Śladami nagrody Nobla. Chemia i światło -od reakcji fotochemicznych do diagnostyki medycznej

Świetlik świętojański Liść Mikroskop fluorescencyjny

dr hab. Damian PlażukKatedra Chemii Organicznej

Wydział ChemiiUniwersytet Łódzki

Zastosowanie metod optycznych w biologii i medycynie

- Obrazowanie na poziomie molekularnym (białka)

- Obserwacja dynamiki wirusów i bakterii

- Farmakokinetyka w czasie rzeczywistym

- Monitoring po terapiach

- Mikro i nano chirurgia

- Nieinwazyjne lub mało inwazyjne terapie nowotworów

Nagroda Nobla

Nagroda Nobla – wyróżnienie przyznawane za wybitneosiągnięcia naukowe, literackie lub zasługi dla społeczeństwi ludzkości, ustanowione ostatnią wolą fundatora,szwedzkiego przemysłowca i wynalazcy dynamitu

Alfred Nobel21.X.1833-10.XII.1896

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:AlfredNobel_adjusted.jpg https://en.wikipedia.org/wiki/File:Nobel_Prize.png

Eric Betzig, Stefan W. Hell and William E. Moerner „za zbudowanie super rozdzielczego mikroskopu fluorescencyjnego".

Eric Betzig

Urodzony: 13 Stycznia 1960, Ann Arbor, MI, USA

Stefan W. Hell

Urodzony: 23 Grudnia 1962, Arad, Rumunia

William E. Moerner

Urodzony: 24 Czerwca 1953, Pleasanton, CA, USA

Miejsce pracy w chwili przyznania nagrody: Stanford University,

Stanford, CA, USA

Miejsce pracy w chwili przyznania nagrody : Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen,

Germany, German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany

Miejsce pracy w chwili przyznania nagrody: JaneliaResearch Campus, Howard Hughes Medical Institute,

Ashburn, VA, USA

Nagroda Nobla w Chemii w 2014 roku

Mikroskopy optyczne

Hans i Zachrias Jansen, ok. 1590 powiększenie ok. 10 razy!

Engelbert & Hensoldt 1870

Galileo Galilei

Robert Hooke –księga „Micrographia” – opisał szeroki zakres obserwacji wykonanych swoim mikroskopem

Anton van Leeuwenhoek – uzyskał duże powiększenia – jako pierwszy obserwował bakterie (XVII wiek)

Mikroskop Cuff’a – oferował ok

45-100 x powiększenie –

rozdzielczość nie lepsza niż 10 mikronów

Do czego przyczyniły się mikroskopy optyczne?

- powstały nowe dziedziny nauki, cytologia oraz mikrobiologia

- możliwy był ogromny postęp w leczeniu chorób zakaźnych.

W roku 1882 Robert Koch odkrył z pomocą mikroskopu

bakterie gruźlicy

- Wykorzystano go do obserwacji podziału chromosomów w

jądrze komórkowym

Jak mikroskop optyczny stał się nanoskopem?

Eric Betzig, Stefan W. Hell oraz William E. Moerner otrzymali nagrodę Nobla w chemii w roku 2014 za

przekroczenie domniemanej bariery Abbye’go uniemożliwiającej obserwacje mikroskopowe z rozdzielczością poniżej

0,2 m (200 nm). Wykorzystując zjawisko fluorescencji, naukowcy ci mogli po raz pierwszy obserwować procesy

zachodzą w żywych komórkach z rozdzielczością nanometrową.

Mrówka Włos Komórka ssaka bakteria mitochondrium wirus białko mała cząsteczka

Ernst Abbe's formula for the diffraction limit, set in stone at a monument in Jena.

Limit rozdzielczości mikroskopu optycznego (limit Abbe’go)Nic mniejszego przy użyciu mikroskopu optycznego nie można zobaczyć

Wynik oddziaływania światła ze związkami chemicznyminie zawsze jest oczywisty

Cząsteczka Cząsteczka

Absorbcja fotonu

(wzbudzenie)

Cząsteczka wzbudzona

Stan wzbudzony

Emisja (wypromieniowanie)

fotonu

Stan podstawowy

Co się może stać, gdy naświetlamy cząsteczkę światłem?

Przejście bezpromieniste

Diagram Jabłońskiego – wersja b. uproszczona

Diagram Jabłońskiego – wersja „pełna”

https://www.google.pl/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwioibzR7u7JAhWBqSwKHb8YAq4QjRwIBw&url=http%3A%2F%2Fwww.olympusmicro.com%2Fprimer%2Fjava%2Fjablonski%2Fjabintro%2F&psig=AFQjCNG4jPBPoXCXP5uqlhLfpMYjYbyJ6Q&ust=1450852947398454

Fluorescencja

1819, Edward D. Clarke oraz w roku 1822 René Just Haüyopisują fluorescencję fluorytu1833, Sir David Brewster opisuje fluorescencję chlorofilu1845, Sir John Herschel opisuje fluorescencję chininy

Fluorescencja fluorytu(CaF2)

Fluorescencja chininy w napoju gazowanym

Fluorescencja chlorofilu

Fluorescencję opisano po raz pierwszy już w 1560.Bernardino de Sahagún oraz w 1565 by Nicolás Monardes opisali fluorescencję napoju moczopędnym znanym jako „lignum nephriticum”

Matlalina – związek fluorescencyjny zawarty w drzewie Narra(Eysenhardtia polystachya)

http://www.wikiwand.com/es/Fluorescencia

1852 George Gabriel Stokes – opisuje w publikacji pt. „Refrangiblity” (zmiana długości fali),zamianę niewidzialnego światła (ultrafioletowego) na widzialne światło barwy niebieskiej przezminerał fluoryt oraz szkło uranowe. Nazywa to zjawisko fluorescencją. Różnica w przesunięciuwartości maksimum emisji w stosunku do maksimum absorbcji nazywane jest „przesunięciemStokes’a”

Przykłady szkła uranowego w świetle widzialnym oraz w świetle UV (niewidzialnym)https://www.google.pl/search?q=matlalina&biw=1920&bih=926&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwj8utnp7u7JAhVpnnIKHUEXC2UQ_AUIBygC#tbm=isch&q=+uranium+glass

Fluorescencja w naturzeFluorescencja w żywych organizmach

Biofluorescencja – ma miejsce tylko wtedy, gdy następujeabsorbcja promieniowania przez organizm a następnieemisja promieniowania o niższej energii (dłuższej fali)

Biofosforescencja – podobna do biofluorescencji – różnicajest jedynie w czasie jej trwania, utrzymuje się długo pousunięciu źródła wzbudzającego

Pokolec turkuowy (Acanthurus coeruleus)

Swellshark (Cephaloscyllium ventriosum)

Kaupichthys brachychirus

Kaupichthys nuchalis

Pipefish (Corythoichthys haematopterus)

Fluorescencja podczas fotosyntezy

W trakcie fotosyntezy rośliny emitują promieniowanie niewidoczne gołym okiem, ale możliwe do zarejestrowania przez detektory np. w satelitach

http://svs.gsfc.nasa.gov/cgi-bin/details.cgi?aid=4086

http://svs.gsfc.nasa.gov/cgi-bin/details.cgi?aid=4086

Fluorescencja obserwowana w trakcie fotosyntezy

Bioluminescencja – emisja promieniowania widzialnego następuję w organizmach żywych w wyniku reakcji chemicznych

98% energii wydziałane jest w postaci światła! Bioluminescencja kryla

Bioluminescencja świetlika świętojańskiego (Lampyris noctiluca)

Bioluminescencja – dlaczego świetliki świętojańskie świecą?Światło wytwarzane przez świetlika świętojańskiego powstaje w wyniku reakcji utleniania lucyferyny z wykorzystaniem . enzymu lucyferaza.

Lucyferaza

Lucyfryna robaczka świętojańskiego

Stan wzbudzony!

Cząsteczka Cząsteczka

Absorbcja fotonu

(wzbudzenie)

Cząsteczka wzbudzona

Stan wzbudzony

Emisja (wypromieniowanie)

fotonu

Stan podstawowy

Tylko światło dużo ciepła, trochę światła

Świetliki Ludzie

Czy istnieje inna niż naturalna luminescencja?

Chemiluminescencja

Bioluminescencja

Elektrochemiluminescencja

Crystaloluminescencja

Elektroluminescencja

Katodoluminescencja

Mechanoluminescencja

Truyboluminescencja

Piezoluminescencja

Sonoluminescencja

Fotoluminescencja

Fluorescencja

Fosforescencja

Radioluminescencja

Termoluminescencja

Crioluminescencja

Chemiluminescencja – emisja światła następuje na drodze reakcji chemicznej

Reakcja z tlenempowstają nadtlenki

Dianion, stan podstawowy (S0)

Dianion, stan wzbudzony singletowy

(S1)

Dianion, stan zbudzony trypletowy (T1)

Fluorescencja materii nieożywionej

Fluorescencja związków organicznych i nieorganicznych

Cząsteczka Cząsteczka

Absorbcja fotonu

(wzbudzenie)

Cząsteczka wzbudzonaStan wzbudzony

Emisja (wypromieniowanie)

fotonu

Stan podstawowy

http://www.materiaienergia.pisz.pl/materia_energia.html

Czy możemy wykorzystać zjawisko fluorescencji w diagnostyce medycznej?

TAK – możemy!

Pytanie - jak?

Autofluorescencja – wykorzystuje obecne w komórkach fluorofory, np: kolagen, elastyna, NAD, tryptofan, keratyna etc.– występujące w pod nabłonkowej warstwie tkanki łącznej – metoda została zatwierdzona do wczesnego wykrywania rakaoskrzeli

Związki podawane z zewnątrz fluoryzują po związaniu z tkanką nowotworową – technika stosowana w urologii. Stosuje się różne substancje m.in. kwas 5-aminolewulinowy i jego ester heksylowy, tetracyklinę, hyperycynę, Photofrin®. Dla hyperycynyoraz porfiryn wzbudzenie światłem widzianym, emisja w czerwieni (590-700 nm).

Do wykonania badania niezbędny jest endoskop wyposażony w źródłoświatła wzbudzającego oraz detektor rejestrujący fluorescencję.

W świetle widzialnym Fluorescencja komórek nowotworowych

Znakowanie kwasem 5-aminolewulinowym

http://www.europeanurology.com/article/S0302-2838(07)01524-2/fulltext/photodynamic-diagnosis-in-urology-state-of-the-art-img-src-manager-uploads-europeanurology-com-eur-articles-s0302-2838-07-01524-2-assets-eulogo1-jpg-alt-eulogo1#section-3-autofluorescence

Pierwsze próby zastosowania tetracyklin w diagnostyceFluorescencyjnej przeprowadzono w 1957 roku.

Wszystko zależy od tego co chcemy zobaczyć

http://goryochemical.com/english/products/proteofluor/proteogreen-gglu.html

Zalety metod fluorescencji w diagnostyce medycznej:- szybkość; - łatwość wykonania; - nieinwazyjność; - selektywność; wysoka czułość

ProteoGREEN™-gGlu – selektywny znacznik komórek nowotworowych. Aktywowany przez g-lutamylotranspeptydazę(GGT), o której wiadomo, że jest enzymem związanym z nowotworami, z uwolnieniem silnie fluoryzującego związku.

Wykorzystanie cystoskopu do wykrywania i leczenia nie drobnokomórkowego raka pęcherza moczowego

https://www.youtube.com/watch?v=0aa-6WQLaPM

http://canjurol.com/howidoit-html.php?ID=2359

Operacja usunięcia raka jajnika z wykorzystaniem technik fluorescencyjnych

https://www.youtube.com/watch?v=xTXJMTH60i8

Do czego jeszcze możemy wykorzystać zjawisko fluorescencji?

Czy możemy wykorzystać fluorescencję w mikroskopii, i co nam to umożliwia?

Próbka spermy śledzia barwiona zielenią SYBROświetlana niebieskim laserem w mikroskopie epifluorescencyjnym

Mikroskop fluorescencyjny – rodzaj mikroskopu świetlnegoużywany w badaniach substancji organicznych i nieorganicznych,którego działanie oparte jest na zjawisku fluorescencjii fosforescencji, zamiast, lub razem ze zjawiskami odbiciai absorpcji światła (co jest wykorzystane w klasycznym mikroskopieoptycznym).

•fluorofory wykazujące powinowactwo do określonych organelli (np. DiI wiąże się specyficznie z błonami

komórkowymi),

•fluorofory, których właściwości fluorescenycjne zależą od parametrów mikrośrodowiska, np. jego pH, lub

stężenia jonów wapnia (Fluo-4, Fura-2);

•fluorofory sprzężone z substancjami wykazującymi specyficzne powinowactwo do określonych białek (np.

rodamina sprzężona z falloidyną, toksyną Ammanita phalloides, łączącą się specyficznie z F-aktyną;

•fluorofory koniugowane z przeciwciałami, bezpośrednio lub pośrednio wiążącymi się z określonymi antygenami;

•białka fluorescencyjne;

•fluorochromy zdolne do przenikania przez błonę komórkową determinujące komunikację międzykomórkową,

np. kalceinę;

•analizami ilości i wewnątrzkomórkowej lokalizacji wybranych struktur na poziomie białka (Western Blot) i

mRNA (RT-PCR)

Zastosowania mikroskopii fluorescencyjnej

-tubulina (w pierwotniaku - Tetrahymena) Włókna aktyny

Mikroskopia konfokalna – odmiana mikroskopii świetlnej charakteryzująca się powiększonym kontrastem, azatem

i rozdzielczością. Używana do uzyskania wysokiej jakości obrazów oraz rekonstrukcji obrazów w trzechwymiarach. Zasada mikroskopii konfokalnej w porównaniu z klasyczną świetlną - szerokiego pola, opiera się nausunięciu, poprzez zastosowanie przesłon przy wejściu do detektora, światła, które wpadło do obiektywu spozapłaszczyzny ogniskowania. Usuwa się także wszelkie odbłyski nie pochodzące bezpośrednio z miejscaogniskowania. Podstawy obrazowania konfokalnego zostały opatentowane przez Marvina Minsky'ego w 1961.

Zasada działania mikroskopu konfokalnego

- Promień lasera pada na lustro dichroiczne o selektywnym odbiciu fal świetlnych

- Wiązka przechodzi przez lustra skanujące, które dzięki minimalnym ruchom obrotowym mogą nią kierować

- Obiektyw skupia wiązkę w jednym punkcie, która wzbudza wyznakowany barwnikiem preparat co powoduje emisję dłuższej fali świetlnej

- Wiązka powraca tą samą drogą przez lustra skanujące i dichroiczne, po czym natrafia na przesłonę z niewielkim otworem

- Wreszcie wiązka dociera do detektora

Wpływ czynników otoczenia.

Blaknięcie.

Fototoksyczność.

Nadal gorsza rozdzielczość niż w mikroskopie elektronowym.

Wysoka cena.

Zalety mikroskopii konfokalnej Wady mikroskopii konfokalnej:

Zastosowanie pinhola przed detektorem (na przykładkamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza płaszczyznyogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakośćuzyskanego obrazu – ostrość i barwność.

Możliwość rekonstrukcji obrazu 3D i 4D.

Pozwala na rejestrowanie obrazów cienkich warstwpreparatu, czyli przekrojów optycznych badanychobiektów. Z tego powodu jest on często stosowany dorejestracji serii przekrojów optycznych na różnychgłębokościach preparatu.

Eliminuje problem poświaty wynikającej z warstwpreparatu leżących poza płaszczyzną ostrości.

Oferuje lepszą rozdzielczość niż tradycyjna mikroskopiaoptyczna.

Możliwość wizualizacji żywych preparatów.

Mimo ogromnej przewagi nad zwykłymmikroskopem, dotychczas produkowane mikroskopykonfokalne podlegają, podobnie jak zwykłymikroskop, ograniczeniu rozdzielczości przestrzennej,wynikającemu z praw fizyki falowej, co nie pozwalana obrazowanie struktur mniejszych niż ok. 200 nm(tzw. limit Abbego). Jest to duży mankamentutrudniający lub uniemożliwiających prowadzenieszeregu badań w wielu dziedzinach naukbiomedycznych w tym w neurobiologii.

Czy można jeszcze bardziej poprawić rozdzielczość w mikroskopie optycznym/fluorescencyjnym?

Mikroskopia 2-fotonowa

http://mcb.berkeley.edu/labs2/robey/content/2-photon-imaging

488 nm 900 nm(1 foton) (2 fotony)

Absorbcja jednego dwóch fotonówfotonu

Prawdopodobieństwo wzbudzenia fluoroforu przez dwafotony jest niskie i zależne od kwadratu natężenia wiązkiwzbudzającej. Jednak zapewnia to, że wzbudzenie nastąpitylko w punkcie ogniskowania wiązek.

Wzbudzanie (2D) wiązka wygaszająca obserwowany obraz

A może jeszcze bardziej można poprawić rozdzielczość w mikroskopie fluorescencyjnym?

Fluorescencja

Wymuszona emisja

Za co Eric Betzig, Stefan W. Hell i William E. Moerner dostaliNagrodę Nobla?

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/introduction.html

Zasada działania super rozdzielczego mikroskopu STED

Soczewka skupiająca

Emisja dodetektora

Zwierciadładichromatyczne

Laser wzbudzający

Laser wygaszający

Obiektyw

Soczewka skupiająca

Soczewka skupiająca

Obraz klasyczny

Obraz STED

Podsumowanie

- Nagroda Nobla 2014 z chemii – za opracowanie wysokorozdzielczego mikroskopu fluorescencyjnego, tzw. nanoskopu

- Metody fluorescencyjne wykorzystywane są w diagnostyce nowotworowej – zarówno w metodach nieinwazyjnych

jak i mało inwazyjnych (metody endoskopowe) jak również w „klasycznej” chirurgii

- Metody fluorescencyjne umożliwiają obserwację procesów zachodzących w żywych komórkach

- Możliwe jest specyficzne oraz wczesne wykrywanie zmian nowotworowych

Czas na

programu, czyli

Eksperymenty!