KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK

Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna

Országos Kémiai Biztonsági IntézetMolekuláris és Sejtbiológiai Osztály

Budapest, Nagyvárad tér 2.

Helyszín: ELTE, 2012. 10. 27.

Kompartmentalizáció

Prokarióta sejtekEukarióta sejtek

Kromatinalapszerkezet: nukleoszóma* DNS kettős spirál és a hisztonok alkotják

* Hisztonok: bázikus fehérjék (argininben és lizinben gazdag) * 5 osztályuk van: H1H1, H2A, H2B, H3 és H4nukleoszomális hisztonok

Hisztonkorong (oktamer):8 hisztonmolekulából álló (2*4)2 csavarulatban146 bázispárnyi DNS tekeredik rá2 korong között kb. 60 bp linkerrégió + H1 molekula

A DNS kondenzációjáta kondenzin foszforilációja indítja el.kohezin ATP-áz

Kromoszóma morfológia

testvérkromatidák

centroméra

hosszú kar

rövid kar

Eukromatikus régió: aktív géneket tartalmaz (génexpresszió, RNS szintézis)

Heterokromatikus régió: inaktív DNS szakaszok konstitutív heterokromatin (pl. centromer) fakultatív heteroktromatikus régió

Kromoszóma territórium Egy adott kromoszóma a sejtmag egy adott régiójában található.Szigorú sejtmagi rend.

Genom: a sejtmagban található összes genetikai információ.Kromoszóma: A genetikai információt tároló strukturális egység. Kromoszóma száma, morfológiája szervezettsége fajra jellemző és állandó.

Fajokecetmuslica

rozs

galamb

egér

patkány

ember

mezei nyúl

kutya

ponty

páfrány

Kromoszómaszám8

14

16

40

42

46

48

78

104

1200

Humán kromoszóma Gének

1 2 968

13 748

18 766

21 303

X 1184 (Barr test)

Y 231 (mikrodeléció meddőség)

Nemhez kötött öröklődés

G-sávos normál női karyotípus

Humán lymphocyta kromoszóma preparátum

Telomer: - kromoszóma vége- rövid TTAGGG szakasz több ezerszeres mennyiségben (20-25 ezer bázispár) genetikai óra, telomer rövidülés öregedés 2009 orvosi Nobel Díj - minden osztódáskor 100 bp rövidülés a DNS polimeráz enzim működéséből adódóan - egészséges sejtekben a telomeraz inaktív- Az emberi sejt 50 osztódásra képes.- 50 osztódás után a sejt apoptózissal meghal.

Tumoros sejtekben a telomer szerepe:-a telomeráz enzim aktivitása magasabb-Azt gondolják, hogy a telomeráz enzim retrovírus eredetű.-Ivarsejtekben is!

Öregedés, rák, stabil kromoszóma

MITOZIS

A mitózis gondoskodik a szülői és az utódsejt azonos kromoszómakészletéről. A sejtosztódás S fázisában a kromoszómák anyaga megkettőződik. A mitózis kromoszóma számtartó osztódás.

*

*

*

A mitózis és meiózis összehasonlító elemzése

                                                                             

             

X-kromoszóma inaktivációA nőstény emlősök sejtjeiben

Az egyik X-kromoszóma inaktiválódik (random módon), XfXv . Az inaktivált X kondenzálódik - Barr-testecske.

Bizonyos sejtek utódai együtt maradnak (sejtklónok). A nőstény emlősök teste mozaikos, vagyis olyan sejtek

klónjainak a keveréke, amelyekben hol egyik, hol a másik X aktív. Heterozigótákon

detektálhatók lehetnek a foltok.

Vörös/fekete tarka macskák esete

Hemofilia

BIX. faktor

Xq28Xq28Xq28Xq28 Xq26.3Xq26.3--27.127.1Xq26.3Xq26.3--27.127.1

AVIII. faktor

Nemhez kötött recesszív megbetegedés

KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI:

Strukturális kromoszóma aberráció:deléció

inszerciótranszlokáció

Numerikus kromoszóma aberráció:poliploidia

aneuploidia

Deléció kromoszóma szegmentek elvesztése

Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza.

A kis deléciók tolerálhatóak.

A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek.

Cri du chat – macskasírás szindróma

• Az ember esetében a genom kiegyensúlyozatlanság miatt a legkisebb deléciók is komoly abnormalitást okoznak.

• A macskasírás szindróma estében az 5. kromoszóma rövid (p) karjának vége hiányzik.

• Mikroencefáliával, holdszerű arccal és szellemi elmaradottsággal jár. 4 év alatti halál.

• születéskori gyakoriság: 1/50,000

Rákos sejtek gyakran mutatnak deléciókat

DUPLIKÁCIÓ:Kromoszóma szegmensek megkettőződése.

Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.

Az X kromoszóma 16A régiójának kópia száma különböző

A gén duplikáció evolúciós szerepe

Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat.

De ha a génből több kópia van a képződő proteinek módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el.

Duplikációval keletkezett gén családok hasonló proteineket készítenek.

Jó példa erre a globin gének, amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak,

a hemoglobin szerkezeti alegységei.

A gén duplikáció lehetőséget ad, a mutációs változásoknak, a funkciók divergálásának

• Az emberi hemoglobin gén duplikációs változások eredménye. Különböző életkorokban különböző alegységek alakítják ki a

működő hemoglobin molekulát.

3 hónapos korig az embrionális Hemg.Szülésig a magzati Hemg. 20-30%Szülés után 2α 2ß.

Inverzió:Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának

az eredménye. pericentrikus inverzió magába foglalja centromert

paracentrikus inverzió a centromert nem érinti, csak a kromoszóma egyik v. másik karját

Gén környezet, gén kapcsoltság, génátírás módosul.

TRANSZLOKÁCIÓ:intrakromoszómális transzlokáció:

Egy kromoszóma szakasz áthelyeződéseugyanabba a kromoszómába.

interkromoszómális transzlokáció: Nem homológ kromoszómák

közötti transzlokáció.

Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés.A gének pozíciója azonban megváltozik.

•14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció.

A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát.Örökölhető.•21-es kromoszóma triszómia (Osztódási hiba)

Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik. Prenatális szűrés. Születéskori gyakorisága nagy: 1/500-1/700

Down szindróma:

Myeloid leukémiaA 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció

eredménye a “Philadelphia kromoszóma”Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.

Burkitt’s lymphoma

Az esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció

következménye.

Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák

keletkezését okozhatják.

Alternatív toxikológiai módszerekin vitro vizsgálatok

előnyei: 1. in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül ) 2. rövid idejű3. olcsóbb4. reprodukálható5. nem használ élő állatotAz esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat egybehangzó eredményére van szükség.

Ajánlott teszt rendszerek:

1. Egysejtűeken végzett tesztek2. Rovartesztek3. in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek4. in vivo mutagenitási tesztek5. long term karcinogenitási állatkísérletek6. humán epidemiológiai vizsgálatok

Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálata

BevezetésA BIZOTTSÁG 440/2008/EK RENDELETE a vegyi anyagok regisztrálásáról,értékeléséről,engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szólóa 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról.

B.rész.:Módszerek a toxicitás és egyéb egészségügyi hatások meghatározásáraB.10. Mutagenitás-Kromoszóma-Rendellenesség in vitro vizsgálata emlősökön

OECD 473 TGOECD 487 TG in vitro mikronukleusz vizsgálat emlős sejteken

B.13/14. Mutagenitás: Reverz mutagenitási vizsgálat baktériumokkal OECD 471 TG

B.18. DNS károsodás és –reparáció-nem tervezett DNS-szintészis (unscheduled DNA Synthesis, UDS) –emlős sejteken in vitro

OECD 476 TGB.19. In vitro emlőssejt testvér-kromatid kicserélődés

(sister chromatid exchange , SCE) vizsgálatOECD 479 TG

B. 20. Nemhez kötött recesszív letális vizsgálat Drosophila melanogasterenOECD 477 TG

Azonos szakmai szabályokGLP= Good Laboratory Practice(Helyes Laboratóriumi Gyakorlat)ISO= International Organization for Standardization(Nemzetközi Szabványügyi Szervezet)

Vizsgálati irányelvekOECD= Organisation for Economical Cooperation and Development (Gazdasági es Fejlesztési Együttműködési Szervezet)

Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken

OECD TG 473 vizsgálati irányelv szerint Célja: azon kémiai anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma károsodástokoznak emlős sejtekben.

A kromoszóma aberráció vizsgálat ismertetéseSejtekAlkalmazható sejtvonalak jellemzői:stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita)jó növekedési képesség, rövid generációs idő, kariotípus stabilitás, állandó krom. szám.Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása.kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO, Puck1957)

Tápfolyadékok, tenyésztési körülményekMesterséges tápfolyadékok elterjedése (Ham’s F12).

Sejtvonalak ellenőrzése:KariogramKromoszóma számMikoplazmaSpontán kromoszóma aberráció gyakoriságTörténeti kontroll

Vizsgálati anyag előkészítése:kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitásoldószer kiválasztásahígítási sor készítésestabilitás vizsgálat archiválás

Elő-kísérlet: citotoxicitási vizsgálat MTT-assay (mitokondriális szukcinát-dehidrogenáz enzim)

mitotikus index meghatározásaMI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya.A sejtpopuláció proliferációjának a mértékét jellemzi.

KoncentrációLegkevesebb három elemezhető koncentráció.Citotoxikus anyag esetén: va. az a koncentrációja amely a festék-redukciót 50%-kal csökkenti.Nem citotoxikus anyag esetén: va. 5 mg/ml v. 0,01M

Metabolikus aktiválás: •S9 alkalmazásarágcsálók enziminducerrel (Arochlor 1254, v. fenobarbiturát és β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9) •kofaktorokkal kiegészítve

(ADPH, glukóz-6-foszfát). •S9 végkoncentráció 5-10% közötti.•citokróm P450 enzim aktiválása.•Indirekt mutagének kimutatására alkalmas

Direkt-és indirekt-mutagén anyagok

Kontrollok:Metabolikus aktiválás nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-CMetabolikus aktiválással: CP, Benz(a)pirénOldószer: tápfolyadék, DMSOArchiválás

Kezelési idők:4 óra +S94 óra -S9 ÉRTÉKELÉS

pozitív Negatívismétlés 24 óra -S9

48 óra -S9

Kolhicinezés:Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése

Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat. Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában.Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár 40-50 százalékuk is blokkolt metafázisban található. A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.

Kromoszóma preparátum

Fénymikroszkópos értékelés kromatid típusú aberrációk: kromoszóma típusú aberrációk:deléció delécióexchange exchange

CHO sejt, kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2010.

CHO sejt, Deléció. Felvétel OKBI. MSBO. 2000.

CHO sejt. Deléció. Felvétel: OKBI. MSBO 2000.

Humán limfocita. Kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2000.

Nö

vekv

ő d

ózi

s

Arzénmérgezés”

Teratogenitás; neurotoxikus hatás

Citotoxikus hatás (immuntoxicitás?)

Hormon diszruptor hatás Glukokortikoid receptor gátlás Ösztrogén receptor gátlás

Daganatkeltő hatás Géntoxicitás (oxidatív stressz) Repair gátlás (ligáz gátlás) Epigenetikus hatás (metiláció)

A környezeti arzén-expozíció egészségkárosító hatásai

CHO-K1 (ATCC-CCL-61; Chinese hamster) Kínai hörcsög ovárium fibroblasztFelvételek készültek: OKBI 2011 Molekuláris és Sejtbiológiai Osztály

Normál metafázis Kromoszóma aberráció

Kromoszóma aberráció vizsgálat in vitro emlős sejtekenOECD TG 473

Endomitózis Fragmentált kromoszómák

Testvérkromatidakicserélődés=sister chromatid exchange

A testi sejtek kromoszómáiban a testvér-kromatidák közötti kicserélődés,reciprok DNS csere.

Láthatóvá tehető, ha két sejtcikluson át bróm-dezoxi-uridinnel (timidin-analóg) jelöljük.Hoechst festés, majd UV kezelés, klasszikus Giemsa festés.Az SCE nem kromoszómaaberráció (Ctr. SCE 5).

Az SCE már olyan kis vegyi mutagén-karcinogén expozíció kiváltja, amelyik még nem okoz krom. aberrációt.Alkalmazása primer prevencióban.

B.19. IN VITRO EMLŐSSEJT TESTVÉR – KROMATID KICSERÉLŐDÉS (SISTER CHROMATID EXCHANGE , SCE) VIZSGÁLATOECD TG 479

Az SCE indukcióban a repair folyamatok részvétele valószínű.A DNS repair deficiens congenitális defektusok esetében fokozott SCE indukáltság figyelhető meg az egészséges kontrollokhoz képest. pl.:

Bloom szindrómaFanconi-anémiaWerner sindróma xeroderma pigmentosumataxia telangiectasiaDow kór

Ataxia telangiectasia (ATM)

Rendkívül sokféle, sok szervet érintő tünet együttes sugár érzékenység és tumorok kialakulása

Bloom szindróma Kromoszóma instabilitás jellemzi

• Örökletes betegség, családi halmozódás

15q26.1, a BLM gén mutációja.• Fokozott sister chromatid exchange (SCE) és spontán kromoszóma

törékenység.• DNS repair enzimek károsodása• Jelentős mutagén túlérzékenység.• a magasabb daganatképződési kockázat

normál sejt Bloom szindromás beteg sejt

In vitro mikronukleusz teszt

OECD TG 487

Kromoszóma aberráció kimutatására alkalmas

Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció teszttel, olcsóbb, gyorsabb

Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén

mikronukleusz

apoptózis

B. 18. Nem-tervezett DNS-szintézis (UDS) in vitro vizsgálata emlős májsejteken OECD

TG 482

A vizsgálatokat az OKBI molekuláris és Sejtbiológiai Osztályán végezték.

patkány primer májsejt

Jelölések:* = sárga testszínű kerek, piros szemű hímkék = kezeletlen X kromoszómapiros = kezelt X kromoszómanyíl = Y kromoszóma

A nemhez kötött recesszív mutagenitási vizsgálat

(Müller-5 teszt) elvi vázlataOECD TG

Molinát és Vernolát gyomírtók repair-szintézist idukáló hatása primer patkánymájsejtbenEgészségtudomány: 36,187-192 (1992)

Kinoxalin származékok vizsgálataNépegészségügy 90 (1) 45-52 (2012)

2012ELTE11.27.