A PATHOGÉN AUTOANTITESTEK SZEREPE ÉS KIMUTATÁSA

SZISZTÉMÁS LUPUS ERYTHEMATOSUSBAN

PH.D. ÉRTEKEZÉS

SALLAI KRISZTINA KATALIN

TÉMAVEZETŐ: PROF. GERGELY PÉTER

SZIGORLATI BIZOTTSÁG TAGJAI: PROF. FEKETE BÉLA

DR. PRECHL JÓZSEF

DR. BARTHA KATALIN

HIVATALOS BÍRÁLÓK: DR. KISS EMESE

DR. KOLEV KRASZIMIR

2006

BUDAPEST

SEMMELWEIS EGYETEM, DOKTORI ISKOLA

MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

2

ÖSSZEFOGLALÓ

A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség, fontos jellemzője - az

egész szervezetre kiterjedő gyulladásos állapot mellett - számos patogén autoantitest

termelődése. Kutatómunkám során kiemelkedő figyelmet fordítottam az autoantitestek

kimutatásával összefüggő laboratóriumi vizsgálatokra, mivel ezen ellenanyagok

megjelenésének és a kórfolyamatokban betöltött szerepének hátterében álló folyamatok

még nem teljesen tisztázottak. Munkám részeként olyan teszteket is elemeztem és

értékeltem, amelyektől várható volt, hogy eredményesen alkalmazhatóak lesznek az

SLE rutin diagnosztikájában.

Megvizsgáltam: 1) a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, ennek

jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi manifesztációinak – elsősorban a lupus

nephritis – megjelenésében 2) az összefüggést a betegek DNáz aktivitása és a szérum

antinukleoszóma antitest szintje között 3) az antifoszfolipid antitestek megjelenését az

SLE-s populációban és ezek összefüggését a tromboembóliás epizódok

bekövetkeztével. 4) az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és az

ezek hátterében álló, az SLE-től független tromboembóliás kockázati tényezőket 5)

annak lehetőségét, a sejtfelszíni Fc receptorok blokkolásával gátolhatóak-e az antitestek

és immunkomplexeik által közvetített effektor funkciók az autoimmun betegségek,

elsősorban az SLE kezelésében.

Eredményeim szerint, bár az SLE-s betegek szérumában szignifikánsan csökkent a

DNáz enzim aktivitása, ez nem áll összefüggésben a betegség aktivitásával, vagy a

betegség során kialakuló vesekárosodással, viszont negatív korrelációt mutat a betegek

antinukleoszóma antitest szintjével. A vizsgált SLE-s betegcsoportban mintegy tízszer

gyakoribbnak találtam a trombózis incidenciáját az áltagnépességhez viszonyítva.

Kimutattam, hogy SLE-ben – az öröklött tényezők mérsékelt befolyása mellett -

elsősorban a betegek több mint harmadának plazmájában kimutatható antifoszfolipid

antitestek okozzák a kiemelkedő tromboembóliás rizikót. Az Fc receptorokra

vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint peptidkonjugátumokkal

kiválthatók monocita effektor funkciók, azonban konjugálatlan, szabad formában a

peptidek nem gátolták sem az immunkomplexek FcR-okhoz való kötődését, sem a

sejtek FcR közvetítette IL-6 termelését, viszont gátló hatással voltak a TNFα termelésre.

3

SUMMARY

Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disorder characterized by a systemic

inflammatory state and the presence of a wide range of pathogenic autoantibodies. My

research focused on the detection and characterization of these autoantibodies, since

many details about their development and their pathogenic effects are still unclear. My

work also included the evaluation of laboratory tests which might help the diagnosis,

disease activity or prediction about the outcome of the SLE.

The aims of my work were: 1) to measure serum DNase activity in the SLE population

with the aim of evaluating the significance of DNase activity in the development of

SLE, especially in lupus nephritis; 2) to study the association between the DNase

activity and the production of antinucleosome antibodies; 3) to examine the presence of

antiphospholipid antibodies in SLE, and their role in the development of

thromboembolic episodes; 4) to examine the role of other, SLE independent

thromboembolic risk factors, and evaluate the clinical value of thrombophilia screen in

SLE; 5) to analyze the inhibitory effect of synthetic peptides from the Fc region of the

antibodies on the Fcγ receptor mediated effector functions of human monocytes, and

evaluate the possible use of these in the treatment of SLE.

My results confirm that patients with SLE have reduced serum DNase activity, but the

enzyme activity doesn’t show association with disease activity or organ involvements

such as lupus glomerulonephritis, but it negatively correlates with serum

antinucleosome antibody concentration. According my results, the incidence of

thromboembolism is about 10-fold higher in SLE that that of the normal population, and

the antiphospholipid antibodies play the primary role in the development of thromboses

in SLE. Other, inherited risk factors seem to be of lesser importance. The IgG Fc

peptides, although in conjugates they could trigger macrophage effector functions via

the FcRs, were unable to inhibit the binding of immuncomplex-bound antibodies to the

receptors, nor could inhibit the IL-6 cytokine production induced by the antibodies.

4

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 6

BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS 8

AZ SLE KLINIKAI HÁTTERE 8 AZ SLE KIALAKULÁSÁNAK MOLEKULÁRIS HÁTTERE 11 AZ ANTI-DNS ÉS ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK JELENŐSÉGE 11 DNÁZ SZEREPE AZ ANTITESTEK KIALAKULÁSÁBAN 12 GENETIKAI HAJLAMOSÍTÓ TÉNYEZŐK 13 MBL ÉS POLIMORFIZMUSAI 14 FC RECEPTOROK 15 FOKOZOTT TROMBÓZISKÉSZSÉG SLE-BEN 16 AZ ALVADÁSI RENDSZER ÁTTEKINTÉSE 16 FŐBB TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK 18 Antitrombin deficiencia 19 A protein C – protein S rendszer defektusai 19 APC rezisztencia és a Leiden-mutáció 20 A protrombin G20210A mutáció 20 Emelkedett VIII-as faktor szint 21 Emelkedett homocisztein szint 22 SZERZETT TROMBOFÍLIÁS TÉNYEZŐK, AVAGY A TROMBÓZIS KIALAKULÁSÁT SEGÍTŐ ÁLLAPOTOK 23 A gyulladás szerepe a trombózis kialakulásában 23 Az APA-k szerepe a trombózis kialakulásában 23

CÉLKITŰZÉSEK 26

MÓDSZEREK 27

A VIZSGÁLT BETEGCSOPORT 27 A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE A VIZSGÁLATOKHOZ 27 AZ ANTINUKLEOSZÓMA ÉS ANTI-DNS ANTITESTEK SZINTJÉNEK A MÉRÉSE 27 DNÁZ AKTIVITÁS MÉRÉS 28 AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK SZINTJÉNEK MÉRÉSE ELISA MÓDSZERREL 28 A FOSZFOLIPID-SPECIFIKUS LA MÉRÉSE KOAGULÁCIÓS MÓDSZERREL 29 A TERMÉSZETES ANTICOAGULÁNS FEHÉRJÉK SZINTJEINEK MÉRÉSE 29 AZ APCR MEGHATÁROZÁSA 30 A LEIDEN MUTÁCIÓ ÉS A PROTROMBIN MUTÁCIÓ DETEKTÁLÁSA 30 AZ V-ÖS FAKTOR VIZSGÁLATA DNS SZEKVENÁLÁSSAL 31 A VIII-AS FAKTOR SZINTJÉNEK MÉRÉSE 31 A VON WILLEBRAND FAKTOR SZINTJÉNEK A MÉRÉSE 32 HOMOCISZTEIN SZINT MÉRÉS 32 A SZINTETIKUS PEPTIDEK ÉS PEPTIDKONJUGÁTUMOK CITOKINTERMELÉSRE GYAKOROLT HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA 32 FCR-OK ÉS A PEPTIDEK KÖZTI KÖTŐDÉS VIZSGÁLATA 33 STATISZTIKAI ANALÍZIS 34

5

EREDMÉNYEK 35

A NUKLEOSZÓMA ELLENI ANTITESTEK ÉS A DNÁZ AKTIVITÁS SLE-BEN 35 DNÁZ ENZIMAKTIVITÁS AZ SLE-S BETEGCSOPORTBAN 35 ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK (ANCSA) SLE-BEN 37 AZ ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK KAPCSOLATA AZ ANTI-DSDNS ANTITESTEKKEL ÉS A DNÁZ ENZIMAKTIVITÁSSAL 39 A DNÁZ AKTIVITÁS SZEREPE AZ SLE KÖVETÉSÉBEN 41 KÖVETÉSES VIZSGÁLATOK 42 A TROMBOEMBÓLIÁS ESEMÉNYEK BEKÖVETKEZTÉNEK ÉS A TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK JELENLÉTÉNEK A KAPCSOLATA SLE-S BETEGKNÉL 45 A TROMBÓZIS INCIDENCIÁJA SLE-BEN 45 AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK ELŐFORDULÁSA A VIZSGÁLT POPULÁCIÓBAN 46 AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK ÉS A TROMBÓZIS KOCKÁZATÁNAK ÖSSZEFÜGGÉSE 47 EGYÉB, ÖRÖKLÖTT TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK ELŐFORDULÁSA A VIZSGÁLT POPULÁCIÓBAN 50 FV Leiden és FII G20210A mutációk 50 Szerzett APCR vizsgálata 51 Természetes antikoaguláns fehérjék (AT, PC és PS) 53 FVIII és vWF szintek 53 Homocisztein szint 53 AZ ÖRÖKLÖTT RIZIKÓFAKTOROK JELENLÉTÉNEK KAPCSOLATA A TROMBOEMBÓLIÁS ESEMÉNYEK KIALAKULÁSÁVAL 54 FV Leiden és FII G20210A mutációk 54 Természetes anticoaguláns fehérjék 54 FVIII és vWF 54 Homocisztein szint 56 AZ APAK ÉS AZ ÖRÖKLÖTT TROMBOEMBÓLIÁS KOCKÁZATI TÉNYEZŐK EGYÜTTES HATÁSA 56 AZ FCR-OK GÁTLÁSÁNAK VIZSGÁLATA 58 A PEPTIDEK KÖTŐDÉSE AZ FC RECEPTOROKHOZ 59 IC-KÖTÉS GÁTLÁSA 59 PEPTIDKONJUGÁTUMOK CITOKINTERMELÉST INDUKÁLÓ HATÁSA 60 MONOMER PEPTIDEK GÁTLÓ HATÁSA 61

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 62

ÖSSZEFOGLALÁS 69

IRODALOMJEGYZÉK 71

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 82

6

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK

ACR American College of Reumatology

ADCC antitest-függő sejtes citotoxicitás

ANCSA antinukleoszóma-antitest

APA antifoszfolipid antitest

APC aktivált protein C

aPTI (=aPTT) aktivált parciális tromboplasztin idő

AT antitrombin

ß2-GPI ß-2-glikoprotein I

C4BP C4 kötő fehérje

Cal cardiolipin

CBA kollagén kötő aktivitás

CBS cisztationin-ß-szintetáz

CI konfidencia intervallum

DNáz dezoxi-ribonukleáz

DNS dezoxi-ribonukleinsav

dNTP dezoxi-nukleotid

ECLAM European Consensus Lupus Activity Measurement

EKG elektro-kardiogram

ELISA enzimkötött immunszorbens technika

Fc „fragment crystallizable”

FcR Fc receptor

FITC fluoreszcein-izo-tiocianát

FPIA fluoreszcens polarizációs immuntechnika

FII II-es alvadási faktor (protrombin)

FX X-es alvadási faktor

FXa aktivált FX

GN glomerulonefritis

HLA humán leukocita antigén

ICAM intercellular cell adhesion molecule

IgG immunglobulin G

7

IL interleukin

IU nemzetközi egység

LA lupus antikoaguláns

MBL mannóz-kötő lektin

MHC fő hisztokompatibilitási komplex

MTHFR metil-tetrahidrofolát-reduktáz

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromid

NK natural killer cell

OR odds ratio

PAI plazminogén aktivátor inhibitor

PC protein C

PCR polimeráz láncreakció

PhL foszfolipid

Ph-Ser foszfatidil-szerin

PS protein S

PT protrombin idő

RR relative risk

rpm percenkénti fordulatszám

SAH S-adenozil-homocisztein

SLAM Systemic Lupus Activity Measure

SLE szisztémás lupus erythematosus

SLEDAI SLE disease activity index

TF szöveti faktor

TFPI TF pathway inhibitor

TNFα tumor nekrózis faktor α

t-PA szöveti-típusú plazminogén aktivátor

u-PA urokináz-típusú plazminogén aktivátor

UCTD nem differenciált kötőszöveti betegség

VCAM vascular cell adhesion molecule

vWF von Willebrand faktor

8

BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS

Az SLE klinikai háttere

A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség. Az immunrendszer

szabályozásában több ponton fellépő zavar miatt a szervezet egyes saját struktúrái elleni

antitestképződés indul, amelyet szisztémás gyulladás kísér.

Nevének eredete a betegség jellegzetes bőrtüneteire vezethető vissza. Lupus vulgarisnak

nevezték korábban a tuberkulózis egyik változatát, mivel farkasmarásra emlékeztető

nyomokat hagyott az arcon. Ettől különböztették meg 1851-ben az erythemákat kiváltó

lupus erythematosust, amelynek szisztémás tüneteit később Kaposi Mór írta le.

Az SLE prevalenciája Európában 100.000 főre vetítve 40-70, éves incidenciája pedig 1-

5/100.000 fő [1-4]. Ezekből az adatokból is kitűnik, hogy a betegség mortalitása nem

magas, a betegek 5 éves túlélése 90 % felett van. A betegségre jellemző, hogy a férfi-nő

arány a megbetegedettek közt 1:8-10-hez, valamint, hogy a színesbőrű népesség

körében magasabb az előfordulása [5, 6]. Szintén érdemes megemlíteni, hogy a

betegség kezdete leggyakrabban a fiatal felnőttkorra tehető, ritkább a pubertáskor előtti

és az 55 év felett jelentkező lupus.

A betegség kialakulásához sok tényező együttes hatása vezethet. Azonosítottak olyan

géneket (pl. HLA izotípusok, IgG-Fc- valamint komplementreceptorok), amelyek egyes

1. ábra: Az SLE kialakulásában szerepet játszó tényezők. A genetikai háttér mellett környezeti hatások is hozzájárulnak a betegség megjelenéséhez.

hormonokfertőzések

antibiotikumok gyógyszerekUV-sugárzás

stressz

HLA izotípuskomplement–citokin és Fc

receptor-MBL-gének

genetikai prediszpozíció

környezeti tényezők

SLEhormonokfertőzések

antibiotikumok gyógyszerekUV-sugárzás

stressz

HLA izotípuskomplement–citokin és Fc

receptor-MBL-gének

genetikai prediszpozíció

környezeti tényezők

SLEhormonokfertőzések

antibiotikumok gyógyszerekUV-sugárzás

stressz

HLA izotípuskomplement–citokin és Fc

receptor-MBL-gének

genetikai prediszpozíció

környezeti tényezők

SLE

9

variánsai hajlamosítanak autoimmun betegségekre, vagy éppen az SLE-re. A genetikai

prediszponáltság azonban önmagában nem elég. A környezeti tényezők közül az UV-

sugárzás, egyes gyógyszerek (pl. hidralazin, prokainamid, α-metil-dopa) [7, 8], és

fertőzések (pl. Eppstein-Barr vírus) [9-13] is lehetnek a betegség közvetlen kiváltói.

Hozzájárul a fentiekhez egyfajta hormonális hatás is: nem véletlen a betegek közti női

dominancia, vagy az sem, hogy a lupuszosoknál gyakran tapasztalható állapotromlás a

terhesség alatt, ösztrogéntartalmú gyógyszerek szedésekor, vagy éppen a premenstruális

időszakban [14-18].

Sokszínűsége miatt az SLE diagnózisa a legtöbb esetben nem egyszerű. Az általános

tünetek – láz, fáradékonyság, nyirokcsomó-duzzanat, gyorsult süllyedés – mellett

gyakran jelentkezik leukopénia, artritis, bőrtünetek (1. táblázat). (A betegség egyik

jelképe világszerte a pillangó, amely a betegek kis hányadának orrán és orcáján

jelentkező, valóban pillangóra emlékeztető vöröses bőrjelenségre utal.) Kisebb

1. táblázat: Az SLE manifesztációinak gyakorisága a betegek körében.

százalékban már a diagnózis idejére kialakult a betegnél vesekárosodás, idegrendszeri

tünet, trombózis. Néhány laboratóriumi paraméter megváltozása is alátámaszthatja a

lupus diagnózisát. A gyakorlatban az American College of Rheumatology (ACR) által

Szervi manifesztáció Érintettek aránya

arthralgia vagy arthritis 95 %

bőrérintettség 80 %

hematológiai tünetek (anémia, leukopénia) 60-90 %

lázas állapotok 50-70 %

veseérintettség 30-60 %

idegrendszeri tünetek 30-50 %

fényérzékenység 30 %

mellkasi fájdalom 20-45 %

hajhullás 15-30 %

szekunder antifoszfolipid szindróma 20 %

10

kialakított kritériumrendszer 11 pontja közül legalább négy együttes teljesülése esetén

mondható ki az SLE fennállása [19](2. táblázat).

2. táblázat: A szisztémás lupus erythematosus (SLE) diagnosztikai kritériumai [19]. A fenti 11 közül négy igazolódása esetén mondható ki a betegség diagnózisa.

1. Vespertilio (pillangó-erythema): lapos vagy kiemelkedő bőrpír az orron és az

orcákon, ami nem terjed rá a nasolabiális redőre.

2. Discoid bőrjelenség: kiemelkedő erythemás foltok, tapadó keratotikus hámlással

és follikuláris dugókkal, a régebbi léziókban atrófiás hegesedéssel

3. Fényérzékenység: a napfényre adott szokatlan bőrreació

4. Orális fekélyek: többnyire fájdalmatlan orális vagy nazofaringeális

fekélyképződés

5. Arthritis: nem destruáló arthritis két vagy több perifériális izületben, fájdalom,

duzzanat és izületi folyadék jelenléte jellemzi

6. Serositis: pleuritis és/vagy pericarditis dörzszörejjel, folyadékkal vagy EKG-val

alátámasztva

7. Vesebetegség: napi 0,5 g-ot meghaladó állandó proteinuria és/vagy szemcsés

cylinderek a vizeletben

8. Neurológiai tünetek: nem gyógyszer vagy anyagcserezavar indukálta görcsök

és/vagy psychosis

9. Hematológiai tünetek (a következők bármelyike): hemolitikus anémia

reticulocytosissal, leukopénia, limfopénia, vagy trombocitopénia

10. Immunológiai eltérések (bármelyik): kóros anti-DNS antitest szint, anti-Sm

pozitivitás vagy cardiolipin pozitivitás

11. ANA pozitivitás

A betegség aktivitása időben váltakozó. Hosszú tünetmentes periódusok után is újra

jelentkezhet exacerbáció. A betegség aktivitásának megítélésekor a beteg klinikai

állapota a döntő. Emellett laboratóriumi leletek is segítenek az immunrendszer

aktiváltsági állapotának megítélésében. Mivel a betegség többféle formában jelentkezik,

és lefolyása egyénenként változó, nincs olyan paraméter, amely minden beteg esetében

egyértelműen segítené a betegségaktivitás megítélését. Éppen ezért dolgozták ki az SLE

11

aktivitását objektíven jellemezni célzó indexeket, amelyek közül mi az egyik

legelterjedtebbet, a SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index)

pontrendszert [20] használtuk vizsgálataink során. Eszerint különböző pontértékeket

számítunk az egyes tünetekre, majd ezek összessége adja meg a betegség aktivitásának

mértékét.

8 pontot számítunk az alábbi tünetekre: akut görcsök, pszichózis, vasculitis,

retinavasculitis okozta látászavar, agyidegtünetek, lupus fejfájás, cerebrovasculáris

léziók, „organic brain” szindróma.

4 pontot számítunk a következőkre: arthritis legalább két izületben, myositis,

haematuria, pyuria, napi 0,5 g-ot meghaladó proteinuria, szemcsés vagy vörös vértestes

cylinduria.

2 pontot számítunk az alábbiakra: Pleuritis, pericarditis, nyálkahártyafekély, alopecia,

friss exanthema, alacsony komplement szint, magas anti-DNS szint.

Végül 1 pontot jelentenek: láz, trombocitopenia, leukopenia.

Mivel a kezelés elsősorban a beteg pillanatnyi állapotától függ, remisszióban teljesen

elhagyható, míg az aktív lupus ellen esetenként csak igen agresszív terápiával lehet

hatásos.

Az exacerbációk közeledtének, valamint a későbbi szervi manifesztációk

kialakulásának az előrejelzése fontos, megoldás előtt álló feladat a kutatók számára.

Az SLE kialakulásának molekuláris háttere

A betegség tüneteinek többségét a nagy mennyiségben képződő autoantitestek

antigénekkel képzett komplexei okozta károsodások váltják ki. Az antitestek közül a

kromatin elemeit, a kettősszálú DNS-t, a hisztonfehérjéket, vagy az ezekből kialakuló

összetett struktúrákat, a nukleoszómákat felismerő antitestek kiemelkedő jelentősséggel

bírnak a betegség kialakulását illetően [21-23].

Az anti-DNS és antinukleoszóma antitestek jelenősége

Az anti-DNS antitestek jelenlétének vizsgálata a betegség diagnózisának felállításakor

és a betegségaktivitás követésekor is elengedhetetlen [21, 24, 25]. Újabb tanulmányok

12

emellett felhívják a kutatók és klinikusok figyelmét az antinukleoszóma antitestek

(ANCSA) diagnosztikai jelentőségére is [26-28]. Ezek az antitestek antigénjüket

felismerve vele immunkomplexet képeznek, majd a veseglomerulusokban lerakódva a

szervben szöveti károsodást okozhatnak [29, 30]. Az immunkomplexek által kiváltott

glomerulonephritis (GN) az SLE-s betegek 30-60 %-át érinti [31-33].

Leírták, hogy kísérleti állatokban a T-sejtes válasz gátlása nemcsak az anti-DNS szintet

csökkenti, hanem a lupus nephritis kialakulását is gátolja. Azt is kimutatták, hogy az

SLE-ben megjelenő anti-DNS antitestek többnyire nagy affinitású, IgG izotípusú

ellenanyagok, amelyek termelődése T-sejt függő. Ezzel bizonyították, hogy az

autoantitestek képzése antigén által indukált, T-sejt dependens úton indul [34-37].

DNáz szerepe az antitestek kialakulásában

Az apoptotizált sejtek eltávolításának defektusa az elhalt sejtekből felszabaduló

nagymennyiségű sejttörmelék, köztük kromatin komponensek keringésben való

felgyülemlése révén előidézheti az autoantitestek termelését, és az SLE kialakulását [38,

39].

A hasnyálmirigy által termelt DNáz I, és a lép által termelt DNáz II enzimek elhasítják a

nukleoszómák kettősszálú DNS láncait, ezzel elősegítik a keringő kromatinállomány

lebontását, eltávolítását. A DNáz I egy 30,4 kDa molekulatömegű glikoprotein, amely

kation-kötő szekretoros endonukleázként hasítja a DNS-t, szekvencia-specifikusan [40].

A DNáz II szintén glikoprotein, molekulatömege 45kDa [41]. Savas pH-optimumának

megfelelően a sejtmagon kívül a lizoszómákban és néhány szekrétumban jelenik meg.

Régóta ismert az elgondolás, amely szerint a DNáz I enzim csökkent működése szerepet

játszhat az SLE és az SLE-ben jelentkező lupus nephritis kialakulásában [42, 43]. Ezt a

feltevést több kísérlet is alátámasztja.

DNáz I deficiens egerek vizsgálata azt mutatta, hogy a kísérleti állatokban SLE-hez

hasonló betegség alakult ki: antinukleáris antitest pozitivitással, magas anti-DNS

szinttel, illetve a veseglomerulusokban megfigyelhető immunkomplex-lerakódással

[44]. Ezek a hatások eltérő mértékben, a DNáz I szinttől függően jelentkeztek az

egereken. Egy másik kutatócsoport eredményei szerint, az SLE-s egereknek adott

intravénás DNáz injekciót követően csökkent az állatokban az autoimmun válasz

erőssége [45].

13

Egy közel 40 éve tett megfigyelés szerint a borjú DNáz I enzimmel történő kezelés

emberekben is visszaszorítja a DNS és rokon struktúrák antigén jellegét; valamint, hogy

a kezelés hatására a betegek egy részének anti-DNS szintje csökkent, illetve klinikai

állapota javult [46]. A borjú DNáz immunogén hatása miatt rekombináns humán

enzimmel folytatódtak a kísérletek. Azonban a bíztató egérkísérletek [45] ellenére sem

sikerült a rekombináns humán DNázzal hatásosan visszaszorítani az autoimmun

folyamatokat [47].

Japán kutatók két betegben is azonosították az A172G báziscserével járó mutációt a

DNASE I gén 2. exonjában [48]. A betegek, akiknek genomjában ez a mutáció

heterozigóta formában jelen volt, alacsony DNáz I enzimaktivitással és az SLE-s

csoportban mértnél is szignifikánsan magasabb anti-DNS szinttel rendelkeztek, de nem

mutatták semmilyen, a mutációval összefüggésbe hozható egyedi manifesztációját a

betegségnek.

Genetikai hajlamosító tényezők

A családfa és ikervizsgálatok, valamint a közelmúlt genetikai vizsgálatainak tapasztalata

szerint az SLE kialakulásának hátterében nem állhat kizárólag egy gén, hanem több gén

is rendelkezik olyan variánssal, amelyek együttállása a betegségre hajlamosító

genotípust alakíthat ki [49-52]. Egyes becslések szerint legalább négy genetikai

defektus, vagy hajlamosító allél szükséges ahhoz, hogy a betegség fenotípusosan is

megjelenjen [53]. Igaz azonban az is, hogy egyes ritka mutációk (például a

komplementrendszer korai elemeinek deficienciájához vezetők) homozigóta formában

önmagukban is a lupuszhoz hasonló tünetegyüttes megjelenéséhez vezethetnek [54, 55].

Az SLE-re hajlamosító genetikai eltéréseket az érintett fehérjék funkciója szerint három

fő csoportba oszthatjuk: Az első csoportban olyan genetikai polimorfizmusok vagy

mutációk szerepelnek, amelyek hatásaként sérül a szervezet fiziológiás sejttörmelék-

eltávolító rendszere. Példaként említhetjük az MBL, a C1q és más komplementfehérjék,

valamint egyes enzimek génjének defektusait. A második halmazba kerülnek azok a

gének, amelyek eltérései - termékeik immunreguláló szerepénél fogva – hozzájárulnak

az immunológiai tolerancia áttöréséhez. Ilyen genetikai eltérések a Fas, Fas-ligand

mutációi. A harmadik csoportban azokat a géneket találjuk, amelyek változatai a

betegség lefolyására, szervi manifesztációira vannak hatással.

14

Többen is vizsgálták az SLE összefüggését az MHC géncsalád polimorf elemeivel [56,

57]. Az MHC II DR2 és DR3 allélek 2-5-szörös relatív kockázatot hordoznak az SLE

kialakulására, ezen felül kimutattak bizonyos összefüggést a fenti allélek és egyes SLE-

re jellemző - ribonukleoproteinek és kromatinelemek ellen irányuló - autoantitestek

megjelenése között is [58]. Az MHC III géncsalád egyes - a korai

komplementfehérjéket kódoló - elemeinek deficienciája súlyos autoimmun folyamatok

beindulását eredményezheti. Ennek az lehet az oka, hogy a komplementrendszer fontos

szerepet tölt be az immunkomplexek eltávolításában, amely funkció kiesése esetén a

felszaporodó komplexek gyulladásos, hiperszenzitivitási reakciókat okozhatnak.

MBL és polimorfizmusai

Az MBL (mannose binding lectin) molekula szerkezetileg a komplement rendszer C1q

komponenséhez hasonlítható. A két fehérje funkciójában is találunk azonosságokat. Az

MBL képes felismerni a különböző mikroorganizmusok – baktériumok, gombák -

felszínén található mannóztartalmú membránmotívumokat. A kórokozókhoz való

kötődéssel aktiválják a komplementrendszer lektin-dependens útvonalát, ezzel

elősegítik a patogén komplement általi lízisét vagy azt, hogy a makrofágok - opszonizált

fagócitózis útján – hatékonyan elpusztítsák a mannózmotívumokkal rendelkező

kórokozót.

Az MBL fehérje szintje egyénenként változó, alakulását nagyban befolyásolja az MBL

gén 1-es exonjában található három ismert polimorfizmus valamelyikének jelenléte,

vagy a gén promóter régiójában leírt három polimorfizmus megjelenése [59]. Ezek

mindegyike a plazmában a vad genotípusú egyénekénél alacsonyabb MBL

koncentrációt eredményez. Leírták, hogy az alacsonyabb MBL koncentráció

hajlamosíthat az SLE-re [60]. Ennek hátterében több folyamat is állhat. Egyrészt, az

MBL megfelelő mennyiségének hiányában lassabban megy végbe az apoptotikus

sejttörmelék eltávolítása, a felhalmozódó sejtalkotók pedig – az arra hajlamos egyének

szervezetében – antigénként beindítják a különféle autoantitestek képződését. Másrészt,

csökkent MBL szint mellett a szervezet hajlamosabb a bakteriális és virális fertőzésekre,

amelyek – szintén az SLE-re prediszponált egyének esetében - közvetlen kiváltói

lehetnek a betegségnek. Újabb tanulmányok vizsgálják a csökkent termelést

15

eredményező polimorfikus MBL allélek összefüggéseit az anti-C1q, illetve az

antifoszfolipid antitestek termelődésével [61, 62].

Fc receptorok

Az ellenanyag molekulák Fc alegységének megkötésére képes receptorok (FcR [63]) a

legtöbb hemopoetikus eredetű sejten megtalálhatóak. Osztályozásuk Ig

izotípuspreferenciájuk szerint történik; szerkezetük, és ezzel összefüggésben funkciójuk

alapján pedig aktiváló vagy gátló Fc receptorokat különböztetünk meg [64, 65]. A

legtöbb esetben a sejtek felszínén egyidejűleg gátló és aktiváló receptorok is

megjelennek.

Az IgG izotípusú ellenanyagokat felismerő FcγR-ok a nagy affinitású FcγRI kivételével

gyengén kötik az IgG-t, ezért a szabad antitest nem, kizárólag az immunkomplexben

szereplő, ezáltal megváltozott térszerkezetű ellenanyag molekulák kötődnek a

receptorhoz, és váltanak ki végrehajtó funkciót.

Az FcR-ok által közvetített effektor funkciók a receptortól, és az azt kifejező sejttípustól

függően sokfélék lehetnek [65]. Aktiváló FcR-on keresztül kiváltható az NK sejtek

antitest-függő citotoxikus reakciója (ADCC), serkenthető a makrofág sejtek fagocitáló

képessége, és indukálható gyulladásoscitokin-termelésük. A gátló jellegű FcγRII fontos

szerepet tölt be B-sejtek antigéntermelésének szabályozásában.

Az FcγRIIa génjében leírt polimorfizmus a molekula 131-es pozíciójában egy aminosav

cseréjéhez vezet. Ismert, hogy a kizárólag H131 FcγRIIa molekulákat hordozó sejtek

sokkal hatékonyabban képesek az IgG2 megkötésére, míg az R131 FcγRIIa-val

rendelkezők kevésbé. Hasonlóan, az FcγRIIIa gén polimorfizmusának köszönhető F158

FcγR-ok az IgG 1-es, 3-as, és 4-es alosztályába tartozó molekulákat kötik kisebb

affinitással, mint a V158 FcγR-ok.

Az MBL molekulához hasonlóan az FcγR-ok Ig-kötést befolyásoló polimorfizmusairól

is leírták, hogy hozzájárulnak az autoimmun folyamatok kialakulásához [66-68].

Ezeknek a megfigyeléseknek a magyarázata az lehet, hogy a csökkent ellenanyag kötés

az immunkomplexek eltávolításának defektusát okozhatja, ezzel hozzájárulhat

hiperszenzitivitási reakciók kialakulásához.

Az FcR-ok gyulladásos folyamatok közvetítésében betöltött szerepének tárgyalásakor ki

kell hangsúlyoznunk az eltérő funkciójú receptorok egyensúlyának fontosságát. Az

16

aktiváló FcγRIII receptor bizonyítottan részt vesz az immunkomplex-mediált

gyulladásos, szövetkárosító folyamatokban [69]. Az FcγRIIb, az egyetlen ismert gátló

receptor viszont intracelluláris jelátviteli utakon képes gátolni az FcγRIII aktivációját

[70]. Leírták, hogy míg az FcγRIIb konstitutív módon kifejeződik a

veseglomerulusokban, az FcγRI és FcγRIII fiziológiás körülmények között nem.

Vannak azonban olyan mediátorok (pl. IFNγ), amelyek hatására az aktiváló receptorok

megjelennek a sejtfelszínen, a gátló FcγRIIb mennyisége viszont lecsökken. Ez a

folyamat végül heves gyulladásos reakcióhoz, ezzel pedig vesekárosodáshoz vezet.

Egy másik példa szerint azok a transzgenikus egerek, amelyek a humán FcγRIIa-t a

humán sejtekre fiziológiásan jellemző mennyiságben kifejezték, trombocitaaktivációt

előidéző ellenanyag beadására trombocitopéniával reagáltak, míg a vad típusú -

FcγRIIa-t nem expresszáló - egerek csak kis mértékben, a jelátvitel gátoltsága miatt nem

aktiválható FcγRI és FcγRIII receptorokkal sem rendelkező egerek pedig egyáltalán

nem mutattak trombocitopéniára utaló tüneteket. Azok az FcγRIIa transzgenikus egerek

pedig, amelyek működőképes FcγRI és FcγRIII fehérjékkel is rendelkeztek,

trombocitaaktivációt követően néhány órával trombózis és sokkreakció következtében

elpusztultak [71].

Fokozott trombóziskészség SLE-ben

Az alvadási rendszer áttekintése

A véralvadási és fibrinolitikus rendszerek helyes működése segít fenntartani a

létfontosságú keringést ereinkben. Amennyiben a rendszer valamelyik eleme nem

megfelelően működik, a fennálló kényes egyensúly eltolódik, felléphet egyrészt

vérzékenység, amely vérveszteségen és szöveti károsodáson keresztül vezethet

életveszélyes állapotokhoz, vagy felléphet fokozott alvadékonyság, amely az érpályák

elzárása révén fontos területek, szervek funkciójának kiesését okozhatja.

Az alvadás megindulása in vivo az intravasálisan fiziológiás körülmények között nem,

vagy csak nyomokban jelenlévő szöveti faktor (TF) megjelenésével kezdődik. A TF

transzmembrán glikoprotein, amely megtalálható a nagyobb ereket körülvevő adventitia

réteg sejtjein, epitélsejteken illetve egy esetleges érsérülést követő károsodásnak

fokozottan kitett helyeken (pl. agy, veseglomerulusok), de nyugalmi állapotban

17

hiányzik a plazmával érintkező endotélium és a vér alakos elemeinek felszínéről. Az

érfal sérülése, vagy a monocita sejtek aktivációja következtében TF kerül kapcsolatba a

plazmával, megköti és aktiválja az ott keringő VII-es alvadási faktort. A VII-es faktor

aktivált enzimalakja (FVIIa) foszfolipid membránfelszín jelenlétében, a TF-hez kötötten

képes hasítani, és ezzel aktiválni a IX-es és X-es alvadási faktorokat, azok pedig kis

mennyiségben egymást. Az FXa foszfolipid felszín és Ca2+-ionok jelenléte mellett

képes a protrombin (II-es faktor) kis mennyiségének aktiválására. Az így keletkezett

trombin (FIIa) beindít egy másik utat: hasítással aktiválja a XI-es faktort, amely

autokatalízise mellett a IX-es faktort aktiválja nagy mennyiségben. Emellett a trombin

és az FXa is aktiválni képes a VIII-as faktort, amely így kofaktorként a FIXa-hoz

kötődve, a foszfolipid felszínnel és a Ca2+-ionokkal kialakítja a X-es faktor

aktiválásának leghatákonyabb komplexét, az angolból átvett szóval „tenase”-komplexet.

Az így nagy mennyiségben keletkezett FXa, az előzőekhez hasonlóan foszfolipidekkel,

Ca2+-ionokkal, és kofaktorával, az FVa-val a protrombint nagy mennyiségben

trombinná hasító protrombináz komplexet képzi. Az eddigi folyamatok mind oda

vezetnek, hogy a keletkező trombin a plazmában keringő fibrinogént (I-es faktort)

hasítva, fibrin keletkezéséhez, annak H-hidakkal történő összekapcsolódásához, így egy

laza fibrinháló kialakulásához vezet, amit végül az aktivált XIII-as faktor stabilizál.

2. ábra: A véralvadási rendszer főbb folyamatainak áttekintése

FIXaFIX

FX FXa

TF-FVIIa

FVIICa2+ + PhL

Ca2+ + PhL

- FVIIIa

- FVa

FII FIIa

FXIa FXI

FXIIa FXII

FI

fibrin + FXIIIaFIXaFIX FIXaFIX

FX FXaFX FXa

TF-FVIIa

FVII

TF-FVIIa

FVIICa2+ + PhL

Ca2+ + PhL

- FVIIIa

- FVa

FII FIIaFII FIIa

FXIa FXIFXIa FXI

FXIIa FXIIFXIIa FXII

FI

fibrin + FXIIIa

18

Az alvadási kaszkád beindulásával egyidőben megkezdődik az antikoaguláns hatású

fehérjék aktiválódása is. A TFPI (tissue factor pathway inhibitor) FXa-val képzett

komplexe a TF és FVIIa komplexéhez köt, és azok működését, a IX-es és X-es faktorok

aktivációját gátolja. Az FXa-nak és a trombinnak több inhibitora is ismert, így az α1-

antitripszin, az α2-makroglobulin, vagy a heparin-kofaktor II. A leghatékonyabb gátlást

azonban az antitrombin (AT) fejti ki a statikus, vagyis a keletkező trombin

mennyiségétől függetlenül jelenlévő inhibitorok közül. Az antitrombin, amely önmaga

is szerin-proteáz, igen hatékony szerin-proteáz inhibitor („serpin”); kofaktoraival, a

heparán-szulfát-proteoglikánokkal illetve az antikoaguláns kezelés során is alkalmazott

heparinszármazékokkal, a trombin, az FXa és az FIXa enzimek inaktiválásáért felelős.

Mennyiségi vagy minőségi elégtelensége fokozott alvadékonysághoz vezet. Hasonlóan

jelentős természetes antikoaguláns fehérje az aktivált protein C (APC) és kofaktora a

protein S (PS). A protein C (PC) az endotél sejtek felszínén található EPCR-hez

(endoteliális PC receptorhoz) kötődve kerül kapcsolatba az őt aktiváló, sejtfelszíni

trombomodulinhoz kötődő trombinnal. Aktivációja után, kofaktorának a PS-nek

segítségével a tenáz és protrombináz komplexekben szereplő FVIIIa-t és FVa-t hasítja,

ezzel több nagyságrenddel csökkenti a trombinképződés sebességét. A PC, vagy a PS

hiánya erősen hozzájárul a trombózis kialakulásához.

Ezen felül, a fibrinképződés mellett azonnal megjelenik annak plazmin által történő

bontása is. A plazmin a plazminogénből keletkezik a szöveti- valamint az urokináz

típusú plazminogén aktivátorok (t-PA és u-PA) segítségével; feladata a fibrin hasításán

felül az extracelluláris mátrix bontásáért felelős mátrix metalloproteázok (pl.

kollegenáz, zselatináz) aktiválása is. A plazminogén, más néven fibrinolitikus

rendszerben részletes ismertetése e dolgozatnak nem célja, illő azonban

megjegyeznünk, hogy a működésében részt vesz több inhibitor is, amelyeknek

defektusa különböző mértékű vérzékenységet okoz.

Főbb tromboembóliás rizikófaktorok

Az alvadási és fibrinolitikus rendszer komplex és igen jól szabályozott. Ennek

következménye, hogy csak kivételesen ritka esetekben vezet egyetlen, a rendszert érintő

defektus trombózis kialakulásához. Számos örökletes, és szerzett állapotot írtak le,

19

amelyekről bebizonyosodott, hogy kisebb-nagyobb mértékben hozzájárulnak a

tromboembóliás események bekövetkeztéhez.

Antitrombin deficiencia

Az elsőként, az 1960-as évek közepén felismert örökletes trombózisra hajlamosító

tényező az antitrombin (AT) deficienciája volt [72]. Az AT képzésének mennyiségi

zavarai, vagy a funkciót érintő mutációk ma is a trombofíliás állapotok ismert kiváltói

közül a legsúlyosabbak közé tartoznak. Ma úgy tudjuk, hogy az AT teljes hiánya, amely

homozigóta AT mutációk következményeként állhat elő, a legtöbb esetben az élettel

összeegyeztethetetlen, viszont leírtak már homozigóta mutációt az AT heparin-kötő

helyén [73, 74], amely az AT funkciójának részleges elvesztésével jár. Heterozigóta

formában számos AT mutáció ismert, ezek a lakosság 0,02-0,20 %-át érintik [75, 76], a

trombofíliás eseteknek pedig mintegy 5 %-ában megtalálhatók [77, 78].

Az AT, amely maga is a szerin-proteáz emzimcsaládba tartozik, egyben szerin-proteáz

inhibitor („szerpin”) is, vagyis a szerin-proteáz aktivitású alvadási faktorokat, legelső

sorban a trombint, az aktivált X-es és IX-es faktorokat hasítja. Ebben természetes

kofaktorai a heparán-szulfát-proteoglikánok, illetve farmakológiai kofaktorai, a heparin

és ennek származékai segítik. Mutációk ismertek az AT aktív centrumában, valamint a

heparin-kötő helyen, ezek heterozigóta formában is fokozott trombóziskészséget

okoznak [79, 80].

A protein C – protein S rendszer defektusai

Az 1980-as években írták le először egy másik természetes antikoaguláns fehérjének, a

protein C-nek (PC) és kofaktorának, a protein S-nek (PS) az örökletes zavarát, mint

trombózisra erősen hajlamosító tényezőket [81-84]. Azóta mindkét fehérjének több mint

száz polimorf változatát megismertük [85-89]; ezek a teljes népesség mintegy 0,1-0,3

%-ában megtalálhatók [90, 91]. Súlyosabb esetekben, homozigóta vagy kettős

heterozigóta formában a PC vagy a PS hiánya vagy funkcionális deficienciája már

újszülöttkorban tromboembóliás események bekövetkeztéhez vezethet [92].

Az aktivált PC (APC) az aktivált V-ös és VIII-as faktorok inaktiválását végzi. Az FVa-t

a 306-os, 506-os, és a 679-es pozícióban lévő argininek mellett hasítja el. Az R679

melletti hasítás nem járul hozzá az FVa funkcióvesztéséhez, az R506 melletti hasítás

20

részleges inaktivációt eredményez, míg az R306 melletti hasítás az FVa aktivitásának

teljes elvesztéséhez vezet [93].

APC rezisztencia és a Leiden-mutáció

Az 1990-es évek elején derült fény az aktivált V-ös faktor APC elleni rezisztenciájának

hátterében álló eltérésre, vagyis az FV génben bekövetkezett G1691A báziscserének

köszönhetően a fehérje 506-os pozíciójában a vad típusú arginin helyett egy glutamin

megjelenésére [94]. Ezzel az eltéréssel - amelyet felfedezésének helyéről „Leiden-

mutáció”-nak neveznek - az FVa APC általi hasítása, vagyis inaktiválása jelentősen, ám

nem teljes mértékben lecsökken, vagyis egy igen fontos reguláló lépés marad ki a

folyamatból. Ez fokozott alvadékképződéshez, így visszatérő, elsősorban a mélyvénákat

érintő trombózisok kialakulásához vezet [95-97]. A Leiden-mutációt hordozó allél a

teljes európai népesség 3-7 %-ában [97-99], Magyarországon a lakosság 6-10 %-ában

megtalálható [100-102]; érdekesség, hogy az ázsiai népesség körében a Leiden-allél

előfordulása rendkívül ritka [103-105].

Az FVIIIa-t az APC az R336-os és R562-es pozíciókban hasítja. Érdekes megjegyezni,

hogy a vad típusú FV jelenléte szignifikáns mértékben segíti az FVIIIa APC általi

hasítását, azonban a Leiden-mutációt hordozó gén termékeként keletkező FV ezt a

funkciót nem képes betölteni, vagyis egy második úton is elősegíti az alvadékképződést.

APC rezisztenciát, és így fokozott alvadékonyságot okoz - az FV R506Q változatához

hasonlóan - az FV „Cambridge-mutáció” [93], amely a 306-os pozícióban bekövetkező

arginin treonin aminosavcserét eredményezi. Ez azonban, ellentétben a Leiden-

mutációval, igen ritka [106].

Ismertté vált, hogy az APC kofaktora, a PS elsősorban az FVa R306-os hasításához

szükséges; konformációs változást eredményez az APC-n, így segíti annak aktív

centrumát a szubsztráthoz közelebb kerülni. Emellett, a PS az FXa-hoz, az aktivált V-ös

és a VIII-as faktorokhoz kötve gátolja a protrombin-trombin átalakulást, ezzel is kifejtve

antikoaguláns hatását.

A protrombin G20210A mutáció

Az enzimatikusan aktív trombin mennyiségét szabályozzák fent említett inhibitorai, de

azt, hogy alapvetően mennyi keletkezik, döntően befolyásolja a protrombin gén

promóter régiója is. A promóter régióban található, 1996-ban leírt G20210A mutáció

21

hatására, a mutáns allélt heterozigóta formában hordozók plazmájában kb. 30%-kal

magasabb lesz a protrombin szintje [107]. Ez több trombin keletkezését

eredményezheti, és ezzel fokozott alvadékonysághoz vezethet. Ez a mutáció a

magyarországi népesség 2,5-5 %-ában mutatható ki [100]; az eddig ismertetett

defektusokénál mérsékeltebb – heterozigóta formában mintegy 2-3 szoros - kockázatot

hordoz [107, 108]. Önmagában jellemzően még homozigóta formában sem vezet

trombózis kialakulásához, azonban megemeli mind a vénás, mind az artériás

trombózisok bekövetkezésének valószínűségét. A protrombin gén más változatairól is

leírták, hogy hozzájárulnak a protrombin szint megemeléséhez. Például, a 13-as

intronban található A19911G polimorfizmus esetében megfigyelték, hogy a homozigóta

G allélt hordozók plazmájában 7 %-kal magasabb a protrombin szintje, mint a

homozigóta A alléllal rendelkezőkében [109]. Bár összefüggést találtak a trombózis

megnövekedett kockázata és a GG genotípus között, ennek jelentősége elmarad a

korábban említett kockázati tényezőkétől.

Emelkedett VIII-as faktor szint

Hasonlóan a protrombin, azaz a II-es faktor fokozott termelődéshez, más alvadási

faktorok emelkedett szintjéről is megállapították, hogy hozzájárulnak a koagulációs

rendszer egyensúlyának az alvadékonyság irányába történő eltolódásához.

Leggyakrabban a VIII-as faktor szerepét említi az irodalom [108, 110, 111], de

születtek eredmények, amelyek a IX-es, XI-es, valamint az I-es faktorok magas szintje

és a trombózis mérsékelten (1,5-3-szorosan) emelkedett rizikója közötti kapcsolatot

támasztják alá [108].

Vizsgálatok során kiderült, hogy az emelkedett FVIII szint határozottam, 3-5-szörösre

megemeli – elsősorban a vénás – trombózis kialakulásának relatív kockázatát. Ismert,

hogy a VIII-as faktor a plazmában a von Willebrand faktorhoz (vWF-hez) kötötten

kering, valamint az is, hogy az AB0 vércsoportrendszer szerinti 0-ás vércsoportú

személyek plazmájában mind a vWF, mind az FVIII szintje szignifikánsan alacsonyabb

a többi vércsoportba tartozókénál. Mind a magas vWF szint, mind a nem 0-ás

vércsoport trombózis kialakulásának relatív kockázatával tapasztalt összefüggése a

magasabb FVIII szint hatásának tulajdonítható. Az emelkedett FVIII szint és a fokozott

alvadékonyság közti kapcsolat hátterében több mechanizmus állhat: a nagyobb

mennyiségű FVIII erősebb kofaktor aktivitásával fokozza az FIXa, ezzel a tenáz-

22

komplex X-es faktort aktiváló működését. Mivel az FVIII és az FV mindketten az APC

szubsztrátjai, az FVIII szint emelkedése egyben az FV csökkent inaktivációját is

eredményezi. Az alvadási rendszer kaszkádszerű felépítésének köszönhetően azonban a

tenáz- és protrombináz-komplexek funkciójának lineáris emelkedése exponenciális

fibrinképződést, illetve alvadékonyságot eredményez.

Emelkedett homocisztein szint

A homocisztein (Hcy) szint megemelkedése is állhat trombofíliás állapot hátterében

[112, 113]. A magas Hcy koncentrációt kezdetben az arteriosclerosis és az artériás

trombózisok kialakulásának megnövekedett kockázatával hozták összefüggésbe [114,

115], de mára egyre több adat támasztja alá szerepét a vénás trombózisok

kialakulásában [116, 117]. A Hcy szint emelkedését okozhatja a Hcy-anyagcsere

valamely enzimének öröklött defektusa. Erre ismert példa a metil-tetrahidrofolát-

reduktáz (MTHFR) génjének gyakori C677T polimorfizmusa [118-120], amely az

MTHFR enzim hőre labilis változatának expresszióját, ezzel homozigóta formában az

enzimaktivitás 50 %-os csökkenését eredményezi. Az MTHFR feladata metionin

előállítása a Hcy metilációjával (a reakcióhoz a metilcsoportot az enzim a metil-

tetrahidro-folsav, az MTHF demetilációjával nyeri), így az enzim csökkent működése

Hcy szint enyhe emelkedésével jár. Egy másik enzim, a cisztationin-ß-szintáz (CBS), a

cisztein Hcy-ből történő képzéséért felelős. Az enzim génjének számos mutációja

ismert, amelyek homozigóta formában a CBS teljes hiányát okozhatják, de heterozigóta

genotípus esetén is vezethet akár már fiatal korban artheriosclerosishoz és vénás

trombózisok kialakulásához [121-123]. A mutáció homozigóta formájának előfordulása

azonban igen ritka (1:100.000). A Hcy-szint megemelkedését többnyire mégis a fent

említett enzimek kofaktorainak, a B6 és B12 vitaminnak, valamint az MTHF

szintéziséhez szükséges folsavnak a hiánya okozza.

A hiperhomociszteinémiának a trombózis és a kardiovaszkuláris betegségek

kialakulására gyakorolt hatása több folyamat révén érvényesül [113, 124]. Egyrészt, a

Hcy autooxidációja során reaktív oxigéngyökök keletkeznek, amelyek az endotélt

károsítják, egyben a keringő trombocitákat és monocitákat aktiválják. Másrészt, a Hcy

gátolja egyes anticoaguláns fehérjék működését: blokkolja az AT kötését a membrán

heparán-szulfát-proteoglikánokhoz; a trombomodulin redukálása révén gátolja a

23

trombin-trombomodulin kapcsolat kialakulását, ezzel a PC aktivációját; módosítja a t-

PA-receptor t-PA kötőhelyét, így gátolva a fiblinolízist.

Szerzett trombofíliás tényezők, avagy a trombózis kialakulását segítő állapotok

A trombózis kockázatát emeli néhány állapot, például terhesség, poszt-menopauzális

hormonpótló vagy orális fogamzásgátló kezelés, infekciók, malignus megbetegedések,

sebészeti beavatkozások, obesitas, amelyeket szerzett rizikófaktoroknak nevezünk. Ezek

közé tartozik a keringő antifoszfolipid antitestek megjelenése is, amely lehet spontán, de

társulhat infekciókhoz, autoimmun betegségekhez is.

Az SLE-re jellemző gyulladás és az antifoszfolipid antitestek protrombotikus hatásának

vélt mechanizmusait érdemes röviden összefoglalni.

A gyulladás szerepe a trombózis kialakulásában

A gyulladás a véralvadás több fázisára is hat, a kezdeti lépésektől egészen a regulációig

[125, 126]. A gyulladásos citokinek mint a TNFa, IL-1, IL-6 beindítják a szöveti faktor

expresszióját és fokozzák a keringő, úgynevezett „blood-born” TF mennyiségét [126-

130]. Ezen kívül, a gyulladásos mediátorok a komplementrendszer aktivációján vagy

fokozott apoptózis előidézésén keresztül hozzájárulnak negatív töltésű foszfolipidek

felszínre kerüléséhez, ami kedvez az alvadási folyamatok beindulásának.

A gyulladásos reakciók során gátlódik a természetes antikoaguláns fehérje, a PC

aktivációja. A C4BP fehérje fokozott expressziója következtében pedig lecsökken a

szabad, funkcionálisan aktív PS mennyisége, hiszen a PS többsége a plazmában a C4BP

szabályozó komplementfehérjéhez kötve kering [131].

Az APA-k szerepe a trombózis kialakulásában

A megfigyelés magyarázatául, miszerint az antifoszfolipid antitestek (APA-k) jelenléte

in vivo hozzájárul a trombózisok kialakulásához, több elmélet is született az elmúlt

években. Többségüket máig sem cáfolták meg, a legvalószínűbb tehát az, hogy az APA-

k kisebb-nagyobb mértékben számos úton hatnak a koagulációs rendszerre, mind az

alvadást elősegítő, mind az azt gátló folyamatok révén, ám összességben az egyensúlyt

az alvadékonyság irányába tolják el [132-135]. Két fő csoportra oszthatjuk az APA-k

koagulációt érintő hatásmechanizmusait: a molekuláris eseményekre ható és a

sejtközvetített hatások csoportjaira.

24

A molekuláris szintű hatások megértéséhez fontos tudni, hogy nyugalmi állapotban a

sejtmembrán kettősrétegének belső rétegében olyan negatív töltésű foszfolipidek

(például foszfatidil-szerin) találhatók, amelyek a sejtek aktiválódásakor a külső felszínre

kerülnek. Ezekhez Ca2+ ionokon keresztül képesek hozzákapcsolódni a Gla-doménnel

rendelkező alvadási faktorok (FVII, FIX, FX, FII) és antikoaguláns fehérjék (PC, PS);

ez a kötés szükséges a felsorolt enzimek működéséhez. Így a véralvadási rendszer több

folyamata - a TF-FVIIa komplex általi FIX és FX aktiváció, az FX tenáz-komplex általi

aktivációja, a protrombináz-komplex által végrehajtott protrombin-trombin átalakítás,

valamint a gátló folyamatok közül a PC aktivációja, majd az APC FVa-t és FVIIIa-t

inaktiváló működése - során elengedhetetlen a foszfolipid felszín jelenléte. Azonban az

antifoszfolipid antitestek is ezeket az anionos felszíneket és a hozzájuk kötődő

fehérjéket ismerik fel, és támadják meg; ezzel pedig gátolják a foszfolipidfüggő

reakcióutakat az alvadási rendszerben.

Kimutatták, hogy a ß-2-glikoprotein I (ß2-GPI) membránfehérje, valamint a hozzá

kötődő APA-k versengenek a szabad foszfolipid felszínért a fent felsorolt

enzimkomplexekkel, ezzek gátolva működésüket [136, 137]. Azt is megfigyelték, hogy

a tisztított ß2-GPI ezen a módon hatékonyabban gátolja a PC aktiválódását és

működését, mint a trombin keletkezéséhez vezető folyamatokat, vagyis a rendszert az

alvadékonyság irányába tolja el.

Az utóbbi évek tanulmányai kiemelik az APA-k és az annexin V kompetíciójának

szerepét a tromboembóliás események pathogenezisében [138]. Az annexin V fehérje

molekulák – amelyeket a placentából és a véredényekből is izoláltak - nagy affinitással

kötnek az anionos foszfolipid felszínhez, azon összekapcsolódnak, és mintegy

kétdimenziós kristályrácsot képezve pajzsként védik az alvadási komplexektől. Így

meggátolják, hogy a különböző folyamatok révén kis mennyiségben felszínre kerülő

anionos foszfolipidek közreműködésével beinduljon az alvadási kaszkád. Az APA-k

foszfolipidekhez való kötődése megbontja az annexin V kristályrácsát, és lecsökkenti

annak alvadásgátló hatását. APA-pozitív betegek placentájából származó sejteken,

trophoblaszt-sejtkultúrákon és mesterséges foszfolipidfelszínen végzett kísérletek

igazolják ezt a működést. Az annexin V-tel való kölcsönhatás megmagyarázza azt is,

miért okoz trombózist az APA-k jelenléte in vivo, és miért gátolja az alvadást in vitro.

In vitro ugyanis - az annexinek távollétében - az APA-k a szabad foszfolipidfelszínt

25

blokkolják az alvadási komplexek elől, viszont nem zavarják meg az annexin

antikoaguláns hatását.

A sejtközvetített folyamatok lényege, hogy a monociták és trombociták membránjához

kötve az antifoszfolipid antitestek képesek beindítani vagy felerősíteni az

intravaszkuláris sejtek aktivációjához vezető jelátviteli útvonalakat. Aktiválódásuk

során a sejtek szöveti faktort (TF) expresszálnak [139]. A TF egy része az azt termelő

sejtek membránján marad, egy másik hányad azonban kis membránpartikulumokkal,

ún. micropartikulumokkal együtt lefűződik a trombocitáról vagy monocitáról, míg újabb

vizsgálatok szerint kis mennyiségben szolubilis formában is található TF a plazmában.

A TF jelenléte a plazmában keringő FVII aktiválásával beindítja az alvadási kaszkádot,

a trombusképződéshez vezető folyamatokat. Több tanulmány eredményei is

alátámasztják, hogy az antifoszfolipid antitestek jelenlétében emelkedik a TF expresszió

[140, 141], illetve, hogy a magasabb plazma TF szint korrelál az APA-k jelenlétével, és

a pozitív tromboembóliás kórtörténettel [142, 143]. A korábban trombózist már

elszenvedett SLE-s betegek tisztított IgG antitest frakciója ezt a hatást erősebben

mutatja, mint a trombózisos kórelőzmény nélküli SLE-s betegek antitestei.

Az endotélsejtek APA-kal történő inkubációja során megfigyelték, hogy a sejtek

aktiválódnak, fokozódik a membránjukon a trombociták és leukociták adhézióját segítő

molekulák, például a szelektinek (P- és E-szelektin), ICAM-1 (intercellular cell

adhesion molecule), VCAM-1 (vascular cell adhezion molecule) expresszója. A TF

mellett emelkedik még a t-PA, vWF és a PAI-1 termelés és szekréció, valamint a

proinflammatórikus citokonek, az IL-1 és IL-6 termelődése is [144].

A trombociták APA általi aktivációja közvetlenül beindítja azokat a jelátviteli

folyamatokat, amelyek következményeként anionos foszfolipidek kerülnek a

vérlemezkék membránjának felszínére, illetve megjelennek a trombocitaaggregációt

közvetítő membránstruktúrák [132], amelyek közül a legfontosabb a GPIIb-IIIa

membránkomplex. Az APA-k köthetnek a trombocitamembrán foszfolipidjeihez és az

ahhoz asszociált fehérjékhez, elsősorban a ß2-GPI-hez az antigénfelismerő Fab-

fragmentumukkal, vagy az Fc fragmentumukkal a vérlemezkék membránján

megtalálható FcγRII receptorhoz. Fontos megjegyezni, hogy így akár fiziológiás vagy

éppen kóros körülmények közt már a trombociták kismértékű aktivációja is további

aktivációhoz és aggregációhoz vezet.

26

CÉLKITŰZÉSEK

Munkám célja az volt, hogy megvizsgáljam az autoantitestek és immunkomplexeik által

okozott szervi károsodások és szisztémás jelenségek hátterét SLE-ben; valamint, hogy

olyan laboratóriumi módszereket keressek, amelyekkel jól jelezhető vagy követhető a

betegség alakulása. Közelebbi céljaim voltak:

• Megvizsgálni a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, felmérni a

DNáz aktivitás jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi

manifesztációinak – elsősorban a lupus nephritis - megjelenésében. Kiértékelni,

mennyire hasznosítható paraméter a DNáz enzimaktivitás a betegek

laboratóriumi követése során.

• Megvizsgálni, milyen összefüggés van a betegek DNáz aktivitása és a szérum

antinukleoszóma antitest szintje között, valamint meghatározni az

antinukleoszóma antitest szint mérésének klinikai jelentőségét.

• Meghatározni az antifoszfolipid antitestek megjelenését az SLE-s populációban

és megvizsgálni ezek összefüggését a tromboembóliás epizódok

bekövetkeztével.

• Meghatározni az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és

kimutatni az ezek hátterében álló, az SLE-től független, többnyire öröklődő

tromboembóliás kockázati tényezőket, illetve megvizsgálni a trombofília-szűrés

indokoltságát SLE-ben.

• Megvizsgálni annak a lehetőségét, hogy szintetikus peptidkonjugátumokkal

előidézhető-e az immunkomplexek hatása, illetve a receptorok blokkolásával

gátolhatóak-e az antitestek és immunkomplexeik által közvetített effektor

funkciók az autoimmun betegségek, elsősorban az SLE kezelésében.

27

MÓDSZEREK

A vizsgált betegcsoport

A vizsgálatok során összesen 173 SLE-s beteg mintáit használtuk fel tájékoztatásuk

után, belegyezésükkel. Közülük 155-en a Semmelweis Egyetem Immunpathológiai

Járóbeteg-szakrendelésének gondozásában álltak, 10-en az I-es számú

Gyermekgyógyászati Klinikán, 8-an pedig a II-es számú Belgyógyászati Klinikán

részesültek ellátásban. A betegek diagnózisa a Tan és munkatársai által 1982-ben

lefektetett kritériumrendszer [19] alapján történt.

A betegség aktivitását minden esetben a SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus

Disease Activity Index) számításával [20] kapott pontokkal jellemeztük.

A DNáz enzim aktivitásával kapcsolatos kísérletekbe 113 SLE-s beteget vontunk be,

tőlük 185 szérummintát vettünk. A betegek közt 105 nő és 8 férfi volt, 13 és 79 év

közötti életkorban, átlagéletkoruk 38,3 ± 14,1 év volt a mintavételek idején. A kísérletek

során 9 nem-differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedő beteg (7 nő, 2

férfi; 45,8 ± 11,9 évesek) és további 14 nem autoimmun beteg kontroll (11 nő 3 férfi; 43

± 22,1 évesek) mintáját is megvizsgáltuk.

A tromboembóliás kockázatok elemzéséhez 105 SLE-s beteget vizsgáltunk ki. Köztük

99 nő és 6 férfi volt, 18 és 68 év között, átlagéletkoruk 41,0 ± 11,7 év volt, az SLE

diagnózisának felállításától vizsgálatunkig átlagosan 14,6 ± 9,1 év telt el.

A minták előkészítése a vizsgálatokhoz

A DNáz aktivitás méréshez, illetve a különböző antitestek kimutatásához natív vérből

centrifugálással (4000 rpm 5’) nyert szérumot, az alvadási vizsgálatokhoz nátrium-

citráttal alvadásgátolt, és két centrifugálással trombocitamentesített plazmát, a genetikai

vizsgálatokhoz pedig leukocitákban dús „buffy coatból” tisztított DNS-t használtunk.

Az antinukleoszóma és anti-DNS antitestek szintjének a mérése

Az antitestek szintjének meghatározása enzim-kötött immunszorbens, azaz ELISA

(enzime-linked immunosorbent assay) technikával történt. A mérésekhez kereskedelmi

forgalomban lévő kiteket használtunk (Orgentec GmbH, Mainz, Németország). Az

immunszorbens módszer az antigén és a specifikus antitest közötti erős, nem-kovalens

28

kölcsönhatás felhasználásán alapszik. A kitekben található polisztirol lemezeken

gyárilag kikötött tisztított antigén (ebben az esetben kettős szálú DNS illetve

nukleoszóma) található. Erre a felületre kikötnek a mintákban található specifikus anti-

DNS és antinukleoszóma antitestek. Miután mosással eltávolítottuk a lemezről a nem

specifikus antitesteket, peroxidáz enzimmel konjugált, humán IgG specifikus, nyúlban

termeltetett antitesteket kötünk a rendszerben maradt specifikus ellenanyagokhoz.

Ezeknek mennyiségét később a peroxidáz enzim által tetra-metil-benzidin szubsztrátból

átalakított színes reakciótermék 405 nm-en fotométerrel leolvasott abszorbanciájából

határozzuk meg. A gyártó leírását követve, hatpontos kalibrációs görbe felhasználásával

végeztük a méréseket. Pozitívnak értékeltük a gyártó által javasolt 20 IU/ml méréshatár

feletti antitest-koncentrációt tartalmazó mintákat.

DNáz aktivitás mérés

A DNáz enzim aktivitását is kereskedelmi forgalomban lévő ELISA elven alapuló kittel

végeztük (Orgentec GmbH, Mainz, Németország). A módszer lényege röviden

összefoglalva a következő: A polisztirol ELISA lemezekre gyárilag DNáz-szubsztrát

volt kitapasztva. A lemezre rámértük a betegek hígított szérum mintáit, majd egy órán

keresztül 37 ºC-on inkubáltuk a lemezeket. Az inkubációs idő leteltével a lemezen

érintetlenül megmaradt szubsztrát mennyiségét mértük az ELISA módszer elve alapján

peroxidáz enzimmel jelölt a DNáz-szubsztrátra specifikus antitest segítségével. A DNáz

specifikus szubsztrát fogyásából hatpontos kalibrációs görbe segítségével számoltuk ki

a mintákban található DNáz enzim aktivitását. A vizsgálatokat minden minta esetén

legalább két párhuzamos méréssel végeztük. A longitudinális összehasonlításokhoz

felhasznált mintákat egyidőben mértük le, ezzel is kiküszöbölve a mérések közti

variabilitásból adódó hibát.

Az antifoszfolipid antitestek szintjének mérése ELISA módszerrel

Az anti-foszfolipid antitestek szintjének meghatározásához kétféle módszert

használtunk. Szilárdfázisú, ELISA elven alapuló módszerrel mértük a betegek

szérumában található antitestek mennyiségét, míg koagulációs módszert alkalmaztunk a

foszfolipid-specifikus lupus antikoaguláns aktivitás mérésére.

29

A fentiekben már ismertetett ELISA technikával az alábbi antifoszfolipid antitestek

mennyiségi meghatározását végeztük el: egy kevert IgG és IgM izotípusú antitesteket is

detektálni képes szűrőteszt után a pozitív mintákban külön-külön megmértük az IgG és

IgM izotípusú anti-cardiolipin antitestek mennyiségét (anti-CalG, anti-CalM); továbbá

kevert, IgG, IgA és IgM izotípusú antitesteket kimutató szűrőteszttel végeztük az anti-

ß2-glikoprotein I (anti-ß2-GPI), az anti protrombin (anti-FII) és az anti-foszfatidil-szerin

(anti-ph-Ser) ellenanyagok mennyiségi meghatározását (a gyártó minden esetben:

Orgentec GmbH).

A foszfolipid-specifikus LA mérése koagulációs módszerrel

A lupus anticoaguláns (LA) aktivitás vizsgálatához nátrium-citráttal alvadásgátolt, és

ismételt centrifugálással trombocitáktól mentesített plazmákat használtunk. A

mérésekhez egy szűrő és megerősítő vizsgálatokból álló háromlépéses tesztrendszert

dolgoztunk ki. Első lépésként három független szűrőtesztet végeztünk. Azokat a

plazmákat vizsgáltuk tovább, amelyek esetében a három teszt különböző reagenseivel

(dPT 1:200, Innovin, Dade Behring, Németország; PTT-LA, Diagnostica Stago,

Franciaország; dRVVT Screen, Gradipore, USA) elvégzett aktivált parciális

tromboplasztin idő (aPTI) illetve protrombin idő (PT) mérés során legalább egy teszttel

a kontroll 1,1-szeresénél hosszabb időt mértünk. A kiszűrt plazmákat először keveréses

teszttel vizsgáltuk tovább. Amennyiben kevert normál plazmával 1:1 arányban keverve

nem kaptunk normál aPTI értéket, azaz a normál plazma hozzáadása nem korrigálta a

megnyúlást, a foszfolipid neutralizációs tesztekkel (Staclot LA, Diagnostica Stago és

dRVVT Confirm, Gradipore) vizsgáltuk a mintát tovább. Azok a plazmák, amelyek

esetében foszfolipid reagens hozzáadása után normál aPTI-t mértünk, vagyis a

foszfolipidek neutralizálták a lupus anticoaguláns aktivitást, megállapítható volt a

foszfolipid-specifikus lupus anticoaguláns pozitivitás.

A természetes anticoaguláns fehérjék szintjeinek mérése

A protein C (PC), protein S (PS) illetve antitrombin (AT) deficiencia okozta

protrombotikus állapotokat a betegek PC, PS és AT aktivitásának mérésével kívántuk

kiszűrni. A méréseket egy Sysmex CA-1500 típusú koagulométeren végeztük gyárilag

előállított és tisztított PC (Chromogenix, Olaszország), PS (Dade Behring, USA) és AT

30

(Sigma, USA) reagensekkel. A reagensek gyártói által ajánlott alábbi normál

határértékeket jelöltük ki: a PC-re mindkét nemnél 70-149 %, a PS normál tartománya

nőknél: 59-118 %, férfiaknál: 75-130 %, az AT határértékei pedig szintén azonosak

voltak mindkét nem esetén: 50-150 %.

Az APCR meghatározása

Az ötös alvadási faktor (FV) aktivált protein C (APC) elleni rezisztenciájának

hátterében leggyakrabban az FV Leiden mutációja áll. Az általunk használt reagens

(Chromogenix, Instrumentation Laboratory SpA, Milánó, Olaszország) is elsősorban az

ilyen plazmák kiszűrésére volt alkalmas. A méréseket - akárcsak a többi alvadási tesztet

- Sysmex CA-1500 típusú koagulométeren végeztük. A vizsgálat elve a következő: a

betegektől származó plazmákat négyszeres mennyiségű, gyártó által biztosított FV-

hiányos plazmával hígítottuk. Ezt a keveréket 1:1 arányban elegyítettük a gyártó által

megadott, tisztított foszfolipideket és kontakt aktivátort tartalmazó aPTI-reagenssel,

majd CaCl2 hozzáadása meginduló alvadás detektálásával megmértük az aPTI-t. A

mérést megismételtük, de ezúttal a CaCl2 reagens helyett APC-t is tartalmazó CaCl2

reagenssel indítottuk az alvadást. Amennyiben az antikoaguláns hatású aktivált PC

jelentétében nem nyúlt meg kellően az aPTI, az APC elleni rezisztenciát állapíthattunk

meg. Amennyiben a két aPTI aránya 2-nél kisebb volt, az FV Leiden mutációjának

heterozigóta jelenléte volt feltételezhető, amennyiben az arány még az 1,4-et sem

haladta meg, homozigóta FV Leiden genotípusra következtethettünk.

A Leiden mutáció és a protrombin mutáció detektálása

Az V-ös faktor 10-es exonjában található G1691A, és a II-es faktor, másnéven

protrombin génjének promoter régiójában található G20210A báziskicserélődéseknek a

kimutatását DNS olvadási görbe analízissel végeztük, kereskedelmi forgalomban lévő

kitek (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) reagenseivel. A módszer lényege,

hogy a PCR technikával felszaporított V-ös illetve II-es faktor gének vizsgált

szakaszához fluoreszcens festékkel jelölt, specifikus DNS oligonukleotid próbát

hibridizáltunk alacsony hőmérsékleten, majd a reakcióelegy fokozatos melegítése

közben detektáltuk a vizsgált génszakaszokról leváló DNS-próbák – mennyiségükkel

arányos - fluoreszcens jelét. A DNS szálak alacsonyabb hőmérsékleten bekövetkező

31

szétválása, olvadása, a pontatlan összekapcsolódásra, nem teljes komplementaritásra

utalt, ami a detektálni kívánt mutációk jelenlétét igazolta.

Az V-ös faktor vizsgálata DNS szekvenálással

Az V-ös faktor két, az aktivált protein C-vel való reakciójához szükséges argininjét

(Arg 306 és Arg 679) és ezek környezetét vizsgáltuk. Az izolált DNS-ből két szakaszt

PCR reakció során felszaporítottunk. Ehhez a következő reakcióelegyet használtuk 50

µl végső reakciótérfogatban: PCR buffer 1x végkoncentrációban (Eppendorf,

Németország), dNTP mix egyenként 0,2 mM végkoncentrációban, primerek egyenként

0,3 µM végkoncentrációban (Genodia, Magyarország), 2U HotStart Taq-polimeráz

(Eppendorf, Németország), 5 µl tisztított DNS, PCR tisztaságú víz. A felhasznált

primerek szekvenciája a következő volt:

306F: 5’-GGGATGCAGGCTTACATTGAC-3’;

306R: 5’-TTCGCTGGTATTACAGGTGCAT-3’

679F: 5’-GAAGCAAAAAGCTGAGGCTGA-3’

679R: 5’-ACGAATTCAGTGCCATTCTCC-3’

A reakcióhoz az alábbi PCR programot használtuk: 95ºC 10’; 30 x (95ºC 15”, 60ºC 15”,

72ºC 30”); 72ºC 7’.

A PCR termékeket 2%-os agaróz gélen futtattuk, ezzel ellenőrizve a reakció

specifikusságát, majd megtisztítottuk (PCR Purification Kit, Qiagen, Németország). Ezt

követően cycle sequencing reakcióval (Cycle Seq Reaction Kit, Applied Biosystems,

USA) állítottuk elő a különböző hosszúságú fluoreszcensen jelölt oligonukleotidokat,

amelyeket ABI 310 genetikai analizátoron futtattunk.

A szekvenciák elemzéséhez az Applied Biosystems Sequence Scanner szoftverét

használtunk.

A VIII-as faktor szintjének mérése

A plazma VIII-as faktor szinteket fotometrikus úton határoztuk meg. A mérések elve az

alábbi: olyan reakcióközeget biztosítottunk Ca2+, foszfolipidek valamint aktivált IX-es

faktor kellő mennyiségű hozzáadásával, hogy a X-es faktor aktiválásának sebességét

meghatározó tényező a VIII-as faktor mennyisége illetve aktivitása lett, így a keletkező

aktivált FX mennyiségéből - amit kromogén szubsztrátjának (S-2765) hidrolízisekor

32

felszabaduló kromofór csoport színintenzitásának detektálásával követhettünk -

számolhattuk ki a plazma FVIII tartalmát. A plazma FVIII szint normál tartományát 50-

150 %-ban határoztuk meg.

A von Willebrand faktor szintjének a mérése

A von Willebrand faktor mennyiségi meghatározásakor a plazmában található von

Willebrand faktor antigén (vWF:Ag) koncentráció mellett a von Willebrand faktor

kollagén kötési aktivitását (CBA: collagen binding activity) is megmértük. Mindkét

tesztet ELISA módszerrel végeztük. A vWF:Ag szint meghatározásakor a lemezeket

anti-humán-vWF antitesttel érzékenyítettük, a CBA méréséhez pedig kollagénnel.

Ezekhez kötött ki a plazmában található összes vWF illetve a kollagént kötő aktív vWF.

Mindkét esetben anti-humán-vWF-hez konjugált tormaperoxidáz által átalakított

kromogén szubsztráttal, hatpontos kalibrációs görbe segítségével kvantifikáltuk a vWF

szintet. A normál tartomány a standard humán plazmában találhazó vWF:Ag illetve

CBA 50-150 %-a volt.

Homocisztein szint mérés

A plazma homocisztein szintek meghatározása fluoreszcens polarizációt alkalmazó

immuntechnikával (FPIA: Fluorescence Polarization Immunoassay) történt Abbott IMx

immunanalizátor segítségével. A vizsgálat előkészítése során a plazmában található

fehérjékben kötött vagy diszulfid-hídban szereplő homociszteineket di-tio-treitollal

szabad homocisztein alakká redukáljuk, majd az összes homociszteint átalakítjuk S-

adenozil-homociszteinné (SAH) SAH-hidroláz enzim hozzáadásával. A keletkező SAH

mennyiségét aszerint határozzuk meg, hogy milyen erős floureszcens jelet ad a SAH-val

a monoklonális ellenanyaghoz való kötésért versengő fluoreszcensen jelölt reagens. A

kvantitatív meghatározás hatpontos kalibrációs görbe alapján történt.

A szintetikus peptidek és peptidkonjugátumok citokintermelésre gyakorolt

hatásának vizsgálata

A kísérleteket humán monocita eredetű, Monomac sejtvonallal végeztük. Sejttenyésztő

lemez lyukaiba kimértük a vizsgálandó peptidkonjugátumok és a pozitív kontrollként

használt aggregált IgG különböző koncentrációjú oldatainak 100-100 µl-ét. Ehhez

33

lyukanként 200.000 sejtet mértünk. 24 órás 37 ºC-os inkubálás után meghatároztuk a

felülúszók IL-6 és TNFα szintjét.

Megvizsgáltuk azt is, hogy a peptidek monomerjei hogyan befolyásolják a sejtek

aggregált IgG hatására meginduló citokintermelését. Ebben az esetben a sejttenyésztő

lemezre kimért Monomac sejtekhez a monomer peptidek keverékének különböző

koncentrációjú oldatát mértük, majd fél óra inkubálás után adtuk az elegyhez a

citokintermelést indukáló aggregált IgG preparátumot. A peptidkeverék végső

koncentrációja az IgG-hez képest 3-, 15- és 75-szörös moláris felesleg volt. A

citokintermelést a fölülúszókból 1, 2, 4 és 24 óra után határoztuk meg.

A TNFα-termelést WEHI 164 TNF-érzékeny sejtvonal felhasználásával állapítottuk

meg. A sejtek a hozzáadott TNFα-tartalmú felülúszó hatására apoptózist szenvednek, a

citokintartalmat így a túlélő sejtek mennyiségéből határoztuk meg. Az MTT festéket az

élő sejtek mitokondriális enzimei ibolya színű formazán kristályokká alakítják, ezt SDS-

ben feloldva, majd fotometriás úton kvantifikálva megállapítható a sejtpusztulás, azaz a

TNFα mennyisége.

Az IL-6 mennyiségi meghatározását szendvics ELISA módszerrel végeztük. A lemez

érzékenyítése rekombináns anti-humán-IL-6 antitesttel történt (Biosource, USA),

második ellenanyagként pedig biotinált anti-hIL-6-ot (Biosource, USA) használtunk,

amelyhez ExtrAvidin-HRPO konjugátumot (Sigma, USA) adtunk. Végül ennek

enzimatikus aktivitásából számoltuk ki az felülúszók IL-6 szintjét, hatpontos,

rekombináns IL-6 (Biosource, USA) hígításával készült standard sor segítségével.

FcR-ok és a peptidek közti kötődés vizsgálata

A szintetikus peptidek kötődését a monociták Fc receptoraihoz áramlási

citofluorimetriás módszerrel (Beckton-Dickinson FACSCalibur készülék és CellQuest

szoftver) vizsgáltuk. A mérésekhez 500.000 Monomac sejtet használtunk. A

sejtszuszpenziókhoz hozzáadtuk a vizsgálni kívánt biotinos peptidek különböző

koncentrációjú oldatát, majd 30 perces 4 ºC-os inkubálást és mosást követően a

sejtekhez kötődött peptideket FITC-ExtrAvidin konjugátummal jelöltük. Újabb mosás

után a sejtek FITC-konjugátumtól származó fluoreszcenciájának intenzitását lemérve

következtettünk a peptidek és a sejtfelszíni receptorok kapcsolatának erősségére.

34

A gátlásra irányuló méréseink során a jelöletlen peptideket adtunk a sejtekhez, majd

biotinált aggregált IgG-t, és ez utóbbi kötődésének lemérésével állapítottuk meg, hogy a

peptidek milyen mértékben voltak képesek kiszorítani az IgG-t a sejtfelszíni receptorok

kötőhelyeiről.

Statisztikai analízis

A kapott adathalmazokat elsőként leíró statisztikával jellemeztük: átlagot, standard

deviációt számítottunk, illetve ellenőriztük az adathalmazok eloszlását. A normál

eloszlást követő változók csoportjait (pl. DNáz aktivitás) Student-féle t-teszttel

hasonlítottuk össze. A folytonos, de nem normál eloszlást követő változók (pl. az anti-

nukleoszóma antitestek koncentrációja) esetén pedig a nem-paraméteres Mann-Whitney

U-tesztet alkalmaztuk. Szignifikánsnak minősítettük a csoportok közti különbséget,

amennyiben p<0,05 értéket kaptunk.

A különböző változók közti korreláció jellemzésére Spearman-féle rangkorrelációs

koefficienst számítottunk.

A diszkrét változók analíziséhez (pl. az MBL polimorfizmusok vizsgálata) χ2-próbát

végeztünk, amelyhez a küszöbértékeket α=0,05 szignifikanciaszint szerint állapítottuk

meg.

Az éves incidenciák számításakor az események számát osztottuk az eltelt betegévek

számával. A betegévek meghatározásakor a diagnózis felállításától a vizsgálat

időpontjáig vagy a vizsgált esemény (pl. vénás trombózis) bekövetkeztéig eltelt időt

vettük figyelembe.

A kockázati tényezők erejének jellemzésére relatív kockázatot (RR: relative risk) és

esélyhányadost (OR: odds ratio) számítottunk 95 %-os konfidencia intervallumokkal.

Emelkedettnek minősítettük a kockázatot, amennyiben a konfidenciaintervallum minden

eleme 1-nél nagyobb szám volt.

Számításainkat a Microsoft Excel, Statistica 6.0 illetve MedCalc szoftverek segítségével

végeztük.

35

EREDMÉNYEK

A nukleoszóma elleni antitestek és a DNáz aktivitás SLE-ben

DNáz enzimaktivitás az SLE-s betegcsoportban

A SLE betegek szérumában szignifikánsan alacsonyabb DNáz-aktivitást mértünk, mint

a nem autoimmun betegektől származó kontroll szérumokban (3. ábra). A betegek

szérumában 63,75 (± 12,1) % volt a DNáz enzimaktivitás, ami a kórosan alacsony

tartományba esik. Kórosan alacsony, 70% alatti volt 75 betegnek, az SLE-s csoport 66,4

%-ának DNáz aktivitás értéke. Ezzel szemben a nem autoimmun beteg kontrollok

átlagos DNáz aktivitása 81.3 (± 9.25) % volt, és mindössze egy betegnél, ez a csoport

7.1 %-a, tapasztaltunk kórosan alacsony szintet. A kontroll és SLE-s csoport közti

különbség statisztikailag szignifikáns (p<0,001).

A nem differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedő betegek csoportjának

DNáz aktivitása 64,9 (±18,2) % volt. Ez az SLE-s csoportéval közel egyezőnek

bizonyult (p=0,854), azonban a nem autoimmun kontroll betegek csoportjától sem

különbözött szignifikánsan (p=0,295).

3. ábra: DNáz enzimaktivitás a három vizsgált betegcsoportban. Az oszlopdiagramról a csoportokban mért átlagos DNáz aktivitás értékeket és szórásokat lehet leolvasni, a pontok pedig az egyes mért értékeket jelölik. Az SLE-s csoport DNáz aktivitása (63,75 ± 12,1 %) szignifikánsan (p<0,001) alacsonyabb volt a nem autoimmun beteg (nem AI) kontrollokétól (81.3 ± 9.25 %), de nem különbözött (p=0,854) a nem-differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedőkétől (64,9 ± 18,2 %).

20

40

60

80

100

SLE (113) UCTD (9) nem AI (14)

DN

áz a

ktiv

itás %

36

Megvizsgáltuk a betegek DNáz aktivitása és a veseérintettség közti kapcsolatot is (4.

ábra). Az SLE-s betegeket az alábbi három csoportba soroltuk: VA - aktív

vesebetegséggel élők (33 beteg); VB - korábban fellépett, de gyógyult a

vesekárosodásos betegek (18 beteg); VC - veseérintettségtől mentesek (61 beteg). A

három csoport átlagos DNáz aktivitás értékei a következők voltak: VA: 60,95 ± 11,23

%; VB: 63,5 ± 10,32 %; VC: 65,48 ± 13,04 %. Bár tendencia észrevehető, a csoportok

közötti különbség statisztikailag nem jelentős. A VA és VC csoportok, vagyis az aktív

vesebetegek és a veseérintettségtől teljesen mentesek DNáz aktivitása közötti különbség

esetében sem kaptunk szignifikáns eltérést (p=0,082), a két másik összehasonlításban (a

korábban vesebetegek aktívakkal, ill. egészségesekkel történő összevetése) pedig még

kisebb különbségeket kaptunk (VA-VB: p=0,420; ill. VB-VC: p=0,505).

4. ábra: DNáz aktivitás a teljes SLE-s csoportban (SLE; 63,75 ± 12,1 %), és a veseérintettség szerint megkülönböztetett három SLE-s alcsoportban: VA - aktív vesebetegséggel élők (60,95 ± 11,23 %); VB - korábban fellépett, de gyógyult a vesekárosodásos betegek (63,5 ± 10,32 %); VC - veseérintettségtől mentesek (65,48 ± 13,04 %). A csoportok között nincs szignifikáns különbség.

20

40

60

80

100

SLE SLE-VA SLE-VB SLE-VC

DN

áz a

ktiv

itás %

37

Antinukleoszóma antitestek (ANCSA) SLE-ben

Az SLE-s betegek szérumában magas antinukleoszóma antitest koncentrációt találtunk

(5. ábra). A csoport átlagos értéke 356,3 ± 851 IU/ml volt. A magas szórás érték is

mutatja, hogy igen tág tartományba estek az ANCSA eredmények (0-10.000 IU/ml-ig).

90 beteg (79,6 %) szérum antitest koncentrációja haladta meg a 20 IU/ml-es

küszöbértéket; közülük 58 személynek (51,3 %) az eredménye volt 100 IU/ml-nél is

magasabb, 9-nek (8 %) pedig meghaladta az 1000 IU/ml-es koncentrációt is. A nem

autoimmun kontroll csoportból mindössze egy személynél találtunk kimutatható

mennyiségű antinukleoszóma antitestet, de ennek koncentrációja sem haladta meg a 20

IU/ml-es határértéket, vagyis a kontrollok közül senki sem minősült ANCSA

pozitívnak. A kontroll csoport átlagos ANCSA szintjét 1,44 ± 2,77 IU/ml-ben

határoztuk meg, ami az SLE-s betegcsoportétól jelentősen különbözött (p<0,001).

Az UCTD betegek közül 5-nek (62,5 %) a szérumában találtunk kimutatható

mennyiségű antinukleoszóma antitestet. A csoport átlagos ANCSA titere 39,9 ± 57,7

IU/ml volt, ami az SLE betegcsoporténál szignifikánsan alacsonyabb, a kontroll

csoporténál szignifikánsan magasabb (p<0,01 mindkét esetben).

5. ábra: Antinukleoszóma antitest (ANCSA) titerek a három vizsgált betegcsoportban, logaritmikus skálán ábrázolva. A csoportokban mért átlagos ANCSA titerek, ezek szórása, és az egyes mért értékek vannak feltüntetve. Az SLE-s csoport ANCSA szintje (356,3 ± 851 IU/ml) szignifikánsan (p<0,01) magasabb volt a nem-differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedőkétől (39,9 ± 57,7 IU/ml) és a nem autoimmun beteg (nem AI) kontrollokétól (1,44 ± 2,77 IU/ml).

356,339,91,44

1

10

100

1000

10000

SLE UCTD nem AI

antit

est t

iter (

IU/m

l)

38

Az anti-nukleoszóma antitestek jelenléte és a veseérintettség kapcsolatának

vizsgálatakor összehasonlítottuk az alábbi három csoport feltűntetett ANCSA szintjeit:

VA - aktív vesebetegséggel élők: 247 ± 344 IU/ml; VB - betegek korábban fellépett, de

gyógyult vesekárosodással: 171 ± 183 IU/ml; VC - veseérintettségtől mentesek 459 ±

1120 IU/ml. A csoportok között semmilyen párosításban nem találtunk szignifikáns

különbséget (p>0,05 minden esetben) (6. ábra).

6. ábra: Anti-nukleoszóma antitest (ANCSA) titerek a teljes SLE-s csoportban (SLE; 356,3 ± 851 IU/ml), és a veseérintettség szerint megkülönböztetett három SLE-s alcsoportban: VA - aktív vesebetegséggel élők (247 ± 344 IU/ml); VB - korábban fellépett, de gyógyult a vesekárosodásos betegek (171 ± 183 IU/ml); VC - veseérintettségtől mentesek (459 ± 1120 IU/ml). A csoportok között nincs szignifikáns különbség.

1

10

100

1000

10000

SLE SLE-VA SLE-VB SLE-VC

antit

est t

iter (

IU/m

l)

39

Az antinukleoszóma antitestek kapcsolata az anti-dsDNS antitestekkel és a DNáz

enzimaktivitással

Megvizsgáltuk - összesen 212 betegmintában - az ANCSA és anti-DNS antitestek

kapcsolatát egymással. Spearman-féle rangkorrelációs eljárással szignifikánsan erős

összefüggést találtunk (rs=0,744; p<0,001) (7. ábra).

7. ábra: Antinukleoszóma antitest titerek az anti-DNS antitest titerek függvényében, logaritmikus skálán feltüntetve. A két antitest koncentrációja között szignifikáns (p<0,001) korreláció tapasztalható.

Megfigyeltük azt is, hogy a betegek ANCSA pozitivitása nemcsak az anti-DNS

pozitivitással korrelál, hanem a hiszton és kromatin elleni antitestek jelenlétével is.

Szignifikáns eltolódást találtunk ugyanis (khi2-statisztikával p<0,001) az anti-hiszton

illetve anti-kromatin pozitív betegek körében az ANCSA pozitivitás irányába. Ezek

alapján az anti-hiszton vagy anti-kromatin pozitív mintákban nagyobb eséllyel találunk

antinukleoszóma antitestet is. Ez utóbbi összefüggés elsősorban az anti-DNS negatív

minták esetében (RR=2,6 CI95%=1,47-4,6) érvényesül, az anti-DNS pozitív minták

esetében nem jelentős (RR=1,11 CI95%=1,04-1,19).

1

10

100

1000

10000

1 10 100 1000 10000

anti-DNS

anti-

nukl

eosz

óma

40

A DNáz enzimaktivitás statisztikailag szignifikáns negatív korrelációt mutat a

szérumban mérhető ANCSA titer logaritmusával (p<0,01), vagyis az alacsonyabb DNáz

aktivitású betegmintákban nagyságrendekkel magasabb a nukleoszóma elleni antitestek

koncentrációja. Ezzel a megfigyeléssel egybecseng az az eredmény, amely szerint az

ANCSA pozitív betegek DNáz aktivitása szignifikánsan alacsonyabb az ANCSA

negatív betegek enzimaktivitásánál (63,3% ± 13,3% illetve 71,7% ± 13,0%; p<0,001)

(8. ábra). Érdekes, hogy - bár az antinukleoszóma és anti-DNS antitestekre való

pozitivitás egymással erősen korrelál – a fenti összefüggés az anti-DNS antitestek

esetében kevésbé markáns. Az anti-DNS pozitív betegek mintáiban is alacsonyabbnak

találtuk a DNáz enzim aktivitását, mint az anti-DNS negatívakéban (61,4% ± 14,6%

illetve 66,1% ± 13,0%, és ez a különbség is szignifikánsnak mutatkozott (p=0,028), de

kevésbé, mint a nukleoszóma elleni antitestek esetén.

8. ábra: Az ANCSA pozitív és ANCSA negatív betegek DNáz aktivitásának összehasonlítása. ANCSA pozitív betegcsoport enzimaktivitása (63,3% ± 13,3%) szignifikánsan (p<0,001) alacsonyabb, mint az ANCSA negatív betegcsoporté (71,7% ± 13,0%).

40

50

60

70

80

90

ANCSA neg ANCSA poz

DN

áz a

ktiv

itás %

41

A DNáz aktivitás szerepe az SLE követésében

Felmerült a kérdés, hogy mennyire jól használható paraméter a DNáz aktivitás változása

a betegség aktivitásának megállapításakor a betegek követése során.

Megvizsgáltuk azt, hogy van-e korreláció a betegek szérumában mért DNáz aktivitás és

a mintavétel időpontjában meghatározott, a betegség aktivitását jellemző SLEDAI

pontértékek között. Nem volt szignifikáns a két változó közti negatív korreláció (rs=-

0,071; p=0,339), csak gyenge tendencia volt észrevehető (9.ábra).

9. ábra: DNáz aktivitás a betegségaktivitást jellemző SLEDAI értékek függvényében. Nem találtunk valós korrelációt a két változó között (rs=-0,071; p=0,339).

Szemben azzal a megfigyeléssel, hogy a DNáz aktivitás nem korrelál a

betegségaktivitást jellemző SLEDAI értékkel, az antinukleoszóma és anti-DNS szintek

illetve a SLEDAI közt találtunk összefüggést. Ennek a hátterében az állhat, hogy az

anti-DNS antitestek jelenléte 2 ponttal hozzájárul a SLEDAI alakulásához, éppen ezért

az anti-DNS antitestek és a SLEDAI között talált korreláció (rs=0,494; p<0,001) nem

tekinthető valósnak. Feltehetőleg az ANCSA és a SLEDAI közti szignifikáns korreláció

(rs=0,369; p<0,01) is összefügg a SLEDAI számítási módjába belekalkulált anti-DNS

antitestekkel, hiszen az ANCSA és az anti-DNS antitestek egymással erős korrelációt

mutattak (10. ábra).

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16

SLEDAI

DN

áz a

ktiv

itás %

42

10. ábra: Az anti-DNS és ANCSA titerek a SLEDAI függvényében. Mindkét antitest szignifikáns (p<0,01), pozitív korrelációt mutat (rs=0,494 az anti-DNS antitestekkel és rs=0,369 az antinukleoszóma antitestekkel) a betegség aktivitását mérő SLEDAI értékekkel.

Követéses vizsgálatok

Longitudinális vizsgálattal 6 betegünk DNáz aktivitását és antitest-szintjeit követtük

azzal a céllal, hogy megfigyeljük, a teljes csoporttól függetlenül az egyes betegek

esetében hogyan alakulnak egymáshoz és a betegség aktivitásához képest a vizsgált

paraméterek (11. ábra). Nem találtunk olyan beteget, akinek az esetében a DNáz

aktivitás a betegség aktivitásával bármilyen irányú egyértelmű összefüggést mutatott

volna. Az egyik beteg esetében viszont az egymást követő mintákban erős pozitív

korrelációt mértünk a DNáz aktivitás és a két antitest mennyisége közt (rPearson=0,95 az

anti-DNS-sel és rPearson =0,66 az ANCSA-val; „F” beteg a 11. ábrán). Azt is

megfigyeltük, hogy a DNáz aktivitása nem mutatott jelentős ingadozást az azonos

személyektől különböző időpontokban vett szérumokban, az ugyanattól a személytől

származó minták szórása (6 és 9,4 % között) átlagosan 7,7 %-a volt a minták átlagának.

Ellenben, nagyobb változékonyságot tapasztaltunk az anti-DNS és antinukleoszóma

antitestek mennyiségének követése során, az anti-DNS antitestek koncentrációjának

szórása átlagosan 66,25 %-a (22,7-113,3 % közt) volt a beteg átlagos antitest-

1

10

100

1000

10000

0 2 4 6 8 10 12 14 16

SLEDAI

antit

est-k

once

ntrá

ció

(IU/m

l) anti-nukleoszómaanti-DNS

43

koncentrációjának. A 6 beteg közül 3 személynél tapasztalhattunk nagyságrendbeli

változást az anti-DNS antitestek titerében a követés néhány hónapja alatt.

Megfigyelhető az is, hogy az anti-DNS és ANCSA titerek a legtöbb esetben együtt

változnak. Két olyan betegünk volt a 6-ból, akiknél a követés teljes ideje alatt erősen

pozitív, az anti-DNS értékeket többszörösen meghaladó ANCSA-t mértünk („C” és „D”

beteg a11. ábrán).

Módunkban állt a vizsgálatokba bevont 9 UCTD beteget a vizsgálattól számítva három

évig figyelemmel kísérni. Korábban megállapítottuk, hogy közülük 4 személynek volt

70 % alatti, kóros tartományba eső DNáz aktivitás értéke, egy személynek határérték-

közeli 71 %-os aktivitást mértünk, 4 betegnél pedig normál tartományba eső DNáz

aktivitást mértünk. A betegek közül egy betegnél - akinél korábban kórosan alacsony

(53,8 %) DNáz aktivitást mértünk - fejlődött ki SLE. Két betegnél - a normál aktivitású

csoportból - Sjögren szindrómát diagnosztizálhattunk, a többiek esetében nem alakult ki

az UCTD-től különböző autoimmun kórkép.

44

11. ábra: Hat SLE-s beteg DNáz, komplement (C3, C4), anti-DNS és anti-nukleoszóma szintjeinek, valamint betegségaktivitásuk változása 1-1,5 éves követésük során. A diagrammok x-tengelyén vannak feltüntetve a mintavételi dátumok (év, hónap); a baloldali y-tengelyen található az antitestek titerét jelző skála (a narancs és kék színű oszlopok mutatják a betegek anti-DNS illetve ANCSA szintjeit); a jobboldali y-tengelyen található a DNáz aktivitáshoz (sárga jelzés) és a komplement szinthez (zöld jelek: C3 és C4 szorzatának 1000, illetve egy esetben 100-szorosa) tartozó skála. Az oszlopok feletti bordó számok a mintavételkor megállapított betegségaktivitást jelző SLEDAI pontértékeket mutatják. Nem találtunk korrelációt a DNáz aktivitás és a betegségaktivitás közt, viszont az „F”-beteg esetében erős pozitív korrelációt mutat a DNáz aktivitás és az anti-DNS antitestek szintjének változása.

"A" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.08. 03.01. 03.05. 03.08. 04.01.

0

40

80

120

160

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

2 444 9

"B" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.11. 03.01. 03.06. 03.09. 03.11.

0

40

80

120

160

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

644 44

"D" beteg

0

40

80

120

160

200

02.07. 02.11. 03.01. 03.04. 03.06. 03.12.

0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

240 59 0

"F" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.09. 02.11. 03.01. 03.05. 03.08. 03.11.0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

624 48 8

"C" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.09. 03.03. 03.09.

0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

42 2

"E" beteg

0

40

80

120

160

200

02.10. 03.06. 03.10.

0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás100*(C3*C4)

102 0

"A" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.08. 03.01. 03.05. 03.08. 04.01.

0

40

80

120

160

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

2 444 9

"A" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.08. 03.01. 03.05. 03.08. 04.01.

0

40

80

120

160

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

2 444 9

"B" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.11. 03.01. 03.06. 03.09. 03.11.

0

40

80

120

160

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

644 44

"B" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.11. 03.01. 03.06. 03.09. 03.11.

0

40

80

120

160

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

644 44 644 44

"D" beteg

0

40

80

120

160

200

02.07. 02.11. 03.01. 03.04. 03.06. 03.12.

0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

240 59 0

"D" beteg

0

40

80

120

160

200

02.07. 02.11. 03.01. 03.04. 03.06. 03.12.

0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

240 59 0

"F" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.09. 02.11. 03.01. 03.05. 03.08. 03.11.0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

624 48 8

"F" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.09. 02.11. 03.01. 03.05. 03.08. 03.11.0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

624 48 8

"C" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.09. 03.03. 03.09.

0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

42 2

"C" beteg

0

400

800

1200

1600

2000

02.09. 03.03. 03.09.

0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás1000*(C3*C4)

42 2

"E" beteg

0

40

80

120

160

200

02.10. 03.06. 03.10.

0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás100*(C3*C4)

102 0

"E" beteg

0

40

80

120

160

200

02.10. 03.06. 03.10.

0

40

80

120

160

200

anti-DNSanti-nukleoszómaDNáz aktivitás100*(C3*C4)

102 0

45

A tromboembóliás események bekövetkeztének és a tromboembóliás

rizikófaktorok jelenlétének a kapcsolata SLE-s betegknél

A trombózis incidenciája SLE-ben

A 105 vizsgált lupuszos beteg közül 22-nek, vagyis 20,95 %-nak szerepel a

kórtörténetében tromboembóliás esemény. Közülük öt személynek volt csak artériás,

14-nek csak vénás trombózisa, három beteg pedig mind artériás, mind vénás epizódon

átesett már.

1335 betegév alatt 22 első tromboembóliás esemény következett be, így a vizsgált

populációban az első trombózis incidenciája 16,5 per 1000 év. A vénás események éves

előfordulása 12,4 per 1000 év volt (12. ábra), vagyis több mint kétszerese az artériás

események incidenciájának, ami 5,4 per 1000 év volt. Az artériás epizódok minden

esetben agyi események voltak, hét beteg esetében agyi mikrotrombózisok, egy betegnél

ismétlődő stroke. A vénás trombózison átesett betegek közül 14 személynek volt

mélyvénás trombózisa, egy kivétellel minden esetben az alsó végtag volt érintett.

Közülük öt betegnél visszatérő DVT-ről van szó. Két másik személynek felületi

thrombophlebitise volt, egy fiatal nő betegnek pedig agyi vénát érintő trombózisa.

12. ábra Az általunk vizsgált SLE-s csoportban előforduló vénás trombózisok éves incidenciájának összehasonlítása az átlagnépességben és egy vegyes etnikumú SLE-s populációban mért adatokkal [145].

0,1-2,5

12,4 13

0

4

8

12

16

20

24

átlagnépesség SLE populációsaját eredmény

SLE populációMok et al

inci

denc

ia10

00 é

vre

0,1-2,5

12,4 13

0

4

8

12

16

20

24

átlagnépesség SLE populációsaját eredmény

SLE populációMok et al

átlagnépesség SLE populációsaját eredmény

SLE populációMok et al

inci

denc

ia10

00 é

vre

46

Az antifoszfolipid antitestek előfordulása a vizsgált populációban

A vizsgált 105 fős SLE-s csoportból 45 beteg mintájában, vagyis a betegek 43,9 %-ánál

mutattuk ki az antifoszfolipid antitestek valamelyik altípusát.

A rutin diagnosztikában leggyakrabban vizsgált anticardiolipin antitest 22 beteg, a

csoport 21 %-ának mintájában volt kimutatható. Közülük 10 személynek csak IgG

típusú antitestje volt, 2 személynek csak IgM, a fennmaradó 10 beteg mintájában pedig

mindkét izotípusú ellenanyag jelen volt. 27 szérumban, vagyis a szérum minták 25,7 %-

ában találtunk anti-ß2-glikoprotein antitestet. 22 beteg szérumában volt anti-protrombin

antitest kimutatható, anti-foszfatidil-szerin antitestet pedig 18 szérumban találtunk. Jól

meghatározható volt a betegek egy 11 fős csoportja, akiknek mintájában kimutatható, de

a küszöbértéket meg nem haladó mennyiségű, foszfatidil-szerin elleni antitestet

detektáltunk. Az ő esetükben ELISA módszerrel semmilyen más antifoszfolipid

antitestet nem tudtunk kimutatni, mintáikat „gyengén pozitív” megjegyzéssel a

negatívak közé soroltuk.

37 plazmában, vagyis a minták 35,2 %-ában találtunk lupus anticoaguláns aktivitást.

Ezek 64,9 %-ában, azaz 24 mintában találtunk ELISA módszerrel is antifoszfolipid

antitesteket.

Megvizsgáltuk az összefüggést a szilárd fázisú és a koagulációs módszerrel kimutatható

antitestek jelenléte között. Azon betegeknél, akiknek a szérumában mind a négyféle

ELISA módszerrel kimutatott antitest jelen volt, 80 %-ban detektáltunk koagulációs

módszerrel lupus anticoagulánst. Azon betegek közül, akiknél háromféle antitestet

találtunk ELISA-val, 77,8 % volt LA pozitív. A kétféle antitestre pozitív betegek

plazmáinak 66,7 %-ban volt jelen LA. Azok közül, akiknél csak egyféle antifoszfolipid

ELISA eredménye lett pozitív, 50 % plazmájában volt kimutatható LA aktivitás. A 11

ELISA módszerrel negatívnak minősített beteg közül, akiknek a szérumában egyedül

alacsony koncentrációjú anti-foszfatidil-szerin antitestet találtunk, négy betegnek

(36,4%-nak) a plazmájában találtunk LA-t. Végül az ELISA módszerrel teljesen negatív

62 beteg közül csupán 10 személynek, azaz 16,1 %-nak a plazmájában volt LA

kimutatható.

A különböző antigénekre specifikus APA ELISA teszt típusok közül egyik sem mutatott

statisztikailag is szignifikáns, egyértelmű összefüggést a LA aktivitással, bár volt eltérés

az egyes tesztek között a lupus antikoagulánssal való együttes megjelenés arányában (3.

47

táblázat). Érdekes megfigyelés, hogy a 9 ELISA módszerrel kizárólag anti-cardiolipin

pozitivitást mutató minta közül 7 betegnél találtunk LA-t, míg az öt csak anti-

protrombin pozitív beteg közül csak egynél. Ezt a különbséget azonban statisztikailag

nem találtuk szignifikánsnak.

n RR (CI95%)* RR (CI95%) a teljes SLE-s csoportban**

LA (%)

RR (CI95%) LA-sal együtt**

a-cardiolipin 22 8,18‡

(2,95-22,71) 4,53‡

(2,26-9,07) 81,8

4,03‡ (2,06-7,86)

a-ß2-glikoprotein I 27 7,78‡

(2,82-21,44) 5,06‡

(2,39-10,71) 74,1

5,10‡ (2,58-10,1)

a-protrombin 18 5,00†

(1,58-15,80) 1,81†

(0,82-3,99) 66,7

2,91† (1,41-5,91)

a-foszfatidil-szerin 22 6,82‡

(2,38-19,52) 3,14†

(1,57-6,30) 77,3

4,31‡ (2,23-8,34)

† p<0,01 ‡ P<0,001 * az antifoszfolipid antitest negatív betegek csoportjához viszonyított tromboembóliás rizikó;

** a teljes SLE-s populáción belüli tromboembóliás kockázat

3. táblázat: Az ELISA módszerrel kimutatott négyféle antifoszfolipid antitest (APA) és a lupus antikoaguláns (LA) együttes előfordulása, valamint tromboembóliás kockázatuk LA-tól függetlenül, illetve azzal együtt megjelenve.

Az antifoszfolipid antitestek és a trombózis kockázatának összefüggése

A vizsgált SLE-s betegcsoportban a legjelentősebb thromboembóliás kockázati

tényezőnek a - mind a szilárd fázisú (ELISA), mind a koagulációs módszerrel

kimutatott - antifoszfolipid antitestek (APA) jelenléte bizonyult (13. ábra). A 45 APA

pozitív beteg közül 18, a betegek 40%-a esett már át tromboembóliás eseményen, míg a

60 APA negatív beteg közül csak 4 személy (6,7%).

Az APA negatív csoport esélyhányadosa és relatív kockázata a teljes SLE-s

populációhoz képest szignifikánsan alacsony volt (OR=0,11 CI95%=0,03-0,35; RR=0,17

CI95%=0,06-0,46). Ezzel szemben a legmagasabb kockázatot az ELISA módszerrel

kimutatott antitestek és a LA aktivitás együttes jelenléte jelentette (OR=7,85

CI95%=2,74-22,49; RR=4,28 CI95%=2,12-8,62) (4. táblázat).

48

13. ábra: A trombózison átesett SLE-s betegek aránya négy alcsoportban aszerint, hogy kivizsgálásuk során detektálható volt-e ELISA módszerrel a szérumukban antifoszfolipid antitest (APA), illetve kimutattunk-e koagulációs módszerrel a plazmájukban lupus anticoaguláns aktivitást (LA). Jól látható, hogy a trombózison átesett betegek legnagyobb arányban (52,2 %) azok közt vannak, akiknél APA és LA is jelen volt, míg legkisebb arányban (6,7 %) az antifoszfolipid antitesttől mentes betegek között fordult elő tromboembóliás esemény. A csak LA vagy csak APA pozitív betegek csoportjaiban átmeneti értékeket kaptunk (28,6 illetve 25 %, sorrendben). Nem volt jelentős különbség az artériás és vénás események relatív kockázata között az

APA pozitív betegcsoportban. Például, az ELISA és koagulációs módszerrel is

kimutatott APA pozitív betegek esetében az antifoszfolipid antitesttel nem rendelkezők

csoportjában tapasztalthoz képest az artériás és vénás epizódok relatív kockázata közel

azonos (RR=6,25 CI95%=1,3-30,04 illetve RR=7,5 CI95%=2,22-25,35); a csak LA

pozitívak csoportjában pedig az artériás és vénás trombózisok relatív kockázatának

értékei (RR=3,95 CI95%=1,05-14,89 és RR=3,95 CI95%=1,61-9,67) egymástól csak a

konfidencia intervallumban térnek el.

11

10

6

56

8

2

2

21

1

1

1

4

0 10 20 30 40 50 60

trombózismentes betegek

VTE

VTE és ATE

ATE

ELISA - és LA +

ELISA + és LA +

ELISA + és LA -

ELISA - és LA -

49

betegek száma RR (CI95%)* ATE VTE

nincs pozitív APA ELISA

73 3 6

egy pozitív APA ELISA

4 3,75

(0,54-26,19) 1 0

kettő pozitív APA ELISA

9 6,67

(2,02-22,04)) 1 5

három pozitív APA ELISA

9 6,67

(2,02-22,04) 2 3

négy pozitív APA ELISA

10 6,00

(1,78-20,19) 1 3

bármelyik APA ELISA pozitív 32

7,03 (2,55-19,42)

5 11

LA pozitív 37 6,49

(12,35-17,92) 6 12

APA ELISA vagy LA pozitív

24 8,13

(2,94-22,44) 5 9

APA ELISA és LA is negatív

60 1 2 3

* az antifoszfolipid antitest negatív betegek csoportjához viszonyított tromboembóliás rizikó 4. táblázat: Az ELISA módszerrel kimutatott antifoszfolipid antitestek előfordulása, tromboembóliás relatív kockázatuk, valamint lupus antikoagulánssal való együttes megjelenésük aránya és relatív TE kockázata.

50

Egyéb, öröklött tromboembóliás rizikófaktorok előfordulása a vizsgált populációban

Az antifoszfolipid antitesteken felül, megvizsgáltuk az SLE-s csoportban más, olyan

faktorok jelenlétét is, amelyek ismert módon a normál populációban is hozzájárulnak

trombózisok illetve trombofíliás állapot kialakulásához.

FV Leiden és FII G20210A mutációk

Ezek közül a leggyakoribb az V-ös faktor Leiden-mutációja révén a faktoron kialakuló

rezisztencia az aktivált protein C hasítása ellen. Az általunk vizsgált 105 fős

betegcsoportban is ez volt a leggyakoribb öröklött defektus, 9 betegnél találtuk meg

heterozigóta, 1 betegnél pedig homozigóta formában. A heterozigóta betegek egyikénél

egy másik ismert mutációt - a protrombin gén promóter régiójában található G20210A

báziskicserélődést - is azonosítottunk, szintén heterozigóta formában. Ez utóbbi,

protrombin mutációt heterozigóta formában még egy másik betegnél is kimutattuk.

14. ábra: Olvadáspont analízis görbéje a Leiden-mutáció kimutatásához. A vad típusú allél szekvenciájára tervezett fluoreszcens próba erősebb kötődést mutat a vele tökéletesen komplementer vad DNS szálhoz, míg gyengébben a Leiden-mutációt hordozó szálhoz. A DNS minták melegítése során a Leiden-szálról alacsonyabb hőmérsékleten válik le és ad jelet a próba. Az ábrán zölddel látható a heterozigóta pozitív kontroll, szürkével a DNS-mentes negatív kontroll, narancs színnel (257-es minta) egy homozigóta Leiden-mutációt hordozó beteg görbéje, vastag kék vonallal pedig (256-os minta) egy vad típusú beteg görbéje.

51

Szerzett APCR vizsgálata

Aktivált PC elleni rezisztenciát mutattunk ki egy olyan betegnél is, akinél a Leiden

mutáció vad típusát találtuk (256-os számú minta a 14. ábrán). DNS szekvenálással

tovább vizsgáltuk a beteg V-ös faktorának további két olyan szakaszát, a 306-os és 679-

es argininek régióit, amelyek szükségesek ahhoz, hogy az APC képes legyen megkötni

és hasítani az V-ös faktort. Nem találtunk mutációt egyik vizsgált szakaszon sem.

15. ábra: DNS-szekvenálás elektroferogrammja az FV vizsgálatához. A baloldali elektroferogrammokon bekeretezett rész a 306-os, a jobboldaliakon jelölt terület a 679-es arginint kódoló bázisokat mutatja (mindkét esetben a reverz szál szekvenciája van feltüntetve). Felül a beteg, alul a vad típusú kontroll szekvenciája látható. A két szekvenciarészlet megegyező.

R306 R679

kontroll

betegminta

52

Ismert, hogy a lupus anticoaguláns jelenléte hozzájárulhat szerzett APC rezisztencia

kialakulásához. Mivel az imént említett beteg plazmájában jelentős mértékű LA

aktivitást mértünk, ennek a jelenségnek tulajdonítottuk az APC elleni rezisztenciát.

Éppen ezért megvizsgáltuk, hogy a többi LA pozitív betegnél is jelentkezik-e a fent

említett hatás. Ebből a vizsgálatból kizártuk azokat a betegeket, akiknél Leiden-

mutációt találtunk, hiszen az ő plazmájukban a mutáció következtében mértünk fokozott

APC rezisztenciát. Összehasonlítottuk tehát a Leiden-mutációra negatív betegek két

csoportjának, a LA negatívaknak és pozitívaknak az APCR értékeit (16. ábra). A LA

negatív csoportba sorolt 59 beteg átlagos APCR aránya 2,46 ± 0,28 volt, a 35 LA

pozitív beteg átlagos aránya pedig 2,39 ± 0,39. A két érték között nincsen szignifikáns

különbség (p=0,344).

16. ábra: APC rezisztenciát (APCR) jelző aPTI hányadosok az SLE-s betegek négy alcsoportjában. A legkisebb hányadost (1,29), azaz a legerősebb APCR-t a homozigóta Leiden mutációt hordozó egyetlen betegnél mértük. A 9 heterozigóta beteg plazmájában mért hányados is szignifikánsan alacsonyabb volt (1,58 ± 0,2; p<0,001), mint a Leiden-mutációt nem hordozók két csoportjáé. A Leiden negatív lupus anticoaguláns (LA) negatív és pozitív betegek hányadosai között nem volt szignifikáns különbség (2,46 ± 0,28 és 2,39 ± 0,39; p=0,344).

1,58

2,46 2,39

1,29

0

1

2

3

Leiden hom. Leiden het. Leiden - és LA - Leiden - és LA +

aPTI

APC

jele

nlét

ében

/ aP

TI A

PC n

élkü

l

53

Természetes antikoaguláns fehérjék (AT, PC és PS)

Megmértük a természetes anticoaguláns fehérjék aktivitását a betegek plazmáiban. A

protein C és protein S szintek vizsgálatából kihagytuk azokat a betegeket, akik tartós

coumarin antikoaguláns kezelés alatt álltak, mivel e K-vitamin anyagcserére ható szer

szedése nemcsak a K-vitamin-függő alvadási faktorok, hanem a PC és PS szintén K-

vitamint igénylő szintézisére is hat, így ezeknél a betegeknél csökkent PC és PS

szinteket mérünk. Egy betegnél találtunk kórosan alacsony, 29 %-os PC aktivitást, egy

másik betegnél pedig csökkent, 46 %-os PS aktivitást. Szintén egy betegnél mértünk

mérsékelten alacsony, 48 %-os antitrombin aktivitást.

FVIII és vWF szintek

Megmértük a plazmák VIII-as faktor és von Willebrand faktor szintjét is. 10 beteg

mintájában volt mindkét fehérje szintje és aktivitása emelkedett. 11 olyan mintát

találtunk, amelyben az FVIII aktivitásának emelkedéséhez nem társult emelkedett vWF

antigén szint, illetve aktivitás. Végül, két mintában csak a vWF szintje és aktivitása volt

emelkedett, az FVIII szint nem.

Homocisztein szint

A plazma homocisztein szintek mérésekor 20 mintában, a plazmák 19 %-ában, találtunk

15 µM feletti Hcy értéket. Közülük 6 személynél 20 µM-t is meghaladó értéket

mértünk. Érdekes megjegyezni, hogy a 6 legmagasabb Hcy szinttel rendelkező beteg

között 3 férfi és 3 nő volt. Ez szignifikáns eltolódás a nemek arányában a teljes SLE-s

csoporthoz képest (χ2 próbával p ≤ 0,001), hiszen a vizsgálatban résztvevő SLE-s

betegek mindössze 5,7 %-a férfi.

54

Az öröklött rizikófaktorok jelenlétének kapcsolata a tromboembóliás események

kialakulásával

Az öröklött tromboembóliás kockázati tényezőket vizsgálva az antifoszfolipid antitestek

esetében számítottnál mérsékeltebb hatást tapasztaltunk.

FV Leiden és FII G20210A mutációk

A Leiden-mutáció tromboembóliás kockázatot jelentő hatását csak az antifoszfolipid

negatív SLE-s betegek csoportjában tudtuk kimutatni (OR=7,25 CI95%=1,00-52,34;

RR=5,17 CI95%=1,18-22,61), az antifoszfolipid pozitív betegcsoportban nem bizonyult

statisztikailag számottevő tényezőnek (OR=1,36 CI95%=0,17-10,84; RR=1,18

CI95%=0,41-3,39). Érdekes, hogy nem szenvedett el trombózist sem a Leiden mutációra

homozigóta beteg, sem az a személy, akinél heterozigóta formában a Leiden mutáció

mellett a protrombin G20210A mutáció is jelen van. A protrombin G20210A mutációja

ebben a populációban – feltehetően alacsony előfordulása miatt – nem hordozott

statisztikailag is szignifikánsan magas tromboembóliás kockázatot (OR=3,9

CI95%=0,23-65,05; RR=2,45 CI95%=0,58-10,33).

Természetes anticoaguláns fehérjék

Nem szenvedett el trombózist az a három beteg, akiknél valamelyik természetes

antikoaguláns fehérje (PC, PS vagy AT) csökkent aktivitását mértük. Nem volt jelentős

különbség a trombózist elszenvedett csoport és a tromboembóliás eseményektől mentes

csoport átlagos AT aktivitása közt sem (114,0 % ± 24,9 % illetve 105,1 % ± 33,2 %

sorrendben, p=0,256).

FVIII és vWF

Négy személynek volt trombózisa azon 11 beteg közül, akiknek a plazmájában

emelkedett FVIII és vWF szinteket mértünk. Az FVIII szint akár a von Willebrand

faktorral együtt, vagy attól függetlenül megemelkedett szintje enyhén, statisztikailag

nem szignifikáns mértékben emelkedett kockázatot hordozott (OR=2,3 CI95%=0,79-

6,67; RR=1,87 CI95%=0.87-3.99 az FVIII emelkedése esetén; OR=2,41 CI95%=0,64-

9,14; RR=1,9 CI95%=0,78-4,6 a FVIII és vWF együttes emelkedése esetén). Nem volt

szignifikáns a különbség a trombózist elszenvedett csoport és a tromboembóliás

55

eseményektől mentes csoport átlagos vWF antigén szintje között (118,4 % ± 53,6 %

illetve 98,1 % ± 41,9 % sorrendben, p=0,109).

kockázati tényező trombózisos

csoport n=22

trombózistól mentes csoport

n=83

RR (CI 95%)

lupus antikoaguláns 16

(72.7%) 21

(25.3%) 4.90

(2.10-11.45)

antifoszfolipid antitestek ELISA-val

15 (68.2%)

17 (20.5%)

4.89 (2.21-10.83)

FV Leiden mutáció 4

(18.2%) 6

(7.2%)

n.sz. 2.11

(0.89-5.02)

FII G20210A mutáció 1

(4.5%) 1

(1.2%)

n.sz. 2.45

(0.58-10.33)

emelkedett FVIII és von Willebrand faktor szintek

4 (18.2%)

6 (7.2%)

n.sz. 2.11

(0.89-5.02)

emelkedett homocisztein szint 6

(27.3%) 14

(16.9%)

n.sz. 1.59

(0.71-3.55)

antitrombin deficiencia 0 1 -

alacsony protein C szint 0 1 -

alacsony protein S szint 0 1 -

nincs kimutatott kockázati tényező

1 (4.5%)

35 (42.2%)

0.09 (0.01-0.65)

5. táblázat: A vizsgált tromboembóliás kockázati tényezőkhöz társuló trombózisos esetek száma, valamint a trombózis kialakulására vonatkozó relatív kockázati (RR) értékek 95 %-os konfidencia intervallummal (CI95%).

56

Homocisztein szint

Hat betegnek volt trombózisa a 20 közül, akiknek a plazmájában 15µM feletti Hcy

szintet mértünk. Közülük két személynek volt artériás és vénás tromboembóliás

epizódja is, egy beteg csak artériás, három pedig csak vénás eseményen esett át.

Vizsgálatunk során így a 15 µM feletti Hcy szint nem bizonyult szignifikáns trombózis

kockázati tényezőnek (OR=1,85 CI95%=0,62-5,55; RR=1,59 CI95%=0,71-3,55). Nem volt

szignifikáns a különbség a trombózist elszenvedett csoport és a tromboembóliás

eseményektől mentes csoport átlagos plazma Hcy szintje között sem (12,2 ± 4,3 µM

illetve 11,5 ± 4,6 µM sorrendben, p=0,534).

Az APAk és az öröklött tromboembóliás kockázati tényezők együttes hatása

Felmerül a kérdés, hogy az antifoszfolipid antitestek jelenléte jelentette magas

tromboembóliás kockázatot hogyan emeli egy második, öröklött kockázati tényező.

Megvizsgáltuk, hogy az antifoszfolipid antitest pozitívak csoportján belül mekkora

kockázatot viselnek az APA mellett Leiden mutációval, emelkedett FVIII vagy Hcy

szinttel élő betegek. A számértékek nem mutattak jelentős kockázatemelkedést (5.

táblázat). Amennyiben az ilyen kombinált eltéréssel rendelkezőknek az APA negatívak

csoportjával szemben mutatott relatív kockázatát hasonlítottuk össze az APA pozitív

csoport ugyanezen értékével, akkor sem találunk jelentős különbséget.

RR (CI95%) az APA pozitív csoporton belül

RR (CI95%) az APA negatív csoporthoz viszonyítva

APA 1 7,03

(2,55-19,42)

APA + FVL 1,3 (0,53-3,18)

7,5 (2,17-25,91)

APA + Hcy 1,35 (0,63-2,86)

7,5 (2,42-23,25)

APA + FVIII és vWF 1,6 (0,70-3,63)

9,0 (2,75-29,49)

6. táblázat: Az antifoszfolipid antitestekhez társuló gyakoribb kockázati tényezők hatása trombózis kialakulásának relatív kockázatára (RR 95 %-os konfidencia intervallummal CI95%). Látható, hogy egyik kombináció esetében sem kapunk az első sorban szereplő, a teljes APA pozitív csoportra vonatkozó értéktől szignifikánsan eltérő kockázatot.

57

A különböző rizikófaktorok között az antifoszfolipid antitestek meghatározó szerepét

mutatja az a tény, hogy az emelkedett Hcy szinttel rendelkező, APA negatív betegek

közük 8,3 %-nak volt trombózisa, míg az emelkedett Hcy szinttel és APA-val

rendelkezők közül 62,5 %-nak. Hasonló különbséget kaptunk a többi rizikófaktorral

rendelkező – az emelkedett plazma FVIII szintű és a Leiden-mutációt hordozó - betegek

esetében is (17. ábra).

17. ábra: A tromboembóliás eseményen már átesett betegek aránya a rizikófaktorok szerinti csoportokban: a Leiden-mutációt hordozók (Leiden), a magas VIII-as faktor (FVIII) illetve magas homocisztein (Hcy) szinttel élők, és – az antifoszfolipid antitesteken (APA-n) kívül - semmilyen kimutatott rizikót nem viselők (-) körében. A kék oszlopok jelzik azt, hogy a rizikófaktor szerinti csoporton belül az antifoszfolipid antitesttel nem rendelkezők mekkora hányada szenvedett el már trombózist; mellettük a piros oszlopok ugyanezt az arányt jelzik az antifoszfolipid pozitív betegek körében. A piros és kék oszlopok közti különbség szemléletesen mutatja az antifoszfolipid antitestek hozzájárulását a trombózisok kockázatához. Csak a kék oszlopokat megfigyelve a három rizikótényező (Leiden, Hcy és FVIII) protrombotikus hatásának erősségét hasonlíthatjuk össze.

0

20

40

60

80

Leiden FVIII Hcy -

trom

bózi

son

átes

ette

k ar

ánya

(%) APA negatívak

APA pozitívak

58

Az FcR-ok gátlásának vizsgálata

Az Fc receptorok fontos szerepet töltenek be az antitestek és immunkomplexek

hatásainak - úgy, mint a gyulladásoscitokin-termelés serkentése vagy a

trombocitaaktiváció - közvetítésében az SLE patogenezise során. Későbbi esetleges

terápiás alkalmazás céljával megvizsgáltuk, hogy szintetikus peptidkonjugátumokkal

előidézhetőek-e az immunkomplexek által kiváltott hatások, valamint, hogy monomer

peptidekkel (18. ábra) gátolhatóak-e ugyanezek.

18. ábra Az IgG molekula szerkezete, a vizsgált peptidek elhelyezkedése a molekulán, valamint szekvenciájuk.

RP 255RTPEVTC(Acm)VVVDVSHEDP271

KS 288KTKPREQQYNS298

PV 230PAPELLGGPSV240

könnyűlánc

nehézlánc

FabFab

kapocsrégió

az általunk vizsgált régió

CH2 domén

könnyűlánc

nehézlánc

FabFab

kapocsrégió

az általunk vizsgált régió

CH2 domén

59

A peptidek kötődése az Fc receptorokhoz

Áramlásos citometriás eljárással mértük meg, hogyan kötődnek az IgG Fc régiójából

származó szintetikus peptidek a monociták sejtfelszíni Fc receptoraihoz. A biotinnal

konjugált peptideket FITC-avidines jelöléssel vizsgáltuk. A peptidek szekvenciánként

eltérő mértékben kötöttek a receptorokhoz (19. ábra). A kötődés dózisfüggőnek

mutatkozott.

19. ábra: a biotinált RP, PV és KS peptidek összehasonlítása monocita sejtek Fc receptoraihoz kötődésük szempontjából; legerősebb kötődést a bRP peptid mutatta. x tengely: fluoreszcenciaintenzitás, y tengely: az adott fluoreszcenciaintenzitású sejtek száma.

IC-kötés gátlása

Bár kimutattuk a vizsgált Fc régióból származó peptidek receptorhoz való kötődését,

nem sikerült gátolni ezekkel az immunkomplexeket modellező fluoreszcensen jelölt

IgG-aggregátumok monocitákhoz való kötődését, még 125-szörös relatív peptidfelesleg

mellett sem (20. ábra).

negatív kontroll

bRPbPVbKS

IgG kontroll

60

20. ábra: az RP jelű IgG Fc peptid nem gátolja, még 125-szörös feleslegben sem az aggregált IgG sejtfelszíni Fc receptorhoz kötődését; az IgG mennyisége 0,16nmol/500.000 sejt, az RP peptidé az IgG mellett 20, 5, illetve 0,8 nmol volt; x tengely: fluoreszcenciaintenzitás, y tengely: az adott fluoreszcenciaintenzitású sejtek száma.

Peptidkonjugátumok citokintermelést indukáló hatása

Megvizsgáltuk, hogy az IgG Fc részéből származó szintetikus peptidkonjugátumok

hogyan hatnak a monociták Fc receptorok által közvetített effektor funkciójára, a

citokintermelésre. A három, az IgG Fc-fragment receptorkötő régiójából származó

szintetikus peptidet biotinnal konjugáltunk, majd ezeket avidinnel kötöttük össze. Az

így kapott konjugátumok - hasonlóan a kötődésvizsgálatok során tapasztaltakhoz –

szekvenciáktól függően eltérő mértékben váltottak ki IL-6 és TNF-α termelést a vizsgált

humán monocita sejtvonalon.

negatív kontroll

IgG kontroll

125xpeptidfelesleg

25xpeptidfelesleg

5xpeptidfelesleg

61

Monomer peptidek gátló hatása

Megvizsgáltuk, hogy a peptidek monomer formában képesek-e versengeni az

komplexben lévő IgG-vel a receptorok kötőhelyeiért, így gátolva az immunkomplexek

citokintermelést indukáló hatását.

Elsőként a három különböző szakasznak megfelelő peptideket vizsgáltuk az aggregált

IgG-vel szemben, a legnagyobb koncentrációban 30-szoros feleslegben. Nem

tapasztaltunk gátló hatást a monocitákon sem az IL-6, sem a TNF-α termelés esetében

sem.

Kipróbáltuk az Fc régió három különböző pontjáról származó peptidek keverékét is, az

aggregált IgG-vel szemben legnagyobb koncentrációban egyenként 75-szörös

feleslegben. Nem tapasztaltunk gátlást a hozzáadott immunkomplexek IL-6-termelést

indukáló hatásával szemben. Sikerült viszont gátolni a peptidkeverékkel a monociták

TNF-α-termelését.

21. ábra: IgG Fc peptidkeverék gátló hatása az immunkomplex által kiválott TNF termelésre a stimulálást követő különböző időpontokban lemérve.

[TNF] mg/ml

2,5·106

2·106

1,5·106

106

5·105

1 óra 2 óra 24 óra

+ kontroll

75x peptidfelesleg

15x peptidfelesleg

3x peptidfelesleg

62

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

A DNáz aktivitással kapcsolatos megfigyeléseink alátámasztják más szerzők korábbi

állításait, miszerint az SLE-s betegek szérumában a DNáz enzim aktivitása alacsonyabb,

mint az egészséges személyek szérumában mérhető enzimaktivitás [42, 146].

Ezt a megállapítást kiegészítettük azzal, hogy a csökkent DNáz aktivitás az SLE-hez

hasonló UCTD tünetegyüttes fellépése során is megfigyelhető. Az UCTD-s betegek 3

éves követése során azt tapasztaltuk, hogy közülük mindössze egy betegnél alakult ki

SLE; ennél a betegnél a korábbi mérések során alacsony DNáz aktivitást mértünk.

Sajnos ez nem elegendő információ ahhoz, hogy eldönthessük, a csökkent DNáz

aktivitás előre jelezheti-e az UCTD betegeknél a későbbi SLE kialakulását.

A csökkent DNáz aktivitás eredetére eddig még nem született pontos magyarázat. Az

egyik elmélet szerint az enzimet kódoló DNASE1 gén 2-es exonjában található mutáció

lenne a felelős az alacsonyabb enzimaktivitásért [48]. E mutáció előfordulási

gyakorisága azonban igen alacsony [146-149], így nem adhat magyarázatot az SLE-s

betegek mintegy kétharmadának a szérumában mérhető csökkent DNáz aktivitásra.

Ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre egy esetleges – valószínűleg antitest

jellegű - enzim-inhibitor kimutatott működéséről. Néhány tanulmány alátámasztja

[150], mások cáfolják [42, 146] egy DNáz ellenes antitestek jelenlétét a betegek

szérumában.

A DNáz enzim fiziológiás funkcióját magyarázó elméletek alapján ésszerű volna azt

feltételezni, hogy az enzim mérsékelt aktivitása hozzájárul az SLE-s betegek esetében

glomerulonephritis kialakulásához. Ennek laboratóriumi alátámasztása volna, ha a

veseérintettséggel küzdő SLE-s betegekben alacsonyabb lenne a DNáz aktivitás.

Méréseink szerint azonban az enzim aktivitása nem különbözik meggyőzően, vagyis

statisztikailag szignifikáns mértékben az aktív vesebeteg és a veseérintettségtől mentes

SLE-s alcsoportok között, azaz vizsgálatunk nem támasztotta alá a DNáz enzim szerepét

a veseérintettség kialakulásának folyamatában. Amennyiben a fenti összefüggés az

enzim aktivitása és a glomerulonephritis kialakulása közt fennállna, és a DNáz

aktivitása genetikai tényezők befolyása miatt volna alacsonyabb, nemcsak az aktív,

hanem a gyógyult vesebeteg csoportban is alacsonyabb DNáz aktivitást kellene

tapasztalnunk. A gyógyult vesebetegek és a veseérintettségtől mentes SLE-s betegek

63

közt azonban még kisebb volt a különbség. Adataink alapján kizárható, hogy az SLE-s

betegek veseérintettségének kialakulását a DNáz enzim genetikai rendellenessége

okozza, vagy jelentős mértékben befolyásolja.

Vizsgálataink során az SLE-s betegek közel 80%-ának szérumában találtunk anti-

nukleoszóma antitesteket. Más tanulmányok eredményei széles tartományban 37,5-100

% szórnak [26, 151-153], de minden esetben megállapítják a nukleoszóma elleni

antitestek megjelenését SLE-ben. Bár az ANCSA szérumbeli koncentrációja és a

betegség aktivitása között találtunk szignifikáns korrelációt, ez valószínűleg csak

következménye a nukleoszóma és a DNS elleni antitestek megjelenése közti erős

összefüggésnek. A betegség aktivitását ugyanis SLEDAI pontértékekkel jellemeztük,

amely indexnek egyik összetevője az anti-DNS antitestek jelenléte. Ellentmondó

adatokat közöltek más szerzők ebben a tárgyban is; egyesek megerősítik [152, 153],

mások cáfolják [26, 151, 154] az ANCSA és a betegség aktivitása közti korrelációt. A

negatív eredményt közlők közül többen a betegség aktivitását más pontrendszerekkel

kvantifikálták, például az ECLAM (European Consensus Lupus Activity Measurement)

vagy a SLAM (Systemic Lupus Activity Measure) értékeket figyelembe véve [26, 151].

Érdekes, hogy ezek között a jelen dolgozatban megfogalmazott eredményekkel

ellentmondani látszó vizsgálatok között olyan is van, amely során ugyanazt a vizsgálati

módszert és reagenseket használták a szerzők [26], mint vizsgálatunk során. Ennek az

ellentmondásnak a magyarázatául ismét az eltérő betegségaktivitási-pontrendszerek

alkalmazása hozható fel.

A nukleoszómák és az ellenük termelődő antitestek, valamint a nukleoszómák

eltávolításában szerepet játszó DNáz a keringésben dinamikus egyensúlyban vannak.

Egy korábbi publikáció szerint [154] azok a szérumok, amelyekben magas nukleoszóma

antigén koncentrációt találtak, egyben alacsony antinukleoszóma antitest szinttel

rendelkeztek. A szerzők magyarázata szerint a nukleoszóma elleni antitestek az

immunkomlexek képzése révén hozzájárulnak a nukleoszómák keringésből történő

eltávolításához. Az említett tanulmány nem vizsgálja a DNáz enzim aktivitását, amely

ebben a megvilágításban az antinukleoszóma antitestekkel versengve degradálja a

keringésben megtalálható nukleoszómákat. Megfigyelésünk, amely szerint az ANCSA

titerek és a DNáz enzim aktivitása negatív korrelációt mutatnak, ennek a korábban

közölt elméletnek nem mond ellent.

64

A DNáz enzimmel kapcsolatos vizsgálatok összegzéseként elmondható, hogy bár a

DNáz enzim csökkent aktivitása az SLE-nek jellemzője, laboratóriumi paraméterként

nem alkalmas a betegség aktivitásának követésére, vagy veseérintettség előrejelzésére.

A betegségre jellemző gyulladásos folyamatok és az antifoszfolipid antitestek jelenléte a

keringésben az SLE betegeket a trombózis szempontjából magas rizikójú csoportba

helyezik. A különböző tromboembóliás események – mind az artériás, mind a vénás

epizódok – gyakrabban, és fiatalabb korban jelentkeznek az SLE betegek körében.

Mivel a cardiovascularis megbetegedések az európai népesség körében vezető

halálozási okok, nem meglepő, hogy az európai SLE-s populációban is a trombózisokat

találták – az aktív lupusz és az infekciós szövődmények mellett – a leggyakoribb

haláloknak [155].

Az általunk vizsgált SLE betegek körében az artériás és vénás tromboembóliás

események incidenciája 5,4 és 12,4 volt ezer betegévre vetítve. Egy korábbi tanulmány,

amely 625 SLE beteg adatait dolgozta fel, hasonló gyakoriságot talált a vénás

események előfordulásában, de magasabbat az artériás epizódok esetében [145]. Ennek

a különbségnek magyarázata lehet, hogy az említett tanulmányban három különböző

etnikai csoporthoz tartozó betegek szerepeltek, köztük ázsiaiak, afro-amerikaiak, és

kaukázusiak, amíg a mi populációnk kaukázusi betegekből állt. A három különböző

etnikumú SLE-s betegcsoport összehasonlításakor az artériás események

legalacsonyabb, és a vénás események legmagasabb előfordulási arányát a három közül

a 227 kaukázusi betegből álló csoportban mérték. Ezek a gyakoriságok az általunk

megállapítottakhoz hasonlóak voltak.

Az általunk vizsgált SLE-s csoportból a betegek 21 %-ának volt már valamilyen

formában trombózisa. Hasonló etnikai, nem- és korösszetételű betegcsoporttal végzett

felmérések ezt a hányadot 20 és 37 % között mérték [156, 157]. Egy 1000 európai SLE-

s beteg adatait elemző vizsgálat során a 10 éves követési idő alatt a betegek 9,2 %-a

esett át trombózison [155]. A trombózison átesett betegeink átlagos életkora az epizód

bekövetkeztekor az artériás illetve vénás trombózisok esetében is alacsonyabb volt (40,1

és 33,1 év; sorrendben), mint az általános populációban tapasztalt [158, 159], de nem

különbözött az antifoszfolipid szindrómás populációban mérttől (35,0 és 34,5 év;

sorrendben) [160].

65

Egy eset kivételével minden trombózison átesett betegnél találtunk kimutatható

kockázati tényezőt, vagy tényezőket. Így megállapíthatjuk, hogy a tromboembóliás

rizikófaktorokkal rendelkezők körében jóval magasabb volt a trombózis incidenciája

(25,5 per 1000 betegév), mint a kockázati tényezővel nem rendelkezők esetében (2 per

1000 betegév). Ez utóbbi adat hozzávetőleg egyező a normál populációra jellemző

értékkel.

Külön-külön megvizsgálva az egyes trombofíliára hajlamosító tényezőket,

megállapítottuk, hogy az SLE-s populációban ezek közül a legnagyobb mértékben az

antifoszfolipid antitestek jelenléte járul hozzá a tromboembóliás események

előidézéséhez.

Megállapítottuk, hogy az SLE-s betegek több mint egyharmadának a plazmájában

kimutatható lupus anticoaguláns aktivitás, illetve a betegek 17-26 %-ának mintájában

jelen vannak a különböző szilárd fázisú módszerrel vizsgált antifoszfolipid antitestek.

Ezek az arányok nem térnek el a mások által korábban megállapítottaktól [156, 157,

161-169]. Azok a betegek, akiknek a keringésében ezek közül az antitestek közül

valamelyik megtalálható, a tromboembóliás események bekövetkezésére 4-8-szoros

kockázattal élnek SLE-s betegtársaikhoz képest.

Az antitestek közül az anti-ß2-glikoprotein I, az anti-cardiolipin, a lupus antikoaguláns,

illetve ezek együttes előfordulása jelentette a legmagasabb kockázatot a trombózis

kialakulására. Ezzel szemben az anti-protrombin antitestek csak mérsékelt hatást

mutattak. A cardiolipin és ß2-GPI elleni antitestek és a trombózis kialakulásának

kapcsolatát többen bizonyították, és az anti-protrombin antitest pozitivitás alacsonyabb

klinikai értékéről is található már adat [168, 169].

Amennyiben az anti-foszfolipidekhez más kockázati tényezők is járulnak ez a kockázat

tovább emelkedhet. Azon betegek közül, akiknek az esetében az antifoszfolipid

antitestek egyetlen kimutatott kockázati tényezőként jelentkeztek, 30 %-nak volt

trombózisa, míg azok közül, akinek az esetében további rizikófaktorok is kimutathatóak

voltak, 50 % ez az arány. Azon betegek közül, akiknél semmilyen rizikófaktort nem

tudtunk detektálni, mindössze egy személynek volt trombózisa, szemben a csupán

antifoszfolipid antitesttel rendelkezők 30 %-ával. Ez az összehasonlítás is az

antifoszfolipid antitestek erős trombózis kialakulását elősegítő hatását mutatja.

Alátámasztandó az antifoszfolipidek jelentőségét a trombózis kialakulása során, illetve

66

az egyes kockázati tényezők együttes hatásának erejét, mérlegeljük azt, hogy az

antifoszfolipid antitestek az emelkedett homocisztein vagy VIII-as faktor szinthez,

illetve APC rezisztenciához társulva 2-5-szörösre emelik az adott rizikófaktorral együtt

élő betegek körében a trombózison átesettek arányát.

Pontosan a foszfolipidek elleni antitestek erős hatása miatt a többi vizsgált kockázati

tényező esetében az SLE-s populáción belül nem tudtuk alátámasztani azoknak a teljes

populációban jelentős tromboembóliás kockázatot jelentő hatását. Példaként

megemlíthető, hogy számításaink alapján az APA negatív SLE-sek körében a Leiden-

mutáció többszörös kockázati tényezőnek bizonyult (OR=7,25 CI95%=1,00-52,34;

RR=5,17 CI95%=1,18-22,61), ez jól látszik a viszonylag alacsony elemszám miatti tág

konfidencia-intervallum ellenére is; ezzel szemben az APA pozitívak körében ez a hatás

teljesen elhanyagolhatónak mutatkozott (OR=1,36 CI95%=0,17-10,84; RR=1,18

CI95%=0,41-3,39).

Az általunk vizsgált SLE-s betegcsoportban az FV Leiden és protrombin G20210A

mutációk előfordulási gyakorisága hasonló volt a magyarországi népességen végzett

egyéb tanulmányok eredményeihez [100-102]. Érdekes megjegyezni, hogy a Leiden

mutáció gyakorisága hazánkban az európai átlagnál magasabb. A két említett mutáció

elterjedését leíró vizsgálatok azt az érdekes eredményt hozták, miszerint a Leiden

mutáció Európában északról dél felé, és nyugatról kelet felé egyre nagyobb előfordulási

gyakoriságot mutat, míg a protrombin mutáció kiemelkedően magas elterjedtségét az

Ibériai-félsziget népességében írták le [98, 170].

Emelkedett (150 % feletti) FVIII szintet a trombózison átesett betegeink körében

mintegy kétszer gyakrabban találtunk, mint a trombózistól mentes SLE-s betegek közt

(32 és 17 %). Hasonló arányt, de valamivel alacsonyabb előfordulást (25 és 11 %) közöl

egy korábbi tanulmány 301-301 az átlagpopulációból kiválasztott trombózisos beteg és

egészséges kontroll személy vizsgálata után [111].

Mérsékelten emelkedett homocisztein szinteket a trombózisos és attól mentes betegeink

27 és 17 %-ánál találtunk. Egy korábbi, az átlagpopuláció hasonló csoportjainak Hcy

szintjét összehasonlító vizsgálat 29 és 12 %-ot állapított meg [171]. Bár több adat

született arról, hogy SLE-ben a betegek plazma Hcy szintje magasabb, mint az

egészséges kontrolloké, van olyan vizsgálat, amely kiemeli, hogy az SLE-s betegeknek

67

csupán a kardiovaszkuláris megbetegedésekkel küzdő csoportjának értékei emelkednek

szignifikánsan a normál populációban mért szintek fölé [172].

Mivel a különböző deficienciák, amelyek a trombózis kialakulását előidézik, a

koagulációs rendszer más-más elemét érintik, eltérő lehet a hozzájuk kötődő

tromboembóliás epizód klinikai képe is. Például, a négy heterozigóta FV-Leiden-

mutációt hordozó beteg, akiknek volt már trombózisa, minden esetben vénás

tromboembólián esett át. Ezzel szemben az az öt beteg, akiknél emelkedett

homocisztein szint és lupus anticoaguláns együttes előfordulását találtuk a trombózis

hátterében, három artériás és négy vénás epizódot is elszenvedett. Ez utóbbi betegeknél

az artériás trombózis relatív kockázata magasabb volt, mint a vénás eseményeké

(OR=9,1 CI95%= 1,74-47,5 illetve 5,11 CI95%=1,21-21,53; RR=6,4 CI95%=1,82-22,51

illetve 3,28 CI95%=1,35-7,98). Az antifoszfolipidekkel összefüggésben viszont

megállapíthatjuk, hogy nem volt eltérés az APA pozitív és APA negatív csoportok

között az artériás és vénás epizódok eloszlásában.

Két olyan beteget találtunk, akiknél szuperficiális thrombophlebitis alakult ki.

Mindkettejük esetében a lupus anticoaguláns volt az egyetlen kimutatható trombózisra

hajlamosító tényező. Bár ez a rendellenesség gyakran jelentkezik gyulladásos

állapotokkal együtt, az említett két betegnek a thrombophlebitis kialakulásának idején

inaktív volt az SLE-je.

Egy fiatal nőbetegünknél, akinek tromboembóliás rizikófaktora a magas

koncentrációban jelenlévő összes vizsgált antifoszfolipid-antitest és a lupus

anticoaguláns volt, agyi vénás sinus trombózis alakult ki. Korábbi esetek ismertek az

irodalomban, ahol fiatal betegek agyi sinusában fellépő tromboembólia hátterében a

lupus anticoaguláns áll [173, 174].

A vizsgált betegcsoportban bekövetkezett tromboembóliás események körülbelül

harmada (az artériás események 25 %-a, a vénás epizódok 35,3 %-a) az SLE

diagnózisát követő két éven belül következett be. További egyharmad (az artériás

események 37,5 %-a, a vénás epizódok 29,4 %-a) a diagnózist követő második és

tizedik év között, míg a fennmaradó harmad (az artériás események 37,5 %-a, a vénás

epizódok 35,3 %-a) következett be a betegség tizedik éve után. Ezek az adatok arra

utalnak, hogy a tromboembóliák – mind az artériás, mind a vénás események – az SLE

korai manifesztációi közé tartoznak.

68

Ismert, hogy a gyulladást- és trombocitaaktivációt gátló készítmények - mint az acetil-

szalicilsav származékai - egyben a trombóziskészséget is mérsékelik, mivel gátolják a

trombociták aggregációjához vezető jelátviteli útvonalakat. Ilyen hatása volna az

aktiváló Fcγ receptorokat gátló vegyületeknek is.

Az Fc receptorokra vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint a

peptidkonjugátumok koncentrációfüggő módon, egymástól eltérő, és az

immunkomplexektől elmaradó mértékben képesek kötődni a receptorokhoz és kiváltani

monocita effektor funkciókat, mint például a gyulladásos citokinek termelése.

A peptidek konjugálatlan, szabad formában nem gátolták sem az immunkomplexek

FcR-okhoz való kötődését, sem a sejtek FcR közvezítette IL-6 termelését. Egyedül a

TNFα termelést voltunk képesek gátolni az IgG Fc régiójából származó peptidekkel.

69

ÖSSZEFOGLALÁS

A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség, fontos jellemzője - az

egész szervezetre kiterjedő gyulladásos állapot mellett - számos patogén autoantitest

termelődése. Kutatómunkám során kiemelkedő figyelmet fordítottam az autoantitestek

kimutatásával összefüggő laboratóriumi vizsgálatokra, mivel ezen ellenanyagok

megjelenésének és a kórfolyamatokban betöltött szerepének hátterében álló folyamatok

még nem teljesen tisztázottak. Munkám részeként olyan teszteket is elemeztem és

értékeltem, amelyektől várható volt, hogy eredményesen alkalmazhatóak lesznek az

SLE rutin diagnosztikájában.

Megvizsgáltam: 1) a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, ennek

jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi manifesztációinak – elsősorban a lupus

nephritis – megjelenésében 2) az összefüggést a betegek DNáz aktivitása és a szérum

antinukleoszóma antitest szintje között 3) az antifoszfolipid antitestek megjelenését az

SLE-s populációban és ezek összefüggését a tromboembóliás epizódok

bekövetkeztével. 4) az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és az

ezek hátterében álló, az SLE-től független tromboembóliás kockázati tényezőket 5)

annak lehetőségét, a sejtfelszíni Fc receptorok blokkolásával gátolhatóak-e az antitestek

és immunkomplexeik által közvetített effektor funkciók az autoimmun betegségek,

elsősorban az SLE kezelésében.

Eredményeim szerint, az SLE-s betegek szérumában a nem autoimmun betegekéhez

képest szignifikánsan alacsonyabb a DNáz enzim aktivitása. Ez azonban nem áll

összefüggésben a betegség aktivitásával, vagy a betegség során kialakuló

vesekárosodással, ezért nincs klinikai jelentősége a betegek követése során.

A DNáz aktivitás negatív korrelációt mutat a betegek antinukleoszóma antitest

szintjével. Ez a megfigyelés alátámasztja azt az elképzelést, amely szerint a DNáz

enzim csökkent működése hozzájárul a DNS, nukleoszóma, illetve más

kromatinstruktúrák elleni tolerancia áttörésében, és az autoimmun folyamatok

megjelenésében.

A vizsgált SLE-s betegcsoportban mintegy tízszer gyakoribbnak találtam a trombózis

incidenciáját az áltagnépességhez viszonyítva. Kimutattam, hogy SLE-ben elsősorban a

70

betegek több mint harmadának plazmájában kimutatható antifoszfolipid antitestek

megjelenése vezet ehhez a kiemelkedő tromboembóliás rizikóhoz.

A klasszikus, jobbára öröklött trombofília tényezők az antifoszfolipid antitestek mellett

csak mérsékelten járultak hozzá a trombózisok kialakulásához, ezért a trombofília

vizsgálatok rutinszerű bevezetése a tromboembóliás tünetektől mentes autoimmun

betegeknél nem indokolt.

Az Fc receptorokra vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint

peptidkonjugátumokkal kiválthatók monocita effektor funkciók. Konjugálatlan,

monomer formában azonban a peptidek nem gátolták sem az immunkomplexek FcR-

okhoz való kötődését, sem a sejtek FcR közvetítette IL-6 termelését, viszont gátló

hatással voltak a TNFα termelésre. Az általunk vizsgált peptidpreparátumoknak ebben a

formában nincs farmakológiai jelentőségük.

71

IRODALOMJEGYZÉK

1. Johnson, A.E., et al., The prevalence and incidence of systemic lupus

erythematosus in Birmingham, England. Relationship to ethnicity and country of birth. Arthritis Rheum, 1995. 38(4): p. 551-8.

2. Stahl-Hallengren, C., et al., Incidence studies of systemic lupus erythematosus in Southern Sweden: increasing age, decreasing frequency of renal manifestations and good prognosis. J Rheumatol, 2000. 27(3): p. 685-91.

3. Uramoto, K.M., et al., Trends in the incidence and mortality of systemic lupus erythematosus, 1950-1992. Arthritis Rheum, 1999. 42(1): p. 46-50.

4. Hopkinson, N.D., M. Doherty, and R.J. Powell, The prevalence and incidence of systemic lupus erythematosus in Nottingham, UK, 1989-1990. Br J Rheumatol, 1993. 32(2): p. 110-5.

5. Cooper, G.S., et al., Differences by race, sex and age in the clinical and immunologic features of recently diagnosed systemic lupus erythematosus patients in the southeastern United States. Lupus, 2002. 11(3): p. 161-7.

6. Hart, H.H., R.R. Grigor, and D.E. Caughey, Ethnic difference in the prevalence of systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis, 1983. 42(5): p. 529-32.

7. Sarzi-Puttini, P., et al., Drug-induced lupus erythematosus. Autoimmunity, 2005. 38(7): p. 507-18.

8. Stratton, M.A., Drug-induced systemic lupus erythematosus. Clin Pharm, 1985. 4(6): p. 657-63.

9. James, J.A., et al., An increased prevalence of Epstein-Barr virus infection in young patients suggests a possible etiology for systemic lupus erythematosus. J Clin Invest, 1997. 100(12): p. 3019-26.

10. Dror, Y., et al., Systemic lupus erythematosus associated with acute Epstein-Barr virus infection. Am J Kidney Dis, 1998. 32(5): p. 825-8.

11. Gross, A.J., et al., EBV and systemic lupus erythematosus: a new perspective. J Immunol, 2005. 174(11): p. 6599-607.

12. Gergely, P., Jr., et al., Increased prevalence of transfusion-transmitted virus and cross-reactivity with immunodominant epitopes of the HRES-1/p28 endogenous retroviral autoantigen in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Immunol, 2005. 116(2): p. 124-34.

13. Zandman-Goddard, G. and Y. Shoenfeld, Infections and SLE. Autoimmunity, 2005. 38(7): p. 473-85.

14. Cutolo, M., et al., Sex hormones influence on the immune system: basic and clinical aspects in autoimmunity. Lupus, 2004. 13(9): p. 635-8.

15. Rider, V. and N.I. Abdou, Gender differences in autoimmunity: molecular basis for estrogen effects in systemic lupus erythematosus. Int Immunopharmacol, 2001. 1(6): p. 1009-24.

16. Petri, M., Exogenous estrogen in systemic lupus erythematosus: oral contraceptives and hormone replacement therapy. Lupus, 2001. 10(3): p. 222-6.

17. Lahita, R.G., The role of sex hormones in systemic lupus erythematosus. Curr Opin Rheumatol, 1999. 11(5): p. 352-6.

18. Ostensen, M., Sex hormones and pregnancy in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Ann N Y Acad Sci, 1999. 876: p. 131-43; discussion 144.

72

19. Tan, E.M., et al., The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1982. 25(11): p. 1271-7.

20. Bombardier, C., et al., Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. The Committee on Prognosis Studies in SLE. Arthritis Rheum, 1992. 35(6): p. 630-40.

21. Blatt, N.B. and G.D. Glick, Anti-DNA autoantibodies and systemic lupus erythematosus. Pharmacol Ther, 1999. 83(2): p. 125-39.

22. Burlingame, R.W. and R. Cervera, Anti-chromatin (anti-nucleosome) autoantibodies. Autoimmun Rev, 2002. 1(6): p. 321-8.

23. Pisetsky, D.S., Antibody responses to DNA in normal immunity and aberrant immunity. Clin Diagn Lab Immunol, 1998. 5(1): p. 1-6.

24. Tozzoli, R., et al., Guidelines for the laboratory use of autoantibody tests in the diagnosis and monitoring of autoimmune rheumatic diseases. Am J Clin Pathol, 2002. 117(2): p. 316-24.

25. von Muhlen, C.A. and E.M. Tan, Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum, 1995. 24(5): p. 323-58.

26. Cairns, A.P., et al., Antinucleosome antibodies in the diagnosis of systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis, 2003. 62(3): p. 272-3.

27. Amoura, Z., et al., Presence of antinucleosome autoantibodies in a restricted set of connective tissue diseases: antinucleosome antibodies of the IgG3 subclass are markers of renal pathogenicity in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 2000. 43(1): p. 76-84.

28. Amoura, Z., S. Koutouzov, and J.C. Piette, The role of nucleosomes in lupus. Curr Opin Rheumatol, 2000. 12(5): p. 369-73.

29. Tang, S., S.L. Lui, and K.N. Lai, Pathogenesis of lupus nephritis: an update. Nephrology (Carlton), 2005. 10(2): p. 174-9.

30. Kewalramani, R. and A.K. Singh, Immunopathogenesis of lupus and lupus nephritis: recent insights. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2002. 11(3): p. 273-7.

31. Houssiau, F.A., Management of lupus nephritis: an update. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(10): p. 2694-704.

32. Font, J., et al., Clusters of clinical and immunologic features in systemic lupus erythematosus: analysis of 600 patients from a single center. Semin Arthritis Rheum, 2004. 33(4): p. 217-30.

33. Brugos, B., et al., Retrospective analysis of patients with lupus nephritis: data from a large clinical immunological center in hungary. Scand J Immunol, 2006. 64(4): p. 433-7.

34. Van Bruggen, M.C., C. Kramers, and J.H. Berden, Autoimmunity against nucleosomes and lupus nephritis. Ann Med Interne (Paris), 1996. 147(7): p. 485-9.

35. Spronk, P.E., et al., Anti-dsDNA production coincides with concurrent B and T cell activation during development of active disease in systemic lupus erythematosus (SLE). Clin Exp Immunol, 1996. 104(3): p. 446-53.

36. Herrmann, M., et al., What triggers anti-dsDNA antibodies? Mol Biol Rep, 1996. 23(3-4): p. 265-7.

37. Bruns, A., et al., Nucleosomes are major T and B cell autoantigens in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 2000. 43(10): p. 2307-15.

38. Berden, J.H., et al., Lupus nephritis: a nucleosome waste disposal defect? J Nephrol, 2002. 15 Suppl 6: p. S1-10.

73

39. Walport, M.J., Lupus, DNase and defective disposal of cellular debris. Nat Genet, 2000. 25(2): p. 135-6.

40. Suck, D. and C. Oefner, Structure of DNase I at 2.0 A resolution suggests a mechanism for binding to and cutting DNA. Nature, 1986. 321(6070): p. 620-5.

41. MacLea, K.S., R.J. Krieser, and A. Eastman, Revised structure of the active form of human deoxyribonuclease IIalpha. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 292(2): p. 415-21.

42. Chitrabamrung, S., R.L. Rubin, and E.M. Tan, Serum deoxyribonuclease I and clinical activity in systemic lupus erythematosus. Rheumatol Int, 1981. 1(2): p. 55-60.

43. Lachmann, P.J., Lupus and desoxyribonuclease. Lupus, 2003. 12(3): p. 202-6. 44. Napirei, M., et al., Features of systemic lupus erythematosus in Dnase1-deficient

mice. Nat Genet, 2000. 25(2): p. 177-81. 45. Macanovic, M., et al., The treatment of systemic lupus erythematosus (SLE) in

NZB/W F1 hybrid mice; studies with recombinant murine DNase and with dexamethasone. Clin Exp Immunol, 1996. 106(2): p. 243-52.

46. Lachmann, P.J., Experimental aspects of systemic lupus erythematosus. Proc R Soc Med, 1967. 60(5): p. 464-5.

47. Davis, J.C., Jr., et al., Recombinant human Dnase I (rhDNase) in patients with lupus nephritis. Lupus, 1999. 8(1): p. 68-76.

48. Yasutomo, K., et al., Mutation of DNASE1 in people with systemic lupus erythematosus. Nat Genet, 2001. 28(4): p. 313-4.

49. Sullivan, K.E., Genetics of systemic lupus erythematosus. Clinical implications. Rheum Dis Clin North Am, 2000. 26(2): p. 229-56, v-vi.

50. Wong, M. and B.P. Tsao, Current topics in human SLE genetics. Springer Semin Immunopathol, 2006.

51. Harley, J.B., et al., The genetics of human systemic lupus erythematosus. Curr Opin Immunol, 1998. 10(6): p. 690-6.

52. Vyse, T.J. and B.L. Kotzin, Genetic susceptibility to systemic lupus erythematosus. Annu Rev Immunol, 1998. 16: p. 261-92.

53. Schur, P.H., Genetics of systemic lupus erythematosus. Lupus, 1995. 4(6): p. 425-37.

54. Atkinson, J.P., Complement activation and complement receptors in systemic lupus erythematosus. Springer Semin Immunopathol, 1986. 9(2-3): p. 179-94.

55. Walport, M.J., K.A. Davies, and M. Botto, C1q and systemic lupus erythematosus. Immunobiology, 1998. 199(2): p. 265-85.

56. Jonsen, A., et al., Analysis of HLA DR, HLA DQ, C4A, FcgammaRIIa, FcgammaRIIIa, MBL, and IL-1Ra allelic variants in Caucasian systemic lupus erythematosus patients suggests an effect of the combined FcgammaRIIa R/R and IL-1Ra 2/2 genotypes on disease susceptibility. Arthritis Res Ther, 2004. 6(6): p. R557-62.

57. Truedsson, L., et al., Sharing of MHC haplotypes among patients with systemic lupus erythematosus from unrelated Caucasian multicase families: disease association with the extended haplotype [HLA-B8, SC01, DR17]. J Rheumatol, 1995. 22(10): p. 1852-61.

58. Mok, C.C. and C.S. Lau, Pathogenesis of systemic lupus erythematosus. J Clin Pathol, 2003. 56(7): p. 481-90.

74

59. Tsutsumi, A., R. Takahashi, and T. Sumida, Mannose binding lectin: genetics and autoimmune disease. Autoimmun Rev, 2005. 4(6): p. 364-72.

60. Garred, P., et al., Association of mannose-binding lectin gene variation with disease severity and infections in a population-based cohort of systemic lupus erythematosus patients. Genes Immun, 2001. 2(8): p. 442-50.

61. Seelen, M.A., et al., A role for mannose-binding lectin dysfunction in generation of autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Rheumatology (Oxford), 2005. 44(1): p. 111-9.

62. Ohlenschlaeger, T., et al., Mannose-binding lectin variant alleles and the risk of arterial thrombosis in systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 2004. 351(3): p. 260-7.

63. Berken, A. and B. Benacerraf, Properties of antibodies cytophilic for macrophages. J Exp Med, 1966. 123(1): p. 119-44.

64. Ravetch, J.V. and S. Bolland, IgG Fc receptors. Annu Rev Immunol, 2001. 19: p. 275-90.

65. Daeron, M., Fc receptor biology. Annu Rev Immunol, 1997. 15: p. 203-34. 66. Takai, T., Roles of Fc receptors in autoimmunity. Nat Rev Immunol, 2002. 2(8):

p. 580-92. 67. Hogarth, P.M., Fc receptors are major mediators of antibody based

inflammation in autoimmunity. Curr Opin Immunol, 2002. 14(6): p. 798-802. 68. Manger, K., et al., Fcgamma receptor IIa, IIIa, and IIIb polymorphisms in

German patients with systemic lupus erythematosus: association with clinical symptoms. Ann Rheum Dis, 2002. 61(9): p. 786-92.

69. Hazenbos, W.L., et al., Impaired IgG-dependent anaphylaxis and Arthus reaction in Fc gamma RIII (CD16) deficient mice. Immunity, 1996. 5(2): p. 181-8.

70. Stefanescu, R.N., et al., Inhibitory Fc gamma receptors: from gene to disease. J Clin Immunol, 2004. 24(4): p. 315-26.

71. Taylor, S.M., et al., Thrombosis and shock induced by activating antiplatelet antibodies in human Fc gamma RIIA transgenic mice: the interplay among antibody, spleen, and Fc receptor. Blood, 2000. 96(13): p. 4254-60.

72. Egeberg, O., Inherited Antithrombin Deficiency Causing Thrombophilia. Thromb Diath Haemorrh, 1965. 13: p. 516-30.

73. Chowdhury, V., et al., Homozygous antithrombin deficiency: report of two new cases (99 Leu to Phe) associated with arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost, 1994. 72(2): p. 198-202.

74. Kuhle, S., et al., Homozygous antithrombin deficiency type II (99 Leu to Phe mutation) and childhood thromboembolism. Thromb Haemost, 2001. 86(4): p. 1007-11.

75. Perry, D.J. and R.W. Carrell, Molecular genetics of human antithrombin deficiency. Hum Mutat, 1996. 7(1): p. 7-22.

76. Tait, R.C., et al., Prevalence of antithrombin deficiency in the healthy population. Br J Haematol, 1994. 87(1): p. 106-12.

77. Bucciarelli, P., et al., Risk of venous thromboembolism and clinical manifestations in carriers of antithrombin, protein C, protein S deficiency, or activated protein C resistance: a multicenter collaborative family study. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999. 19(4): p. 1026-33.

75

78. Harper, P.L., et al., The incidence of dysfunctional antithrombin variants: four cases in 210 patients with thromboembolic disease. Br J Haematol, 1991. 77(3): p. 360-4.

79. Bayston, T.A. and D.A. Lane, Antithrombin: molecular basis of deficiency. Thromb Haemost, 1997. 78(1): p. 339-43.

80. Lane, D.A., et al., Antithrombin mutation database: 2nd (1997) update. For the Plasma Coagulation Inhibitors Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost, 1997. 77(1): p. 197-211.

81. Griffin, J.H., et al., Deficiency of protein C in congenital thrombotic disease. J Clin Invest, 1981. 68(5): p. 1370-3.

82. Schwarz, H.P., et al., Plasma protein S deficiency in familial thrombotic disease. Blood, 1984. 64(6): p. 1297-300.

83. Comp, P.C., et al., Familial protein S deficiency is associated with recurrent thrombosis. J Clin Invest, 1984. 74(6): p. 2082-8.

84. Broekmans, A.W., J.J. Veltkamp, and R.M. Bertina, Congenital protein C deficiency and venous thromboembolism. A study of three Dutch families. N Engl J Med, 1983. 309(6): p. 340-4.

85. Reitsma, P.H., Protein C deficiency: from gene defects to disease. Thromb Haemost, 1997. 78(1): p. 344-50.

86. Reitsma, P.H., et al., Protein C deficiency: a database of mutations, 1995 update. On behalf of the Subcommittee on Plasma Coagulation Inhibitors of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost, 1995. 73(5): p. 876-89.

87. Millar, D.S., et al., Molecular genetic analysis of severe protein C deficiency. Hum Genet, 2000. 106(6): p. 646-53.

88. Aiach, M., et al., Protein C and protein S deficiencies. Semin Hematol, 1997. 34(3): p. 205-16.

89. Gandrille, S., et al., Protein S deficiency: a database of mutations--summary of the first update. Thromb Haemost, 2000. 84(5): p. 918.

90. Miletich, J., L. Sherman, and G. Broze, Jr., Absence of thrombosis in subjects with heterozygous protein C deficiency. N Engl J Med, 1987. 317(16): p. 991-6.

91. Dykes, A.C., et al., A study of Protein S antigen levels in 3788 healthy volunteers: influence of age, sex and hormone use, and estimate for prevalence of deficiency state. Br J Haematol, 2001. 113(3): p. 636-41.

92. Seligsohn, U., et al., Homozygous protein C deficiency manifested by massive venous thrombosis in the newborn. N Engl J Med, 1984. 310(9): p. 559-62.

93. Williamson, D., et al., Factor V Cambridge: a new mutation (Arg306-->Thr) associated with resistance to activated protein C. Blood, 1998. 91(4): p. 1140-4.

94. Bertina, R.M., et al., Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature, 1994. 369(6475): p. 64-7.

95. Dahlback, B., M. Carlsson, and P.J. Svensson, Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(3): p. 1004-8.

96. Rosendaal, F.R., et al., High risk of thrombosis in patients homozygous for factor V Leiden (activated protein C resistance). Blood, 1995. 85(6): p. 1504-8.

76

97. Ruggeri, M., et al., Factor V Leiden mutation carriership and venous thromboembolism in polycythemia vera and essential thrombocythemia. Am J Hematol, 2002. 71(1): p. 1-6.

98. Lucotte, G. and G. Mercier, Population genetics of factor V Leiden in Europe. Blood Cells Mol Dis, 2001. 27(2): p. 362-7.

99. Herrmann, F.H., et al., Prevalence of factor V Leiden mutation in various populations. Genet Epidemiol, 1997. 14(4): p. 403-11.

100. Balogh, I., et al., High prevalence of factor V Leiden mutation and 20210A prothrombin variant in Hungary. Thromb Haemost, 1999. 81(4): p. 660-1.

101. Pongracz, E., et al., [Significance of Factor V gene A506G mutation (Leiden) in the pathogenesis of ischemic stroke]. Ideggyogy Sz, 2003. 56(5-6): p. 157-64.

102. Stankovics, J., et al., [Incidence of factor V G1681A (Leiden) mutation in samplings from the Hungarian population]. Orv Hetil, 1998. 139(19): p. 1161-3.

103. Jun, Z.J., et al., Prevalence of factor V Leiden and prothrombin G20210A mutations in Chinese patients with deep venous thrombosis and pulmonary embolism. Clin Lab Haematol, 2006. 28(2): p. 111-6.

104. Pepe, G., et al., Prevalence of factor V Leiden mutation in non-European populations. Thromb Haemost, 1997. 77(2): p. 329-31.

105. Kim, Y.W., et al., Absence of factor V Leiden mutation in Koreans. Thromb Res, 1997. 86(2): p. 181-2.

106. Franco, R.F., et al., The prevalence of factor V Arg306-->Thr (factor V Cambridge) and factor V Arg306-->Gly mutations in different human populations. Thromb Haemost, 1999. 81(2): p. 312-3.

107. Poort, S.R., et al., A common genetic variation in the 3'-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood, 1996. 88(10): p. 3698-703.

108. Bertina, R.M., Elevated clotting factor levels and venous thrombosis. Pathophysiol Haemost Thromb, 2003. 33(5-6): p. 395-400.

109. Ceelie, H., et al., Polymorphisms in the prothrombin gene and their association with plasma prothrombin levels. Thromb Haemost, 2001. 85(6): p. 1066-70.

110. Kyrle, P.A., et al., High plasma levels of factor VIII and the risk of recurrent venous thromboembolism. N Engl J Med, 2000. 343(7): p. 457-62.

111. Koster, T., et al., Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet, 1995. 345(8943): p. 152-5.

112. Cattaneo, M., Hyperhomocysteinemia, atherosclerosis and thrombosis. Thromb Haemost, 1999. 81(2): p. 165-76.

113. Harpel, P.C., X. Zhang, and W. Borth, Homocysteine and hemostasis: pathogenic mechanisms predisposing to thrombosis. J Nutr, 1996. 126(4 Suppl): p. 1285S-9S.

114. Brattstrom, L., et al., Hyperhomocysteinaemia in stroke: prevalence, cause, and relationships to type of stroke and stroke risk factors. Eur J Clin Invest, 1992. 22(3): p. 214-21.

115. Haim, M., et al., Serum Homocysteine and Long-Term Risk of Myocardial Infarction and Sudden Death in Patients with Coronary Heart Disease. Cardiology, 2006. 107(1): p. 52-56.

116. Falcon, C.R., et al., High prevalence of hyperhomocyst(e)inemia in patients with juvenile venous thrombosis. Arterioscler Thromb, 1994. 14(7): p. 1080-3.

77

117. den Heijer, M., et al., Hyperhomocysteinemia as a risk factor for deep-vein thrombosis. N Engl J Med, 1996. 334(12): p. 759-62.

118. Frosst, P., et al., A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet, 1995. 10(1): p. 111-3.

119. Legnani, C., et al., Hyperhomocyst(e)inemia and a common methylenetetrahydrofolate reductase mutation (Ala223Val MTHFR) in patients with inherited thrombophilic coagulation defects. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997. 17(11): p. 2924-9.

120. Schmitz, C., et al., Genetic polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase and myocardial infarction. A case-control study. Circulation, 1996. 94(8): p. 1812-4.

121. Choumenkovitch, S.F., et al., In the cystathionine beta-synthase knockout mouse, elevations in total plasma homocysteine increase tissue S-adenosylhomocysteine, but responses of S-adenosylmethionine and DNA methylation are tissue specific. J Nutr, 2002. 132(8): p. 2157-60.

122. Kelly, P.J., et al., Stroke in young patients with hyperhomocysteinemia due to cystathionine beta-synthase deficiency. Neurology, 2003. 60(2): p. 275-9.

123. Mudd, S.H., et al., Homocystinuria: An Enzymatic Defect. Science, 1964. 143: p. 1443-5.

124. Di Minno, G., et al., Homocysteine, platelet function and thrombosis. Haematologica, 1999. 84 Suppl EHA-4: p. 61-3.

125. Esmon, C.T., The impact of the inflammatory response on coagulation. Thromb Res, 2004. 114(5-6): p. 321-7.

126. Shebuski, R.J. and K.S. Kilgore, Role of inflammatory mediators in thrombogenesis. J Pharmacol Exp Ther, 2002. 300(3): p. 729-35.

127. Giesen, P.L., et al., Blood-borne tissue factor: another view of thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(5): p. 2311-5.

128. Nawroth, P.P. and D.M. Stern, Modulation of endothelial cell hemostatic properties by tumor necrosis factor. J Exp Med, 1986. 163(3): p. 740-5.

129. Bevilacqua, M.P., et al., Interleukin 1 (IL-1) induces biosynthesis and cell surface expression of procoagulant activity in human vascular endothelial cells. J Exp Med, 1984. 160(2): p. 618-23.

130. Eilertsen, K.E. and B. Osterud, Tissue factor: (patho)physiology and cellular biology. Blood Coagul Fibrinolysis, 2004. 15(7): p. 521-38.

131. Rezende, S.M., R.E. Simmonds, and D.A. Lane, Coagulation, inflammation, and apoptosis: different roles for protein S and the protein S-C4b binding protein complex. Blood, 2004. 103(4): p. 1192-201.

132. Espinosa, G., et al., Antiphospholipid syndrome: pathogenic mechanisms. Autoimmun Rev, 2003. 2(2): p. 86-93.

133. Singh, A.K., Immunopathogenesis of the antiphospholipid antibody syndrome: an update. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2001. 10(3): p. 355-8.

134. Field, S.L., et al., Recent insights into antiphospholipid antibody-mediated thrombosis. Baillieres Best Pract Res Clin Haematol, 1999. 12(3): p. 407-22.

135. Rand, J.H., The antiphospholipid syndrome. Annu Rev Med, 2003. 54: p. 409-24.

78

136. Borrell, M., et al., Immunoglobulin fractions isolated from patients with antiphospholipid antibodies prevent the inactivation of factor Va by activated protein C on human endothelial cells. Thromb Haemost, 1992. 68(3): p. 268-72.

137. Mori, T., et al., beta 2-Glycoprotein I modulates the anticoagulant activity of activated protein C on the phospholipid surface. Thromb Haemost, 1996. 75(1): p. 49-55.

138. Rand, J.H., Antiphospholipid antibody-mediated disruption of the annexin-V antithrombotic shield: a thrombogenic mechanism for the antiphospholipid syndrome. J Autoimmun, 2000. 15(2): p. 107-11.

139. Wolberg, A.S. and R.A. Roubey, Mechanisms of autoantibody-induced monocyte tissue factor expression. Thromb Res, 2004. 114(5-6): p. 391-6.

140. Kornberg, A., et al., Induction of tissue factor-like activity in monocytes by anti-cardiolipin antibodies. J Immunol, 1994. 153(3): p. 1328-32.

141. Cuadrado, M.J., et al., Thrombosis in primary antiphospholipid syndrome: a pivotal role for monocyte tissue factor expression. Arthritis Rheum, 1997. 40(5): p. 834-41.

142. Reverter, J.C., et al., Hypercoagulable state in patients with antiphospholipid syndrome is related to high induced tissue factor expression on monocytes and to low free protein s. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1996. 16(11): p. 1319-26.

143. Reverter, J.C., et al., Effects of human monoclonal anticardiolipin antibodies on platelet function and on tissue factor expression on monocytes. Arthritis Rheum, 1998. 41(8): p. 1420-7.

144. Meroni, P.L., et al., Endothelial activation by aPL: a potential pathogenetic mechanism for the clinical manifestations of the syndrome. J Autoimmun, 2000. 15(2): p. 237-40.

145. Mok, C.C., et al., Incidence and risk factors of thromboembolism in systemic lupus erythematosus: a comparison of three ethnic groups. Arthritis Rheum, 2005. 52(9): p. 2774-82.

146. Tew, M.B., et al., A molecular analysis of the low serum deoxyribonuclease activity in lupus patients. Arthritis Rheum, 2001. 44(10): p. 2446-7.

147. Balada, E., et al., DNASE I mutation and systemic lupus erythematosus in a Spanish population: comment on the article by Tew et al. Arthritis Rheum, 2002. 46(7): p. 1974-6; author reply 1976-7.

148. Chakraborty, P., et al., The A/T mutation in exon 2 of the DNASE1 gene is not present in Tunisian patients with systemic lupus erythematosus or in healthy subjects. Arthritis Rheum, 2003. 48(11): p. 3297-8.

149. Simmonds, M.J., et al., A nonsense mutation in exon 2 of the DNase I gene is not present in UK subjects with systemic lupus erythematosus and Graves' disease: Comment on the article by Rood et al. Arthritis Rheum, 2002. 46(11): p. 3109-10.

150. Yeh, T.M., et al., Deoxyribonuclease-inhibitory antibodies in systemic lupus erythematosus. J Biomed Sci, 2003. 10(5): p. 544-51.

151. Benucci, M., et al., Disease activity and antinucleosome antibodies in systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol, 2003. 32(1): p. 42-5.

152. Min, D.J., et al., Anti-nucleosome antibody: significance in lupus patients lacking anti-double-stranded DNA antibody. Clin Exp Rheumatol, 2002. 20(1): p. 13-8.

79

153. Simon, J.A., et al., Anti-nucleosome antibodies in patients with systemic lupus erythematosus of recent onset. Potential utility as a diagnostic tool and disease activity marker. Rheumatology (Oxford), 2004. 43(2): p. 220-4.

154. Amoura, Z., et al., Circulating plasma levels of nucleosomes in patients with systemic lupus erythematosus: correlation with serum antinucleosome antibody titers and absence of clear association with disease activity. Arthritis Rheum, 1997. 40(12): p. 2217-25.

155. Cervera, R., et al., Morbidity and mortality in systemic lupus erythematosus during a 10-year period: a comparison of early and late manifestations in a cohort of 1,000 patients. Medicine (Baltimore), 2003. 82(5): p. 299-308.

156. Brouwer, J.L., et al., The contribution of inherited and acquired thrombophilic defects, alone or combined with antiphospholipid antibodies, to venous and arterial thromboembolism in patients with systemic lupus erythematosus. Blood, 2004. 104(1): p. 143-8.

157. Afeltra, A., et al., Thrombosis in systemic lupus erythematosus: congenital and acquired risk factors. Arthritis Rheum, 2005. 53(3): p. 452-9.

158. Nordstrom, M., et al., A prospective study of the incidence of deep-vein thrombosis within a defined urban population. J Intern Med, 1992. 232(2): p. 155-60.

159. Anderson, F.A., Jr., et al., A population-based perspective of the hospital incidence and case-fatality rates of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. The Worcester DVT Study. Arch Intern Med, 1991. 151(5): p. 933-8.

160. Erkan, D., et al., A cross-sectional study of clinical thrombotic risk factors and preventive treatments in antiphospholipid syndrome. Rheumatology (Oxford), 2002. 41(8): p. 924-9.

161. Shapiro, S.S., The lupus anticoagulant/antiphospholipid syndrome. Annu Rev Med, 1996. 47: p. 533-53.

162. Galli, M. and T. Barbui, Prevalence of different anti-phospholipid antibodies in systemic lupus erythematosus and their relationship with the antiphospholipid syndrome. Clin Chem, 2001. 47(6): p. 985-7.

163. Love, P.E. and S.A. Santoro, Antiphospholipid antibodies: anticardiolipin and the lupus anticoagulant in systemic lupus erythematosus (SLE) and in non-SLE disorders. Prevalence and clinical significance. Ann Intern Med, 1990. 112(9): p. 682-98.

164. Palomo, I., et al., Antiphospholipid antibodies in Chilean patients with systemic lupus erythematosus. J Lab Clin Med, 2002. 140(5): p. 336-41.

165. Radway-Bright, E.L., C.T. Ravirajan, and D.A. Isenberg, The prevalence of antibodies to anionic phospholipids in patients with the primary antiphospholipid syndrome, systemic lupus erythematosus and their relatives and spouses. Rheumatology (Oxford), 2000. 39(4): p. 427-31.

166. Amoroso, A., et al., Safety of conventional drugs and biologic agents for Rheumatoid Arthritis. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2003. 7(5): p. 139-45.

167. Caccavo, D., et al., Raynaud's phenomenon and antiphospholipid antibodies in systemic lupus erythematosus: is there an association? Ann Rheum Dis, 2003. 62(10): p. 1003-5.

168. Sebastiani, G.D., et al., Anticardiolipin and anti-beta2GPI antibodies in a large series of European patients with systemic lupus erythematosus. Prevalence and

80

clinical associations. European Concerted Action on the Immunogenetics of SLE. Scand J Rheumatol, 1999. 28(6): p. 344-51.

169. Gould, T., et al., Prevalence and clinical correlates of anti-phospholipid antibodies in South Africans with systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol, 2006. 35(1): p. 29-34.

170. Rees, D.C., M. Cox, and J.B. Clegg, World distribution of factor V Leiden. Lancet, 1995. 346(8983): p. 1133-4.

171. Simioni, P., et al., Hyperhomocysteinemia and deep-vein thrombosis. A case-control study. Thromb Haemost, 1996. 76(6): p. 883-6.

172. Svenungsson, E., et al., Risk factors for cardiovascular disease in systemic lupus erythematosus. Circulation, 2001. 104(16): p. 1887-93.

173. Levine, S.R., et al., Cerebral venous thrombosis with lupus anticoagulants. Report of two cases. Stroke, 1987. 18(4): p. 801-4.

174. Levy, D.M., et al., Thromboembolism in paediatric lupus patients. Lupus, 2003. 12(10): p. 741-6.

81

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés témájában megjelent közlemények Scandinavian Journal of Rheumatology: Thrombosis Risk in Systemic Lupus Erythematosus: the Role of Thrombophilia Risk Factors (accepted for publication) Sallai K, Nagy E, Bodó I, Mohl A, Gergely P Clin Diagn Lab Immunol. 2005 Jan;12(1):56-9.: Antinucleosome antibodies and decreased deoxyribonuclease activity in sera of patients with systemic lupus erythematosus Sallai K, Nagy E, Derfalvy B, Muzes G, Gergely P Eur J Immunol. 2004 Apr;34(4):1127-35.: Functional mapping of the Fc gamma RII binding site on human IgG1 by synthetic peptides Medgyesi D, Uray K, Sallai K, Hudecz F, Koncz G, Abramson J, Pecht I, Sarmay G, Gergely J Az értekezés témájához kapcsolódó, de abban nem szereplő közlemény Magyar Immunológia 3, 16-21 (2004): SS-A(Ro) és SS-B(La) autoantitestek előfordulása szisztémás lupus erythematosusban Sallai K, Nagy E, Gergely P.

82

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Tisztelettel köszönöm Prof. Gergely Péternek, téma- és programvezetőmnek, valamint

Prof. Mandl Józsefnek, a Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola vezetőjének a

lehetőséget a doktori munkám és dolgozatom elkészítésére.

Hálásan köszönöm dr. Nagy Eszter és dr. Bodó Imre áldozatos segítségét, számos

tanácsát és állandó támogatását közös munkánk során.

Sokszor köszönöm Berczeliné Sarus Renáta, Benák Tiborné, Homályné Herbály

Mária, Kissné Szabó Katalin, Móricz Gyöngyi, Nagy Edit, Pósa Zsolt, dr. Szabó Teréz,

Szegedi Sándorné, dr. Szilágyi Jánosné, a SE Központi Immunológiai Laboratórium

dolgozóinak - nem csupán szakmai – segítségét,

valamint dr. Mohl Adrienn Ph.D. hallgatónak segítségét és barátságát.

Nagy szeretettel köszönöm szüleim és egész családom megértő támogatását.

Köszönettel tartozom továbbá az etiópiai és brazil kávétermesztőknek, akik nélkül

dolgozatom sosem készült volna el.