KultivKultivácia sácia síraníran-- redukujúc redukujúcichich baktér baktériíií

Jozef Molnár , 3.A

Oddelenie minerálnych biotechnológiíOddelenie minerálnych biotechnológiíÚstav geotechniky - Slovenská akadémia vied Ústav geotechniky - Slovenská akadémia vied

Watsonova 45, 043 53 Košice, Slovenská republikaWatsonova 45, 043 53 Košice, Slovenská republika

ÚvodÚvod

Mikroorganizmy sú mikroskopické organizmy Mikroorganizmy sú mikroskopické organizmy ktoré sa nachádzajú prakticky na každom mieste ktoré sa nachádzajú prakticky na každom mieste našej zemeguli . Ich veľkosť je rádovo niekoľko našej zemeguli . Ich veľkosť je rádovo niekoľko µm. Ich hlavnou úlohou je aktívna účasť v µm. Ich hlavnou úlohou je aktívna účasť v biologickom kolobehu prvkov v prírode. biologickom kolobehu prvkov v prírode.

Všeobecné rozdelenie mikroorganizmov:Všeobecné rozdelenie mikroorganizmov:

Mikroorganizmy našli svoje uplatnenie v priemysle, Mikroorganizmy našli svoje uplatnenie v priemysle, medicíne, poľnohospodárstve a pod. Hovoríme o tzv. medicíne, poľnohospodárstve a pod. Hovoríme o tzv. Biotechnológiách .Biotechnológiách .

BiotechnológieBiotechnológie sú to biologické procesy ktoré riadenie sú to biologické procesy ktoré riadenie využívajú vhodné mikroorganizmy, alebo ich využívajú vhodné mikroorganizmy, alebo ich metabolické produkty na technologické a iné účely .metabolické produkty na technologické a iné účely .

Biotechnológie hojne využívané aj pri riešení Biotechnológie hojne využívané aj pri riešení ekologických problémov napr. pri čistení odpadových ekologických problémov napr. pri čistení odpadových vôd.vôd.

Vážnym ekologickým problémom banského, Vážnym ekologickým problémom banského, úpravníckeho a metalurgického priemyslu je vznik a úpravníckeho a metalurgického priemyslu je vznik a úprava odpadových vôd s obsahom ťažkých kovov. Na úprava odpadových vôd s obsahom ťažkých kovov. Na odstránenie kovov s uvedených vôd existuje mnoho odstránenie kovov s uvedených vôd existuje mnoho fyzikálnych, chemických a biologicko-chemických fyzikálnych, chemických a biologicko-chemických metód. Jednou z nich je aj použitie metód. Jednou z nich je aj použitie síran-redukujúcich síran-redukujúcich

baktériíbaktérií (SRB)(SRB)..

Síran-redukujúce baktérie Síran-redukujúce baktérie

Klasifikácia SRB:Klasifikácia SRB: : :PodľaPodľa Bergeyho taxonomickej klasifikácie, sú Bergeyho taxonomickej klasifikácie, sú síran-redukujúce baktérie zatriedené do sekcie 7 – Disimilačné síran- síran-redukujúce baktérie zatriedené do sekcie 7 – Disimilačné síran- alebo síru- redukujúce baktérie.alebo síru- redukujúce baktérie.

SpirillumSpirillum desulfuricansdesulfuricans 1895 M. W. Beijerick1895 M. W. Beijerick

1936 Kluyver a van Niel1936 Kluyver a van Niel DesulfovibrioDesulfovibrio desulfuricansdesulfuricans

DesulfovibrioDesulfovibrio DesulfotomaculumDesulfotomaculum

1965 Campbell a 1965 Campbell a

Postgate Postgate

Vlastnosti SRB:Vlastnosti SRB: Morfologické vlastnosti:Morfologické vlastnosti:

Tvar buniek SRB je veľmi rozmanitý a môže byť vo forme Tvar buniek SRB je veľmi rozmanitý a môže byť vo forme kokov, malých oválnych tyčiniek, malých oválnych tyčiniek kokov, malých oválnych tyčiniek, malých oválnych tyčiniek v agregátoch, vibrií, veľkých tyčiniek s endospórami alebo v agregátoch, vibrií, veľkých tyčiniek s endospórami alebo bez nich a podobnebez nich a podobne

Vývoj :Vývoj :

V súčasnej dobe je známych 36 rodov V súčasnej dobe je známych 36 rodov SRB.SRB.

Fyziologické vlastnosti: Fyziologické vlastnosti: Na základe výsledkov fyziologických testov sú SRB : Na základe výsledkov fyziologických testov sú SRB : -chemoorganotrófné-chemoorganotrófné -striktne anaeróbne-striktne anaeróbne -s optimálnymi rastovými hodnotami: - pH 6,5 až 7,3-s optimálnymi rastovými hodnotami: - pH 6,5 až 7,3 - - oxidačno-redukčného potenciálu od -100mV do -200mVoxidačno-redukčného potenciálu od -100mV do -200mV - - teploty: - pre mezofilné druhy 30 - 37 C teploty: - pre mezofilné druhy 30 - 37 C - pre termofilné druhy 50 - 70 C - pre termofilné druhy 50 - 70 C ..

Kultivačné Kultivačné vlastnostivlastnosti::

Pre kultiváciu SRB sa používa selektívna živná pôda Pre kultiváciu SRB sa používa selektívna živná pôda podľa podľa J. Postgate ,ktorá je v literatúre označovaná ako živná J. Postgate ,ktorá je v literatúre označovaná ako živná pôda DSM – 63,kde zdrojom uhlíka je laktát sodný pôda DSM – 63,kde zdrojom uhlíka je laktát sodný a zdrojom síranov síran sodný.a zdrojom síranov síran sodný.

Biochemické Biochemické vlastnosti:vlastnosti: -základným metabolickým procesom SRB anaeróbna redukcia -základným metabolickým procesom SRB anaeróbna redukcia

síranov.síranov.

Autotrofná redukcia síranov: Autotrofná redukcia síranov:

Heterotrofná redukcia síranov:Heterotrofná redukcia síranov:

SRB SRB

4 H4 H22 + SO + SO

442-2- —————> S —————> S2-2- + 4 H + 4 H

22O O

SRBSRB

4 CH4 CH33COCOONa + 5 MgSOCOCOONa + 5 MgSO

44 ————> 5 MgCO ————> 5 MgCO33 + 2 Na + 2 Na

22COCO33 + 5 H + 5 H

22S S

+ 5 CO+ 5 CO22 + H + H

22O O

MeMe22++ + H + H22S ————> MeS + 2HS ————> MeS + 2H++

PPri ktorej energetickým zdrojom je plynný vodík ri ktorej energetickým zdrojom je plynný vodík a prebieha v niekoľkých stupňoch a celý dej je a prebieha v niekoľkých stupňoch a celý dej je možné vyjadriť sumárne rovnicoumožné vyjadriť sumárne rovnicou

PPri ktorej sú energetickým zdrojom jednoduché ri ktorej sú energetickým zdrojom jednoduché organické látky (laktát, fumarát, pyruvát, organické látky (laktát, fumarát, pyruvát, niektoré alkoholy a podobne).niektoré alkoholy a podobne).

Uvedené reakcie 1,2 až 3 poukazujú na možnosť využitia síran-Uvedené reakcie 1,2 až 3 poukazujú na možnosť využitia síran-redukujúcich baktérií pri odstraňovaní ťažkých kovov z redukujúcich baktérií pri odstraňovaní ťažkých kovov z priemyselných odpadových vôd.priemyselných odpadových vôd.

Je to biologicko chemická metóda ktorá v praxi predstavuje jednu Je to biologicko chemická metóda ktorá v praxi predstavuje jednu zo základných metód bioremediácie tzv. kyslých banských vôd.zo základných metód bioremediácie tzv. kyslých banských vôd.

Jej praktické využitie je závislé od mnohých Jej praktické využitie je závislé od mnohých ekonomických faktorovekonomických faktorov medzi ktoré patrí najme správna voľba vhodného substrátu pre rast medzi ktoré patrí najme správna voľba vhodného substrátu pre rast SRB, teda pre produkciu biogénneho sulfánu.SRB, teda pre produkciu biogénneho sulfánu.

Základným energetickým substrátom pre SRB je laktát sodný, Základným energetickým substrátom pre SRB je laktát sodný, ktorého cena je pre využitie v praxi pomerne vysoká.ktorého cena je pre využitie v praxi pomerne vysoká.

Z týchto dôvodov hlavným cieľom predpokladanej práce bolo nájsť Z týchto dôvodov hlavným cieľom predpokladanej práce bolo nájsť vhodný, vhodný, ekonomicky menej náročný substrátekonomicky menej náročný substrát..

Ciele Ciele prácepráce

1.1. Literárna rešerš z domácej a zahraničnej odbornej literatúry Literárna rešerš z domácej a zahraničnej odbornej literatúry zameraná na výber vhodných substrátov pre kultiváciu SRB.zameraná na výber vhodných substrátov pre kultiváciu SRB.

2.2.Sledovanie rastu SRB za použitia vybraných energetických Sledovanie rastu SRB za použitia vybraných energetických substrátov.substrátov.

3.3. Spracovanie a vyhodnotenie výsledkov. Spracovanie a vyhodnotenie výsledkov.

Experimentálna časťExperimentálna časť

Materiál: Materiál:

SRB – získané z minerálneho prameňa GajdovkaSRB – získané z minerálneho prameňa Gajdovka

Základné živné médiumZákladné živné médium

Modifikované živné médiá-SubstrátyModifikované živné médiá-Substráty

Metódy:Metódy:

-Metóda prípravy fixovaného preparátu baktérií-Metóda prípravy fixovaného preparátu baktérií

-Metóda farbenia baktérií podľa-Metóda farbenia baktérií podľa GrammaGramma

-Svetelná mikroskopia baktérií-Svetelná mikroskopia baktérií

-Identifikácia vzniku a stanovenie koncentrácie -Identifikácia vzniku a stanovenie koncentrácie sulfánusulfánu

-Nefelometrické stanovenie síranov-Nefelometrické stanovenie síranov

-Meranie hodnôt pH.-Meranie hodnôt pH.

V práci sme použili síran redukujúce baktérie ,vyizolovane z V práci sme použili síran redukujúce baktérie ,vyizolovane z minerálneho prameňa minerálneho prameňa GajdovkaGajdovka

Baktérie Desulfovibrio desulfuricans Baktérie Desulfovibrio desulfuricans ,, vyizolované z pitnej minerálnej vody - prameň vyizolované z pitnej minerálnej vody - prameň Gajdovka (zväčšenie 1200-x, olejová imerzia , Gajdovka (zväčšenie 1200-x, olejová imerzia , svetelný mikroskop).svetelný mikroskop).   

Baktérie Desulfovibrio desulfuricansBaktérie Desulfovibrio desulfuricans,, vyizolované z pitnej minerálnej vody - vyizolované z pitnej minerálnej vody - prameň Gajdovka (elektrónový mikroskop).prameň Gajdovka (elektrónový mikroskop).

Zloženie modifikovanej selektívnej živnej pôdy Zloženie modifikovanej selektívnej živnej pôdy DSM – 63 pre izoláciu a kultiváciu SRBDSM – 63 pre izoláciu a kultiváciu SRB

• Postup prípravy:Postup prípravy:

1.1.Do varnej banky nalejeme 850 mlDo varnej banky nalejeme 850 ml destilovanej vodydestilovanej vody

2.2.Následne pridáme odpipetovanýchNásledne pridáme odpipetovaných 10ml z roztoku A , 10 ml z roztoku A1 ,10 ml roztoku 10ml z roztoku A , 10 ml z roztoku A1 ,10 ml roztoku “oligo”“oligo”

3.3.PPrevrieť 10min ,po prevareni chladime vodou za stáleho prebublávania dusíkom revrieť 10min ,po prevareni chladime vodou za stáleho prebublávania dusíkom (vytvoríme anaeróbne prostredie(vytvoríme anaeróbne prostredie))

4.4.NNavážimeavážime 0.1 g z Kys. Askorbovej0.1 g z Kys. Askorbovej aa Tyoglikolátu sodnéhoTyoglikolátu sodného

5.5.Do odmerného valca nalejemeDo odmerného valca nalejeme 2.5 ml Síranu železnatého2.5 ml Síranu železnatého

6.6.Po vychladení pridáme do prevareného roztokuPo vychladení pridáme do prevareného roztoku ,,KKysys.. askorbov askorbovú,ú, Tioglokol Tioglokoláát,t, SSííran ran železnaty,železnaty, (premie(premieššameame))

7.7.PrPridáme koidáme konnkrétny substrát (napr.krétny substrát (napr. LaktLaktáát sodnýt sodný))

8.8.AA nakoniec nakoniec upravíme upravíme pH na zasaditu mieru pomocov 5 molekulového pH na zasaditu mieru pomocov 5 molekulového NaOHNaOH na výsledne na výsledne pH 7.5pH 7.5

Modifikované živné médiá-SubstrátyModifikované živné médiá-Substráty

Vybrané substráty a ich konkrétne množstváVybrané substráty a ich konkrétne množstvá..

--Laktát sodnýLaktát sodný (D(DLL-N-Na)a)……………………. . 2,52ml2,52ml

-Laktát vápenatý-Laktát vápenatý(DL-Ca(DL-Ca))……….………. 22,,75g75g-Glycerol-Glycerol ………………………………………………... ... 11,,3300mmll-Srvátka-Srvátka…………………………..………………………….. 22,,0000gg-Glukóza-Glukóza………………………….…………………………. 11,,75g75g-Sacharóza-Sacharóza……………………….………………………. 11,,59g59g Množstvá substrátov sú vypočítané na základe Množstvá substrátov sú vypočítané na základe

množstva organickej časti v Laktáte sodnom.množstva organickej časti v Laktáte sodnom.

Označenie vzoriek na základe konkrétnych Označenie vzoriek na základe konkrétnych substrátovsubstrátov

• 1.1. Laktát sodnýLaktát sodný +SRB+SRB• 2.2. Laktát sodný bez SRBLaktát sodný bez SRB (abiotická kontrola) (abiotická kontrola)

• 3.3. Laktát vápenatýLaktát vápenatý +SRB+SRB• 4.4. Laktát vápenatý bez SRBLaktát vápenatý bez SRB (abiotická kontrola) (abiotická kontrola)

• 5.5. Glycerol Glycerol + SRB+ SRB• 6.6. Glycerol bez SRBGlycerol bez SRB (abiotická kontrola) (abiotická kontrola)

• 7.7. SrvátkaSrvátka + SRB+ SRB• 8.8. Srvátka bez SRBSrvátka bez SRB (abiotická kontrola) (abiotická kontrola)

• 9.9. Glukóza Glukóza + SRB+ SRB• 10.10. Glukóza bez SRBGlukóza bez SRB (abiotická kontrola) (abiotická kontrola)

• 11.11. SacharózaSacharóza + SRB+ SRB• 12.12. Sacharóźa bez SRB Sacharóźa bez SRB (abiotická kontrola)(abiotická kontrola)

Obsah kultivačných nádob:Obsah kultivačných nádob:

--400 400 ml kvapalnej fázy obsahujúcej hlavné zložky živnej pôdy a ml kvapalnej fázy obsahujúcej hlavné zložky živnej pôdy a s prídavkom substrátus prídavkom substrátu

-- 30 ml aktívnej bakteriálnej kultúry SRB 30 ml aktívnej bakteriálnej kultúry SRB

--10 ml staršej bak.kultúry SRB10 ml staršej bak.kultúry SRB

--Obsah kultivačných nádob v kontrolných experimentoch tj. v Obsah kultivačných nádob v kontrolných experimentoch tj. v abiotických bol bez pridania bakteriálnych kultúr SRB.abiotických bol bez pridania bakteriálnych kultúr SRB.

--NNa zisa zisťťovanie prítomnosti SRB v kvapalnej fázeovanie prítomnosti SRB v kvapalnej fáze bola použitá bola použitá ssvetelná mikroskopiavetelná mikroskopia..

Baktérie boli po fixácii teplom a farbení podľa Grama pozorované Baktérie boli po fixácii teplom a farbení podľa Grama pozorované svetelným mikroskopom svetelným mikroskopom NIKON E 400 (Japonsko),NIKON E 400 (Japonsko), olejovou olejovou imerziou pri 1200-násobnom zväčšení. Fotografický záznam bol imerziou pri 1200-násobnom zväčšení. Fotografický záznam bol realizovaný fotoaparátom NIKON F 70 (Japonsko).realizovaný fotoaparátom NIKON F 70 (Japonsko).

Odber vzoriek a Odber vzoriek a rastrast SRB SRB

-Rast síran redukujúcich baktérií bol sledovaný na základe -Rast síran redukujúcich baktérií bol sledovaný na základe úbytku koncentrácie síranov v kvapalnej fáze.úbytku koncentrácie síranov v kvapalnej fáze.

--Odber vzoriek Odber vzoriek kvapalnej fázy prebiehal kvapalnej fázy prebiehal každých 72 hodínkaždých 72 hodín

--Odobratá vzorka Odobratá vzorka po odstránení vzniknutých precipitátov po odstránení vzniknutých precipitátov pomocov pomocov centrifúgy centrifúgy bola následne spracovaná pre bola následne spracovaná pre potreby vlastného stanovenia síranov .potreby vlastného stanovenia síranov .

-Stanovenie síranov--Stanovenie síranov-NefelometrickyNefelometricky vo forme koloidného vo forme koloidného BaSOBaSO44 na prístroji na prístroji

Spektromon 195Spektromon 195..