Epoj6 BOJHOCAHMTETCKH CTpaHa 733

UDC543.545:[616-074:577.1

Kapilarna elektroforeza - nov metodoloskipristup analizi niolekula i izazov za

biohemicare

Gordana

Vojnomedicinska akademija, Institut za medicinska Jstraiivanja. Beograd

elektroforeza, kapilarna; hemija, klinit^ka; hemija,analiticka; hemija, klinicka, testovi; telesne te^nosti.

K e y w o r d s : electrophoresis, capillary; chemistry, clinical;chemistry, analytical; clinical chemistry tests; bodyfluids.

Uvod

Kapilarna eleklroforeza (KE) obuhvata skup analitiC-kih posiupaka razliCitih operativnih i separacionih karakteri-stika. Ovaj novi naCin razdvajanja i odredivanja kompone-nata iz smeSe koristi elektriCno polje uspostavljeno u kapila-ri. lako je jo§ krajem Sezdeselih godina opisan prvi niCnoizraden sistem za KE sa kvarcnom kapilarom unutraSnjegdijametra 1 do 3 mm (1), pravi razvoj ove nove metodologi-je zapoCinje pre dvadeseiak godina upotrebom ruCno izrade-nih staklenih kapilara manjeg promera i radovima Jorgenseni Lukacsa (2). Unapredenju analitii^kih mogucnosti KE po-sebno je doprinela pojava industrijski proizvedenih elastiC-nih kapilara od siopljenog silikata sa spoljne strane obloi^e-nih puliimidnim siojem. Komercijaino dostupni. industrijskiproizvedeni slstemi za izvodenje elektroforeze u kapilaramaunutraSnjeg dijametra manjeg od 100 \im pojavili su se predesetak godina dovodeci postepeno do ekspanzije ove anali-ti^kc tehnikc u razne oblasti.

Po svemu sudeci kapilara daje nov format kretanju ie-stica u elektri£nom polju i ( ini da se pomocu KE mogu raz-dvajaii male i velike molekule, kako naelektrisane, tako ione bez neto naelektrisanja (3). Ova problemalika je posled-njih godina polje brojnih eksperimentnih istraiivanja, ali iteorijskih razmatranja (2,4-9). Ona su doprinela boljem po-znavanJLi ovog novog analitiCkog postupka i detaljnijem de-finisanju brojnih faktora bitnih za etektroforezno razdvaja-nja pojedinih komponenata u kapilari. Od poietnih radova

Jorgensen i Lukacsa (2) osamdesetih godina broj publikaci-ja o kapilamoj elektroforezi raste eksponencijaino (I)- a po-slednjih godina godiSnje se publikuje oko ! 500 radova po-svedenih ovoj problematici (10 }. Mada ce tek vreme poka-zati prave mogucnosti i analiii£ki zna£aj KE, predvida se dace ona biti glavni separacioni princip u bududnosti i ubrajase u tehnologije 21 veka. OCekuje se da ce ona postati bitananaliti^ki postupak u istra^iva^kim i klini(^kim laboratorija-ma, u prvom redu medicinsko-biohemijskim, molekulsko-bioIoSkim i toksikoloSkim. Medutim, ona se jo§ uvek najvi-5e koristi u odredivanju Cistih supstanci Hi analizi smeSamanjeg broja komponenata (1). NaroCito je veliki broj pu-blikacija o njenoj primeni u analizi iekova, bilo pri odredi-vanju aktivnih komponenata ili oneiiScenja, ali i njihovomodredivanju u bioloSkom materijalu pri farmakoloSkim. tok-sikoloSkim i forenziCnim ispitivanjima {8. 11-16). Madavec skoro deset godina KE predstavija anaiiliiko sredstvokoje obecava da ce zameniti mnoge konvencionalne kiiniC-ko-Iaboratorijske metode, u prvom redu elektroforezu i teC-nu hromatografiju (3), analiza bioloSkog materijala je jo5povezana sa ozbiljnim analitiCkim problemima uzrokova-nim prisustvom velikog broja razliCitih vrsta jonizovanih ijonizabilnih grupa, kvantiiatjvno zastupljenih u razliCitimkoncentracijama i koliCinama (1, 17-19). Poslednjih godinasu intenzivirani napori da se KE viSe koristi u analizi biolo-5kih teCnosti (20-23). Razvoj i primena razliCitih tipova KE(slobodna zonska, izotahoforeza, izoelektriCno fokusiranje ukapilari, miceiama elektrokinetiCka kapilama hromatografi-

lumc G. Vojnosanit Pregl 2003; 60(6): 733-739.

Cxpana 734 BOJHOCAHI Epo)6

ja i dr) proSirila su mogucnosti analize kretanja £estica uclektriinom polju. Do sada je razvijen veliki broj postupakaza odredivanje proteina (6, 24. 25) i nuklcinsklh kisclina(26, 27), mada su pri elektroforezi u kapilari probiemi jon-skih interakcija jo5 uvek predmet prouCavanja (28. 29). Da-nas posiojc i komercijaino dostupni sistemi za analizu ovihmakromolekula zasnovanih na separacionim principima KE.lma pokuSaja da se KE koristi i u analizi lipoproteina (21).a)i i u scparaciji, idcntifikaciji i karakterizaciji mikruurgani-zma (30). S druge slranc, koriScenje KE u analizi malih mo-lekula u bioloSkim leinostima joii je u fazi intenzivnih eks-pcrimenmih islra?ivanja i praceno razvijanjcm niza novihpostupaka za odredivanje slobodnih aminokiselina i pcptida(23, 31, 32), anjona i katjona (22, 33, 34), sleroida (18) i dr.Medutim, /a uvodenje ovih analiti£kih postupaka u klini^kupraksu ncophodna su daija usavrSavanja, pre svega, standar-di7acija postupaka. Posebno treba ukazati da upotreba vcxle-nih raslvora, njihova mala potroSnJa i niska cena uz kratkovreme trajanja analiza predstavljaju glavne prednosti ovenove, ckoloSki prihvatljive tehnologije. U lome se sasloji ickonomska isplativost oprema za izvodenje KE i njihovasve veca prakiifina primena u raznim oblastlma.

Kunngurucija sistcma za kapilarnu clcktroforezu

Osnovna konfiguracija sislema za KE jc relativno jed-nostavna. Strujno kolo i sistem za dctekciju, medusobno po-vezani kapilarom u koji se posebnim posiupcima unoseuzorci za analizu, predstavljaju glavne delove ovog sjstema(si. I). Kapilara je glavni deo sistema i u njoj se ostvarujukretanja komponenata i njihova medusobna razdvajanja naosnovu razlifilih brzina u elektri£nom polju pod datim uslo-vima. Koniercijaino su dostupne kapilare unutraSnjcg dija-metra od 25, 50 i 75 \un. One su obloiene zaStitinim polii-midnim slojem, koji se pre montiranja skida na delu koji ka-pilam povezuje sa detektorom. Zavisno od anaiiti^kih potre-ba du2ina kapilara varira u SIrokonfi rasponu od 6 cm do pre-ko 100 cm. Ukupna zapremina kapilare izrafunava se poformuli: V = d' L7I/4 (V-zapreniina kapilare; d-dijatnelar, L-dUiLina) i krece se u granicama od nekotiko nl (iO'' I) do ^I(10"*" I). Tako kapilara unulraSnjeg dijameira 50\im i dulinc50cm ima ukupnu zapreminu od samo 1 ^1. Zapremine une-tih uzoraka su znaino manje i iznose svega nekoliko nL. ZaunoSenje ovako malih zapremina koriste se hidrodinamskiili elektrokinctit^ki postupci, zavisno od vrste analizovanihkomponenaia i primenjenog postupka KE.

Kapilare se smeSlaju u odgovarajuce nosaCSe kroz kojeprotiCe leCnosi za hiadenje, Cime se odr^ava potrebna tem-peraiura, bitan element svake elektroforeze u kapilari (4).Pti kapllamoj eleklroforczi razvijaju se velike koliCine to-plote proporcionalne kvadratu jaCine elektriCnog polja. Rad-ne usiove treba podesiti tako da brzina stvaranja i uklanja-nja toplote u sistemu budu izjedna^ene. U strujno koio sekapilara povezuje preko rezervoara ispunjenih radnim ras-ivorima elektrolita u koje su uronjene elektrode. izradetie odplemenitih metala. Strujno kolo £ini izvor visokog napona.

koji je preko odgovarajucih elektroda i radnog rastvora po-vezan sa kapilarom (si.I). Izvor struje postiie napone do30 (XK) V. a zavisno od toga da li se analizuju katjoni, anjo-ni ili neutralne molekuie operator ima mogucnost promenepolamosti elektroda. Nomialna polamost podrazumeva po-zitivnu elektrodu na ulaznom, a negativnu na izlaznom delukapilare. Sistem za detekciju omogucava vizuelizovanje do-gadaja u kapilari, §to je neophodno i u kvalitativnoj i ukvantitativnoj analizi. Zavisno od komponente koja se txlre-duje i od primenjenih analitiCkih usiova, koriste se razne vr-ste detekiora (fotometri. spektrofotometri. konduktomelri.amperometri itd.). NajCeScc deteklori prute promene apsor-bovanja svetlosti na razli^itim talasnim du2inama (od UV.spcktra do vidtjive svellosti), fluorescenciju. !aserom Indu-kovanu fluorescenciju i sli£no. Za sada nema univerzalnihdetektora i joS uvek se koristi uglavnom konvencionalnahronialografska detekciona tehnologija, koja Cesto nije do-voljno osetljiva pri odredivanju malih kolitina/koncentraci-ja komponenaia razdvojenih pri elektroforezi u kapilari(35). Cini se da je detekcija jo§ uvek najslabija lafka KE.Sem toga, treba imati u vidu i da relativno mali broj sup-stanci apsorbuje svetlost. pa je radi vizuelizacije neophodnanjihova derivatizacija ili pracenje nekih drugih obeleija is-pilivanih komponenata(maseni spektar, provodljivosi itd.).Mada se Cine pokuSaji da se uvede kapilama (16) ili postka-pilama (36) derivatizacija. zbog brojnih poteSkoca one nlsuzaiivele i obiino se koristi prekapilama derivatizacija. Deri-vatizovanje komponenata pre unoSenja u kapilaru ne samoda produ2ava ukupno irajanje analize vec i nespecifiCnouli^ne na kretanje komponenaia u kapilari, i>io predsiavijadodatni problem pri njihovom razdvajanju i analizi. Posiiza-nje adekvatnog razdvajanja se ostvaruje (xiabirom odgova-rajucih usiova KE. To podrazumeva koriScenje kapilare od-govarujuce duiine i unutraSnjeg promera, elektrollt adekvat-nog saslava u anodnom i katodnom prostoru (vrsia joniza-bilnih i nejonizabiinih komponenata, pH, jonskajafina i dr.)uz odgovarajucu polarnost elektroda, napon, stniju. tempe-raturu i dr. Pri odabiru usiova treba imati u vidu karakteri-stike analizovanih komponenata, ali i osnovna svojslva, kaoi dodatne separacione mogucnosti pojedinih tipova KE.

Osmovni principi i vrste kapilarne elektroforeze

Glavni dogadaji pri KE se odvijaju u kapilari. Kapilaradaje sasvim nov formal i dimenziju pulovanju naeleklrisa-nih Ceslica u elektriCnom polju. U njoj do izralaja dolazerazne sile (sl.l), te KE ne treba posmatrali kao klasi^nuelcktroforezu u kapilari. Elekiroendoosmoza je glavni i fun-damentalni princip svake KE, a koriScenje ovih sila u raz-dvajanju molekula iz smeSe umnogome izdvaja ovu anali-tiCku lehniku od svih drugih separacionih postupaka. Onanastaje kao rezultat specifiCne distribucije jona oko unulra-Snjeg zida kapilare, izradenog od stopljenog silikata. Pozna-to je da izoelektriOna tafka siianol grupe iznosi oko 1,5, te usredini iiji je pH veci od ove vrednosti unutraSnji zid kapi-lare postaje negativno naelekirisan. Ovi fiksirani negativni

Epoj 6 BOJHOCAHHTETCKH CTpaHa 735

joni unutraSnjeg zida kapilare privlaCe pozilivne jone izunetog elektrolita. a na njih se dalje asociraju negalivni joniiz rastvora, Cime se stvara gu§ci sloj mobilnih jona. Tck naudaljenosli od zida kapilare je homogeno polje jona raslvo-ra. Potencijal koji se slvara izmedu fiksiranih jona i asocira-nog oblaka mobilnih jona predstavlja elektroklnetiCki zeta(Q potencijal. Ovaj potencijal je pri uspostavljanju strujnogkola odgovoran za brzinu clektroosmotskog proloka u kapi-lari. Tako naelektrisanja vezana za zid kapilare u elektri^-nom polju ostaju fiksirana, a oblak jona rastvora se kreceprema elektrodi suprotne polamosti. Sa jonskim oblakom sekrecu i molekule vode. Kao rezullat ovih slo^enih elektro-hemijskih dogadanja u kapilari, na kretanje rastvorenihkomponenata pri delovanju elektridnog polja suSlinski delu-je rezultanta vi§e sila (si. I), tinjenica je da su karakteristi-ke pojedinaiinih sila poznate (si. 1), ali rezultanta njihovogdejstva pri kapilamoj eleklroforezi raznih komponenata seteorijski ne moze precizno predvideti, jer kretanja konipo-nenata zavise od viSe meduzavisnih faktora. Verovatno tuleii i razlog Sio je KE jo5 uvek metodologija u razvoju.

Zna se da je brzina eleklroosmotskog protoka direktnosrazniema zcta potencijalu, dielektridnoj konslanti raslvora ijaCini elektriCnog polja. a obmuto srazmema viskoznosti

u kapilari (si. I). Elektroforetske sile koje pokrecu

apsorbanca

DETEKTOR

Erekti kunlakatalefnost/tcfnust

UinosU ivrsla Taza

ELEKTROOSMOZA

i^cig protoka

E • dieickififna konsianu

C - Kia potencijal niikoniaktu lt£ruisl/£vnila fuu

T) - vitkouiosi idrxuiit (puferalE - jaiina ekkthfnug polja

lnjjdl JJA); n.ipon l3()kV)ELEKTKOFOREZA

puiovanjeicMicii u clcktninom polju

E . Q

F- illi koju pokrtfc ittXktX - jifina elckihtno^ pi>'j' tv/cm|Q- nocleklrtuinjc f C9(ii:iiE -napond - udaljcnoM iunolu clcklnidl

F'-6Kri|V r* prodrdia(Mpw)

- nidijum jonizovuneCesiice I- vUkoinusi l(f nmli (pufcca)- btzina putovanji

SI. 1 -Osnovna konfiguracija sistema i glavne sile koje deluju unutarkapilare pri kapilamoj elektroforczi

Cestice u elektri^nom polju su srazmeme jaCini ovog polja inaelektrisanju samih cSesiica koje u njemu ostvaruju svojekretanje. Ovoj siii se suprotstavlja sila otpora, koja zavisi odsvojstava rastvora u kome se elektroforeza izvodi. Pri tomedo izraiaja dolazi veliCina jonizovanih Cestica i viskoznostpufera. Treba imati u vidu da na brzinu kretanja £estica ukapilari utiCu i efekti kontakata teCnost- tecnosi i teCnost-Cvrsta faza. Modulacija efekata pojedinih sila pri kapilamojelektroforezi se postiie upolrebom razliCitih pufera, pufer-skih aditiva. kao i modifikatora jonskih karakteristika unu-trai»njeg zida kapilare. Od pufera se najCeSce koriste fosfamii acetatni za kiselo podruCje, a fosfatni i boratni za neutral-no i bazno pH podrucje. Pri razdvajanju proteina i peptidaiesto se koriste i dvopoini (cvWr/^r-jonski) puferi sa u^im ra-sponom pH. Prednost ovih dvopolnih pufera lezi u njihovojniskoj provodljivosti, slaboj struji i smanjenom zagrevanju.Treba imati u vidu da i soli dodate u etektrolit uti£u na nae-lektrisanje jonskog dvo.sloja kapitamog zida, te da u znadaj-noj med menjaju brzinu elektroosmotskog protoka.

Sem toga, dodavanje neorganskih soli u elektrolit me-nja konformaciju proteina, pa i to uti^e na njihovo razdvaja-nje. Razliiite efekte na elektroosmotski protok imaju i or-ganski rastvaraCi. Pokrivanjem slobodnih silanol grupa ami-ni moduliraju ovaj protok. a celulozni derivati stvaraju i

usiove prosejavanja. Pokazalo se da katjonskisurfaktanti vracaju naelektrisanje zida kapitare, asulfonske kiseline doprinose jonskom sparivanjui utiCu na hidrofobne interakcije. S druge strane,urea utiCe na solubilizaciju proteina i denaturaci-ju oligonukleotida. Upotreba ovih mtxlifikato-ra/modulatora elektrosomotskog protoka suStin-ski menja separacione karakteristike postupakaKE, pa se govori o njihovim razliCitim vrstama.Najjednostavnija forma je slobodna zonska kapi-lama elektroforeza, koja predstavlja kretanje na-elektrisanih Cestica u slobodnom rastvoru. Sepa-racija je ovde zasnovana na razlikama u odnosunaelektrisanje /masa ispitivanih supstanci. Ovajtip KE se pokazao kao pogodan za analizu veli-kih (24, 37), ali i malih molekula (5, 22, 23). Ka-pilarno izoe]ektri(5no fokusiranje se koristi prirazdvajanju meSavine kompleksnih proteina sarazlic^itim izoelektrii^nim ta£kama (38). Osnovnapremisa izoelekldCnog fokusiranja je da protein-ska molekula migrira sve dok je naelektrisana.Pri IzoelektriCnoj taCki protein gubi neto naelek-tri-sanje na svojoj molekuli i pre.staje da se kreieu elektriCnom polju. IzoelektriCno fokusiranjepredstavlja kretanje u pH gradijentu, Cije se ge-nedsanje postiie upotrebom razliCitih dvopolnihhemikalija. poznatih kao amfolini. Kapilamaizotahoforeza razdvaja komponente iste pokre-tljivosti kao Sto su joni pufera, a koristi se prirazdvajanju malih molekula, proteina i peptida.Kapilame gel elektroforeze. pored razUka u od-nosu naelektrisanje/masa, pri razdvajanju ispiti-

CtpaHa 736 BOJHOCAHMTETCKH nPErJ\EJi. Epoj 6

vanih komponenata koriste i elemente prosejavanja na osno-vu veliiine molekula. Ove tebnike KE se koriste prilikomanalize peptida. proteina, nukleinskib kiselina (5, 39). Pritome je moguce koriScenje usiova gde se nativna strukturamakromolekula ne mcnja ili onib koji dovode do njihovedenaturacije. Treba imati u vidu da unutar kapilare dolazedo izraiaja i Slovene jonske interakcije uzrokovane jonskimjaCinama rastvora (28).

Primena kapilame elektroforeze u analizi bioloskihtefnosti

Kako su za razvijanje KE kao analitiCkog postupka <;e-sto koriScene razlifite i iste komponente (aminokiseline,proteini itd.), normalno prisutne u bioIoSkim teCnostima, po-vrSnim pregledom literature moie se steci utisak da su pro-blemi koriScenja KE u odredivanju ovih komponenata u si-stemima reSeni. Medutim, studioznija analiza podataka iz li-terature o tome daje drugadiju sliku, a sve CeSce se ukazuje idaje kori§cenje KE u analizi biofluidajoS uvek pravi izazov(3. 18, 32, 33). Najvii5e se napredovalo u analizi makromo-lekula. Poslednjih godina primenom posebnih usiova slo-bodne zonske elektroforeze (24,40) ili presvlaCenjem unu-traSnjeg zida kapilare raznim jonoaktivnini komponentamamnogo se napredovalo u analizi razliCitib proteina (39). Po-sebno obecava upotreba KE u pracenju abnormalnosti pro-teinskih profila u cerebrospinainoj tefinosti, mada ovi podet-ni uspesi zahtevaju daIja ispitivanja pre nego §to se uvedukao rutinska metoda u kliniCke laboratorije (41). Do sada jerazvijeno viSe metoda za analizu proteina u likvoru pomocuKE. Cowdrey i saradnici (42) su medu prvima analizovalineukoncentrisani likvor i razdvojili oko 25 pikova koristeciboratni pufer pH 10 i metilcelulozu za smanjenje elektroo-smotskog protoka. KoriScenjem kombinacije boratnog pufc-ra pH 9.2 uz dodatak polietilenglikola i o-fosforil etanola-mina, umesto metilceluloze, u analizi ukoncentrisanih uzo-raka likvora bilo je moguce identifikovati i oligoklonsketrake (43). Posebna painjaje posvecena unapredivanjuanaliti^kih mogucnosti KEu ispitivanju nukleinskih ki-selina (27). S druge strane.dobro je poznato da tetesneteCnosti predstavljaju kom-pleksan matriks razliiSitihjonizabilnib komponenata,uz visok sadrzaj proteina isoli. Poznato je i da prote-inske makromolekule lakoprecipitiraju ako je pH sre-dine blizak njihovoj izoe-lektri£noj ta5ki, Sto moie

da dovede i do zaCepljenja kapilare. Sem toga, pri slobodnojzonskoj elektroforezi povoljni su usiovi za njihovu interak-ciju sa silanol grupama, fiime se brzo gube separacione spo-sobnosti kapilare. Posebno treba ukazati da zbog prisustva

velikog broja razliCitih vrsta jonizovanih ili jonizabilnihgrupa, kvantitativno zastupljenih u razliCitim koncenlracija-ma, postupci koji se primenjuju za anaiizu tSistih kompone-nala vrlo Cesto ne mogu da se primene u analizi istih kom-ponenata u bioloskom materijalu (plazma, uHn, likvor, tki-va). Sem toga, brojni joni prisutni u biofiuidima imaju afmi-tet i dvrsto se vezuju za zid kapilare £ime se brzo, a nekad iirajno menjaju njena jonska svojslva. Tako pri analizi biolo-Skih tednosti, pored mogucnosli fiziCke okluzije kapilare,proteini umnogome remete razdvajanje ispitivanib kompo-nenata i povecavaju varijabilnost njihovih vremena migraci-je, dovodedi do smanjenja osetljivosti pHmenjenih postupa-ka (18). Zatoje uobiCajenoda se pre analize malib molekulaiz uzoraka biofluida uklanjaju proteini. Pokazalo se, medu-tim, da primena adekvatnih usiova za KE moie da omogu(iii odredivanje malib molekula u biofluidima bez njiboveprethodne deproteinizacije. Tako bazni boraini pufer visokejonske jafiine (pH 10. 100 mmol/1) u kapilari promera75 |j.m i dugoj 36,5 ^m, pri naponu od 15 kV, uz jaCinu odstruje 122 fiA omogucava odredivanje nitrita i nitrita u pla-zmi i likvoru bez prethodnog uklanjanja proteina (22). Nai-me, primenjeni bazni pH omogucava kretanje serumskibproteina u kapilari brze od ispitivanib anjona. paje pretbod-na deprotcinizacija uzoraka biofluida izoslavljena. Ova jed-nostavna metoda omogucava odredivanje nilrita i nitrata uplazmi i likvoru za samo desetak minuta. Odredivanje nitri-la/nitrata u plazmi se tokom posiednjib godina pokazao kaodobar indikator za pracenje obima .stvaranja azotoksida, naj-novije otkrivenog inter- i intra-ceiijskog medijatora ukljuCe-nog u niz fizioIoSkib, ali i patofizioloSkib stanja u organi-zmu (44, 45). Ovaj postupak ima jo§ jednu prednost jer nekoristi skupe modifikatore elektroosmotskog protoka. Kori-Scenje boratnog pufcra velike jonske jaCine ovde obezbedu-je sna2an eiektroosmotski protok. a ispitivanim anjonimadaje negativno naelektrisanje. Pod primenjenim usiovimaodnos naelektrisanje/masa nitrita je 1/65, a nitrata 1/85, £i-me je obezbedeno njihovo dobro razdvajanje (si. 2).

0 9CT

a oos

c oo*

0 003

c oo»

NITRIT

A .

NITRAT

A\

JA

SI. 2 - Elektroferogram nilrita i nitraia u plazmi bez dodataka i sa dodatkom 100 \imo\/l nitrita initrata.

Slcbodna zonska elektroforeza: elektrolit 100 mmol/1 borat. pH 10; napon 15kV; kapilara36,5 cm X 75 ^m, detekcija direktna aposrbanca na 214 nm; metoda iumt i sar 1999 (22).

Treba istaci da direktno merenje apsorbance na 214nmomogucava detektovanje samo ispitivanih anjona. dok seelektroforezno kretanje proteina i drugih anjona na ovoj ta-lasnoj duiini ne registruje. Ovde dolazi do izraiaja I speci-

Bpoj 6 BOJHOCAHMTETCKM CrpaHa 737

fiinost KE da se proteinske makromolekule krecu znatnobrie od ispitivanih malih anjona. Ovakvajonska kreianja prislobodnoj zonskoj KE elektroforezi se suStinski razlikuju odkiasidnih elektroforeza gde je brzina kretanja molekula obr-nulo srazmerna njihovoj velidini. Zahvaljuci snaznom elek-troosmotskom protoku pri KE je moguce postici i kretanjenegalivno naclektrisanih Cestica preina kalodi, mada se nor-malno isioimena naelekirisanja odbijaju. Upravo to potvrdu-je nedavno razvijena metoda odredivanja 30 aminokiselina ipeplida u plaznii pomocu slobodne zonske KE (23), premakojoj se za razdvajanje aminokiselina koristi siobodna zon-ska KE u baznoj sredini (p-aminosalicilna kiselina 8 mmol/li karbonai 2 mmol/I. pH 10,25). U tim uslovima skoro sveslobodne aminokiseline (izuzeiak arginin) disociraju kaoanjoni, tj. nose negalivno neto naelektrisanje. Zaio je logi^-no oCekivati da ce se one kretati prema anodi. Medulim, udalim uslovimazbog sna^nog elek-Iroosmotskog proto-ka sve ispitivanekomponente se kre-cu ka negativno nae-leklrisanoj elektrodi.Treba isiaci da je i uovom postupku me-rena indirektna

aposbanca u pHsu-stvu p-aminosalicil-ne kiseline, koja ap-sorbuje svetlost na254nm, a ima sliCnueleklroforeisku po-kreiljivost kao vedi-na ispilivanih kom-ponenata. Time jepostignuia vizueli-zacija dogadaja ukapilari nativnihaminokiselina beznjihove preihodnederivatizacije. Pri-menjeni uslovi KE(23) su omogucilirazdvajanje 30 ami-nokiselina i peptidaiz plazme (si. 3).Druge metode. bazi-rane na principu KE,razdvajaju mnogomanji broj, uglav-nom Cistih, aminoki-selina i uz prethod-nu derivatizaciju.Boutat i saradnici

(31) su pre kapilame elektroforeze derivatizovali aminoki-seline sa 3-(4-karboksibenzoil) hinolin-2-karboksaldehi-dom, ali se pokazalo da primenjeni postupak unosi izraieneprobleme vezane za kvanlifikaciju aminokiselina. Pomenutenovorazvijene metode KE ce verovaino doprineti uvodenjuovog novog analitifkog postupka u analizu pula slobodnihaaminokiseiina u fizioIoSkim te^nostima. dobrih metaboIiC-kih indikatora u raznim patofizioIoSkim stanjima (46-48).

U zakljuCku se moie reci da postepeno prevazilaienjeproblema nezeljenih jonskih interakcija pri kapilarnoj elek-troforezi bioloSkog materijala daje ovoj novoj metodologijisve veci znaCaj u biohemijskim proudavanjima proteina, nu-kleinskih kiselina. aminokiselina, elektrolita i drugih biomo-lekula. Danas je reSavanje brojnih problema vezanih za ko-riScenje KE u klini£kim laboratorijama pravi izazov za bio-hemiCare.

ovwwa TnoM

uoie

001'

0013.

1

0010

oooal

1

\

0000- •:

2

i

11

.

14

1

1w

9

14

12

^ ' 1

1

7 , 1

17II

5

li

1

I 1

1

2

34

6

7

E

10

n12

13

14

IS

16

17

J9 1819

20

21

1 "' i 24

\ 25

i: 26

\

ll1 «• 1 1 1

ArgininLi/inOmiiinProlinY-aminDhutcmakiscltnaHidroksilizinP-alaninKamozinLcucin/i/olcucinTriplofanCilrulinValinFcnilalaninALaninHislitlinMcltoninGiutaminTrconinAspantginGlicinSerin

Homcx-islinHomoci steinCistein/cislinGlutationoksidovanGlulaminskakisetinaGtutalionrcdukovanAspamginskakiselina

SI. 3 - Elektroferogram aminokiseiina humane plazme deproteinizirane etanolom bez (A) i sa dodat-kom (B) standardne smeSe slobodnih aminokiselina i peplida individualnih koncentracija 100 \imo\f].Siobodna zonska elektroforeza: elektrolit 8 mmol/l p-aminosalicilna kiseiina - 2 mmoI/1 NaiCO^, pH10,15, 20°C; napon 15 kV; kapilara 87 cm x 75 ^m. detekcija indirektna apsorbanca na 254 nm; me-

loda Zunic i sar 2002 (23).

BOJHOCAHMTETCKM Bpoj 6

LITERATURA

1. Lele M, Leie SM, Petersen JR. Mohammad AA. Capil-lary electrophoresis - general overview and applica-tions in the clinical laboratory. In: Peiersen JR, Mo-hammad AA, editors. Clinica! and Forensic Applica-tions of Capillary electrophoresis. Totowa: HumanaPress Inc; 2001. p. 3-19.

2. Jorgenson JW. Lukacs KD. Capillary zone electropho-resis. Science 1983: 222(4621): : 266-72.

3. Petersen JR. Okorodudu AO. Mohammad A. PayneDA. Capillary electrophoresis and its application in theclinical laboratory. Clin Chim Acta 2003;330(1-2): 1-30.

4. Grushka E. McConnick RM. K'trkland JJ. Effect oftemperature gradients on the efficiency of capillaryzone electrophoresis separations. Anal Chem 1989;61:241-6.

5. Landers JP. Clinical capillary electrophoresis. ClinChem 1995; 41(4): 495-509.

6. Chen FT. Liu CM. Hsieh YZ. Steinberg JC. Capillaryelectrophoresis - a new clinical tool. Clin Chem 1991;37(1): 14-9.

7. Forel F. Demi M. Bocek P. Capillary zone electropho-resis - quantitative study of the effects of some disper-sive processes on the separation efficiency. J Chroma-togR 1988; 452: 601-13.

8. Atamna IZ. Issaq HJ. Muschik GM. JaninI GM. Opti-mization of resolution in capillary zone electrophore-sis: combined effect of applied voltage and buffer con-centration. J Chromatogr 1991; 588(1-2): 315-20.

9. Nielen MWF. Quantitative aspects of indirect UV de-tection in capillary zone electrophoresis. J Chrotnatogr1991; 588:: 321-6.

10. St Claire RL 3rd. Capillary electrophoresis. Anal Chem1996; 68(12): 569R-86R.

11. Bojarski J. Aboul-Enein HY. Application of capillaryelectrophoresis for the analysis of chiral drugs in bio-logical fluids. Electrophoresis 1997; 18(6): 965-9.

12. Hudson J. Malcolm M, Golin M. Screening biologicalspecimens for drugs of forensic significance. In: Peter-sen JR, Mohammad AA, editors. Clinical and ForensicApplications of Capillary Electrophoresis. Totowa:Humana Press Inc; 2001. p. 423-36.

13. Shihabi ZK. Serxim drug monitoring by capillary elec-trophoresis. In: Petersen JR. Mohammad AA, editors.Clinical and Forensic Applications of Capillary Elec-trophoresis. Totowa: Humana Press Inc; 2001. p.355-83.

14. Cherkaoui S. Combing capillary electrophoresis withelectrospray ionization mass spectrometry. In: PetersenJR. Mohammad AA. editors. Clinical and Fo^'ensic Ap-

plications of Capillary Electrophoresis. Totowa: Hu-mana Press Inc; 2001. p. 285-313.

15. Awadallah B, Schmidt PC. Wahl MA. Quantitation oCthe enantiomers of ofloxacin by capillary electrophore-sis in the parts per billion concentration range for invitro drug absorption studies. J Chromatogr A 2003;988(1): 135-43.

16. Silverio CF, Azad M, Gomez FA. On-column derivati-zation of the antibiotics teicoplanin and risocctin cou-pled in affinity capillary electrophoresis. Electrophore-sis 2003; 24(5): 808-15.

17. McDonnell PA. Caldwell GW, Masucci JA. Using cap-illary electrophoresis/frontal analysis to screen drugsinteracting with human semm proteins. Electrophoresis1998; 19(3): 448-54.

18. Yotih C. Mohammad AA. Petersen JR. Steroids. Tn:Petersen JR. Mohammad AA, editors. Clinical and Fo-rensic Applications of Capillary Electrophoresis.Totowa: Humana Press Inc; 2001. p. 209-19.

19. Cer\enakova L Brown P. Soukharev S. Yakovleva O.Diringer H. Saenko EL et al. Failure of immunocom-petitive capillary electrophoresis assay to detect dis-ease-specific prion protein in buffy coat from humansand chimpanzees with Creutzfcldt-Jakob disease. Elec-trophoresis 2003; 24(5):: 853-9.

20. Jolliff CR. Clinical .serum protein capillary zone elec-trophoresis. In: Petersen JR. Mohammad AA. editors.Clinical and Forensic Applications of Capillary Elec-trophoresis. Totowa: Humana Press Inc; 2001. p.79-91.

21. Lehman R. Lipoprotein analysis. In: Petersen JR. Mo-hammad AA, editors. Clinical and Forensic Applica-tions of Capillary Electrophoresis. Totowa: HumanaPress Inc; 2001. p. 113-44.

22. 2unic G. Spasic S. JeUc-lvanovic Z. Simple and rapidmethod for the measurement of nitrite and nitrate inhuman plasma and cerebrospinal fiuid by capillaryelectrophoresis. J Chromatogr B Biomed Sci Appl1999; 727(1-2): 73-9.

23. ixinic C, Jelic-Ivanovic Z, CoUc M. Spasic S. Optimi-zation of a free separation of 30 free amino acids andpeptides by capillary zone electrophoresis with indirectabsorbance detection: a potential for quantification inphysiological fluids. J Chromatogr B Analyt TechnolBiomed Life Sci 2002; 772(1): 19-33.

24. Chen FTA. Rapid protein analysis by capillary electro-phoresis. J Chromatogr 1991; 559: 445-53.

25. Qtiang C. Malek A. Khaledi MG. Separation of pep-tides and proteins by capillary electrophoresis usingacidic buffers containing tetraaIky 1 ammonium cations

Bpoj 6 BOJHOCAHHTETCKH

and cyclodextrins. Electrophoresis 2003; 24(5):: 824-8.

26. Alha DH. Wenz HM. Morehead H. Tian J, O'ConnellCD. Detection of P53 point mutaions by single strandconformation polymorpism: analysis by capillary elec-trophoresis. Electrophoresis 1998; 19{2): : 172-9.

27. McCord B. Butler J. The application of capillary elec-trophoresis in the analysis of PCR Products used in fo-rensic DNA Typing. In: Petersen JR. Mohammad AA.editors. Clinical and Forensic Applications of CapillaryElectrophoresis. Totowa: Humana Press Inc; 2001. p.261-84.

28. Seyrek E, Dubin PL. Tribet C. Gamble EA. Ionicstrength dependence of protein-polyeiectrolyte interac-tions. Biomacromoleculcs 2003; 4(2): 273-82.

29. Simo C. Cifuentes A. Capillary electrophoresis-massspectrometry of peptides from enzymatic protein hy-drolysis: simulation and optimization. Electrophoresis2003; 24(5): 834-42.

30. Desai MJ. Armstrong DW. Separation, identification,and characterization of microorganisms by capillaryelectrophoresis. Microbiol Mol Biol Rev 2003; 67(1):: 38-51.

31. Boulat O. McLaren DG. Arriaga EA. Chen DD. Sepa-ration of free amino acids in human plasma by capil-lary electrophoresis with laser induced fiuorescence:potential for emergency diagnosis of inborn errors ofmetabolism. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 2001;754(1): 217-28.

32. Linde MK. Amino Acid Analysis. In: PetersenJR.Mohammad AA, editors. Clinical and Forensic Ap-plications of Capillary Electrophoresis. Totowa: Hu-mana Press Inc; 2001. p. 167-92.

33. Nuttall KL, Guzman NA. Organic Acids. In: PetersenJR. Mohammad AA. editors. Clinical and Forensic Ap-plications of Capillary Blectrophoresis. Totowa: Hu-mana Press Inc; 2001. p. 193-208.

34. Gatceran MT. Puignou L. Diez M. Comparison of dif-ferent electroosmotic flow modifiers in the analysis ofinorganic anions by capillary electrophoresis. J Chro-matogr A 1996; 732: 167-74.

35. Burgi DS. Chien RL Application and limits of samplestacking in capillary electrophoresis. In: Altria KD.editor. Capillary Electrophoresis Guidebook, Princi-ples. Operation and Applications. Totowa: HumanaPress Inc; W. 1996. p. 211-26.

36. Jacobson SC, Koutny LB, Hergenroder R, Moore AW,Ramsey MJ. Microchip capillary electrophoresis withan integrated postcolumn reactor. Anal Chem 1994;66(20): 3472-6.

37. Lee KJ. Heo GS. Free solution capillary electrophoresisof proteins using untreated fused-silica capillaries. JChromatogr 1991; 559(1-2): 317-24.

38. Zftu M. Rodriguez R. Wehr T. Optimizing separationparameters in capillary isoelectric focusing. J Chro-matogr 1991; 559(1-2): 479-488.

39. Srinivasan K. Pohl C. Avdalovic N. Capillary coatingsfor protein analysis In: Petersen JR, Mohammad AA,editors. Clinical and Forensic Applications of CapillaryElectrophoresis. Totow: Humana Press Inc; 2001. p.61-78.

40. Wang 2. Swinney K. Bornhop DJ. Attomole .sensitivityfor unlabeled proteins and polypeptides with on-chipcapillary electrophoresis and universal detection byinterferometric backscatter. Electrophoresis 2003;24(5): 865-73.

41. Petersen JR. Mohammad AA. Cerebrospinal fluid pro-tein electrophoresis. In: Petersen JR. Mohammad AA.editors. Clinical and Forensic Applications of CapillaryElectrophoresis. Totowa: Humana Press Inc; 2001. p.105-12.

42. Cowdrey G, Firth M. Firth G. Separation of cerebro-spinal fluid proteins using capillary electrophoresis: apotential method for the diagnosis of neurological dis-orders. Electrophoresis 1995; 16(10): 1922-6,

43. Sanders E, Katvnann JA. Clark R. Oda RP. Shihabi Z.Landers JP. Development of capillary electrophoresisas an alternative to high resolution agarose electropho-resis for the diagnosis of multiple sclerosis. Clin ChemLabMed 1998; 37(1): 37-45.

44. tunic G, Pavlovic R. Malidevic 1. Savic V, Cemak I.Pulmonary blast injury increases nitric oxide produc-tion, disturbs arginine metabolism and alters plasmafree amino acid pool in rabbits during the early post-traumatic period. Nitric Oxide 2000; 4(2): : 123-8.

45. tunic G. KoturJ. Pavlovic R. Savic V. Cemak /. Nitricoxide production and oxidative cell damage followingpulmonary blast injury in rabbits. In: Faist E. editor.Proceedings from the 5th World Congress on Trauma,shock. Inflammation and Sepsis. 2000 February 29 -March 4; Munich, Germany. Bologna, Italy: MonduzziEditore; 2000. p. 723-7.

46. tunic G. Free amino acids in the evaluation of proteinmetabolism. Vojnosanit Pregl 1997; 54(6): 615-20 (inSerbian)

47. Sevaljevic LM. tunic GD. Acute-phase protein .synthe-sis in rats is influenced by alterations in plasma andmuscle free amino acid pools related to lower plasmavolume following trauma. J Nutr 1996; 126(12)::3136-42.

48. tunic G. Savic J. tgnjatovic D, Ta.seski J. Early plasmaamino acid pool alterations in patients with militarygunshot/missile wounds. J Trauma 1996; 40(3 Suppl)::S 152-6.

Rad je primljen 14. IV 2003. god.

Correspondence to: Gordana 2imic, Vojnomedicinska akademija, Institut za medicinska istra^ivanja; Cmoiravska 17, 11040Beograd. Srbija i Crna Gora. Tel: +381 266 11 22. ext. 31 562.