LABORATOR 1

TEHNICI MICROSCOPICE DE ANALIZ MICROSTRUCTURAL

Microscopia este tehnica folosit pentru producerea de imagini vizibile ale unor

structuri sau componente prea mici pentru a fi vzute cu ochiul liber. Aparatul

folosit n microscopie se numete microscop.

Microscopul este instrumentul folosit pentru vizualizarea obiectelor care sunt

prea mici pentru a fi observate cu ochiul liber. Acest instrument ndeplinete trei

sarcini:

- produce o imagine mrit a specimenului analizat;

- separ detaliile din imagine;

- reprezint (face vizibil) pentru ochiul uman imaginea obinut.

Microscopia i-a gsit o larg rspndire n industria alimentar, fiind folosit cu

succes la analiza microorganismelor implicate n bioprocese [Oprean i

Mironescu, 2000], la vizualizarea componentelor i transformrilor care au loc n

produsele alimentare sub influena diferiilor factori [Indrani i colab, 2003].

Cele mai utilizate tipuri ce microscoape sunt microscopul optic i microscopul

electronic.

a) Microscopul optic

Microscopul optic este cel mai vechi i mai ntlnit tip de microscop.

Principiul lui de funcionare se bazeaz pe folosirea luminii vizibile i a unui

sistem de lentile pentru mrirea imaginii. Principala parte component este un

ansamblu alctuit din dou sisteme de lentile care formeaz obiectivul i

ocularul. Obiectivul d o imagine real, rsturnat i mrit a specimenului

studiat, iar ocularul preia aceast imagine i o transform ntr-una virtual,

rsturnat i mrit, astfel nct imaginea final este virtual, dreapt i mrit.

Obiectivul este cea mai important parte component a unui microscop,

deoarece acesta determin calitatea imaginii obinute. n figura este prezentat

semnificaia principalelor valori nscrise pe un obiectiv. Grosismentul indic de

cte ori este mrit imaginea. Apertura numeric este o constant caracteristic

fiecrui obiectiv i are un rol important la stabilirea puterii de separare a imaginii

pentru obiectivul folosit.

Puterea de mrire a microscopului optic este de maxim 1500x, cu o rezoluie de

aproximativ 2 m. Puterea de mrire este dat de produsul ntre grosismentul

ocularului i cel al obiectivului.

b) Microscopul electronic

Principiul obinerii imaginii prin microscopie electronic este dat n figur

Principiul obinerii imaginii prin microscopie electronic

a b

Lama

Ocular

Sistem preluare imagine

Diafragma

Condensor

Obiectiv

60x/1,25

Grosismentul

Apertura numeric

Principalele caracteristici

ale obiectivului

Raze X

Electroni

secundari

Lumin

Electroni

primari

Electroni

retrimii napoi

(backscattered)

Specimen Cldur

Electroni

transmiiTEM

SEM

Raze X

Electroni

secundari

Lumin

Electroni

primari

Electroni

retrimii napoi

(backscattered)

Specimen Cldur

Electroni

transmiiTEM

SEM

Traseul luminii (a) i formarea

imaginii (b) la microscopul optic

Microscopul electronic de scanare (Scaning Electron Microscop) SEM folosete

electronii pentru scanarea suprafeei unei probe, obinndu-se astfel o imagine

tridimensional.

La pregtirea probelor pentru SEM, trebuieinut cont c acestea trebuie s

ndeplineasc cerinele: s aib stabilitate mecanic, s nu conin ap, s

prezinte conductivitate bun pentru electroni. Astfel, se face acoperirea probei cu

un strat metalic foarte subire (aur, paladiu) sau se utilizeaz un cmp electronic

cu accelerare foarte sczut.

Exemple de imagini obinute folosind SEM:

Imagine SEM a iaurtului.

Microscopul electronic de transmisie(Transmission Electron Microscop) TEM

folosete electronii transmii prin prob. Pregtirea probelor biologice pentru TEM

este mult mai dificil dect pentru orice alt tip de microscopie. Const n:

Fixarea : ageni de fixare (aldehide i tetraoxid de osmiu). Tetraoxidul de

osmiu fixeaz cel mai bine lipidele.

Splare

Deshidratare

Acoperire cu un material care s ajute tierea (rini epoxidice, rezine

poliesterice, metacrilai)

Micele de cazein n lapte

Micelele de cazein formeaz lanuri n iaurt

Micelele de cazein formeaz clustere n brnz

Tierea n fii foarte fine (m)

Exemple de imagini obinute folosind TEM:

c) Microscopie cu forte atomice (atomic force microscopy: AFM)

Principiul de functionare: Vrful instrumentului interacioneaz cu atomii i se

deplaseaz, n funcie de potenialul interatomic. Deplasarea este msurat cu

ajutorul unui sistem laser i transformat n imagine.

TEM la trei globule de grsime

(portocaliu) care arat

cristalinitate mic n interiorul

globulelor (liniile albe). Proteinele

sunt vizualizate ca sfere negre.

TEM la 2 globule de grsime cu

coninutul aproape complet

cristalizat (liniile albe din interiorul

globulelor).

Microscop cu fore atomice

Sonda microscopului cu forta atomica este alcatuita dintr-o lamela sub forma de

cruce, alungita si elastica, numita cantilever, cu dimensiuni de ordinul zecilor de

microni, n capatul careia este plasat un ac ascutit, perpendicular pe cantilever.

Cantileverul este miscat n plan xy si vertical de un sistem de pozitionare

piezoelectric, cu precizia n jur de 5 nm orizontal si pna la 10 pm vertical. n

timp ce acul baleiaza suprafata, miscndu-se n sus si n jos odata cu conturul

acesteia, o raza laser cade oblic pe partea superioara (puternic reflectatoare) a

cantileverului si se reflecta catre un senzor alcatuit din doua fotodiode alaturate.

Diferenta dintre semnalele celor doua diode indica pozitia spotului laser pe

senzor si deci pozitia pe verticala a cantileverului. Deoarece distanta ntre

cantilever si detector este de obicei de mii de ori mai mare dect lungimea

cantileverului, sistemul realizeaza o marire a deplasarii cu un factor de peste

2000, usor de masurat.

Acul cu un varf foarte ascutit (in varf se afla cativa atomi), montat pe cantilever

se deplaseaz pe suprafaa probei dup un rastru de baleiaj. Vrful acului face

ca latura cantilverului care l conine sa se deformeze in funcie de forele care

actioneaza asupra sa . Aceste forte sunt intr-o stricta relaie cu harta

topografica a probei studiate. Vrful este apropiat de proba pana cnd intre

acesta si molecule din proba se stabilete o forta din categoria fortelor van der

Waals, bazate in primul rand pe fortele electrostatice dintre particulele incarcate

ale acului si probei. Aceasta forta, in funcie de denivelrile de la suprafaa

probei , respinge sau atrage vrful . Cantileverul sesizeaz aceste deplasri pe

axa z , si in baza lor , alturi de ofsetul (x,y) cruia ii este asociata forta care

actioneaza asupra vrfului pe axa z , unitatea de calcul asociata microscopului cu

forte atomice poate alctui a harta topografica a probei.

In timp ce cantileverul de deformeaz, lumina provenita de la un laser este

reflectata pe o fotodioda splitata . Msurnd diferena de semnal (A-B) ,

deformrile cantilverului pe axa z pot fi observate si msurate foarte precis.

Din moment ce cantileverul respecta legea lui Hooke pentru mici deplasamente ,

se regaseste o forta de interactie intre vrf si proba .

Deplasarea vrfului sau a probei este realizata cu ajutorul unui dispozitiv de

poziionare deosebit de precis realizat din ceramici piezo-electrice, cel mai

adesea sub forma unui scanner tub . Scanner-ul este capabil de rezoluii sub

nivelul unui Angstrom pe direciile axelor x,y si z. In mod convenional , axa z ,

este perpendiculara pe proba.

Mecanismul de detectie a semnalului sondei, actioneaza asupra circuitului de

reactie, care la randul sau actioneaza asupra traductorului piezoelectric ce

actioneaza intr-un mod foarte fin asupra suportului probei, in functie de modul

de lucru dorit.

Modul in care contrastul unei imagini este realizat , poate fi obinut in mai multe

modalitati. In microscopia cu forte atomice avem trei tipuri de interactie intre

vrful cantilverului si proba:

1) modul contact continuu

2) modul contact intermitent

3) modul non-contact

Modul contact :

Este cel mai comun mod de operare al microscopului cu forte atomice. Precum

este sugerat si de numele acestui mod, vrful si proba raman in contact strns

din momentul nceperii scanrii pana la sfarsitul acesteia.

APLICAIE PRACTIC: ANALIZA MICROSTRUCTURAL A

BIOPOLIMERILOR ALIMENTARI

Polizaharidele precum amidonul, alginatul sau proteinele precum gelatina sunt

folosite la obinerea texturii alimentelor.

Materiale i modul de lucru

Se folosete gelatin i alginat de sodiu. Ambele se las la mbibat n ap cald la

50oC i se urmrete procesul de mbibare.

Pentru colorarea gelatinei se folosete soluie de fuxin 25%. Colorarea filmului

de alginat se face cu rou de Congo.

Cteva picturi sunt plasate pe o lam pe care se gsete proba i sunt

examinate ca preparate umede (preparate ntre lam i lamel) la microscopul

optic.

Pentru analiza microscopic, se utilizeaz microscopul optic cu obiective cu

grosismente de 40x i 100x.

Rezultate i discuii