Laboratoriediagnostik av svampinfektioner

Erja Chryssanthou

JästUnicellulära

Knoppande jästceller (blastosporer)

Foto Dan Eshel

Pseudohyf, förlängda jästceller som bildar kedjor, förökning genom unipolar knoppning

Candida albicans äkta hyfer•

Bildas i närvaro av

serum• Växer apikalt• Liknar mögelhyfer:

•Aspergillus och Penicillium•

Hjälper C. albicans att

fästa och penetrera värdceller

Trådsvampar (mögel, dermatofyter)Multicellulära

Septerade hyferSepta med porerAspergillus, Fusarium, dermatofytarter

Osepterade hyferzygomyceter: Absidia, Rhizomucor, Rhizopus, Mucor arter

Svampar•

Karakteristisk livscykel

•

Olika morfologiska former•

Växling mellan sexuell och asexuell förökning

•

Den sexuellt förökande svampen kallas teleomorf•

Den asexuella anamorf

•

En del har flera olika typer av anamorfer (=synamorf)•

T.ex Pseudoallescheria boydii (teleomorf)

•

Synanamorf Scedosporium apiospermum och Graphium eumorphum

Taxonomi•

Minst 100 000 olika svampar

•

397 arter i Atlas of Clinical Fungi (de Hoog)

•

Heterotrofiska eukaryota

•

Nomenklatur•

Hierarkisk indelning

•

Division :-mycota•

Klass

:-mycetes

•

Order :-ales

•

Familj :-acea

•

Genus•

Species

Kliniskt viktiga grupper•

Fungi (svamp) Eumycota

•

Äkta svampar•

Division

•

Zygomycota (släkten Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Absidia)

•

Ascomycota (släkten Aspergillus, Fusarium, Candida, dimorfa svampar, dermatofyter)

•

Basidiomycota (släkten Cryptococcus, Trichosporon, Malassezia)

Laboratoriediagnostik

Mikroskopi •Direktpåvisning av svampstrukturer i provmaterial

• Fluorescensmikroskopi känsligare än vanlig ljus•

Fluorescerande färg binder till β-glucan i cellväggen

•

Blankofor, calcofluor white

Foto D. Denning

Nyttan med mikroskopi

• Snabb metod, invasiv infektion

• Skilja jästsvamp från Aspergillus och zygomyceter•

Jästceller + pseudohyfer

•

Septerade hyfer med dikotoma (45 gr) förgreningar•

Aspergillus, Fusarium och Scedosporium liknar varandra

•

Breda osepterade ”bandliknande”

hyfer hos zygomyceter

•

Kan vara svårt• Odling för zygomyceter kan vara negativ

Jästceller

Aspergillus hyfer

Zygomycet

hyfer

MikroskopiDiagnostisk för vissa dimorfa (endemiska) svampar

•

Coccidioides immitis sferula•

Små

Histoplasma capsulatum jästceller i

magrofager

Histologisk undersökning

•

Påvisande av svampstrukturer i vävnadsnitt

• Periodic acid schiff

(PAS)•Bakgrundens cellstruktur (t. ex hyfer i blodådra)

•

Silverfärgning (Grocott’s Methenamine

Silver)

•Känsligare

Jäst

Aspergillus

Immunohistokemi

Henrik Jensen (Avd för Veterinär

Patobiologi, Köpenhamns Universitet)

Specifika antikroppar mot

Candida, Aspergillus, Fusarium och

Rhizopus

© H.E. Jensen

© H.E. Jensen

Aspergillus

Odling

Odling

Blododling•

Okänslig markör för

invasiv

svampinfektion•

Bättre system idag

•

BacT/Alert System (bioMérieux)

•

Bactec

System (BD)–

Mycosis

IC/F medium för svamp

•

Likvärdiga system men Mycosis

flaskan upptäcker flera fall av blandinfektion med jäst+bakterier

Odling

• 401 svenska

candidemifall

05-0660.6 % C. albicans20.2 % C. glabrata9.0 % C. parapsilosis3.7 % C. dubliniensis2.0 % C. tropicalis2.0 % C. lusitaniae1.2 % C. krusei1.0 % andra arter

Fördelning efter klinik på 304 candidemier 1997- juni 2009 vid Karolinska, Solna

122; 41%

82; 27%

43; 14% 18; 6%16; 5%

8; 3%7; 2%

7; 2%1; 0%

IVA

Barn+neonatal+neoiva

Kirurgi

Infektion

Medicin

Urologi

Hematologi+onkologi

Geriatri

Öron

Övervakningsodlingar

Koloniseringsindex•

Antal koloniserade områden/

provtagna

områden

•

>0.5•

Vilka patienter ska

provtas?

•

ECMO, brännskade-, hematologiska patienter

Isolering och

artidentifiering

viktigt

Olika svampar olikakänslighet för

antimykotika

C. albicans känsligC. glabrata nedsatt känslighetför

flukonazol,

itrakonazol

och ofta

för

vorikonazol

Zygomyceter

naturligt resistenta motvorikonazol

och

echinocandiner

Cryptococcus, Fusarium,Trichosporon naturligt resistentamot

echinocandiner

Serologisk diagnostikImmunoelektroosmofores

(IEOP)

Antikroppsbestämning

Aspergillus IgG•

Aspergilloma

•

CF-patienter

Antikroppsbestämning

Endemiska svampar•

Histoplasma,

Coccidioides,

Blastomyces,

Paracoccidioides•

IgG

2-6 v

•

Känslighet ca 80%•

Korsreaktioner

Antigentest

för

Histoplasma,

Coccidioides,

Blastomyces (www.miravistalabs.com)

•

Serum/plasma, BAL,

likvor, urin

Galactofuranos-antigenerSvampens cellvägg

•

Galactomannan•

Utsöndras vid

hyfväxt

•

Polysackarid•

Platelia Aspergillus

ELISA (Bio-Rad)

•

FDA godkänd•

EORTC/MSG

fungal

definitions consensus

guidelines:

sannolik IFI diagnos•

1,3-β-D-glucan

•

4 kommersiella

testkit•

Fungitell

test (Cape

Cod)

–

EORTC sannolik IFI diagnos–

FDA godkänd 2003

Aspergillus

cellvägg

Galactomannan

Galactomannan

antigen

Aspergillus

Double

sandwich enzym

immunoassay

Ett indexvärde•

Provets optisk densitet delas med

kitberoende

”tröskel”

serum•

Serum och

likvor

(gräns för positivt resultat ≥

0,5),

bal (≥

1,0)

Aspergillus

antigen ELISA

Neg kontroll

Positivt prov

Tröskel kontroll

Poskontroll

Galactomannan

Falskt positiva test•

GM eller molekyler som reagerar med EIA antikroppen

•

Vissa andra svampar I mat, mjölk, Plasmalyte för Bal•

Bifidobacterium spp. korsreaktiva

epitoper

•

Mukosit

i mag-tarmkanalen•

B-lactam

antibiotika

•

Piperacillin-tazobactam,

amoxicillin-clavulansyra–

Semisyntetiska från

Penicillium

Falskt negativa test•

Anti-aspergillus

antikroppar

•

Profylax eller empirisk behandling med

antimykotika

Galactomannan

Högt negativt prediktivt värde (98,5%) (Maertens2007)

Hög specificitet (>95%)

Surrogat markör för behandlingseffekt•

Flera studier, sjunkande antigennivåer vid positiv behandlingseffekt

Upprepad screening med lung-CT och GM•

Mindre empirisk behandling (Maertens

2005)

GalactomannanScreening av serum för tidig detektion av invasiv

aspergillos hos neutropena ell. stamcellstransplanteradepatienter

Hur bra är det för icke-hematologiska patienter?

Analys av balKänslig metod för hematologiska och icke-hematologiska patienter (organtransplanterade, ICU, AIDS)Högt positivt prediktivt värdeKonfirmerande diagnostisk test under pågående sjukdom

1-3-beta-D-Glucan

antigen

• Candida, Aspergillus, Fusarium, Pneumocystis

• Ej hos

zygomyceter

• Låga nivåer

Cryptococcus

• Serum

β-glucan

En

proteas-zymogen-baserad kolorimetrisk

kinetisk analys

β-glucan• Varierande känslighet i olika studier

• Högt negativt prediktivt värde

• Begränsningar•

Data för nyfödda och spädbarn <6 mån saknas

• Falskt positiva testresultat•

Glukaninnehållande

gasväv

•

Hemodialyspatienter•

Antibiotika med svampursprung (piperacillin)

•

Albumin och immunoglobuliner•

β-glucan

reaktivitet hos P. aeruginosa, A. faecalis, S.

pneumoniae

Cryptococcus

Antigen påvisning

Likvor, serum, urin

Latex test•

Kommersiell

•

Mycket känsligEIA test

•

Samma känslighetsom agglutination

Molekylär diagnostik

rDNA

av

Aspergillus target

för PCR

PCR•

PCR ingår inte i EORTC definition av sannolik IFI diagnos

•

Standardisering av metodik behövs•

In house

•

Få

kommersiella metoder•

Europeisk initiativ ISHAM:

•

Olika PCR metoder•

Detektion ok

•

DNA extraktion fungerar sämre

PCR

Kvarvarande frågor:•

Optimal provmaterial

•

Serum/plasma: fritt DNA•

Helblod: cell-associerad DNA

•

Huddinge analyserar både plasma och cellfraktion•

Likvor: både fritt och cell-ass. DNA

•

Biopsier (färska prov)•

Bal: fördel att svamp (jäst,

conidia ell. hyfer) finns

•

Kinetik av

Aspergillus DNAemia

i blodet•

Tidpunkt för provtagning