

mật độ 0,5x106 tế bào/đĩa, nuôi bằng môi trường nuôi cấy tương ứng trong tủ ấm

37oC, 5% CO2, độ ẩm 90%.

Ngoài ra, một đĩa tế bào không qua xử lý lentivirus được nuôi cấy song song

làm đối chứng nhằm đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới cESCs. Cả hai đĩa tế bào

đều được quan sát hằng ngày và so sánh dưới kính hiển vi soi ngược. Kết quả đánh

giá cho thấy: tế bào được xử lý cùng virus cũng như đối chứng vẫn phát triển bình

thường, không xuất hiện các tế bào chết nổi trên bề mặt, cESCs vẫn giữ được những

đặc điểm hình thái của tế bào gốc đa tiềm năng (Hình 20). Kết quả này bước đầu

chứng minh được vector lentivirus hầu như không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của

cESCs. Tuy nhiên để có kết luận chính xác cần những nghiên cứu sâu hơn nữa.

Hiện nay chúng tôi đã thu nhận và bảo quản lạnh sâu được năm quần thể cESCs sau

chuyển nhiễm để tiếp tục sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 20. Đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới sự sinh trưởng của cESCs

cESCs được thâm nhiễm vector lentivirus và đối chứng được nuôi cấy hoàn toàn tương tự

và so sánh khả năng sinh trưởng. Các tế bào ở cả hai trường hợp đều không có sự khác



biệt nhau đáng kể ở cả thế hệ F0 và F2, sinh trưởng bình thường, duy trì các đặc điểm đặc

trưng của tế bào gốc đa tiềm năng.

3.2.3. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR

Trong nghiên cứu này, cặp mồi IL6–F và IL6–R đã thiết kế (sản phẩm

khuếch đại 289 bp) được sử dụng để kiểm tra sự có mặt gen IL–6 trong các mẫu tế

bào sau chuyển nhiễm. Đồng thời, cặp mồi khuếch đại đoạn ADN kích thước 321

bp trong gen ribosome 18S cũng được sử dụng làm chứng nội. Kết quả điện di sản

phẩm PCR các mẫu tế bào chuyển gen thể hiện ở Hình 21. Các mẫu tế bào chuyển

gen xuất hiện cả hai băng có kích thước 289 bp (IL–6) và 321 bp (18S), trong khi

mẫu đối chứng chỉ quan sát được một băng duy nhất của gen 18S.

Hình 21. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen

(18S) Sản phẩm khuếch đại gen 18S; (IL–6) Sản phẩm khuếch đại gen chuyển IL–6; (–)

Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương; (M) Thang chuẩn; (ĐC) Mẫu tế bào đối chứng

không được chuyển nhiễm; (E1101, E1102, E1203) Các mẫu tế bào được chuyển gen.

Để kiểm tra gen chuyển có được duy trì ổn định qua các thế hệ tế bào hay

không, chúng tôi thực hiện phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen qua mỗi lần

cấy chuyển. Kết quả kiểm tra cho thấy, sau hơn 20 ngày nuôi cấy với 3 lần cấy

chuyển, gen chuyển vẫn được duy trì ổn định trong hệ gen của cESCs. Tất cả các

mẫu tế bào chuyển gen và trải qua các lần cấy chuyển đều cho kết quả dương tính

với phản ứng PCR.



Hình 22. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào qua các lần cấy chuyển

(18S) Sản phẩm khuếch đại gen 18S; (IL–6) Sản phẩm khuếch đại gen chuyển IL–6; (–)

Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương; (M) Thang chuẩn; (ĐC) Mẫu tế bào đối chứng

không được chuyển nhiễm; (E1203: F1, F2, F3) Mẫu tế bào E1203 trải qua lần lượt 3 lần

cấy chuyển.

Vector pLenti6/V5-DEST không thể nhân lên trong tế bào chất của cESCs.

Bên cạnh tâm tái bản trong E. coli, vector chứa tâm tái bản của Simian vacuolating

virus 40 (SV40 origin), hoạt động trên các loại tế bào người và khỉ biểu hiện mạnh

kháng nguyên T lớn SV40 (như COS–7, 293T) và một số dòng tế bào chuột (như

CHO) [70]. Đến nay chưa có báo cáo nào về hoạt động của SV40 origin trên tế bào

những loài khác. Ngoài ra, cESCs được phân tích PCR đã trải qua quá trình nuôi

cấy dài ngày, ADN được tách bằng kit cung cấp bởi hãng Roche đặc hiệu với ADN

hệ gen. Vì vậy, bước đầu có thể khẳng định băng 289 bp được phát hiện trong các

phản ứng PCR do gen IL–6 đã chèn vào ADN trong nhân tế bào.

3.3. KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs

Tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 được gắn lên lam, xử lý qua RNase và

pepsin, sau đó ủ cùng 10 µl Hybridization Buffer (chứa 5 ng/µl đầu dò), biến tính ở

70oC trong 10 phút và lai ở 65oC qua đêm. Sau khi lai, tiêu bản được hạ từ từ nhiệt

độ xuống 37oC, rửa qua Wash Buffer (chứa formamide 20% để biến tính các đoạn

lai không đặc hiệu) và SSC 2x, tiếp tục ủ cùng Detection Buffer (BSA 5%; Tween

20 nồng độ 0,2%; pha trong SSC 4X) trong 30 phút. Các mẫu được nhuộm DAPI 2



µg/ml trong 10 phút trước khi phân tích bằng kính hiển vi huỳnh quang Axioplan 2

(Carl Zeiss).

Hình 23. Kết quả lai FISH trên tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người (ĐC) Mẫu đối chứng; (TN) mẫu chuyển gen E110–F2. Nhân tế bào được nhuộm với DAPI

bắt màu xanh lam. Các vị trí bắt cặp đặc hiệu giữa đầu dò đánh dấu Alexa Fluor® 568 và

ADN đích có màu đỏ (vị trí mũi tên).

Tín hiệu huỳnh quang thu được thể hiện ở Hình 23. Nhân tế bào bắt màu với

thuốc nhuộm DAPI có màu xanh lam. Ở mẫu thí nghiệm có những tế bào chứa vị trí

ADN trong nhân tế bào bắt cặp với đầu dò cho tín hiệu huỳnh quang màu đỏ. Kết

quả này cho thấy mẫu thí nghiệm đã được phát hiện gen chuyển IL–6 bằng đầu dò



đặc hiệu gắn Alexa Fluor® 568, đồng thời gen đã được đưa vào nhân tế bào. Có thể

dễ dàng nhận thấy các vị trí này phát tín hiệu với cường độ không đồng đều, nguyên

nhân có thể giải thích do số lượng Alexa Fluor® 568–5–dUTP được gắn vào các

đầu dò không giống nhau.

3.4. THẢO LUẬN

Trong thời gian gần đây, gà chuyển gen là đối tượng nhận được nhiều sự

quan tâm của các nhà khoa học trong ứng dụng sản xuất các protein tái tổ hợp.

Nhiều sinh phẩm có nguồn gốc từ người đã được nghiên cứu tạo ra trên gà với mục

đích ứng dụng điều trị bệnh, như hormone FSH, kháng thể đơn dòng miR24,

interferon β–1a, interferon α–2a ,… [28, 52]. Ở Việt Nam, ứng dụng công nghệ

chuyển gen trên động vật là hướng nghiên cứu còn mới mẻ, những kết quả đạt được

còn rất hạn chế do yêu cầu đầu tư về kỹ thuật và cơ sở vật chất. Các thành tựu về gà

chuyển gen mới chỉ được công bố bởi nhóm nghiên cứu của cố GS. TS. Nguyễn

Mộng Hùng và TS. Nguyễn Lai Thành (ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội).

Đề tài khoa học trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển

gen tạo ra động vật sản xuất protein dược liệu” đã thu được những thành công bước

đầu trong việc ứng dụng một số phương pháp chuyển gen trên gà để tạo ra protein

tái tổ hợp ở lòng trắng trứng [2, 10]. So với phương pháp thông qua tinh trùng và vi

tiêm trực tiếp ADN vào đĩa phôi giai đoạn X, tạo gà chuyển gen dựa trên tế bào gốc

phôi có ưu điểm là lựa chọn được biến đổi di truyền không gây hại từ trước khi tạo

thành cơ thể khảm, do đó tiết kiệm thời gian cũng như chi phí cho quá trình tạo

dòng [25].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập và nhân nuôi cESCs từ đĩa phôi

giai đoạn X. Những tế bào này thể hiện những đặc điểm hình thái đặc trưng khi nuôi

cấy in vitro: tế bào tròn với nhân lớn, liên kết không chặt chẽ với nhau tạo thành

quần lạc tương tự như ESCs ở nhiều loài động vật có vú khác. Nguyên bào sợi thai

chuột cũng được sử dụng để làm lớp tế bào nuôi, đây là loại tế bào có khả năng hỗ

trợ ESCs tăng sinh không biệt hóa trong thời gian dài. Hiện nay cESCs đã được duy



trì qua 28 ngày nuôi cấy với 3 lần cấy chuyển mà vẫn giữ được những đặc điểm đặc

trưng của tế bào gốc đa tiềm năng.

Khi nghiên cứu biến đổi di truyền cESCs cần chú ý đến các hệ thống vector

đủ mạnh để chuyển gen mong muốn với hiệu suất cao và duy trì ổn định trong cơ

thể vật chủ. Trước đây, chúng tôi đã thử nghiệm sử dụng các kỹ thuật vật lý (xung

điện) và hóa chất (Lipofectamine™ 2000) để chuyển gen EGFP vào cESCs, trong

đó gen chuyển đã được phát hiện trong tế bào bằng phản ứng PCR, cũng như biểu

hiện thành sản phẩm phát huỳnh quang màu xanh lá cây (kết quả chưa công bố).

Tuy nhiên, hiệu suất thu được khá thấp, đồng thời xung điện ảnh hưởng lớn tới sức

sống và sự sinh trưởng của tế bào. Ngoài ra, quá trình sàng lọc trong thời gian dài

ảnh hưởng tới khả năng hội nhập của những tế bào này khi tiêm vào phôi nhận

(người ta chưa ghi nhận trường hợp nào cESCs nuôi cấy quá một tuần có khả năng

tạo cơ thể khảm dòng sinh dục [51]). Trong nghiên cứu này, vector được sử dụng là

pLenti6/V5–DEST (có nguồn gốc lentivirus) đã chèn gen IL–6 người. Đây là vector

có khả năng chuyển gen cao và ổn định đối với cESCs, tất cả các mẫu cESCs được

chuyển nhiễm đều dương tính với phản ứng PCR, đồng thời gen chuyển vẫn được

phát hiện trong những mẫu đã trải qua gần 30 ngày nuôi cấy với 3 lần cấy chuyển.

Ngoài ra, chúng tôi đã tiêm những tế bào này vào phôi nhận, kết quả phân tích PCR

cho thấy gen ngoại lai vẫn được duy trì trong cơ thể gà con [6]. Bên cạnh đó, thực

nghiệm cho thấy vector này khá an toàn khi sử dụng, ít ảnh hưởng tới tế bào, đồng

thời là những vector tái bản thiếu nên không tạo thành virus có hại. Vì vậy, đây thực

sự là công cụ chuyển gen đầy tiềm năng.

Để tạo gà chuyển gen, quá trình sàng lọc tế bào biến đổi di truyền như mong

muốn đóng vai trò rất quan trọng. Gen chuyển cần được cài vào ADN trong nhân tế

bào để có thể truyền lại cho thế hệ sau, đồng thời phải được duy trì bền vững qua

nhiều thế hệ cơ thể. Hơn nữa, gen ngoại lai phải nằm ở vị trí thích hợp: trong vùng

ADN hoạt động, nhưng không được chèn vào giữa gen cấu trúc hay các vùng ADN

giữ chức năng điều hòa,... Thực tế, chúng tôi đã vi tiêm những tế bào trên vào phôi

nhận, tuy nhiên kết quả thu được rất hạn chế: phôi thường chết ở giai đoạn sớm của



quá trình phát triển, chỉ có khoảng 10% trong số đó nở thành gà con, nguyên nhân

có thể do những lý do trên, khiến sức sống của phôi bị ảnh hưởng [6] (xem thêm

Phụ lục 3).

Để xác định vị trí gen chuyển trong cESCs, chúng tôi lựa chọn sử dụng kỹ

thuật FISH. Nó có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, đặc hiệu và tốc độ tiến hành khá

nhanh, nên trở thành trở thành công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu cơ bản cũng

như chẩn đoán và điều trị [12, 37]. Sử dụng kỹ thuật FISH ở kỳ trung gian của quá

trình nguyên phân, chúng tôi đã phát hiện được gen IL–6 trong nhân tế bào thông

qua tín hiệu huỳnh quang quan sát được dưới kính hiển vi. Phát triển từ nghiên cứu

này, chúng tôi đang thử nghiệm thực hiện phản ứng lai ở kỳ giữa nguyên phân

nhằm xác định vị trí chính xác của gen chuyển trên nhiễm sắc thể cESCs. Thành

công của hướng đi này sẽ tạo tiền đề cho việc dự đoán ảnh hưởng của vị trí chèn

gen chuyển tới các gen chức năng khác trong tế bào, từ đó có thể sàng lọc được

những tế bào mong muốn để tiêm vào phôi nhận tạo gà khảm.

Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng FISH, hiệu quả chúng tôi thu được không

cao. Trong tổng số 10 mẫu cESCs dương tính với phản ứng PCR được phân tích,

chỉ có hai mẫu cho kết quả mong muốn (tín hiệu huỳnh quang rõ nét, không có

nhiễu nền kể cả ở mẫu đối chứng). Một số nguyên nhân đã được đưa ra để giải thích

cho vấn đề này. Đầu dò có kích thước tương đối lớn (gần 300 bp), gắn thêm các

phân tử phát huỳnh quang Alexa Fluor® 568 cấu trúc khá cồng kềnh (Hình 4) làm

giảm khả năng bắt cặp với ADN đích. Thao tác rửa lam sau quá trình phản ứng

nhằm loại bỏ sự không đặc hiệu được thực hiện khá nghiêm ngặt, trong đó có sử

dụng chất gây biến tính mạnh (formamide) có thể làm mất một phần những phức hệ

lai mong muốn. Trong thời gian tới, chúng tôi tiếp tục tối ưu hóa điều kiện thực

hiện phản ứng FISH, cũng như cải thiện đầu dò (đánh giá số lượng phân tử huỳnh

quang được gắn vào để giảm kích thước đầu dò, tổng hợp đầu dò mạch đơn,…)

nhằm nâng cao hiệu quả phân tích.



Mặc dù vậy, đề tài đã đạt được những thành công đáng khích lệ. Đây là lần

đầu tiên ở Việt Nam khi sử dụng kỹ thuật FISH, đầu dò huỳnh quang được tổng hợp

ngay tại phòng thí nghiệm bằng phương pháp PCR. Sử dụng phương pháp này,

nghiên cứu viên có thể chủ động tổng hợp được bất cứ loại đầu dò cho trình tự

ADN đã biết nào đó, không bị bó hẹp trong phạm vi một gen hay một trình tự nhất

định. Kết quả nghiên cứu cũng góp phần triển khai áp dụng và tiếp tục phát triển

nhiều kỹ thuật về sinh học phân tử, sinh học tế bào, di truyền học,... trong nghiên

cứu sinh học ở nước ta.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Kết luận và kiến nghị


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã đưa ra các kết luận như sau:

1. Đã sử dụng vector chuyển gen dựa trên lentivirus để tạo các quần thể tế bào gốc

phôi gà mang gen IL–6 người.

2. Đã thiết kế mồi và tổng hợp được đầu dò gắn chất huỳnh quang Alexa Fluor®

568 đặc hiệu với gen IL–6 của người bằng phản ứng PCR.

3. Đã bước đầu thành công trong việc phát hiện gen chuyển IL–6 người trong nhân

tế bào gốc phôi gà sau chuyển gen bằng kỹ thuật FISH sử dụng đầu dò tổng hợp

được.

KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả đã thu được, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị như sau:

1. Tiếp tục sử dụng vector chuyển gen dựa trên lentivirus để chuyển gen vào tế bào

gốc phôi gà.

2. Điều chỉnh kích thước đầu dò để nâng cao hiệu quả phản ứng lai FISH.

3. Mở rộng ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện gen trong tế bào, lai với nhiễm sắc

thể ở giai đoạn kỳ giữa nguyên phân để xác định vị trí gen trên nhiễm sắc thể.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Tài liệu tham khảo


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Đặng Văn Đức, Nguyễn Lai Thành, Bùi Việt Anh, Đỗ Doãn Lợi (2010),

“Nhận biết và nuôi cấy đơn dòng tế bào gốc phân lập từ nút phôi của túi phôi

chuột”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 26

(2), tr. 71-82.

2. Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Lai Thành, Nguyễn Duy Điều, Thân Thị

Trang Uyên, Lê Thị Tuyết, Thân Thị Linh Quyên (2010), “Thử nghiệm

chuyển gen EGFP trên gà (Gallus gallus domesticus) sử dụng vector pT2/BH-

CVpf-SB11 bằng phương pháp vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp”, Tạp chí Khoa

học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 26 (2S), tr. 124-131.

3. Bùi Võ Minh Hoàng, Nguyễn Duy Tài, Phan Chiến Thắng (2007), “Ứng dụng

kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chấn đoán trước sinh các dị bội nhiễm

sắc thể thường gặp”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 11 (Phụ bản số 1), tr.

289-295.

4. Nguyễn Mộng Hùng, Vũ Văn Vụ, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học -

Tập 2: Công nghệ Tế bào, Nxb Giáo dục, Hà Nội.

5. Nguyễn Văn Kình, Nguyễn Quốc Tuấn, Nguyễn Tuấn Anh (2007), Thực hành

Ứng dụng Gen trị liệu, Nxb Y học, Hà Nội.

6. Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành (2012), “Thử nghiệm chuyển gen IL-6

người bằng lentivirus vào tế bào gốc phôi gà”, Tạp chí Khoa học và Công

nghệ - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 50 (3C), tr. 401-406.

7. Nguyễn Văn Nguyên, Lê Thanh Tùng, Lưu Xuân Hòa, Vũ Tuấn Nam, Vũ

Minh Hào, Đinh Thái Bình (2011), “Thử nghiệm kỹ thuật lai huỳnh quang tại

chỗ F.I.S.H nhận diện nhanh và chuẩn xác một số loài tảo giáp độc hại”, in

Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học và công nghệ biển toàn quốc lần thứ V,

tr. 261-268.



8. Đinh Thị Hồng Nhung, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Hoàng Thị Thanh

Mộc, Nguyễn Thị Phương Mai, Nguyễn Thị Mai Hương, Lý Thị Thanh Hà,

Trần Thị Nga, Nguyễn Thanh Liêm (2008), “Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang

tại chỗ trong phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Nhi

Trung ương”, Tạp chí nghiên cứu y học, 57, tr. 57-62.

9. Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Đinh Thị Hồng Nhung,

Lê Thị Liễu, Nguyễn Thanh Liêm (2011), “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh

quang tại chỗ trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường

gặp”, Tạp chí Y học lâm sàng, Số đặc biệt tháng 2/2011, tr. 253-258.

10. Lê Thị Tuyết, Nguyễn Lai Thành, Nguyễn Duy Điều, Nguyễn Thị Hồng Hạnh,

Phạm Nguyệt Hằng (2010), “Thử nghiệm chuyển gen GFP trên gà (Gallus

gallus domesticus) sử dụng vector pT2/BH-CVpf-SB11 bằng phương pháp

chuyển gen qua tinh trùng”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên

và Công nghệ, 26 (2), tr. 266-273.

Tài liệu tiếng Anh

11. Abd-Elsalam K.A. (2003), “Bioinformatic tools and guideline for PCR primer

design”, African Journal of biotechnology, 2 (5), pp. 91-95.

12. Bishop R. (2010), “Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH)

in detecting genetic aberrations of medical significance”, Bioscience Horizons,

3 (1), pp. 85-95.

13. Bolzer A., Kreth G., Solovei I., Koehler D., Saracoglu K., Fauth C., Müller S.,

Eils R., Cremer C., Speicher M.R. (2005), “Three-dimensional maps of all

chromosomes in human male fibroblast nuclei and prometaphase rosettes”,

PLoS biology, 3 (5), pp. e157.

14. Bottari B., Ercolini D., Gatti M., Neviani E. (2009), “FISH in food

microbiology”, in Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)—Application

Guide, Springer, pp. 395-408.



15. Brammer S.P., Vasconcelos S., Poersch L.B., Oliveira A.R., Brasileiro-Vidal

A.C. (2013), “Genomic in situ Hybridization in Triticeae: A Methodological

Approach”, in Plant Breeding from Laboratories to Fields, InTech.

16. Brown W.R., Hubbard S.J., Tickle C., Wilson S.A. (2003), “The chicken as a

model for large-scale analysis of vertebrate gene function”, Nature Reviews

Genetics, 4 (2), pp. 87-98.

17. Chen B.-Y., Janes H.W., Chen S. (2002), “Computer programs for PCR

primer design and analysis”, in Methods in Molecular Biology 192: PCR

Cloning Protocols, Springer, pp. 19-29.

18. Cyriac S., Churchil R.R., George T.G. (2012), “Transgenic chicken: methods

and applications”, Journal of Indian Veterinary Association, Kerala (JIVA), 10

(2), pp. 67-71.

19. Darouich S., Popovici C., Missirian C., Moncla A. (2012), “Use of DOP-PCR

for amplification and labeling of BAC DNA for FISH”, Biotechnic &

Histochemistry, 87 (2), pp. 117-121.

20. Das R.M., Van Hateren N.J., Howell G.R., Farrell E.R., Bangs F.K., Porteous

V.C., Manning E.M., Mcgrew M.J., Ohyama K., Sacco M.A. (2006), “A

robust system for RNA interference in the chicken using a modified

microRNA operon”, Developmental biology, 294 (2), pp. 554-563.

21. Davenport-Jones J. (2000), “Nick Translation and Random Hexamer Labeling

of DNA”, in The Nucleic Acid Protocols Handbook, Humana Press, pp. 123-

125.

22. De Muro M.A. (2008), “Probe Design: Production and Applications”, in

Molecular Biomethods Handbook, Springer, pp. 41-53.

23. Doak S.H., Saidely D., Jenkins G.J.S., Parry E.M., Griffiths A.P., Baxter J.N.,

Parry J.M. (2004), “Generation of locus-specific probes for interphase

fluorescence in situ hybridisation--application in Barrett's esophagus”,

Experimental and molecular pathology, 77 (1), pp. 26-33.



24. Etches R.J., Clark M.E., Toner A., Liu G., Gibbins A.M. (1996),

“Contributions to somatic and germline lineages of chicken blastodermal cells

maintained in culture”, Molecular Reproduction and Development, 45, pp.

291-298.

25. Gilbert S.F. (2006), Development biology, 6th edition, Swarthmore College,

Sinauer Associates, Inc. Publishers Sunderland, Massachusettes.

26. Gozzetti A., Le Beau M.M. (2000), “Fluorescence in situ hybridization: uses

and limitations”, Seminars in hematology, 37 (4), pp. 320-333.

27. Hamburger V., Hamilton H.L. (1951), “A series of normal stages in the

development of the chick embryo”, Journal of Morphology, 88 (1), pp. 49–92.

28. Harel-Markowitz E., Gurevich M., Shore L.S., Katz A., Stram Y., Shemesh M.

(2009), “Use of sperm plasmid DNA lipofection combined with REMI

(restriction enzyme-mediated insertion) for production of transgenic chickens

expressing eGFP (enhanced green fluorescent protein) or human follicle-

stimulating hormone”, Biology of Reproduction, 80 (5), pp. 1046-1052.

29. Harwood W.A., Bilham L.J., Travella S., Salvo-Garrido H., Snape J.W.

(2004), “Fluorescence in situ hybridization to localize transgenes in plant

chromosomes”, in Transgenic Plants: Methods and Protocols, Springer, pp.

327-339.

30. Hawkins A.L., Jones R.J., Zehnbauer B.A., Zicha M.S., Collector M.J.,

Sharkis S.J., Griffin C.A. (1992), “Fluorescence in situ hybridization to

determine engraftment status after murine bone marrow transplant”, Cancer

genetics and cytogenetics, 64 (2), pp. 145-148.

31. Hopman A.H.N., Ramaekers F.C.S., Speel E.J.M. (1998), “Rapid synthesis of

biotin-, digoxigenin-, trinitrophenyl-, and fluorochrome-labeled tyramides and

their application for In situ hybridization using CARD amplification”, Journal

of Histochemistry & Cytochemistry, 46 (6), pp. 771-777.



32. Horiuchi H., Furusawa S., Matsuda H. (2006), “Maintenance of chicken

embryonic stem cells in vitro”, in Embryonic stem cell protocols – Volume 1:

Isolation and characterization, Humana Press, New York, USA, pp. 17-34.

33. Houdebine L.-M. (2009), “Production of pharmaceutical proteins by

transgenic animals”, Comparative immunology, microbiology and infectious

diseases, 32 (2), pp. 107-121.

34. Ishibashi T., Takoh K., Kaji H., Abe T., Nishizawa M. (2007), “A porous

membrane–based culture substrate for localized in situ electroporation of

adherent mammalian cells”, Sensors and Actuators B: Chemical, 128 (1), pp.

5-11.

35. Jung J.G., Lee Y.M., Park T.S., Park S.H., Lim J.M., Han J.Y. (2007),

“Identification, culture, and characterization of germline stem cell-like cells in

chicken testes”, Biology of reproduction, 76 (1), pp. 173-182.

36. Kamihira M., Ono K.-I., Esaka K., Nishijima K.-I., Kigaku R., Komatsu H.,

Yamashita T., Kyogoku K., Iijima S. (2005), “High-level expression of single-

chain Fv-Fc fusion protein in serum and egg white of genetically manipulated

chickens by using a retroviral vector”, Journal of virology, 79 (17), pp. 10864-

10874.

37. Kearney L. (2001), “Molecular cytogenetics”, Best Practice & Research

Clinical Haematology, 14, pp. 645–668.

38. Kearney L. (2006), “Multiplex-FISH (M-FISH): technique, developments and

applications”, Cytogenetic and Genome Research, 114 (3-4), pp. 189-198.

39. Kevin S., Corrado S. (2005), “Sperm – mediated gene transfer: Applications

and implications”, BioEssays, 27 (5), pp. 551–562.

40. Kishimoto T. (2010), “IL-6: from its discovery to clinical applications”,

International immunology, 22 (5), pp. 347-352.

41. Kochav S., Eyal–Giladi H. (1976), “From cleavage to primitive streak

formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of



the development of the chick. I. General morphology.”, Developmental

Biology, 49 (2), pp. 321-337.

42. Kovalchuk A.L., Kim J.S., Park S.S., Coleman A.E., Ward J.M., Morse H.C.,

Kishimoto T., Potter M., Janz S. (2002), “IL-6 transgenic mouse model for

extraosseous plasmacytoma”, Proceedings of the National Academy of

Sciences, 99 (3), pp. 1509-1514.

43. Kwon M.S., Koo B.C., Choi B.R., Lee H.T., Kim Y.H., Ryu W.-S., Shim H.,

Kim J.-H., Kim N.-H., Kim T. (2004), “Development of transgenic chickens

expressing enhanced green fluorescent protein”, Biochemical and Biophysical

Research Communications, 320 (2), pp. 442-448.

44. Langer P.R., Waldrop A.A., Ward D.C. (1981), “Enzymatic synthesis of

biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes”,

Proceedings of the National Academy of Sciences, 78 (11), pp. 6633-6637.

45. Lavial F., Montillet G., Bachelard E., Samarut J., Pain B. (2006), “Chicken

stem cells as a model to generate transgenic chicken: present and

perspectives”, The Journal of Poultry Science, 43 (4), pp. 313-322.

46. Lavial F., Pain B. (2010), “Chicken embryonic stem cells as a non‐mammalian

embryonic stem cell model”, Development, growth & differentiation, 52 (1),

pp. 101-114.

47. Lavitrano M., Forni M., M.L. Bacci, Di Stefano C., Varzi V., Hongjun W.,

Seren E. (2003), “Sperm mediated gene transfer in pig: selection of donor

boars and optimization of DNA uptake”, Molecular Reproduction and

Development, 64 (3), pp. 284–291.

48. Le Goff B., Blanchard F., Berthelot J.-M., Heymann D., Maugars Y. (2010),

“Role for interleukin-6 in structural joint damage and systemic bone loss in

rheumatoid arthritis”, Joint Bone Spine, 77 (3), pp. 201-205.

49. Lee Y.M., Jung J.G., Kim J.N., Park T.S., Kim T.M., Shin S.S., Kang D.K.,

Lim J.M., Han J.Y. (2006), “A testis-mediated germline chimera production



based on transfer of chicken testicular cells directly into heterologous testes”,

Biology of Reproduction, 75, pp. 380-386.

50. Levsky J.M., Singer R.H. (2003), “Fluorescence in situ hybridization: past,

present and future”, Journal of Cell Science, 116 (14), pp. 2833-2838.

51. Li J.-J., Lu L.-Z. (2010), “Recent progress on technologies and applications of

transgenic poultry”, African Journal of Biotechnology, 9 (24), pp. 3481-3488.

52. Lillico S.G., Mcgrew M.J., Sherman A., Robertson C.D., Smith J., Haslam C.,

Barnard P., Radcliffe P.A., Mitrophanous K.A., Elliot E.A., Sang H.M.

(2007), “Oviduct – specific expression of two therapeutic proteins in

transgenic hens”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 104 (6),

pp. 1771-1776.

53. Love J., Gribbin C., Mather C., Sang H. (1994), “Transgenic birds by DNA

microinjection”, Nature Biotechnology, 12 (1), pp. 60-63.

54. Lucas W., Deng J.N. (1999), “Combined FISH with pan-telomeric PNA and

whole chromosome-specific DNA probes to detect complete and incomplete

chromosomal exchanges in human lymphocytes”, International journal of

radiation biology, 75 (9), pp. 1107-1112.

55. Macville M., Veldman T., Padilla-Nash H., Wangsa D., O’brien P., Schröck

E., Ried T. (1997), “Spectral karyotyping, a 24-colour FISH technique for the

identification of chromosomal rearrangements”, Histochemistry and cell

biology, 108 (4-5), pp. 299-305.

56. Mcgrew M.J., Sherman A., Lillico S.G., Taylor L., Sang H. (2010),

“Functional conservation between rodents and chicken of regulatory

sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens”,

BMC developmental biology, 10 (1), pp. 26.

57. Meyne J., Moyzis R.K. (1995), “In situ hybridization using synthetic

oligomers as probes for centromere and telomere repeats”, in In Situ

Hybridization Protocols, Springer, pp. 63-74.



58. Mitrović T. (2003), “Gene transfer systems”, Medicine and Biology, 10, pp.

101–105.

59. Morrison L.E., Ramakrishnan R., Ruffalo T.M., Wilber K.A. (2003),

“Labeling fluorescence in situ hybridization probes for genomic targets”, in

Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, Springer, pp. 21-40.

60. Motono M., Yamada Y., Hattori Y., Nakagawa R., Nishijima K.-I., Iijima S.

(2010), “Production of transgenic chickens from purified primordial germ

cells infected with a lentiviral vector”, Journal of Bioscience and

Bioengineering, 109 (4), pp. 315-321.

61. Nakamura H., Funahashi J. (2013), “Electroporation: Past, present and future”,

Development, Growth & Differentiation, 55 (1), pp. 15-19.

62. Nakamura Y., Yamamoto Y., Usui F., Mushika T., Ono T., Setioko A.R.,

Takeda K., Nirasawa K., Kagami H., Tagami T. (2007), “Migration and

proliferation of primordial germ cells in the early chicken embryo”, Poultry

Science, 86, pp. 2182-2193.

63. Nelson T.E., Olde Engberink A., Hernandez R., Puro A., Huitron-Resendiz S.,

Hao C., De Graan P.N.E., Gruol D.L. (2012), “Altered synaptic transmission

in the hippocampus of transgenic mice with enhanced central nervous systems

expression of interleukin-6”, Brain, Behavior, and Immunity, 26 (6), pp. 959-

971.

64. Pain B., Chenevier P., Samarut J. (1999), “Chicken embryonic stem cells and

transgenic strategies”, Cells Tissues Organs, 165 (3–4), pp. 212-219.

65. Park T.S., Jeong D.K., Kim J.N., Song G.H., Yong Y.H., Lim J.M., J.Y. H.

(2003), “Improved germline transmission in chicken chimeras produced by

transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos”,

Biology of Reproduction, 68, pp. 1657-1662.

66. Parker A.L., Newman C., Briggs S., Seymour L., Sheridan P.J. (2003),

“Nonviral gene delivery: techniques and implications for molecular medicine”,

Expert Reviews in Molecular Medicine, 5 (22), pp. 1-15.



67. Pavel T., Alena M., Jitka M., Hejnar J., Martin P., Murray R.B., Kalina J., B.

J.-P. (2006), “Restoration of spermatogenesis and male fertility by

transplantation of dispersed testicular cells in the chicken”, Biology of

Reproduction, 75, pp. 575-581.

68. Petitte J.N., Clark M.E., Liu G., Gibbins A.M.V., Etches R.J. (1990),

“Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of

early blastodermal cells”, Development, 108 (1), pp. 185–189.

69. Petitte J.N., Liu G., Yang Z. (2004), “Avian pluripotent stem cells”,

Mechanisms of Development, 121 (9), pp. 1159-1168.

70. Piechaczek C., Fetzer C., Baiker A., Bode J., Lipps H.J. (1999), “A vector

based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates

episomally in CHO cells”, Nucleic Acids Research, 27 (2), pp. 426-428.

71. Rowley J.D. (1973), “A new consistent chromosomal abnormality in chronic

myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa

staining”, Nature, 243, pp. 290 - 293.

72. Salahuddin P. (2011), “Gene Therapy for Alpha-1-Antitrypsin Deficiency

Diseases”, in Gene Therapy Applications, InTech.

73. Samoylov A.V., Kesyan A.Z., Suraeva N.M. (2013), “Development of

transgenic chicken with a gene of human granulocyte colony-stimulating

factor using sperm-mediated gene transfer”, Biology Bulletin, 40 (5), pp. 419-

422.

74. Sandrin V., Russell S.J., Cosset F.L. (2003), “Targeting retroviral and

lentiviral vectors”, Current Topics in Microbiology and Immunology, 281, pp.

137–178.

75. Sarrate Z., Vidal F., Blanco J. (2010), “Role of sperm fluorescent in situ

hybridization studies in infertile patients: indications, study approach, and

clinical relevance”, Fertility and Sterility, 93 (6), pp. 1892-1902.

76. Sawyer J.R., Lukacs J.L., Munshi N., Desikan K.R., Singhal S., Mehta J.,

Siegel D., Shaughnessy J., Barlogie B. (1998), “Identification of new



nonrandom translocations in multiple myeloma with multicolor spectral

karyotyping”, Blood, 92 (11), pp. 4269-4278.

77. Schenborn E.T. (2000), “Transfection technologies”, in Transcription Factor

Protocols, pp. 91-102.

78. Schrock E., Du Manoir S., Veldman T., Schoell B., Wienberg J., Ferguson-

Smith M.A., Ning Y., Ledbetter D.H., Bar-Am I., Soenksen D. (1996),

“Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes”, Science, 273

(5274), pp. 494-497.

79. Schwarzacher T. (2009), “Fluorescent in situ hybridization to detect transgene

integration into plant genomes”, in Transgenic Wheat, Barley and Oats,

Springer, pp. 227-246.

80. Sehgal P.B. (1990), “Interleukin-6: molecular pathophysiology”, Journal of

Investigative Dermatology, 94, pp. 2s-6s.

81. Shiue Y.L., Tailiu J.J., Liou J.F., Lu H.T., Tai C., Shiau J.W., Chen L.R.

(2009), “Establishment of the Long‐Term In Vitro Culture System for Chicken

Primordial Germ Cells”, Reproduction in Domestic Animals, 44 (1), pp. 55-61.

82. Speicher M.R., Ballard S.G., Ward D.C. (1996), “Karyotyping human

chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH”, Nature genetics, 12 (4), pp.

368-375.

83. Speicher M.R., Carter N.P. (2005), “The new cytogenetics: blurring the

boundaries with molecular biology”, Nature Reviews Genetics, 6 (10), pp.

782-792.

84. Suganami Y., Kawashima H., Hasegawa D., Sato S., Hoshika A. (2008),

“Clinical application of rapid assay of serum interleukin‐6 in Kawasaki

disease”, Pediatrics International, 50 (2), pp. 264-266.

85. Swiger R.R., Tucker J.D. (1996), “Fluorescence in situ hybridization”,

Environmental and molecular mutagenesis, 27, pp. 245-254.



86. Tanaka T., Narazaki M., Kishimoto T. (2012), “Therapeutic targeting of the

interleukin-6 receptor”, Annual review of pharmacology and toxicology, 52,

pp. 199-219.

87. Van De Lavoir M.-C., Diamond J.H., Leighton P.A., Mather-Love C., Heyer

B.S., Bradshaw R., Kerchner A., Hooi L.T., Gessaro T.M., Swanberg S.E.

(2006), “Germline transmission of genetically modified primordial germ

cells”, Nature, 441 (7094), pp. 766-769.

88. Van De Lavoir M.C., Mather–Love C., Klimanskaya I., Robert L. (2006),

“Avian Embryonic Stem Cells”, in Methods in Enzymology, Academic Press,

pp. 38-64.

89. Van Hummelen P., Lowe X.R., Wyrobek A.J. (1996), “Simultaneous detection

of structural and numerical chromosome abnormalities in sperm of healthy

men by multicolor fluorescence in situ hybridization”, Human genetics, 98 (5),

pp. 608-615.

90. Van Laere K., Khrustaleva L., Van Huylenbroeck J., Van Bockstaele E.

(2010), “Application of GISH to characterize woody ornamental hybrids with

small genomes and chromosomes”, Plant Breeding, 129 (4), pp. 442-447.

91. Waar K., Degener J.E., Van Luyn M.J., Harmsen H.J.M. (2005), “Fluorescent

in situ hybridization with specific DNA probes offers adequate detection of

Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium in clinical samples”, Journal

of medical microbiology, 54 (10), pp. 937-944.

92. Wang Y., Brooks C.F., Jones S.A., Olliff L.K., Morgan M., Speksnijder G.L.,

Foley C., Harvey A.J. (2006), “Progress toward the culture and transformation

of chicken blastodermal cells”, Stem Cells, 24 (7), pp. 1638-1645.

93. Wiegant J., Raap A.K. (2001), “Probe labeling and fluorescence in situ

hybridization”, Current protocols in cytometry, pp. 8.3.1-8.3.21.

94. Wolman S.R. (1997), “Applications of fluorescence in situ hybridization

techniques in cytopathology”, Cancer Cytopathology, 81 (4), pp. 193-197.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Phụ lục

Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm A

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Kết quả định lượng ADN các sản phẩm PCR

ở những điều kiện phản ứng được thử nghiệm

Ta = 45,9oC Ta = 47,8oC Ta = 49,3oC Ta = 51,0oC Ta = 53,5oC

Mg2+ 1,00 mM

212 493 655 580 593

370 688 609 593 555

604 508 751 682 634

Mg2+ 1,75 mM

318 740 820 756 771

368 685 809 596 608

598 634 748 859 627

Mg2+ 2,50 mM

685 845 1248 875 920

527 921 1083 850 813

638 627 1327 721 958

Mg2+ 3,25 mM

872 1333 1708 1408 1218

748 997 1425 1583 927

817 1257 1203 1048 1078

Mg2+ 4,00 mM

728 850 1085 1040 978

805 921 1168 1180 986

796 1184 921 1152 1161

(Đơn vị: ng/μl)


Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm B

Phụ lục 2. Kết quả giải trình tự các sản phẩm PCR được tổng hợp ở một số điều kiện phản ứng khác nhau

Ta = 45,9oC; Mg2+ 1,75 mM

Ta = 45,9oC; Mg2+ 3,25 mM

Ta = 49,3oC; Mg2+ 1,75 mM

Ta = 49,3oC; Mg2+ 3,25 mM


Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm C

Ta = 45,9oC; Mg2+ 1,75 mM

Ta = 45,9oC; Mg2+ 3,25 mM

Ta = 49,3oC; Mg2+ 1,75 mM

Ta = 49,3oC; Mg2+ 3,25 mM


Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm D

Ta = 45,9oC; Mg2+ 1,75 mM

Ta = 45,9oC; Mg2+ 3,25 mM

Ta = 49,3oC; Mg2+ 1,75 mM

Ta = 49,3oC; Mg2+ 3,25 mM


Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm E

Ta = 45,9oC; Mg2+ 1,75 mM

Ta = 45,9oC; Mg2+ 3,25 mM

Ta = 49,3oC; Mg2+ 1,75 mM

Ta = 49,3oC; Mg2+ 3,25 mM


Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm F

Phụ lục 3. Các công trình đã công bố có liên quan đến luận văn

– Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành (2012), “Thử nghiệm chuyển gen IL-6

người bằng lentivirus vào tế bào gốc phôi gà”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ -

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Tập 50, Số 3C, trang 401–406.

– Nguyễn Tiến Lung, Hoàng Thị Xoan, Nguyễn Lai Thành (2013), “Tổng hợp đầu

dò gắn huỳnh quang phục vụ lai FISH sử dụng kỹ thuật DOP–PCR”, Tuyển tập

Báo cáo khoa học Hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học Toàn quốc 2013,

Quyển 1, trang 668–671.

Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50 (3C) (2012) 401–406

THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN IL-6 NGƯỜI BẰNG LENTIVIRUS VÀO TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ

Nguyễn Tiến Lung*, Nguyễn Lai Thành

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

*Email: [email protected]

Đến Tòa soạn: 15/7/2012; Chấp nhận đăng: 1/11/2012

TÓM TẮT

Gà chuyển gen có triển vọng rất lớn trong việc sản xuất các protein tái tổ hợp. Những phương pháp tạo gia cầm chuyển gen hiện nay tập trung vào hướng thông qua các tế bào gốc phôi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi mô tả tóm tắt phương pháp phân lập, nhân nuôi in vitro tế bào gốc phôi gà, chuyển nhiễm gen mã hóa interleukin 6 (IL–6) phân lập từ người vào những tế bào này thông qua vector lentivirus và vi tiêm các tế bào nhận gen chuyển vào phôi gà 0 giờ ấp để tạo gà khảm mang tế bào chuyển gen. Kết quả cho thấy vector lentivirus có khả năng chuyển gen vào tế bào gốc phôi gà cho hiệu quả cao và ổn định. Gen chuyển cũng đã được phát hiện trong mẫu ADN tách từ ruột của một trong những gà con thu nhận được. Kết quả này cho thấy tính khả thi của việc ứng dụng tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc ở Việt Nam.

Từ khóa. Gà chuyển gen, tế bào gốc phôi, vector lentivirus, interleukin 6.

1. MỞ ĐẦU

Interleukin 6 (IL–6) là một protein điều hòa miễn dịch thuộc họ hematopoietin. Trong cơ thể, IL–6 có nhiều chức năng khác nhau đặc trưng khi được tiết ra bởi các tế bào khác nhau trong các điều kiện riêng biệt như kích thích hệ thống miễn dịch đáp ứng lại tổn thương, kích thích sự hình thành xương, đóng vai trò quan trọng trong sự tạo máu và hình thành tế bào máu, đóng vai trò là nhân tố sinh trưởng của các tế bào lai trong sản xuất kháng thể, các tế bào đa u tủy,...[1, 2]. Do đó, từ lâu IL–6 đã được ứng dụng trong điều trị lâm sàng các bệnh về viêm khớp dạng thấp, viêm gan tự miễn, một số bênh về máu,... [2, 3].

Nhằm sản xuất IL–6 nói riêng và nhiều loại protein tái tổ hợp nói chung, phương pháp được chú ý đến hiện nay là thông qua động vật chuyển gen. Đặc biệt, gà chuyển gen có những lợi thế hơn hẳn so với các loài động vật khác: mất ít thời gian tạo dòng, thành phần protein lòng trắng trứng đơn giản nên dễ tách chiết sản phẩm, trứng có môi trường vô trùng tự nhiên,…[4, 5]. Những nghiên cứu gần đây tập trung chủ yếu vào phương pháp chuyển gen thông qua tế bào gốc phôi gà (chicken Embryonic Stem Cells – cESC). cESC là những tế bào đa tiềm năng không biệt hóa, có khả năng tăng sinh vô hạn khi nuôi cấy in vitro và khi được đặt vào những điều kiện thích hợp có thể biệt hóa thành tất cả các tế bào chuyên hóa của cơ thể, trong đó có các giao tử [6, 7].

Phương pháp tạo gia cầm chuyển gen thông qua tế bào gốc có ưu điểm là lựa chọn được ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển mong muốn trước khi tiêm chúng vào phôi nhận, do đó tiết kiệm được thời gian cũng như chi phí cho quá trình sàng lọc cơ thể chuyển gen từ bố mẹ khảm [8].

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Phương pháp phân lập và nuôi cấy cESC

cESC được phân lập từ đĩa phôi 0 giờ ấp theo mô tả của Horiuchi và cộng sự [9]. Tế bào được nuôi trong các đĩa đường kính 35mm (Corning) đã phủ gelatin với mật độ khoảng 5x104 tế bào / cm2. Môi trường nuôi cấy cESC bao gồm Opti–MEM® (Gibco) bổ sung 10% thể tích FBS (Gibco), 1mM sodium pyruvate (Gibco), 100μM non–essential amino acid (Gibco), 2000U/ml LIF (Sigma), 45mM sodium bicarbonate (Sigma), 100U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (Gibco), 100μM β–mercaptoethanol (Gibco).

2.2. Phương pháp chuyển gen sử dụng vector lentivirus

Vector lentivirus pLenti6/V5–DEST (Gateway) đã chèn gen IL–6 được sử dụng làm vector chuyển gen trong thí nghiệm này. Khi cESC sinh trưởng đạt khoảng 80–90% bề mặt đĩa nuôi cấy, cESC được thu nhận bằng cách xử lý với Trypsin 0,25%/EDTA 0,025% (Sigma) và ly tâm 200g trong 15 phút. Loại bỏ dịch nổi, huyền phù hóa tế bào bằng Opti–MEM® sao cho đạt nồng độ 0,5x106 tế bào/ml. Huyền phù tế bào được ủ cùng các hạt virus (trung bình 20 virus/tế bào) ở 370C trong 15 phút, sau đó được ly tâm 800g trong 30 phút. Tế bào được huyền phù hóa bằng môi trường nuôi cấy, chuyển vào các đĩa đường kính 35mm (Corning) với mật độ khoảng 5x104 tế bào/cm2 và nuôi ở tủ ấm 370C, 5% CO2, độ ẩm 90%.

2.3. Phương pháp mở cửa sổ và vi tiêm tế bào gốc vào đĩa phôi 0 giờ ấp

Qua mỗi lần cấy chuyển, một phần tế bào được thu nhận để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR. Những mẫu tế bào dương tính trong phản ứng PCR được thu nhận để vi tiêm vào đĩa phôi 0 giờ ấp. Phương pháp mở cửa sổ và vi tiêm tế bào gốc vào đĩa phôi 0 giờ ấp được thực hiện theo quy trình đã thiết lập bởi tác giả Nguyễn Mộng Hùng (2005) và Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2010) [10, 11]. Mỗi phôi được tiêm vào thể tích 2μl huyền phù tế bào với nồng độ 150 – 250 tế bào/µl. Sau khi vi tiêm, cửa sổ được đậy lại bằng các lớp màng được chuẩn bị từ vỏ trứng và dán kín bằng keo Duco. Trứng sau vi tiêm được ấp trong điều kiện nhiệt độ 37–38oC, độ ẩm 55%–75%, thường xuyên được kiểm tra sự phát triển phôi.

2.4. Phương pháp phát hiện gen chuyển bằng phản ứng PCR

Các mẫu cần kiểm tra được tách chiết ADN hệ gen bằng DNA Isolation Kit for Cells and Tissues (Roche). Sản phẩm tách chiết được phân tích PCR để kiểm tra sự có mặt gen chuyển IL–6 bằng cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn ADN 630bp (mồi xuôi IL6F: 5’–CACCTAGCTAGCGCC GCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCG–3’; mồi ngược IL6R: 5’–CTCGAGGAATTC TCACAACATTTGCCGAAGAGCCC–3’). Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN 321bp của gen ribosome 18S cũng được sử dụng nhằm chứng minh sự hiện diện của ADN hệ gen gà trong mẫu thí nghiệm (mồi xuôi 18SFor 5’–GTCGGCGTCCAACTTCTT–3’; mồi

Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành

402

ngược 18SRev 5’–CGATCCGAGGACCTCACT–3’). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, nhuộm bằng Ethidium bromide (Invitrogen) nồng độ 2g/ml và phân tích kết quả.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập và nuôi cấy cESC

Sau 24 giờ được phân lập và nuôi cấy, cESC đã thực sự bám dính vào đáy đĩa nuôi cấy, kết hợp với nhau thành quần lạc cESC với những đặc điểm hình thái đặc trưng: tế bào tròn, nhân lớn, nhân chiếm hầu hết tế bào chất, các tế bào liên kết với nhau lỏng lẻo (Hình 24A). Yếu tố quan trọng trong việc duy trì cESC in vitro mà vẫn giữ được đặc tính đa tiềm năng là sự có mặt lớp tế bào nuôi [8, 12]. Khi được nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi là nguyên bào sợi thai chuột đã bất hoạt phân bào, cESC có xu hướng xâm lấn xuống dưới lớp tế bào nuôi và bám trực tiếp vào bề mặt đĩa nuôi cấy (Hình 24B). Những kết quả này khá tương đồng với những nghiên cứu đã công bố trước đây thế giới cũng như tại Việt Nam [8, 13, 14].

Hình 24. cESC nuôi cấy in vitro

(A) cESC 24 giờ sau khi phân lập nuôi cấy trên chất nền gelatin; (B) Quần lạc cESC sinh trưởng trên lớp tế bào nuôi (10x32).

3.2. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong hệ gen cESC

Sau khi được chuyển nhiễm, trong quá trình cấy chuyển, một phần tế bào được thu nhận và tách chiết ADN hệ gen để thực hiện phản ứng PCR nhằm kiểm tra sự có mặt của gen chuyển IL–6. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 630bp của gen chuyển IL–6 và 321bp của gen ribosome 18S. Kết quả điện di sản phẩm PCR được thể hiện ở Hình 25. Gen chuyển đã được phát hiện ở tất cả các mẫu tế bào được lây nhiễm với vector lentivirus. Mặt khác, để kiểm tra gen chuyển có được duy trì ổn định qua các thế hệ tế bào hay không, qua mỗi lần cấy chuyển cESC, chúng tôi đều tiến hành thu tế bào để tách chiết DNA và phân tích PCR. Kết quả kiểm tra cho thấy, sau hơn 20 ngày nuôi cấy với 3 lần cấy chuyển, gen chuyển vẫn được duy trì ổn định trong hệ gen của cESC.

Những kết quả trên bước đầu chứng minh rằng vector có nguồn gốc lentivirus có khả năng chuyển gen vào cESC với hiệu quả khá cao và ổn định. Điều này càng có ý nghĩa khi những nghiên cứu của Pain và cộng sự đã chỉ ra rằng, cESC có khả năng nhận gen chuyển khó khăn hơn nhiều so với những tế bào đã biệt hóa [8].

Thử nghiệm chuyển gen IL–6 người bằng lentivirus vào tế bào gốc phôi gà

403

Hình 25. Kết quả phân tích PCR với cESC được chuyển gen

(–) : Đối chứng âm; (18S) Mẫu đối chứng 18S (321bp); (+) Đối chứng dương; (M) Thang chuẩn 0,5–4,6kb; (ĐC) Mẫu tế bào đối chứng không được chuyển nhiễm; (E1101, E1102, E1203) Các mẫu tế bào được chuyển nhiễm; (E1808: F1, F2, F3) Mẫu tế bào E1203 trải qua lần lượt 3 lần cấy chuyển.

3.3. Kết quả vi tiêm tế bào gốc đã nhận gen vào đĩa phôi gà chưa ấp

Vị trí được lựa chọn vi tiêm là vùng mờ của đĩa phôi [11]. Qua 4 lần thí nghiệm, đã có 90 trứng được vi tiêm, nhưng tỷ lệ phôi phát triển không cao, đặc biệt là phôi bị chết ở giai đoạn sớm khá nhiều (lên tới 60%), nguyên nhân có thể do phôi bị tổn thương và nhiễm khuẩn trong quá trình thao tác; phôi rất nhạy cảm với các tác động bên ngoài, tế bào gốc phôi sau quá trình nuôi cấy in vitro và được lây nhiễm virus có thể gây nên những biệt hóa bất thường khi hội nhập vào phôi nhận, làm phôi chết sớm. Kết thúc đợt thí nghiệm, có 9 gà con nở ra, đạt tỷ lệ 10%.

Hình 26. Kết quả phân tích PCR các mẫu mô gà G1–ES2509 chuyển gen thông qua tế bào gốc phôi

(–) : Đối chứng âm không có ADN khuôn; (ĐC) Mẫu đối chứng không tiêm; (+) Đối chứng dương là plasmid mang gen IL-6; (M) Thang chuẩn 0,5–4,6kb; (18S) Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ribosome 18S (321bp); (IL6) Sản phẩm khuếch đại đoạn gen IL–6 (630bp).

Các con gà con nở ra đều được lấy các phần mô, cơ quan khác nhau để tách chiết ADN hệ

gen và làm khuôn cho phản ứng PCR nhằm kiểm tra sự có mặt của gen IL-6 người. Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu mô thu từ gà con G1–ES2509 chuyển gen qua tế bào gốc phôi thể hiện ở Hình 3. Gen chuyển IL–6 chỉ được phát hiện trong mẫu ruột mà không tìm thấy ở các mô


404

khác. Đối với gà con nở ra từ phôi đã vi tiêm còn lại, không có mẫu nào xuất hiện băng của IL–6 người.

Hiệu quả thu được khá thấp cho thấy khả năng hội nhập của cESC mang gen chuyển vào phôi nhận là rất hạn chế, nguyên nhân có thể do vector lentivirus có ảnh hưởng lớn tới việc duy trì trạng thái đa tiềm năng của cESC mà không biểu hiện về mặt hình thái trong quá trình nuôi cấy in vitro, hoặc gen chuyển được cài ngẫu nhiên vào những vị trí gen hoạt động, ảnh hưởng tới sức sống của cESC. Mặc dù kết quả thu được còn hạn chế song nó cho thấy tính khả thi của phương pháp tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc.

4. KẾT LUẬN

Vector lentivirus có thể chuyển nhiễm được vào tế bào gốc phôi gà nuôi cấy. Gen chuyển IL–6 phân lập từ người có thể xâm nhập được vào hệ gen của tế bào gà và tồn tại bền vững qua các lần phân bào. Một lợi thế có thể thấy khá rõ ràng của vector lentivirus khi được sử dụng để chuyển gen là không gây ảnh hưởng nhiều tới sức sống của tế bào sau khi chuyển nhiễm với vector. Tế bào gốc phôi gà chuyển gen mang gen IL–6 người khi được chuyển vào đĩa phôi nhận đã có khả năng tạo khảm ở gà con mặc dù còn ở tỷ lệ thấp.

Lời cảm ơn. Kết quả nghiên cứu này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Nhà nước KC.04.04/06–10 và Quỹ hỗ trợ nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà nội. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn cố GS.TS. Nguyễn Mộng Hùng, người đi đầu trong hướng nghiên cứu tạo động vật chuyển gen ở Việt Nam, cũng là người đã xây dựng nên đề tài nghiên cứu này. Chúng tôi cũng xin cảm ơn Phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt nam đã cung cấp lentivirus cho quá trình nghiên cứu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Kishimoto T. – IL-6: from its discovery to clinical applications, International Immunology 22(5) (2010) 347-352.

2. Sehgal P. B. – Interleukin-6: Molecular Pathophysiology, J Investig Dermatol 94(s6) (1990) 2s-6s.

3. Suganami Y., Kawashima H., Hasegawa D., Sato S., and Hoshika A. – Clinical application of rapid assay of serum interleukin-6 in Kawasaki disease., Pediatrics International 50(2) (2008) 264-266.

4. Harvey A. J., and Ivarie R. – Validating the hen as a bioreactor for the production of exogenous proteins in egg white, Poultry Science 82(6) (2003) 927-930.

5. Lillico S. G., Mcgrew M. J., Sherman A., and Sang H. M. – Transgenic chickens as bioreactors for protein–based drugs, Drug Discovery Today 10(3) (2005) 191-196.

6. Kirschstein R., and Skirboll L.R. – Stem cells: Scientific progress and future research directions, The National Institutes of Health, US Department of Health and Human Services, 2001.

7. Macdonald J., Glover J. D., Taylor L., Sang H. M., and McGrew M. J. – Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells, PLoS ONE 5(11) (2010) e15518.

8. Pain B., Chenevier P., and Samarut J. – Chicken embryonic stem cells and transgenic strategies, Cells Tissues Organs 165(3–4) (1999) 212-219.

Thử nghiệm chuyển gen IL–6 người bằng lentivirus vào tế bào gốc phôi gà

405

9. Horiuchi H., Furusawa S., and Matsuda H. – “Maintenance of chicken embryonic stem cells in vitro”, in Embryonic stem cell protocols – Volume 1: Isolation and characterization, Humana Press, New York, USA, 2006, pp. 17-34.

10. Nguyễn Mộng Hùng, Chu Văn Trung, Hà Minh Tiệp, Bùi Việt Anh, Phùng Đức Tiến, Bạch Thị Thanh Dân, Phạm Nguyệt Hằng, Nguyễn Duy Điều – Tạo gà ác tiềm khảm Lương Phượng bằng vi tiêm tế bào gốc phôi, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 2 (2005), 1-4.

11. Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Lai Thành, Nguyễn Duy Điều, Thân Thị Trang Uyên, Lê Thị Tuyết, Thân Thị Linh Quyên – Thử nghiệm chuyển gen EGFP trên gà (Gallus gallus domesticus) sử dụng vector pT2/BH-CVpf-SB11 bằng phương pháp vi tiêm vào phôi gà 0 giờ ấp, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 26(2S) (2010) 124-131.

12. Lavial F., Montillet G., Bachelard E., Samarut J., and Pain B. – Chicken stem cells as a model to generate transgenic chicken: present and perspectives, The Journal of Poultry Science 43(4) (2006) 313-322.

13. Petitte J. N., Liu G., and Yang Z. – Avian pluripotent stem cells, Mechanisms of Development 121(9) (2004) 1159-1168.

14. Nguyễn Mộng Hùng, Chu Văn Trung, Bùi Việt Anh, Phan Ngọc Quang, Vũ Minh Đức, Hà Minh Tiệp, Thân Thị Trang Uyên, Nguyễn Hoàng Thịnh – Nuôi cấy tế bào gốc phôi gà (Gallus gallus domesticus) in vitro, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sự sống định hướng sinh-y học, Tuyển tập Báo cáo Khoa học, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 2004, tr. 235-238.

ABTRACT

TRANSFOMATION OF HUMAN IL-6 GENE TO CHICKEN EMBRYONIC STEM CELLS USING LENTIVIRUS VECTOR

Production of recombinant proteins in chicken egg has the great promise in medical applications. Currently, the method of creating transgenic poultry has been mainly based on embryonic stem cells. In this study, we transfer genes encoding interleukin 6 (IL-6) isolated from humans in to in vitro embryonic stem cells by using lentivirus vector. The IL-6 gene-screened embryonic stem cells were injected into recipient embryos at 0 h incubation to generate chimeric chickens carrying the transgenic cells. The results show that lentivirus vector capable of transferring genes into chicken embryonic stem cells for high efficiency and stability. One of nine obtained chicken was determined with the presence of transgenic IL-6 gene in the intestines.

Keywords: Transgenic chicken, embryonic stem cell, lentivirus vector, interleukin 6.


406

HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TOÀN QUỐC 2013

TỔNG HỢP ĐẦU DÒ GẮN HUỲNH QUANG PHỤC VỤ LAI FISH SỬ DỤNG KỸ THUẬT DOP–PCR Nguyễn Tiến Lung, Hoàng Thị Xoan, Nguyễn Lai Thành

Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

TÓM TẮT

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một kỹ thuật di truyền tế bào được sử dụng để phát hiện và xác định vị trí của trình tự ADN cụ thể trong tế bào. FISH sử dụng đầu dò gắn huỳnh quang liên kết với những vị trí đặc hiệu của nhiễm sắc thể tế bào đích. Trong nghiên cứu này chúng tôi thiết kế mồi và chuẩn hóa điều kiện phản ứng DOP–PCR để tổng hợp đầu dò gắn Alexa 568 đặc hiệu với gen interleukin–6 ở người. Đầu dò đã được tổng hợp với cường độ tín hiệu quỳnh quang cao, đồng thời đã bước đầu được sử dụng để phát hiện gen tương ứng trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen. Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển việc ứng dụng kỹ thuật FISH trong nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng tại Việt Nam.

Từ khóa: lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), đầu dò gắn huỳnh quang, DOP–PCR.

MỞ ĐẦU

Lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence In Situ Hybryzation – FISH) là một trong những phương pháp lai ADN được sử dụng phổ biến hiện nay. Trong phản ứng FISH, đầu dò đặc hiệu với một trình tự đích nào đó được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang, được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang, cho phép phát hiện và xác định vị trí của gen đích trên mẫu nghiên cứu. Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và chẩn đoán điều trị nhằm phát hiện những bất thường trên nhiễm sắc thể, nghiên cứu về khối u, lập bản đồ kiểu nhân, xây dựng hệ thống phát sinh loài,... Có thể nói FISH là cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học hiện đại, kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan bằng kính hiển vi (Bishop, 2010; Wolman, 1997).

Ở Việt Nam hiện nay, một số bệnh viện lớn như Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bệnh viên Nhi Trung ương,... đã sử dụng FISH để chẩn đoán một số bệnh di truyền ở người (Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc, 2008; Nguyễn Thị Tân Sinh et al, 2011). Tuy nhiên, trong nghiên cứu cơ bản, việc ứng dụng nó còn rất hạn chế. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc sử dụng phương pháp này để đánh giá sự chèn gen ngoại lai vào hệ gen của tế bào động vật. Mặt khác, trong những nghiên cứu trên, đầu dò sử dụng đều là các sản phẩm thương mại, hoặc được tự thiết kế nhưng đặt tổng hợp tại các hãng nổi tiếng, chưa tự tổng hợp tại phòng thí nghiệm sử dụng chúng (Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc, 2008; Nguyễn Thị Tân Sinh et al, 2011; Nguyễn Văn Nguyên et al, 2011).

Trước đây, chúng tôi đã tiến hành chuyển gen mã hóa interleukin–6 (IL–6) vào tế bào gốc phôi gà thông qua vector chuyển gen pL6/IL6 (dựa trên vector pLenti6/V5–DEST (Gateway), đã chèn thêm gen IL–6), gen chuyển đã được phát hiện trong tế bào bằng phản ứng PCR. Tuy nhiên khi tiêm những tế bào này vào phôi nhận, hiệu quả thu được không cao, nguyên nhân có thể do gen được chuyển chèn vào các vị trí gen hoạt động của tế bào, từ đó gây nên những biến động bất thường làm tế bào không thể hội nhập vào phôi nhận hoặc phôi bị chết (Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành, 2012). Vì vậy việc xác định vị trí chèn gen ngoại lai trên nhiễm sắc thể của tế bào, từ đó dự đoán ảnh hưởng của chúng là việc làm cần thiết. Nghiên cứu này tập trung theo hướng tổng hợp đầu dò đặc hiệu gen IL–6 người ngay tại phòng thí nghiệm làm nguyên liệu cho phản ứng lai.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế cặp mồi để tổng hợp đầu dò đặc hiệu gen IL–6 người

Các cặp mồi tổng hợp đầu dò (kích thước khoảng 300bp) đặc hiệu gen IL–6 người được thiết kế dựa trên trình tự cDNA bằng chương trình thiết kế mồi Primer3. Cặp mồi (IL6–F và IL6–R) có các thông số phù hợp nhất được kiểm tra khả năng tổng hợp với vector chuyển gen và ADN hệ gen tế bào chủ (hệ gen gà Gallus gallus domesticus) bằng công cụ tìm kiếm BLAST tại cơ sở dữ liệu NCBI. Sau khi kiểm tra, cặp mồi được đặt tổng hợp bởi hãng BioBasic.

Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR tổng hợp đầu dò

Trong nghiên cứu này, hai điều kiện được chuẩn hóa là nhiệt độ bắt cặp mồi và nồng độ Mg2+ của phản ứng (nồng độ Mg2+ càng cao, nhiệt độ bắt cặp càng thấp thì càng tăng hiệu suất PCR nhưng làm giảm độ đặc hiệu). Nồng độ các chất trong các phản ứng PCR bao gồm: dNTP 0,15 mM mỗi loại; các mồi IL6–F và IL6–R 0,5 mM mỗi loại; 0,1 U/µl Taq DNA polymerase; PCR buffer 1X (không chứa MgCl2); 0,3 ng/µl khuôn (vector pL6/IL6); MgCl2 ở dải nồng độ 1–4 mM. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR: 94oC trong 7 phút trước chu kỳ đầu tiên; 35 chu kỳ: biến tính 94oC trong 30 giây, gắn mồi với gradient nhiệt độ 45–55oC trong 30 giây, tổng hợp 72oC trong 30 giây; 72oC trong 7 phút sau chu kỳ cuối cùng. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1,5% và nhuộm ethidium bromide 2µg/ml để đánh giá hàm lượng ADN được tổng hợp. Ngoài ra, các mẫu sản phẩm cũng được giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130 Sequencer nhằm đánh giá mức độ tương đồng của sản phẩm tổng hợp với trình tự đầu dò theo thiết kế.

Tổng hợp đầu dò bằng phản ứng DOP–PCR

Thành phần phản ứng PCR tương tự như trên, trong đó nồng độ Mg2+ đã chuẩn hóa, nồng độ dTTP giảm xuống 0,05 mM, bổ sung Alexa 568–5–dUTP (Invitrogen) 1mM sao cho nồng độ cuối cùng là 0,10 mM. Chu kỳ nhiệt của phản ứng DOP–PCR: 94oC trong 7 phút trước chu kỳ đầu tiên; 35 chu kỳ: biến tính 94oC trong 30 giây, gắn mồi theo nhiệt độ tối ưu trong 60 giây, tổng hợp 72oC trong 60 giây và tăng thêm 2 giây sau mỗi chu kỳ; 72oC trong 7 phút sau chu kỳ cuối cùng. Sản phẩm tổng hợp được tinh sạch để sử dụng cho phản ứng lai FISH.

Đánh giá khả năng lai của đầu dò

Đệm lai chứa đầu dò được chuẩn bị với các thành phần có nồng độ như sau: 0,5–1,5 ng/µl đầu dò; formamide 50%;

668


SDS 0,1%; 300 ng/ml ADN tinh trùng cá; pha trong SSC 2X (NaCl 300 mM; sodium citrate 30 mM). Tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 được gắn lên lam, xử lý qua RNase và trypsin, sau đó ủ cùng 10µl đệm lai, biến tính ở 70oC trong 10 phút và lai ở 65oC qua đêm (ít nhất 12 giờ). Sau khi lai, tiêu bản được hạ từ từ nhiệt độ xuống 37oC, rửa qua formamide 20%/SSC 0,1X và SSC 2x, tiếp tục ủ cùng đệm phát hiện (BSA 5%; Tween 20 nồng độ 0,2%; pha trong SSC 4X) trong 30 phút. Các mẫu được nhuộm DAPI 2 µg/ml trong 10 phút trước khi phân tích bằng hệ thống hiển vi huỳnh quang Axiovert 100M Confocal LSM (Zeiss).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho gen IL–6 của người

Sử dụng chương trình Primer3, dựa trên trình tự cDNA của gen IL–6, chúng tôi thiết kế được 5 cặp mồi với các sản phẩm tương ứng có kích thước 288–336 bp có thể sử dụng làm đầu dò, trong đó cặp mồi có chất lượng tốt nhất theo kết quả xử lý của chương trình Primer 3 (kích thước sản phẩm 289bp) là:

IL6–F: TGC TCC TGG TGT TG (nhiệt độ tách mồi Tm = 46,2oC)

IL6–R: TTC ACC AGG CAA GT (Tm = 44,6oC)

Kết quả kiểm tra bằng công cụ Nucleotide – BLAST (BLASTn) cho thấy cặp mồi được thiết kế có độ đặc hiệu và độ nhạy cao với cDNA của gen IL–6 (độ tương đồng đạt 100%). Sử dụng trình tự đầu dò được nhân lên theo lý thuyết (kích thước 289bp), chúng tôi đánh giá khả năng bắt cặp của nó với vector pL6/IL6 và với hệ gen tế bào chủ (gà Lương Phượng Gallus gallus domesticus). Kết quả cho thấy đầu dò bắt cặp đặc hiệu với vector ở vị trí 2537–2835, nằm trong vị trí của gen chuyển IL–6 (ở vị trí 2485 – 3123), cho thấy khi tổng hợp đầu dò bằng vector pL6/IL6 sẽ thu được sản phẩm duy nhất trong gen IL–6. Khi kiểm tra với hệ gen gà Gallus gallus domesticus, đầu dò không bắt cặp được với vị trí nào, nên có thể sử dụng để kiểm tra khả năng chuyển gen IL–6 trên tế bào gà.

Kết quả tối ưu hóa điều kiện phản ứng

Nồng độ Mg2+ thường được sử dụng trong phản ứng PCR là 1,00 – 4,00 mM, trong khi nhiệt độ bắt cặp mồi thường cao hơn nhiệt độ biến tính 5–10oC. Trong nghiên cứu này chúng tôi tối ưu hóa điều kiện phản ứng với các thông số nhiệt độ bắt cặp mồi 45oC – 55oC và nồng độ ion Mg2+ 1,00 – 4,00 mM.

Kết quả đánh giá hiệu suất phản ứng bằng cách điện di sản phẩm PCR cho thấy, khi nồng độ Mg2+ tăng dần (1,00–3,25 mM), lượng sản phẩm sinh ra càng nhiều, nhưng khi nồng độ Mg2+ lên quá cao (4 mM) thì phản ứng PCR bị ức chế, lượng sản phẩm thu được ít hơn. Nhiệt độ gắn mồi 49,3oC cho kết quả khuếch đại gen tốt nhất trong các nhiệt độ được thử nghiệm. Trong tất cả các mẫu, mẫu ở nồng độ Mg2+ 3,25 mM và nhiệt độ gắn mồi 49,3oC thu được nhiều sản phẩm PCR nhất, tức băng điện di có độ sáng lớn nhất (Hình 27).

Yêu cầu quan trọng trong việc tổng hợp đầu dò là trình tự đoạn được khuếch đại phải đảm bảo chính xác. Vì vậy chúng tôi thu một số mẫu có độ sáng băng điện di khác nhau để tiến hành giải trình tự: nồng độ Mg2+ 1,75M và 3,25M, mỗi nồng độ đó chọn 2 mẫu có nhiệt độ gắn mồi 45,9oC và 49,3oC. Kết quả giải trình tự và so sánh trình tự thu được với trình tự đầu dò theo lý thuyết cho thấy các sản phẩm PCR đều có trình tự và vị trí tương đồng cao (trên 90%) với trình tự đầu dò theo lý thuyết. Mặc dù vậy, các mẫu đó cho mức độ tín hiệu khác nhau: mẫu tổng hợp ở điều kiện nồng độ Mg2+ 3,25M, nhiệt độ gắn mồi 49,3oC cho tín hiệu rõ nét nhất, độ nhiễu thấp; các mẫu còn lại có độ nhiễu cao hơn hoặc tín hiệu không rõ bằng (Hình 16).

Hình 27. Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ tới hiệu suất phản ứng

669


Hình 28. Kết quả giải trình tự các sản phẩm PCR và so sánh với trình tự đầu dò lý thuyết

Kết quả giải trình tự các mẫu (hình trên) và kết quả so sánh với trình tự đầu dò theo lý thuyết (hình dưới); Các mẫu tổng hơp ở các điều kiện khác nhau: Mg2+ 1,75 M; Ta = 45,9oC (1); Mg2+ 1,75 M; Ta = 49,3oC (2); Mg2+ 3,25 M; Ta = 45,9oC (3); Mg2+ 3,25 M; Ta = 49,3oC (4).

Kết quả tổng hợp đầu dò bằng phản ứng DOP–PCR

Hình 29. Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò

Các giếng 1-3: các mẫu đối chứng sau khi nhuộm ethidium bromide, tổng hợp với dNTP thường, khuôn tổng hợp: giếng 1 - H2O (đối chứng âm); giếng 2 - vector pL6/IL6; giếng 3 - ADN gà. Giếng 4: mẫu tổng hợp từ vector pL6/IL6 với thành phần phản ứng bổ sung dUTP đánh dấu, không nhuộm ethidium bromide.

Đầu dò được tổng hợp bằng phản ứng DOP–PCR, với thời gian tổng hợp ở 72oC được kéo dài sau mỗi chu kỳ, do nguyên liệu tổng hợp chứa thêm dUTP gắn Alexa 568 có cấu trúc cồng kềnh, cần thời gian dài hơn để vận chuyển cũng như gắn vào chuỗi tổng hợp.

Kết quả điện di cho thấy: băng kích thước 289bp (kích thước gần bằng băng 300bp ở thang chuẩn) thu được ở mẫu PCR sử dụng khuôn là vector chuyển gen pL6/IL6, trong khi không xuất hiện ở mẫu ADN hệ gen gà, chứng minh bằng thực nghiệm về độ đặc hiệu của cặp mồi với gen IL–6 người trên vector. Mẫu tổng hợp sử dụng dUTP đánh dấu Alexa 568 thu được băng có kích thước tương đương, độ sáng đủ quan sát bằng mắt thường khi không nhuộm qua các thuốc nhuộm đặc hiệu, cho thấy sản phẩm đã được đánh dấu với mức độ tương đối lớn (Hình 29). Sản phẩm này được tinh sạch nhằm chuẩn bị cho những nghiên cứu tiếp theo. Các mẫu đầu dò này đều cho cường độ huỳnh quang (theo chỉ số đơn vị huỳnh quang tương đối – RFU) ở bước sóng 665 nm là 102,1–106,5. Kết quả lai FISH sử dụng đầu dò

Sử dụng đầu dò đã tổng hợp thực hiện phản ứng lai FISH với tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người, chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở Hình 23.

Hình 30. Kết quả lai FISH trên tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người sử dụng đầu dò đã tổng hợp

(ĐC) Mẫu đối chứng; (TN) mẫu chuyển gen. Nhân tế bào được nhuộm với DAPI bắt màu xanh lam. Các vị trí bắt cặp đặc hiệu giữa đầu dò đánh dấu Alexa 568 và ADN nhân tế bào có màu đỏ (vị trí mũi tên).

Thảo luận về tiềm năng ứng dụng của đầu dò tổng hợp tại chỗ bằng DOP–PCR

Ở Việt Nam, kỹ thuật FISH đã được ứng dụng ở một số bệnh viện lớn cũng như viện nghiên cứu hải sản, tuy nhiên đầu dò sử dụng đều là các sản phẩm thương mại, hoặc được tự thiết kế nhưng đặt tổng hợp tại các hãng nổi tiếng (Đặng

670


Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc, 2008; Nguyễn Thị Tân Sinh et al, 2011; Nguyễn Văn Nguyên et al, 2011). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thiết kế mồi và tự tổng hợp đầu dò đánh dấu Alexa 568 bằng phản ứng DOP–PCR ngay tại phòng thí nghiệm.

Thực nghiệm cho thấy công việc này không hề đơn giản. dUTP gắn Alexa 568 có cấu trúc cồng kềnh gây nhiều khó khăn cho quá trình tổng hợp ở điều kiện phòng thí nghiệm. Tỷ lệ nồng độ dUTP : dTTP trong phản ứng PCR theo chỉ dẫn của nhà sản xuất là 1:3, nhưng phải đến khi chúng tôi phải nâng dần lên 2:1 thì thu được kết quả tương đối khả quan. Khả năng tổng hợp của Taq DNA polymerase cũng cần được xét đến. Thực tế là một số loại Taq của Promega (GoTaq®), Invitrogen, hoặc được cung cấp bởi một số đơn vị trong nước đã được thử nghiệm nhưng không thu được hiệu quả mong muốn, cho đến khi sử dụng DNA Taq Polymerase (Cat. No. M0267L, New England Bio Lab). Nguyên nhân vẫn còn là ẩn số đối với chúng tôi.

Trong nghiên cứu này, đầu dò được thiết kế sao cho có kích thước khoảng 300bp để đủ tín hiệu huỳnh quang phát hiện được dưới kính hiển vi, nhưng đây là con số tương đối lớn khi sử dụng. Chúng tôi phải tiến hành phản ứng lai ở nhiệt độ khá cao (65oC, so với đầu dò oligo thương mại là 37oC) mới bước đầu thu được kết quả.

Trong những nghiên cứu đang tiến hành, chúng tôi tiếp tục tối ưu hóa các điều kiện để giảm hàm lượng dUTP sử dụng trong phản ứng PCR, cũng như các thử nghiệm tổng hợp đầu dò mạch đơn, hoặc bẻ gãy đầu dò nhằm nâng cao hiệu suất của phản ứng FISH. Đầu dò đã tổng hợp cũng được tiếp tục sử dụng nhằm xác định vị trí chính xác hơn (vị trí nào, trên nhiễm sắc thể nào) của gen chuyển IL–6 trong tế bào gốc phôi gà.

KẾT LUẬN

Chúng tôi đã thiết kế cặp mồi và chuẩn hóa các điều kiện để tổng hợp được đầu dò gắn Alexa 568 đặc hiệu với gen IL–6 của người. Cặp mồi được thiết kế có trình tự TGC TCC TGG TGT TG (IL6–F) và TTC ACC AGG CAA GT (IL6–R), nhân bản đoạn ADN có kích thước 289bp từ cDNA của gen IL–6. Điều kiện PCR thích hợp nhất về nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ để tổng hợp tương ứng là 49,3oC và 3,25 mM. Sử dụng phương pháp DOP–PCR, chúng tôi đã tổng hợp được đầu dò đặc hiệu cho gen IL–6 của người và đã chứng minh được rằng có thể sử dụng để phát hiện gen tương ứng trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen. Lần đầu tiên ở Việt Nam, chúng tôi đã tự tổng hợp đầu dò ngay tại phòng thí nghiệm sử dụng cho lai FISH. Điều này có ý nghĩa quan trọng cho các nhà nghiên cứu có thể chủ động tạo nguồn đầu dò tương ứng với bất kỳ gen nào được quan tâm ở từng thí nghiệm.

Lời cảm ơn. Nghiên cứu này là một phần kết quả của đề tài “Sử dụng kỹ thuật FISH để kiểm tra sự hội nhập của gen IL-6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen” được Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á – ĐHQG Hà Nội tài trợ kinh phí. Chúng tôi xin chân thành cảm hơn nhóm nghiên cứu Phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ hoàn thiện vector chuyển gen sử dụng cho nghiên cứu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Bishop R (2010), Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons 3(1): 85-95. Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc (2008), Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang tại chỗ trong phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Tạp chí nghiên cứu y học 57: 57-62. Nguyễn Thị Tân S inh, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Đinh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Liễu, Nguyễn Thanh Liêm (2011), Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp. Tạp chí Y học lâm sàng Số đặc biệt tháng 2/2011: 253-258. Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành (2012), Thử nghiệm chuyển gen IL-6 người bằng lentivirus vào tế bào gốc phôi gà. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 50(3C): 401-406. Nguyễn Văn Nguyên, Lê Thanh Tùng, Lưu Xuân Hòa, Vũ Tuấn Nam, Vũ Minh Hào, Đinh Thái Bình (2011), Thử nghiệm kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ F.I.S.H nhận diện nhanh và chuẩn xác một số loài tảo giáp độc hại, in Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học và công nghệ biển toàn quốc lần thứ V. p. 261-268. Wolman SR (1997), Applications of fluorescence in situ hybridization techniques in cytopathology. Cancer Cytopathology 81(4): 193-197.

PRODUCE FLUORESCENT–LABELING PROBE FOR FISH USING DOP–PCR ASSAY Nguyen Tien Lung, Hoang Thi Xoan, Nguyen Lai Thanh

Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam

SUMMARY

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a cytogenetic technique that is used to detect and localize specific DNA sequences in cells. FISH uses fluorescent–labeling probes that specifically bind to those parts of a chromosome in target cell. In this study, we design and optimize condition of DOP–PCR reaction for produce Alexa 568–labeling probe which specifically bind with human interleukin–6 gene. Probe was produceed with hight fluorescent intensity, and used to detect corresponding gene in transgenic chicken embryonic stem cells. This result contributes to the development of the FISH technique applied basic research and application in Vietnam.

Keywords: fluorescence in situ hybridization (FISH), fluorescent–labeling probe, DOP–PCR.

671

Documents

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 3 – Kết quả và thảo luận