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INFORME TECNICO FINAL
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
SIP-20070271
TÍTULO:
DIAGNÓSTICO RAPIDO DE TUBERCULOSIS
RESPONSABLE:
DRA. JULIETA LUNA HERRERA
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
Febrero 2008
RESUMEN
La situación actual de tuberculosis incluyendo la aparición de cepas multirresistentes a los
fármacos, ha provocado que se den cambios dramáticos en el diagnóstico de esta enfermedad,
no bastando con la observación única de los bacilos en la muestra, sino resaltando la
importancia del aislamiento, la identificación taxonómica de la bacteria y la realización de un
antibiograma que marque de manera precisa el tratamiento para cada individuo. Un cúmulo de
esfuerzos y conocimientos en torno a la biología de las micobacterias y a la patología de la
tuberculosis se han generado en los últimos 10 años, de tal forma que los enfoques y
perspectivas del estudio de la enfermedad han cambiado drásticamente. El área de diagnóstico
de la enfermedad ha sido una de las que más impacto ha tenido, de tal forma que es oportuno
que estos nuevos conocimientos empiecen a llevarse a la práctica. Por esto, en este trabajo
quisimos hacer una recopilación de las técnicas y metodologías que consideramos las más
viables de aplicarse en un laboratorio de diagnóstico de tuberculosis, estableciendo con ellas
un algoritmo que marque la secuencia de eventos y procedimientos que permitan que se
pueda dar un diagnóstico rápid/o de la tuberculosis. Las técnicas y/o elementos para el
desarrollo del algoritmo aquí propuesto incluyen: a) la utilización del medio líquido 7H9
“casero”; b) la utilización del medio sólido 7H11 en su formato de capa delgada en presencia de
CO2; c) una técnica de PCR para permitir la identificación del complejo tuberculosis; d) para
realizar la determinación de sensibilidad a fármacos primarios y secundarios: el microensayo
fluorométrico del alamar azul. Para este trabajo se colectaron y analizaron 108 muestras de
esputo de pacientes canalizados al Servicio de Neumología del Hospital General de México,
con diagnóstico probable tuberculosis pulmonar por ser tosedores crónicos, no se sesgó el
estudio a casos con síntomas radiológicos o clínicos presuntivos de tuberculosis. Las 108
muestras procesadas fueron sometidas a concentración y cultivo independientemente de su
resultado de baciloscopía. Del total de muestras procesadas 5 fueron BAAR positivo en la
baciloscopia directa y 103 fueron BAAR negativo. El resultado de BAAR por concentración
permitió que se detectara una muestra más, alcanzándose un total de 6 muestras positivas. Un
total de 6 cepas crecieron puras en el medio 7H9, en este medio en un promedio de 6-13 días,
representando así un 5.5% de recuperación, una de estas cepas creció de manera poco usual
en este medio después de 13 días de cultivo, a esta muestra no se le pudo realizar ni la PCR,
ni la sensibilidad a fármacos, y eventualmente se perdió. La capa delgada permitió que se
aislaran 7/108 cepas (6.5% de recuperación), siendo así el medio que mayor recuperación
permitió. En el medio de Lowestein-Jensen se logró el aislamiento de 6 cepas después de 20
días en cultivo (promedio 30 días). De las 8 cepas aisladas, se logró la identificación, de 7 de
ellas como pertenecientes al complejo tuberculosis (técnica de PCR y su confirmación por
pruebas de niacina y nitratos). Se realizó la determinación de sensibilidad a fármacos por el
ensayo de alamar azul encontrándose que 6 de las 7 cepas estudiadas fueron sensibles a los
fármacos analizados, solo una fue simutáneamente resistente a isoniacida, rifampicina,
etambutol, y etionamida. A partir de muestras con baciloscopia positiva permite un 100% de
recuperación en un tiempo máximo de 5 semanas a partir de la colecta de la muestra.
INTRODUCCIÓN
1.- Generalidades
El impacto de enfermedad y muerte causada por M. tuberculosis (MTB) es
inmenso, con un estimado de 8.8 millones de casos y cerca de dos millones de
muertes ocurridos en el año 2003 únicamente. La epidemia del virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) ha repercutido dramáticamente en la
incidencia de tuberculosis (TB) a nivel mundial y especialmente en África. La
tuberculosis es la causa principal de muerte de personas infectadas con VIH,
representando actualmente un 11% de las muertes relacionadas al SIDA a
nivel mundial (Room y Garay, 2004).
La tuberculosis (TB) es una enfermedad contagiosa. A semejanza del catarro
común, se disemina a través del aire. Solamente son infecciosos aquellos
individuos con infección pulmonar, cuando las personas enfermas tosen,
estornudan, hablan o escupen, diseminan la micobacteria siendo la inhalación
de unos cuantos bacilos la suficiente para que una persona sea infectada. Sin
tratamiento, cada persona con TB activa infectará un promedio de 10 a 15
personas por año (WHO, Fact Sheet 2006). Sin embargo, los individuos
infectados no necesariamente desarrollarán la enfermedad. El sistema
inmunológico del individuo en la mayoría de los casos elimina eficientemente a
la bacteria; en otros casos, el sistema inmune “aísla” a la bacteria, la cual
rodeada de una gruesa capa de lípidos puede entrar en un estado de latencia
permaneciendo en ese estado por años para posteriormente desarrollar la
enfermedad durante un episodio de debilitamiento del sistema inmune
(Kaufman, 2001). Se dice que cada segundo una persona en el mundo se
infecta con el bacilo de la tuberculosis, de tal forma que un tercio de la
población mundial se encuentra infectada con esta bacteria, un 5-10% de los
individuos infectados desarrollarán la enfermedad en alguna etapa de su vida
(WHO, 2006).
La tuberculosis es una enfermedad crónica, infecto-contagiosa causada por
algunos miembros del complejo M. tuberculosis el cual agrupa a M. canettii, M.
tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. pinnipedii, M. caprae, M. bovis y M.
bovis BCG (Warren y col, 2006), se caracteriza por tos, fiebre y pérdida de
peso, y es probablemente la responsable de más muertes que cualquier otra
enfermedad infecciosa (WHO, Fact sheet 2006).
2.- Diagnóstico bacteriológico.
El control definitivo de la TB no ha podido ser posible en gran parte por el bajo
índice de detección de los casos. Aunque en años recientes la proporción de
casos identificados con baciloscopía positiva ha ido en aumento, en el año
2003, únicamente el 45% de los casos fueron efectivamente reconocidos (Pai y
col, 2006).
El diagnóstico convencional de la tuberculosis está sustentado en la
baciloscopía, el cultivo y el estudio radiológico (Pai y col. 2006). En el pasado,
estos procedimientos presentaban serias limitaciones, como el ser tardados,
laboriosos, caros, etc. La necesidad implícita para mejorar los métodos
tradicionales de diagnóstico, así como el desarrollo y aplicación de nuevos
métodos, rápidos, económicos, precisos, etc., ha sido un tema abordado por
múltiples grupos de investigación y gracias al desarrollo de nuevas disciplinas
una gran variedad de nuevas propuestas metodológicas encaminadas a
mejorar y acelerar el diagnóstico de la tuberculosis han surgido.
a) Baciloscopía “mejorada”.
La expectoración es la muestra más comúnmente utilizada para el diagnóstico
de la tuberculosis pulmonar y sigue siendo el elemento de diagnóstico más
utilizado en países de recursos medios y bajos. En estos países muchos de los
laboratorios realizan baciloscopías de la expectoración sin concentrar
(baciloscopía directa), utilizando la tinción de Ziehl-Neelsen, de tal forma que la
baciloscopía permite la identificación de la mayoría de los pacientes con
tuberculosis; así, la baciloscopía representa al elemento más económico del
diagnóstico. Por esto se ha promovido que este procedimiento se realice de
manera óptima, de tal forma que en la actualidad se ha logrado más de un
80% de sensibilidad para identificar a casos pulmonares (Steingard y col.
2006). De la calidad de la muestra depende en gran medida el éxito del
resultado microscópico y de aislamiento bacteriano; a su vez, el éxito de la
microscopía depende del buen entrenamiento de los técnicos encargados de
realizar las lecturas. La muestra biológica una vez colectada será objeto de
homogeneización/digestión/descontaminación, concentración, observación
microscópica y cultivo por lo cual es fundamental explicar al paciente la manera
en que debe obtenerla, colectarla y transportarla al laboratorio. En pacientes
con franca tos productiva la muestra puede obtenerse a cualquier hora del día;
para aquellos con poca producción, la mejor muestra es la primera del día,
después de levantarse. En pacientes cuya producción sea escasa, se puede
inducir la expectoración mediante la administración de solución salina caliente
nebulizada, con ayuda de broncoscopio o por aspiración gástrica. El
contenedor ideal será un frasco o tubo estéril, de boca ancha y tapón de rosca.
(Iseman, 2001). Recientemente se ha sugerido la utilización de agentes
bacteriostáticos como el cloruro de cetil-piridina, que previene el crecimiento de
bacterias contaminantes durante el transporte de la muestra (Steingard y col,
2006, Pai y col. 2006). Las secreciones respiratorias típicamente contienen una
matriz espesa de origen protéico, para disgregar a este material, se puede
adicionar un agente mucolítico como la N-acetil-cisteína, o hidróxido de sodio
diluído (a su vez es bactericida), y para eliminar a la flora contaminante se
utilizan substancias como el cloruro de benzalconio o el hipoclorito de sodio
siendo este último uno de los reactivos más recomendados para la
baciloscopía, más no para el cultivo (Steingard y col, 2006). Una vez
digerida/homogeneizada la muestra, los elementos químicos utilizados en tales
procedimientos deben ser eliminados por lavado y centrifugación, y el
sedimento será sujeto a análisis microscópico y cultivo. La tinción tradicional
tanto de la muestra directa como del concentrado es la de Ziehl-Neelsen, sin
embargo, poco a poco se ha ido promoviendo el uso de la tinción de
fluorescencia con los compuestos auramina-rodamina, ya que esta última
ofrece más posibilidades de contraste (bacilos verdes brillantes contra un fondo
negro) y rapidez, además de que la lectura se puede realizar a aumentos de
25 y 40x, para lo cual se requieren un par de minutos para hacer dicho análisis
(Iseman, 2001). La norma oficial mexicana establece a la microscopía con
tinción de Ziehl-Neelsen como norma de diagnóstico y establece que los
laboratorios donde se realizan dichos procedimientos, constantemente estén
bajo supervisión central (Balandrano 1996, Balandrano 2003).
b) Cultivo mejorado.
El aislamiento y cultivo in vitro del agente etiológico causante del caso clínico
es clave para la identificación y confirmación de la especie, para la realización
de los ensayos fenotípicos de sensibilidad a fármacos y sobre todo para
determinar la eficacia del tratamiento (el cultivo se debe negativizar después
del tratamiento). El aislamiento micobacteriano se realiza a partir de la muestra
biológica digerida y descontaminada, principalmente con N-acetil-cisteina o
más comúnmente con hidróxido de sodio, no se recomienda el aislamiento a
partir de la muestra directa por la presencia de una gran cantidad de
contaminantes. Actualmente se recomienda que para favorecer el aislamiento,
el sedimento proveniente de los procesos de descontaminación y digestión se
neutralice con albúmina sérica bovina (Iseman, 2001). Desde el descubrimiento
de M. tuberculosis como agente causal de la enfermedad, se sabe que esta
bacteria es de crecimiento lento, requiriendo hasta 4 semanas para crecer y
obtener colonias típicas. No se ha encontrado ningún medio que permita
acelerar este crecimiento. En el pasado, el medio tradicionalmente utilizado en
el aislamiento había sido el de Lowestein-Jensen, sin embargo, en la actualidad
se tiene ya el conocimiento, cada vez mas aceptado, de que para favorecer el
aislamiento es necesario que se utilicen una variedad de medios de cultivo,
adicionales al Lowestein-Jensen (Rivera y col 1997, Schuler, 2001). Dentro de
los medios más reconocidos se encuentran los correspondientes a la serie
Middlebrook, tanto 7H9 (caldo), como 7H11 (agar). La utilidad de estos medios
surgió de los resultados obtenidos con el medio Middlebrook 7H12 formulado
en el método radiométrico de BACTEC, el cual demostró ser muy eficiente
tanto en la detección rápida de crecimiento como en la recuperación bacteriana
(Fluornoy y Twilley, 2001, Iseman, 2001). Por las complicaciones relativas al
manejo de materiales radiactivos, el método radiométrico de BACTEC ha sido
reemplazado por la alternativa comercial no radiactiva denominada “tubo
indicador de crecimiento micobacteriano o MGIT”, cuya formulación tiene como
base el medio 7H9 (Rivera y col, 1997), cada vez son más los reportes que
mencionan la utilidad del medio comercial MGIT para la recuperación
micobacteriana (Rivera y col 1997, Ichiyama y Suzuki, 2005). El agar
Middlebrook 7H11 ofrece una alternativa adecuada para la obtención de
unidades formadoras de colonia, reduciendo el tiempo de desarrollo en
comparación con el medio Lowestein Jensen (18-21 días contra 21-42 días), y
permitiendo la observación más clara de las colonias (por ser un medio no
opaco) (Iseman, 2001). Por estas ventajas se ha propuesto el uso de este
medio en los procesos de aislamiento bacteriano a partir de muestras
biológicas, sin que sustituya al Lowestein-Jensen. Una variante más del uso del
medio 7H11, es el denominado método de “capa delgada”, el cual como su
nombre lo señala, corresponde a la formación de una capa delgada de agar en
una caja de Petri más pequeña que las convencionales (60X100mm) de tal
forma que permita su observación bajo el microscopio tanto óptico como
invertido y así se pueda revisar el crecimiento bacteriano este medio (Idígoras
y col, 1995, Mejia y col, 1999). De esta forma la observación microscópica de
las microcolonias permite: a) tener una evidencia rápida del cultivo, ya que
estas se pueden observar tan solo a unos 5-7 días de cultivo; b) dar un
diagnóstico presuntivo de tuberculosis ya que las características morfológicas
permiten de una manera relativamente fácil diferenciar las colonias del
complejo tuberculosis, con las de las micobacterias no tuberculosas más
comunes presentes en muestras biológicas pulmonares (por ejemplo M.
avium); c) tener un parámetro de la pureza del cultivo. La utilidad de la capa
delgada ha sido demostrada recientemente por un grupo multinacional de
Latinoamérica (Robledo y col, 2006).
3.- Diagnóstico molecular
Los ensayos de amplificación de ácidos nucléicos están basados en la
detección o secuenciación de regiones específicas del genoma del complejo
Mycobacterium tuberculosis. Estas pruebas puedes realizarse directamente en
especimenes clínicos como la expectoración o sobre bacterias aisladas, la
mayoría de los métodos son con bacterias aisladas. Existen versiones
comerciales y “caseras” de estos tipos de ensayos. Los ensayos de
amplificación de ácidos nucleicos tanto comerciales como caseros, son
básicamente pruebas de ribotipificación cuyas sondas reconocen fragmentos o
regiones de gen del RNA ribosomal micobacteriano (16S o 16S-23S rRNA)
que esta presente en forma de copias múltiples y cuyas secuencias son
específicas del complejo tuberculosis o algunas de sus especies (Iseman 2001,
Suffis y col 2001, Cobos-Marin y col 2003). Los ensayos comerciales más
comunes utilizados para la identificación del complejo tuberculosis basados en
la amplificación e hibridación de una región del 16S rRNA son: a) la prueba
MTD de Gen-Probe (“Amplified M. tuberculosis Direct Test”); b) el sistema
Amplicor M. tuberculosis de Roche: c) el ensayo BD-ProbeTec-ET de Becton-
Dickinson (Iseman 2001, Pai y col, 2006b). Los ensayos Amplicor y MTD
actualmente han sido aprobados por la agencia FDA (Food and Drug
Administration) de Estados Unidos. Estos ensayos se pueden realizar a partir
de la muestra biológica o de la bacteria aislada, sin embargo tienen el
inconveniente de su alto costo, y el de tener una buena confiabilidad
únicamente cuando la muestra es baciloscopia positiva, lo que les descarta de
su uso en muestras pausibacilares, en donde realmente serían de utilidad
indiscutible (Iseman, 2001). Otro tipo de ensayo molecular comercial para la
identificación del complejo tuberculosis y/o otras especies micobacterianas a
partir de bacterias creciendo en medio líquido, lo constituye la metodología de
INNO-LyPA-Mycobacteria versión 2 (Innogenetics, Bélgica). Este método está
basado en la detección mediante hibridación reversa, con 14 sondas diferentes
colocadas en forma paralela que abarcan la región espaciadora interna del
16S-23S rRNA micobacteriano, siendo esta región utilizada en lugar de la
tradicional región 16S rRNA por presentar mayor polimorfismo inter-intra
especies; a través de este análisis, se puede identificar al complejo
tuberculosis, y a 16 especies y subespecies más, incluyendo M. avium, M.
chelonae, M. xenopi, M. marinum etc (Suffis y col 2001, Lebraun y col, 2005).
Otros genes micobacterianos han sido utilizados como herramienta para la
identificación de especies, siendo estos el gen que codifica para la proteína de
32 kDa (Soini y Musser, 2001), y el gen de la proteína de choque térmico de
65 kDa (Pai y col, 1997). De estos, el más utilizado ha sido el análisis de
restricción de los amplicones obtenidos por PCR del gen de 65 kDa, método
conocido como PRA (del inglés PCR-restriction enzyme análisis) (Soini y
Musser, 2001, Da Silva y col 2002), este es un ensayo típicamente casero de
difícil estandarización que se realiza con bacterias aisladas en medio
líquido/sólido. Dentro de los métodos moleculares que mayor sensibilidad y
especificidad han demostrado en la identificación correcta de especies y
subespecies micobacterianas es la secuenciación basada en la amplificación
por PCR de genes micobacterianos, dentro de los cuales el gen 16S rRNA es
el más reconocido y representa el estándar de oro en la identificación
taxonómica de micobacterias ya que presenta tanto regiones conservadas
como variables altamente específicas y fácilmente reconocidas en la
secuenciación (Soini y Musser, 2001). Finalmente, el desarrollo tecnológico de
microarreglos de oligonucleótidos de alta densidad (microarreglos de DNA),
permite la posibilidad de análisis de un gran número de secuencias
oligonucleotídicas marcadas con diferentes fluorocromos, mediante un solo
paso de hibridación a partir de amplicones obtenidos por PCR; los amplicones
unidos a las diferentes secuencias emitirán una fluorescencia característica
analizada en un sistema automatizado de escaneo fluorescente. Dentro de los
microarreglos descritos se encuentra uno que permite la identificación de 54
especies micobacterianas con el análisis de 82 secuencias características
presentes en el 16S rRNA, además de permitir simultáneamente la
determinación de resistencia a rifampicina ya que este microarreglo también
contiene 51 secuencias características del gen rpoB. De esta forma se ha dado
el inició a una metodología prometedora que permitirá la identificación y
determinación de resistencia en un solo paso a partir de cultivos con poco
crecimiento, o contaminados (Soini y Musser, 2001), acortando así el tiempo de
diagnóstico.
4.- Diagnóstico serológico.
El diagnóstico serológico de la tuberculosis ha sido objeto de un sin fin de
estudios teniendo como objetivo particular el diagnóstico de los casos
extrapulmonares, pausibacilares, y contactos donde no se cuenta con
elementos de diagnósticos útiles y evidentes como la baciloscopía de la
expectoración o la imagen radiológica. A diferencia de muchas de las
enfermedades infecciosas donde la serología ha demostrado su gran utilidad
en la tuberculosis este objetivo no se ha alcanzado. A pesar de esto, se han
desarrollado y tratado de comercializar varias docenas de equipos
diagnósticos para la detección de anticuerpos, aunque también se han dado
esfuerzos para el desarrollo de ensayos encaminados a detectar antígenos y
complejos inmunes (Pai y col, 2006a), sin embargo a la fecha no existe un
ensayo lo suficientemente exacto para substituir a la microscopía o el cultivo.
Los principales problemas que ha afrontado el diagnóstico serológico radican
en la especificidad de los ensayos, que no permiten diferenciar con claridad a
los individuos infectados de los enfermos, siendo este un hecho
particularmente relevante en países en desarrollo en donde se estima que
hasta un 40% de la población presenta una infección latente de tuberculosis
(Iseman, 2001). Por otro lado, en dichos países, una proporción muy elevada
de la población también ha sido vacunada con M. bovis var BCG, bacteria que
forma parte del complejo tuberculosis y por ende susceptible de interferir con el
diagnóstico. Un problema más que se suma a los factores de la falla en el
diagnóstico serológico de la tuberculosis es la prevalencia de infección en la
población por micobacterias no tuberculosas, hecho particularmente relevante
en países industrializados (Iseman, 2001). El análisis de una gran cantidad de
estudios sobre serodiagnóstico en TB donde numerosos antígenos se han
ensayado, en las múltiples formas de la enfermedad, han demostrado que los
peores resultados se obtuvieron con extractos crudos y mezclas no específicas
de antígenos (Bothamley 1996, Chan y col 2000), sin embargo la posibilidades
actuales de expresar y obtener antígenos específicos puros a través de
técnicas recombinantes han devuelto la expectativa de encontrar antígenos
prometedores. Algunos de los tantos antígenos ensayados de origen protéico
son: 38kDa, 30kDa, 85B, 16 kDa, 19 kDa, y el “early secreted antigenic target”
o antígeno específico de secreción temprana (ESAT-6) (Beck y col 2005), de
los de origen lipídico se encuentran: la liporarabinomanana (LAM) y los factores
cuerda (Iseman, 2001, Beck y col 2005). La utilización de más de uno de estos
antígenos aumenta sensibilidad de los ensayos, se ha visto que las
combinaciones que involucran a los antígenos ESAT-6, LAM y 38 kDa
aumentan la sensibilidad de las detecciones (Azurri y col 2006, Pai y col
2006b). Los resultados de los estudios serológicos han demostrado claramente
que el reconocimiento tan diverso hacia los antígenos micobacterianos se debe
a las grandes variaciones antigénicas desarrolladas durante el proceso
infección-enfermedad (Pai y col 2006); durante el proceso enfermedad activa-
latente y durante el proceso enfermedad-tratamiento (Gennaro 2005, Azurri y
col 2006b), etc.
5.- Diagnóstico celular
Los avances recientes en biología molecular y los conocimientos generados en
estudios proteómicos, han permitido el desarrollo de propuestas celulares
novedosas para el diagnóstico, sobretodo de la tuberculosis latente o
pausibacilar, en la forma de ensayos in vitro para la medición de citocinas
(interferón gamma, IFNγ) producidas por los linfocitos T sensibilizados después
de la estimulación con diferentes antígenos micobacterianos (Pai y col 2006b).
Los primeros estudios utilizaron al derivado proteico purificado (PPD) como
antígeno de estimulación (Laal y Seike 2005), sin embargo los ensayos se han
substituido con antígenos más específicos dentro de los cuales están el ESAT-
6, la proteína de filtrado de cultivo- 10 (CFP-10), y el antígeno TB7.7 (Rv2654)
(Pai y col 2004). ESAT-6 y CFP-10 son antígenos codificados en un segmento
de la región de diferenciación 1 (RD1), específica para el genoma de M.
tuberculosis, no compartida con la cepa vacunal BCG, ni con micobacterias no
tuberculosas causales de patologías clínicas (Pai y col 2006a). Existen
formatos comerciales de los ensayos de producción de IFNg, el denominado T-
SPOT-TB (Immunonotec, Oxford) y el QuantifFERON-TB-Gold (Cellestis,
Australia), en el primero la cuantificación de la producción de la citocina se
realiza por la técnica de ELISA en mancha (ELISPOT) (Dehesa y col 2005) y el
segundo por un ELISA convencional (Pai y col 2006a). Los estudios han
demostrado que la sensibilidad de los métodos para la determinación de
citocinas con los antígenos ESAT-6 y CFP-10, es similar a la alcanzada por la
prueba de la tuberculina (Pai y col 2004, Dehesa y col 2005, Pai y col 2006a).
Otra opción novedosa, que ha surgido como resultado de los estudios
genómicos y proteómicos micobacterianos, es el desarrollo del parche cutáneo
con el antígeno MPB64, que teóricamente permite distinguir de manera sencilla
a los pacientes con tuberculosis activa de los de infección latente (Nakamura y
col 2001), a través de la realización de una prueba de hipersensibilidad tipo IV
similar a la que se desarrolla con el PPD, los estudios realizados han
demostrado una alta sensibilidad (88%) y especificidad (100%) para identificar
a la tuberculosis activa (Pai y col 2006b). Las ventajas obvias de este método
radican en la facilidad de realización, en la rapidez y sobretodo que se puede
realizar en lugares remotos donde el acceso a un laboratorio equipado no es
factible. El tiempo establecerá la utilidad de este método.
6.- Determinación de resistencia a fármacos.
El surgimiento de la tuberculosis resistente a fármacos dio un giro a los
procedimientos diagnósticos tradicionales de la tuberculosis pulmonar que se
basaban el la baciloscopía como elemento central de diagnóstico, siendo
entonces indispensable el aislamiento para poder llevar a cabo la
determinación de sensibilidad a los fármacos. La detección temprana de
resistencia a fármacos en tuberculosis permite que de manera inmediata se
inicie el tratamiento adecuado, favoreciendo la curación del paciente, la
diseminación de la bacteria a otros individuos y sobretodo evitando que la
bacteria genere resistencia a un número mayor de fármacos. De manera
similar a lo sucedido con el diagnóstico de la tuberculosis, en los años
recientes, se ha dado un cúmulo de estudios que han permitido que se den
nuevos avances encaminados a acelerar y favorecer la determinación de
sensibilidad a fármacos antimicobacterianos. Dentro de los desarrollos
metodológicos se pueden distinguir dos grandes grupos, aquellos basados en
determinaciones fenotípicas, en donde es indispensable tener a la bacteria
aislada para poder realizarlos y los basados en determinaciones genotípicas en
los que se buscan las mutaciones responsables de la resistencia manifiesta.
Por razones de orientación del tema a abordar en este trabajo, las
determinaciones genotípicas no se abordarán en detalle, baste únicamente
señalar que estas determinaciones disminuyen el tiempo de ensayo, no
requieren de desarrollo bacteriano puro (aunque la mayoría de los ensayos
descritos se hacen a partir de bacterias recuperadas de cultivo), ofrecen la
posibilidad de la automatización y determinación directa a partir de la muestra
biológica; sin embargo son más costosos, más laboriosos, requieren de
equipos y reactivos más sofisticados y lo más importante, aun no todos los
mecanismos de resistencia se conocen de tal forma que las determinaciones
genotípicas evaluaría únicamente una parte de los posibles responsables de la
resistencia (Iseman 2001, Palomino 2006, Pai y col 2006b). Por otro lado, las
determinaciones fenotípicas son en general más simples de realizar, son
fácilmente adaptables a condiciones de trabajo de laboratorios sin mucho
presupuesto e infraestructura, y pueden llegar a ser independientes del uso de
reactivos comerciales, hecho que las hace ideales para países en desarrollo.
La gran desventaja de los métodos fenotípicos, como se mencionaba
anteriormente es la necesidad imperativa de contar con un crecimiento
micobacteriano viable y puro, pero una vez logrado, estas determinaciones
pueden arrojar resultados en pocos días, ya que la mayoría de las propuestas
actuales están basadas en la detección indirecta del crecimiento bacteriano, es
decir no requieren que se de el desarrollo de unidades formadoras de colonia
para evidenciar el crecimiento, sino que utilizan diversos indicadores del
mismo. A continuación se hará una breve descripción de estas propuestas.
a) Tubo indicador de crecimiento micobacteriano (MGIT).
El desarrollo comercial MGIT (Becton-Dickinson), ha sido un substituto natural
del método radiométrico de BACTEC 460 (Becton-Dickinson), prácticamente
descontinuado por costo y sobretodo por las desventajas del manejo de
desechos radiactivos. El método MGIT es un método indirecto basado en la
detección de crecimiento a través del uso de un compuesto que bajo una
tensión elevada de oxígeno no fluorece, pero cuando la bacteria inicia el
crecimiento consumiendo el oxígeno del medio, dicho compuesto emite
fluorescencia, siendo esta detectada de manera manual o automatizada en un
lapso tan corto como 2 días (promedio 5-10) (Rivera y col 97, Ichimaya y col
2005). El MGIT se ha utilizado en la determinación de sensibilidad a los
fármacos primarios isoniacida, rifampicina, estreptomicina y etambutol,
presentando alta sensibilidad y especificidad cuando se compara con el método
de proporciones (Kruuner y col 2006). Existen también estudios que señalan
su utilidad en la determinación a fármacos secundarios (Gerder y col 2006). A
pesar de sus ventajas su utilización más generalizada no se ha dado por su
elevado costo, de tal forma que únicamente en laboratorios con alto
presupuesto es un método rutinario (Palomino 2006).
b) Ensayos basados en la utilización de fagos.
Los ensayos con fagos han introducido una nueva modalidad de detección
rápida de resistencia, en estos se utilizan variantes del fago D29, con
especificidad de infección hacia el género Mycobacterium (Palomino 2006).
Existen dos modalidades metodológicas con fagos, los ensayos con “fagos
luminosos”, acarreadores de la enzima luciferasa (Banajee y col 2003) y los
ensayos con “fagos líticos” (Simboli y col 2005), presentándose ambas
modalidades como ensayos caseros y en el caso de los “fagos líticos” en forma
comercial también (Palomino 2006). Los ensayos con fagos líticos no
requieren de ningún equipo sofisticado para su lectura, la micobacteria a ser
analizada se pone en contacto unas cuantas horas con los fármacos a ensayar,
posteriormente se agrega a dichas bacterias el fago lítico y se permite le
infección por un par de horas, transcurrido este tiempo se agrega un agente
neutralizante del fago extra-bacteriano y se procede a la siembra tales
micobacterias sobre una “cama” constituida por micobacterias de crecimiento
rápido como M. smegmatis, el fago acarreado únicamente por la micobacteria
original viable se replicará hasta fragmentar a dicha micobacteria y se esparcirá
sobre la micobacteria de crecimiento rápido que sirve como indicador. Después
de unas horas de cultivo, se determina la confluencia y abundancia de placas
líticas determinándose así si la micobacteria original era susceptible o
resistente al fármaco en cuestión (Pai y col 2006b). Este ensayo se ha
realizado con algún éxito en la determinación de resistencia a rifampicina
(Simboloi y col 2005). El ensayo con fago luminoso es más costoso y laborioso,
existe en dos modalidades una fotográfica y una luminométrica, en este ensayo
se utiliza un fago acarreador construído mediante técnicas moleculares y que
lleva a la enzima luciferasa, cuando el fago se pone en contacto con
micobacterias metabólicamente activas (como aquellas resistentes a los
fármacos), se da una replicación del mismo, de tal forma que al poner en
contacto al sustrato de la enzima luciferasa, la luciferina, se dará una reacción
que emana luz, misma que puede ser detectada en un luminómetro o en una
placa fotográfica que requiere una caja obscura a la que se ha denominado
“Bronx Box” en honor al lugar de su descubrimiento (Pai y col 2006b), la
necesidad de ambos sistemas de detección hacen a esta determinación muy
costosa. De las dos versiones la que más ha sido utilizada y validada a nivel
internacional es la tipo fago lítico.
c) Métodos colorimétricos.
Los métodos colorimétricos se basan en la utilización de colorantes de óxido
reducción que cambian sus propiedades fisicoquímicas cuando están sujetos a
un potencial de reducción elevado como el que se genera cuando la
micobacteria resistente a los fármacos crece irrestricta en el medio de cultivo.
Son varios los reactivos utilizados en las propuestas colorimétricas, algunos de
ellos se pueden preparar a partir de los compuestos puros y otros se han
comercializado por diferentes compañías, dentro de los compuestos caseros se
encuentra el MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide,
Sigma), el XTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-
carboxanilide, Sigma) (De Logu y col 2003, Abate y col 2004) y la resazurina
(Sigma) (Palomino, 2006). Dentro de los comerciales, el reactivo más
ampliamente utilizado y validado ha sido el Alamar Azul (Trek, Biosurce), cuya
implementación fue la pionera en la propuesta de métodos colorimétricos para
la determinación de sensibilidad a fármacos (Luna-Herrera y col 2003). Estos
métodos se han utilizado en la determinación a fármacos primarios y
secundarios con resultados muy buenos (más de 90% de sensibilidad y
especificidad, dependiendo del fármaco), teniendo el mejor desempeño hacia
los fármaco isoniacida y rifampicina (Palomino, 2006). De los colorantes, el
MTT es el único cuyo producto de reducción es insoluble, el XTT, la resazurina
y alamar azul dan productos solubles, de estos dos últimos su producto de
reducción además es fluorescente, lo que permite la determinación mediante
cuantificación fluorométrica (unidades relativas de fluorescencia), esta
propiedad ha permitido que el método de alamar azul se diversifique al
denominado FMABA (“fluorometric microplate alamar blue assay”) siendo muy
utilizado en la búsqueda de nuevos compuestos anti-TB (a la fecha se han
ensayado más de 50,000 compuestos a nivel internacional, Franzblau S.,
comunicación personal); y en la determinación de interacciones
farmacológicas (Luna Herrera y col 2006). Los ensayos colorimétricos permiten
la obtención de resultados en un máximo de 8 días a partir de la preparación de
la placa, siendo prácticamente comparable el tiempo de lectura con el del
método hasta ahora más rápido descrito (el método radiométrico de BACTEC
460) (Collins y Franzblau 1997). La determinación de farmacosensibilidad por
el método de alamar azul ha demostrado ya tener utilidad clínica, no solo en la
determinación contra M. tuberculosis sino también contra micobacterias no
tuberculosas, de hecho nuestro grupo de trabajo cuenta ya con experiencias
clínicas que demuestran que pacientes tratados con los fármacos identificados
en el ensayo de FMABA como útiles, han mostrado mejoría y curación (Dra.
Vanzinni Hospital para la Prevención de la Ceguera, comunicación personal).
d) Ensayo de observación microscópica de fármaco-sensibilidad (MODS).
El ensayo de observación microscópica de sensibilidad a fármacos MODS, es
un método muy sencillo que se realiza en caldo Middlebrook 7H9, en
microplacas de cultivo de 24 pozos, para obtener la lectura del mismo se
requiere de analizar bajo el microscopio los pozos con fármaco y comparar el
crecimiento del control sin fármaco, el crecimiento micobacteriano deberá ser
compatible con MTB, esto es se deben observar pequeños cúmulos de bacilos
con formas curveadas (tipo cordón serpentino). El ensayo se puede leer a los 7
dias post-inocuolación, y normalmente se ensayan 2 concentraciones por
fármaco (Pai y col 2006b).
JUSTIFICACIÓN
El diagnóstico presuntivo de la tuberculosis pulmonar en el pasado tenía como
elemento central el hallazgo de bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) en
las muestras biológicas, a pesar de que por este método se requiere de que la
muestra contenga por lo menos 10 000 bacilos por mililitro, presentando una
sensibilidad del 60%. La situación actual de tuberculosis incluyendo la aparición
de cepas multirresistentes a los fármacos, ha provocado que se den cambios
dramáticos en el diagnóstico de esta enfermedad, no bastando con la
observación única de los bacilos en la muestra, sino resaltando la importancia
del aislamiento, la identificación taxonómica de la bacteria y la realización de un
antibiograma que marque de manera precisa el tratamiento para cada
individuo. Un cúmulo de esfuerzos y conocimientos en torno a la biología de las
micobacterias y a la patología de la tuberculosis se han generado en los
últimos 10 años, de tal forma que los enfoques y perspectivas del estudio de la
enfermedad han cambiado drásticamente. El área de diagnóstico de la
enfermedad ha sido una de las que más impacto ha tenido, de tal forma que es
oportuno que estos nuevos conocimientos empiecen a llevarse a la práctica.
Por esto, en este trabajo quisimos hacer una recopilación de las técnicas y
metodologías que consideramos las más viables de aplicarse en un laboratorio
de diagnóstico de tuberculosis, la selección de las técnicas se realizó con base
a varios criterios que incluyeron: a) la facilidad de realización; b) la rapidez en
la obtención de resultados; c) la independencia de reactivos comerciales; d) el
costo; e) la facilidad de obtención de los reactivos y preparación de los mismos.
A su vez la propuesta de este trabajo no solo implica la “repetición” de las
técnicas, implica el desarrollo de un algoritmo en donde se establezca la
secuencia de eventos y técnicas que permitan que se pueda dar un diagnóstico
rápido de la tuberculosis. Las técnicas y/o elementos para el desarrollo del
algoritmo aquí propuesto incluyen: 1.- para favorecer el aislamiento: a) la
utilización del medio líquido 7H9 “casero”, b) la utilización del medio sólido
7H11 en su formato de capa delgada en presencia de CO2; 2.- para permitir la
identificación del complejo tuberculosis: una técnica de PCR que amplifica una
región del 16S rRNA micobacteriano; 3.- para realizar la determinación de
sensibilidad a fármacos primarios y secundarios: el microensayo fluorométrico
del alamar azul.
HIPOTESIS
La recopilación de técnicas novedosas para el diagnóstico de la tuberculosis,
estructuradas de una manera secuencial, permitirán realizar un diagnóstico
rápido de la tuberculosis, que abarque desde la microscopía hasta la obtención
de un antibiograma a 16 fármacos. Este algoritmo permitirá la reducción en
tiempos y costos y aumentará la sensibilidad de la detección de la
enfermedad.
OBJETIVO GENERAL
Seleccionar un grupo de ensayos novedosos para el diagnóstico de la
tuberculosis, estandarizarlos a las condiciones de trabajo de nuestro
laboratorio, y establecer con ellos, un algoritmno que permita el diagnóstico
rápido a partir de muestras pulmonares con sospecha de tuberculosis.
OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Estandarizar y establecer la utilidad de los siguientes ensayos o
procedimientos:
a) La capa delgada en el aislamiento e identificación micobacteriana.
b) Del medio líquido 7H9 para favorecer el aislamiento micobacteriano.
c) De un ensayo de PCR para identificación del complejo tuberculosis a partir
de la micobacteria aislada en cualquiera de los medios utilizados en el
aislamiento.
d) Del microensayo fluorométrico de alamar azul a 16 antibióticos.
2.- Establecer una secuencia de eventos con los ensayos y procedimientos ya
estandarizados y desarrollar un algoritmo para el diagnóstico rápido de la
tuberculosis a partir de muestras pulmonares.
3.- Comparar los resultados con la metodología tradicional de diagnóstico en
muestras pulmonares.
MATERIAL Y METODOS
1.- Muestras biológicas.
Se procesaron 108 muestras de esputo de pacientes canalizados al Servicio de
Neumología del Hospital General de México, con diagnóstico probable de
tuberculosis, establecido básicamente por presentar tos persistente por más
de 4 semanas.
Los criterios de inclusión fueron:
a) muestras de pacientes con sospecha clínica de tuberculosis,
b) muestras de pacientes con falla o fracaso terapéutico.
Los criterios de exclusión fueron:
a) muestras seriadas de un mismo paciente
b) muestra no apropiadamente tomadas o refrigeradas por varios días.
2.- Baciloscopia.
Se realizó baciloscopia directa y del concentrado evidenciando los bacilos
acido-alcohol resistentes mediante la tinción de Ziehl-Neelsen, se registro el
resultado de ambos procedimientos.
El procedimiento realizado fue el siguiente:
1.- Para hacer el extendido se utilizó un aplicador o palillo de madera que
previamente astilló permitiendo así que se colectara el material caseoso o
mucopurulento y trasladarlo al portaobjetos para elaborar el frote. Se realizó un
frote de 2 cm de largo x 1 cm de ancho, haciendo movimientos circulares para
obtener una película uniforme.
2.- Dejar secar el frote a temperatura ambiente.
3.- Fijar el frote pasando la laminilla sobre la flama del mechero con suavidad 2
o 3 veces, evitando el sobrecalentamiento.
4.- Tinción del extendido:
a) Cubrir completamente cada portaobjeto con carbol-fucsina
b) Calentar (usando un hisopo de algodón mediano impregnado con alcohol)
las laminillas con la carbol-fucsina hasta producir vapores visibles.
c) Dejar de calentar y repetir la operación dos veces más. Esta operación debe
durar aproximadamente 5 minutos.
d) Enjuagar suavemente con agua hasta quitar el colorante laminilla. Inclinar la
laminilla para eliminar el exceso de agua.
e) Colocar sobre la superficie del portaobjetos alcohol ácido al 3% (solución
decolorante). E l alcohol ácido remueve la carbol-fucsina contenida en el frote a
excepción de la que ha teñido los bacilos. Por esta propiedad los bacilos son
conocidos como ácido alcohol resistentes. Dejar el alcohol ácido sobre el
portaobjetos de 1 a 2 minutos. Enjuagar cuidadosamente con agua. Inclinar el
portaobjetos para eliminar el exceso de agua.
f) Cubrir con azul de metileno todo el portaobjetos. El azul de metileno es el
colorante de contraste: tiñe todo menos el bacilo. Dejar el azul de metileno
sobre el portaobjeto no más de 1 minuto. Enjuagar cuidadosamente con agua.
Limpiar la parte inferior (cara opuesta a la del frote) del portaobjetos con un
algodón impregnado de con alcohol ácido para eliminar los restos de
colorantes, ya que éstos pueden interferir en la lectura.
g) Dejar secar y examinar el frote en el microscopio óptico a inmersión.
h) Analizar por 100 campos microscópicos y registrar el número de bacilos
observados, dar el resultado de la baciloscopía de acuerdo a la tabla 1.
Tabla 1. Clasificación de resultado de baciloscopia.
TABLA PARA CLASIFICAR EL RESULTADO DE LA BACILOSCOPIA
NEGATIVO No se observan BAAR en 100 campos microscópicosDe 1 a 9 BAAR Informar el número de BAAR en 100 campos observados POSITIVO (+)
Menos de un bacilo por campo en promedio (de 10 a 99 BAAR), en 100campos observados
POSITIVO (++) De uno a diez BAAR por campo en promedio en 50 camposPOSITIVO (+++) Más de 10 BAAR por campo en 20 campos observados
3.- Descontaminación de la muestra biológica.
Para preparar las muestras para cultivo se siguió el método tradicional de
Petroff de la siguiente manera:
1.- Colocar la muestra en un tubo para centrífuga, y se establecer el volumen
aproximado adicionando una cantidad similar de NaOH al 4% con rojo de fenol
incorporado.
2.- Agitar en un agitador automático (vortex) durante 20 seg.
3.- Incubar a 37º C durante 15 minutos.
4.- Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos.
5.- Eliminar el sobrenadante en un dispositivo a prueba de salpicaduras que
contenga fenol al 5%.
6.- Neutralizar el sedimento con HCL 1N hasta que el sedimento tome un color
amarillo paja ( pH cercano a la neutralidad).
7.- El sedimento está listo para cultivo.
4.- Cultivo.
Una de las variantes más importantes a analizar en este trabajo fue la
utilización de tres medios para favorecer el aislamiento micobacteriano. Así la
muestra biológica ya descontaminada y concentrada se sembró en 3 medios de
cultivo, por la naturaleza misma de la muestra biológica en la que algunas
veces es muy escasa y en otras abundante, el sedimento obtenido después de
la descontaminación, se dividió en tres partes iguales y cada una de ellas se
sembró en los tres medios seleccionados.
a) Agar Middlebrook 7H11 en su formato de capa delgada.
Por muestra se sembró una placa de capa delgada de agar Middlebrook 7H11
(Remel), adicionada de una mezcla de antibióticos (penicilina, trimetropim,
anfotericina B y piperazilina), para prevenir contaminaciones y con prueba de
esterilidad previa. Se sembró un tercio del sedimento concentrado
extendiéndolo en la mayor superficie del agar. Una vez absorbido el inóculo, la
placa se incubó a 37º C en presencia de CO2, en una cámara de anaerobiosis
con una vela o directamente en una incubadora con 5% de CO2. A partir del 3er
día se observó el desarrollo de microcolonias típicas de tuberculosis en el
microscopio óptico o invertido analizando su morfología colonial, para lo cual se
recurrió a un banco de imágenes previamente obtenido. Mediante comparación
se dió una identificación presuntiva de tuberculosis, y a su vez se estableció la
pureza del cultivo ya que se pudo determinar si solo existió un solo tipo
colonial o más. El cultivo de capa delgada se consideró positivo cuando se
observó el desarrollo de la microcolonia hasta que alcanzara un tamaño tal que
la hiciera manipulable, siendo esto alrededor de los 10-12 días de cultivo. El
cultivo se descartó después de 4 semanas de incubación o cuando el agar
empezó a secarse. Se corroboró la naturaleza micobacteriana de las colonias
mediante una tinción de Ziehl-Neelsen.
b) Tubo de caldo Middlebrook 7H9.
Se prepararon tubos de vidrio con tapón de rosca de 13x100, conteniendo 3 ml
de caldo Middlebrook 7H9 (Beckton-Dickinson), con enriquecimiento OADC
(ácido oléico, albúmina, catalasa y dextrosa, casero), y adicionado de una
mezcla de antibióticos para prevenir la contaminación (penicilina, trimetropim,
anfotericina B y piperazilina). Un tubo por muestra (con prueba de esterilidad
previa) se inoculó con un tercio del volumen obtenido del sedimento
concentrado y descontaminado y se incubó a 37°C. Se vigiló el desarrollo
bacteriano en el tubo por agitación cada tercer día. Un cultivo se consideró
positivo cuando estuvo puro y alcanzó una turbidez similar a la del tubo número
1 de McFarland, normalmente esto sucedió alrededor de los 10 días de
incubación, sin embargo se incubo hasta 8 semanas antes de descartar la
posibilidad de crecimiento bacteriano, evidenciado por observación visual y
microscópica. Una vez que se dió el crecimiento bacteriano, se confirmó si eran
bacilos ácido alcohol resistentes mediante una tinción de Ziehl-Neelsen. La
presencia de contaminación bacteriana en el caldo generalmente fue evidente
a las 48 horas de sembrada la muestra por los que los tubos con crecimiento
abundante en ese tiempo se analizaron por microscopia con tinción de Ziehl-
Neelsen y Gram, cuando resultaron contaminados se procedió a hacer una
descontaminación con acido sulfúrico al 4-15% dependiendo del grado de
contaminación.
c) Medio tradicional de Lowenstein-Jensen.
Para comparar la utilidad de los nuevos medios de aislamiento, paralelo a su
uso se sembró el medio tradicional de Lowestein-Jensen para lo cual por
muestra se sembró un tubo de este medio (con prueba de esterilidad previa)
con un tercio del sedimento concentrado y descontaminado. El tubo se incubó
a 37°C, una vez que se dió el desarrollo micobacteriano característico (colonias
típicas blancas a color crema, de aspecto rugoso a seco, que con el tiempo
toman forma de coliflor), se tomó una asada y se tiño por la técnica de Ziehl-
Neelsen. A la octava semana de incubación se dió un resultado negativo de
aislamiento si no se observó ningún crecimiento característico.
5. Identificación de complejo tuberculosis.
Las bacterias aisladas y puras obtenidas a partir del caldo 7H9 directamente
se utilizaron en el ensayo de identificación de PCR, mientras que las bacterias
aisladas a partir de los medios sólidos, después de comprobar que estaban
puras fueron resembradas en caldo 7H9 y a partir de ahí fueron utilizadas en el
ensayo de PCR.
Existen diversos métodos para identificar a las micobacterias, estos van desde
los métodos tradicionales basados en pruebas bioquímicas (Balandrano y col
1996), hasta los más novedosos que utilizan biología molecular, dentro de
estos se encuentra la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita por
Cobos-Marín y col. en el 2003, que detecta y amplifica una secuencia
característica del complejo M. tuberculosis, útil para distinguirlo de especies
micobacterianas no tuberculosas. Este ensayo permite identificar al complejo
tuberculosis en unas cuantas horas a partir de la bacteria crecida en medio
7H9 (Hernández, 2005). A continuación se describe con detalle el ensayo aquí
utilizado.
- Iniciadores. Se utilizaron 3 juegos de iniciadores que permiten la identificación
del complejo tuberculosis, del género Mycobacterium y la diferenciación de M
bovis (aunque este no fue objetivo primordial del trabajo)
a. Identificación del complejo tuberculosis: MTB-F (5’ CGG GTA TGC TGT
TAG GCG ACG 3’)/MTB-R (5’ CCA CCA CAA GAC ATG CATG 3’), estas
secuencias amplifican un fragmento de 488 bp, del gen que identifica al
complejo tuberculosis y son la secuencia complementaria de la región
promotora múltiple hipervariable (HMPR), el rrnA del operón y la región V2,
en su posición 192-210, estas dos últimas se localizan dentro del gen 16S
rRNA
b. Identificación de M. bovis: RD4F (5’ GAC ATG TAC GAG AGA CGG CAT
GAG 3’)/RD4-R (5’ AAT CCA ACA CGC AGC AAC CAG 3’), estos
iniciadores codifican para una región de 1031 bp ausente en M. bovis y que
corresponde a la región RD4 presente en el resto de los miembros del CMT.
c. Identificación del género Mycobacterium: RAC1 (5’ TCG ATG ATC ACC
GAG AAC GTG TTC 3’)/RAC8 (5’ CAC TGG TGC CTC CCG TAGG 3’),
secuencias que identifican al género Mycobacterium a través de la
amplificación de una región de 934 bp correspondiente al gen murA, la
región múltiple hipervariable (HMPR) y el gen 16S rRNA.
-Condiciones de la PCR. El procedimiento de amplificación se realizó de
acuerdo a las condiciones descritas por Cobos-Marín y col. 2003, utilizando las
siguientes constantes:
a. MTB-F/MTBR (complejo tuberculosis): 36 ciclos de desnaturalización a
95 °C/30 seg, alineación a 55 °C por 1 min, extensión a 72 °C por 2 min y
un ciclo final a 72 °C por 5min; se utilizó un volumen de la mezcla de
reacción de 40 µl, conteniendo MgCl2 1.7 mM, 0.4 µM de cada iniciador, 200
µM de dNTP’s, 1U de Taq polimerasa (Life Technologies, Gaithersburg,
MD, USA) y 10 µl de DNA genómico, el volumen total (50 µl) fue
previamente hervido durante 1 minuto.
b. RAC1/RAC8 (género Mycobacterium): 36 ciclos de desnaturalización a 94
°C/1min, alineación a 58°C/1min, extensión a 72°C/2min y un ciclo final a 72
°C/5min; se utilizó un volumen de la mezcla de reacción de 50 µl,
conteniendo MgCl2 1.5 mM, 0.4µM de cada iniciador, 200 µM de dNTP’s, 1U
de Taq polimerasa y 10 µl de DNA genómico, todo previamente hervido 1
minuto.
c. RD4F/RD4R (diferenciación de M. bovis): 36 ciclos de desnaturalización a
95°C/30seg, alineación a 55°C/1min, extensión a 72°C/2min y un ciclo final
a 72°C/5min; el volumen de la mezcla de reacción fue de 50 µl, conteniendo
MgCl2 1.5 mM, 0.4µM de cada iniciador, 200 µM de dNTP’s, 1U de Taq
polimerasa, 10% de DMSO y 10 µl de DNA genómico previamente hervido 1
minuto.
-Identificación de los productos. Los productos de las PCRs se corrieron a 80V
en un gel neutro de agarosa al 1%, teñido con 5 µg/ml de bromuro de etidio y
fueron visualizados en un transiluminador de luz ultravioleta (Vilber-Lourmat).
6.- Determinación de sensibilidad por el microensayo flouorométrico de alamar
azul.
Una vez que se obtuvo el cultivo puro a partir de caldo 7H9 directamente o por
subcultivo proveniente de los medios sólidos, se realizó la determinación de
sensibilidad a 16 fármacos por el método de alamar azul. El alamar azul es un
colorante de oxido-reducción usado como un indicador de viabilidad de
crecimiento celular cuya forma oxidada es azul y no fluoresce y la reducida es
rosa y fluoresce, pudiendo detectarse y cuantificarse dicha propiedad en
unidades relativas de fluorescencia (RFU) (Collins y col. 1997, y Luna-
Herrera, 2006). El ensayo había sido estandarizado a 12 fármacos (Mijares,
2003). En este trabajo extendimos la determinación a 4 fármacos más
completando así la determinación a 16 fármacos totales. Los 4 fármacos
estandarizados fueron: capreomicina, ciprofloxacina, enrofloxacina y
tiacetazona.
-Estandarización de fármacos adicionales.
Las condiciones de trabajo fueron similares a las descritas por Mijares en 2003,
con algunas modificaciones. De cada fármaco se ensayaron 10
concentraciones de contra un grupo de 50 aislados clínicos de M. tuberculosis
provenientes de la colección de aislados de Laboratorio de Neumología del
Hospital General de México. Cada aislado fue analizado paralelamente por el
método estándar de oro, representado por la modificación del Nacional Jewish
Center al método de las proporciones de Canetti en el que se emplearon 3
concentraciones de cada uno de los fármacos y determinando el número de
unidades formadoras de colonias después de 3 semanas de incubación, para
establecer si el aislado era susceptible o resistente, se contabilizó el número de
colonias en el medio sin fármacos, se estableció el 1% de colonias y se
comparó con el número de colonias obtenidas en el medio con fármaco
(Heifiets, libro). Para establecer la concentración critica del método de alamar
azul, misma que se utilizaría como criterio de sensibilidad/resistencia, se
elaboraron las correspondientes curvas ROC en el programa Medcal ver 7.0
utilizando como referencia el resultado obtenido por el estándar de oro
(sensible o resistente) y como variable la concentración mínima inhibitoria
encontrada por el método de alamar azul, de esta manera, se determinó la
concentración critica para cada fármaco, parámetro que permitió establecer el
criterio de resistencia/ sensibilidad para cada aislado.
-Fármacos.
Se prepararon soluciones “stock” o concentradas de los fármacos solubles en
agua, en agua millipore, esterilizándose posteriormente por filtración. Las
soluciones de rifampicina, clofazimina, rifabutina, etionamida y cicloserina se
prepararon en dimetil-sulfóxido. La tiacetazona se preparó en NN-dimetil
formamida. Todas las soluciones stock se almacenaron en alícuotas pequeñas
a – 70º C hasta su uso.
Los fármacos utilizados fueron: estreptomicina (STR), isoniacida (INH),
rifampicina (RIF), etambutol (EMB), rifabutina (RIB), etionamida (ETM),
kanamicina (KA), amikacina (AM), cicloserina (CS), ofloxacina (OFX),
claritromicina (CLA), clofazimina (CLO), enrofloxacina (ENRO), ciprofloxacina
(CIPRO), tiacetazona (TZ) y capreomicina (CAPREO).
-Preparación del inóculo para el microensayo de alamar azul.
Se trabajó con aislados clínicos recuperados en medio 7H9 que alcanzaron la
turbidez del tubo número 1 del Nefelómetro de McFarland, los cuales se
diluyeron 1:10 en caldo 7H9 suplementado con 10% de enriquecimiento OADC,
esta suspensión se preparó justo antes de la inoculación de la microplaca.
-Ensayo en microplaca.
El ensayo se realizó en microplacas de 96 pozos, para cada aislado se
utilizaron 2 placas, en cada placa se probaron 8 fármacos a 6 concentraciones,
distribuidos de la columnas 2 a la 9 y de las filas B a la G. Todos los pozos
recibieron 100 μl de medio 7H9 enriquecido con OADC. Posteriormente se
adicionaron 100 μl de solución de cada fármaco a una concentración 4 veces
mayor (4X) a la máxima a ser analizada. Con una pipeta multicanal se mezcló
el contenido de esos pozos y se realizaron las correspondientes 5 diluciones
seriadas adicionales, descartando los últimos 100 μl restantes. Posteriormente
se agregaron 100 μl del inóculo de M. tuberculosis preparado previamente, a
cada uno de los pozos conteniendo fármaco y también en los controles sin
fármaco, también se preparó un control de referencia sin fármaco y
conteniendo el inóculo correspondiente al 1% del cultivo ensayado. El rango
de concentración final para cada uno de los compuestos fue la siguiente: STR
(0.25-8.0 μg/ ml), INH (0.3-1.0 μg/ml), RIF (0.6- 2.0 μg/ml), EMB 1.0 – 32
μg/ml), RIB (0.06 - 2.0 μg/ml), ETM ( 0.3-10.0 μg/ml), KM (0.3-10.0 μg/ml), AM
(0.5-16 μg/ml), CS (1.25-40 μg/ml), OFX (0.25-8 μg/ml), CLA (1.0-32 μg/ml),
CLO (0.6-4 μg/ml), ENRO (0.25-8 μg/ml), CIPRO (0.25-8 μg/ml), CAPREO (0.3-
10.0 μg/ml) y TZ (1.25-40 μg/ml).
Una vez preparados los pozos con fármacos y los controles de 100 y 1% de
inóculo, las placas se taparon, se aseguraron con cinta adhesiva en los lados,
se introdujeron en una bolsa transparente y se incubaron a 37°C durante 5
días. El día 5 de incubación se inspeccionó el crecimiento del control con 100%
de inóculo en un microscopio invertido, si el crecimiento era visible y
abundante, se procedió a revelar las dos placas adicionando 25 μl de solución
de alamar azul y 13 μl de tween 80 al 20% estéril por pozo, en los casos en los
que el crecimiento fue escaso, las placas se reincubaron hasta observar el
crecimiento abundante. Las placas reveladas se incubaron por 24 horas
adicionales tiempo al cual se determinaron las unidades relativas de
fluorescencia en un fluorómetro (Fluoroskan Ascent) con los filtros de
excitación de 490 nm y de emisión de 540 nm.
La concentración mínima inhibitoria (MIC) fue definida como la mínima
concentración que presentó valores de RFU menores o iguales al control
conteniendo el 1% de bacteria.
RESULTADOS
1.- Baciloscopía.
Para este trabajo se colectaron y analizaron 108 muestras de esputo de
pacientes canalizados al Servicio de Neumología del Hospital General de
México, con diagnóstico probable tuberculosis pulmonar por ser tosedores
crónicos, no se sesgó el estudio a casos con síntomas radiológicos o clínicos
presuntivos de tuberculosis. Es pertinente señalar que en este servicio
únicamente se someten a descontaminación por Petroff y cultivo las muestras
que por baciloscopía directa son positivas o aquellas que son de seguimiento
de tratamiento, representando un aproximado del 2 % de la totalidad de
muestras recibidas en dicho servicio que llegan a ser hasta 5000 en un año
(QBP. Francisco Salinas, Jefe de la Unidad, comunicación personal). En este
servicio el cultivo únicamente lo realizan en el medio comercial de MGIT
(Beckton-Dickinson), y si es positivo se resiembra en Lowestein-Jensen para su
identificación con las pruebas básicas de niacina y nitratos (Balandrano, 1996).
En nuestro caso no quisimos hacer ninguna modificación en el procedimiento
de descontaminación para no alterar el trabajo rutinario de dicho servicio, de
tal forma que el procesamiento inicial de la muestra fue el que rutinariamente
se sigue en dicha unidad. Sin embargo, en nuestro caso la totalidad de las 108
muestras procesadas fueron sometidas a concentración y cultivo
independientemente de su resultado de baciloscopía. De estas 108 muestras, 5
fueron BAAR positivo en la baciloscopia directa y 103 fueron BAAR negativo. A
las 108 muestras se les realizó BAAR por concentración y cultivo. El resultado
de BAAR por concentración permitió que se detectara una muestra más,
alcanzándose un total de 6 muestras positivas (tabla 4).
2.- Cultivo.
a) Tubo casero con caldo 7H9.
Después de hacer la descontaminación por el método de Petroff, se realizó el
cultivo en el medio 7H9, los tubos se incubaron a 37º C hasta por 42 días, se
revisaron 2 veces por semana, agitándolos para observar el crecimiento en el
fondo del tubo, en aquellos tubos en los que se observó crecimiento se
procedió a hacerles un frote y se tiñó por la técnica de Ziehl Neelsen para
determinar la existencia de BAAR y su pureza. De las 108 muestras
procesadas, 6 crecieron puras en este medio en un promedio de 6-13 días,
representando así un 5.5% de recuperación (tabla 4), de estos aislados uno de
ellos creció de manera poco usual en este medio después de 13 días de
cultivo, con este aislado no se pudo realizar ni la PCR, ni la sensibilidad a
fármacos, y eventualmente se perdió.
b) Placa con capa delgada de agar 7H11.
Las muestras sembradas en este medio se incubaron a 37º C en atmósfera de
CO2, se revisaron 3 veces por semana en el microscopio óptico a seco débil o
en el microscopio invertido con el objetivo 20x, para observar el desarrollo de
las microcolonias y poder compararlas con un banco de imágenes y así dar un
diagnóstico presuntivo de la especie micobacteriana aislada. En la figura 1 se
presentan 2 microcolonias con crecimiento compatible al de M. tuberculosis
observadas después de 7 días de cultivo. Las muestras en este medio se
incubaron por un mes antes de considerarlas como negativas. En este medio
se aislaron 7 muestras de las 108 probadas con un 6.5% de recuperación
(tabla 3). La incubación de la capa delgada en presencia de CO2 favorece el
crecimiento de la micobacteria como lo demuestra la fotografía mostrada en la
figura 2 (generosamente donada por el Dr. Isidoro de Paz Palacios, quien en
nuestro laboratorio mostró que la capa delgada en ese ambiente favorece
sustancialmente el desarrollo micobacteriano).
A B
Figura 1. Microcolonias compatibles con M. tuberculosis obtenidas en capa
delgada. Se muestran 2 fotografías de colonias obtenidas en capa delgada
después de 12 días de cultivo, las colonias se observaron en un microscopio
invertido a un aumento de 200x.
c) Medio de Lowenstein Jensen.
Las muestras sembradas en este medio se incubaron a 37º C por 2 meses
antes de darlos negativos, haciendo la revisión 1 vez por semana. Los aislados
que se obtuvieron en este medio se identificaron por los métodos tradicionales
(niacina y reducción de nitratos). De las 108 muestras procesadas y sembradas
en este medio, 6 presentaron crecimiento en este medio (6.5% de
recuperación), con un tiempo de recuperación >18 días. En comparación con el
medio 7H11 en presencia o ausencia de C02, el crecimiento en Lowestein-
Jensen es mas escaso, como se muestra en la figura 2.
Figura 2. Recuperación micobacteriana en varios medios de cultivo.
Comparación de la recuperación micobacteriana en medio 7H11 en ausencia
de C02 (placa izquierda) en presencia de C02 (placa derecha) y en Lowestein-
Jensen después de 20 días de cultivo. Fotografía perteneciente al Dr. Isidoro de Paz y reproducida
con su permiso.
De esta manera, en la figura 3 y tabla 4 se resumen los resultados que
comparan la eficiencia de recuperación de muestras en los 3 medios utilizados
con respecto al tiempo.
0
1
2
3
4
5
6
1 a 6 7 a 10 11 a 15 16 a 37 38 a 45
Días de cultivo
No. m
uest
ras
posi
tivas
7H9
7H11
L-J
Figura 3. Tiempo de recuperación en los diferentes medios de aislamiento. Se
presenta la distribución de muestras positivas en los diferentes medios de
cultivo, el tubo con caldo 7H9 (7H9), la capa delgada (7H11) y Lowestein-
Jensen (L-J).
3.- Reacción en cadena de la polimerasa.
Una vez que se obtuvieron los aislados en medio líquido 7H9, se procedió a
realizar la PCR para la identificación del complejo tuberculosis. Se analizaron
los 8 aislados obtenidos en los diferentes medios, sin embargo solamente se
pudo realizar la determinación con 7 de ellos, el aislado que no pudo
identificarse fue el proveniente de caldo que mostró un crecimiento “diferente”
al del resto de los aislados. Se encontró que los 7 aislados dieron positivos a
las reacciones de PCR (tabla 2), confirmando que los aislados pertenecían al
género Mycobacterium, al complejo tuberculosis y que ninguno de ellos era M.
bovis.
Tabla 2. Resultados de PCR.
4.- Estandarización del ensayo de alamar azul a 4 fármacos adicionales.
MTBIdentificación de
complejo tuberculosis
RD4Descarta a
M. bovis
RAC 1/ RAC 8Identificación de género
Mycobacterium
MUESTRA 1 POSITIVO POSITIVO POSITIVO
MUESTRA 2 POSITIVO POSITIVO POSITIVO
MUESTRA 3 POSITIVO POSITIVO POSITIVO
MUESTRA 4 POSITIVO POSITIVO POSITIVO
MUESTRA 5 POSITIVO POSITIVO POSITIVO
MUESTRA 6 POSITIVO POSITIVO POSITIVO
MUESTRA7 POSITIVO POSITIVO POSITIVO
El ensayo de alamar azul se tenía estandarizado a 12 fármacos (Mijares,
2003), por lo que se decidió incluir 4 fármacos adicionales potencialmente útiles
en el tratamiento de la tuberculosis resistente: capreomicina, tiacetazona,
ciprofloxacina y enrofloxacina. Se ensayaron 50 aislados clínicos por el método
fluorométrico de alamar azul y por el de proporciones en agar 7H11. La
mayoría de los aislados fueron sensibles a los 4 fármacos , sin embargo se
pudieron realizar las correspondientes curvas ROC con el programa Medcalc.
Como ejemplo, se presenta en la figura 4 la curva ROC obtenida en la
determinación de a capreomicina. En la tabla 3 se presenta un resumen de los
resultados obtenidos en la estandarización hacia los fármacos, donde se
observa que las determinaciones a ciprofloxacina, capreomicina y enrofloxacina
fueron las de mayor sensibilidad y especificidad. La determinación a
tiacetazona tuvo el gran problema de que el fármaco por sí solo tiende a
reducir el colorante, de tal forma que en esta determinación siempre se tiene
que preparar una serie con fármaco únicamente y restarle dicho valor al de su
correspondiente serie con fármaco y bacteria.
CAPREOMICINA
0 40 80100-Specificity
100
80
60
40
20
0
Sens
itivi
ty
Tabla 3. Resumen de resultados obtenidos en la estandarización a 4 fármacos.
FÁRMACOSENSIBILIDAD
%ESPECIFICIDAD
%
RANGODE
ENSAYO
µg/ml
CONCENTRACIÓNCRÍTICA
µg/ml
AREABAJO
LA CURVA ROC
ENROFLOXACINA 100 100 16-0.5 >1 R* 1
CIPROFLOXACINA 100 100 16-0.5 >1 R 1
TIACETAZONA 86 82 40-1.25 >10 R 0.88
CAPREOMICINA 100 97 40-1.25 >10 R 0.99
*R= resistente
Figura 4. Análisis ROC de la determinación a capreomicina por el método de
alamar azul. En este ensayo se alcanzó un 100% de sensibilidad y un 97% de
especificidad, con un punto de corte (concentración crítica) de 10 µg/ml y un
área bajo la curva de 0.99.
5.- Determinación de sensibilidad a fármacos de los aislados recuperados.
De los 8 aislados recuperados en alguno de los medios, únicamente se pudo
realizar la determinación de sensibilidad a 16 fármacos (incluyendo los 4
adicionales), el único aislado que no pudo determinarse fue el que presentó
características “diferentes” de crecimiento. De los 7 aislados analizados, 6
fueron sensibles a todos los fármacos y uno resistente a isoniacida, rifampicina
y en el límite de resistencia a etambutol. En la tabla 4 se presenta un resumen
de los resultados obtenidos en la determinación de sensibilidad de los aislados
recuperados en este trabajo.
6.- Desarrollo de algoritmo de trabajo y su desempeño.
Los resultados arrojados de este trabajo nos permitieron establecer un
algoritmo de diagnóstico rápido que pudiera ser aplicado a muestras clínicas
pulmonares. El algoritmo quedaría como se muestra en el diagrama de flujo
presentado en la figura 5.
Figura 5. Algoritmo de diagnóstico rápido de tuberculosis con métodos
novedosos.
El algoritmo propuesto en materia de tiempo permite que en un tiempo
relativamente corto, se pueda dar el diagnóstico y la sensibilidad fármacos. En
la tabla 4 se presenta una resumen de todos los datos procesados en este
trabajo con el grupo de 108 muestras procesadas, y como se puede observar la
mayoría de las muestras con sospecha de tuberculosis fueron negativas por
todos los métodos realizados, sin embargo, en las muestras con baciloscopia
positiva se logró la recuperación bacteriana en un 100% de los casos, en un
tiempo promedio de 6 a 15 días en capa delgada, mientras que en el medio
líquido se logró en un tiempo promedio de 6 a 10 días. La combinación de los
medios 7H9 y 7H11 permitió un 7.45% de recuperación (8 aislados) del grupo
total de muestras procesadas, mientras que el medio L-J permitió el 5.5% de
DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE TB
MUESTRA BIOLOGICA
DESCONTAMINACION
-LIQUIDO-CAPA DELGADA-L-J PCR
IDENT
ALAMARAZUL
BAAR DIRECTO
MÉT. DE PETROFF
Día 1Diagnóstico
Completo entre 17-26 días5 semanas
Día 1
Día 6-15Día 6-15Día 37-45
Día 14-23
Día 8- 17
recuperación en un tiempo mayor a los 30 días. En la tabla 5 se presenta un
resumen de recuperación de crecimiento bacteriano por medio de cultivo. Es
importante señalar que el algoritmo permitió la recuperación de muestras
baciloscopia negativa en un porcentaje elevado ya que de las 8 muestras
recuperadas 3 fueron negativas en la baciloscopia directa, representando un
37.5% de la recuperación total, que de no haberse incluído en nuestro
protocolo se hubiera perdido. El análisis de PCR demostró que todas las cepas
recuperadas pertenecían al complejo tuberculosis y los resultados de
sensibilidad demostraron que 6/7 cepas fueron sensibles a los fármacos
primarios (SIRE) y secundarios analizados, sólo una presentó resistencia a
etambutol, resistencia parcial a isoniacida, en el limite de
sensibilidad/resistencia a rifampicina y sensible al resto de los fármacos
ensayados. El tiempo total de realización del algoritmo desde el procesamiento
de la muestra hasta la obtención del resultado de PCR y Alamar azul se pudo
realizar en un tiempo máximo de 5 semanas.
Tabla 4. Resumen de resultados obtenidos con el algoritmo de diagnóstico
rápido de tuberculosis aplicado a 108 muestras pulmonares
No.
Muestras
Procesadas
BAAR
DIRECTO
BAAR
CONCENTRADO
7H9
Caldo
7H11
Capa
delgada
LJ PCR ALAMAR
AZUL
Positivas 5 5 6 7 67
CTB*
7
6 (S)
1(EIR-r)
Negativas 103 103 102 101 102 - -
Total 108 108 108 108 108 7 7
Total de muestras con aislamiento positivo= 8 (5 BAAR+ ; 3 BAAR-)
Una muestra recuperada únicamente en 7H9 no pudo subcultivarse en capa delgada, ni en
medio Lowestein-Jensen, ni procesarse para PCR, ni alamar azul.* CTB = identificación como perteneciente a complejo tuberculosis. (S) = sensibles a fármacos primarios (EIR-r) = resistencia a fármacos etambutol, isoniacida, rifampicina
Tabla 5. Resumen de recuperación de aislados en los diferentes medios de
cultivo.
No. muestraBAAR
directo
BAAR
concentración7H9
Capa
delgadaL-J
1 + + + + +2 + + + + +3 + + + + +4 + + + + +5 + - + + +6 - + - + +7 - - + - -8 - - - + -
Total 5 6 6 7 6DISCUSION
La situación actual de tuberculosis incluyendo la aparición de cepas
multirresistentes a los fármacos, ha provocado que se den cambios dramáticos
en la concepción del diagnóstico de esta enfermedad, no bastando con la
observación única de los bacilos en la muestra, sino resaltando la importancia
del aislamiento, la identificación taxonómica de la bacteria y la realización de un
antibiograma que marque de manera precisa el tratamiento para cada
individuo, sobre todo de aquellos pacientes que portan a una micobacteria multi
o polifarmacorresistente (MDR o XDR) (WHO, 2006). Un cúmulo de esfuerzos
y conocimientos en torno a la biología de las micobacterias y a la patología de
la tuberculosis se han generado en los últimos 10 años, de tal forma que los
enfoques y perspectivas del estudio de la enfermedad han cambiado
drásticamente. El área de diagnóstico de la enfermedad ha sido una de las que
más impacto ha tenido, de tal forma que es oportuno que estos nuevos
conocimientos empiecen a llevarse a la práctica.
Después de analizar las diferentes propuestas, decidimos hacer una
selección de aquellas que ofrecían los atributos que les permitieran una fácil
implementación en un laboratorio de rutina de diagnóstico de tuberculosis, sin
muchos recursos, ni mucho personal, de tal forma que aquellas propuestas
laboriosas, costosas y/o dependientes de reactivos comerciales fueron
descartadas. Consideramos que las técnicas seleccionadas por nosotros
cumplen con varios de los siguientes criterios: a) la facilidad de realización; b)
la rapidez en la obtención de resultados; c) la independencia de reactivos
comerciales; d) el costo; e) la facilidad de obtención de los reactivos y
preparación de los mismos; f) buena correlación con los métodos tradicionales.
A su vez la propuesta de este trabajo no solo implicó la “repetición” de las
técnicas publicadas, implicó el desarrollo de un algoritmo que permita que se
pueda dar un diagnóstico de la tuberculosis más rápido que el convencional,
sin que sea tan costoso ni tan laborioso y si muy preciso. De alguna manera
nuestra propuesta tiene elementos en común con la propuesta de Iseman (libro
iseman), que incluye la diversificación de los medios para favorecer el
aislamiento, incluyendo el uso de un medio líquido, el uso de una técnica
molecular para la identificación (aunque comercial) y la utilización de el método
comercial de MGIT para la detección de sensibilidad. Como resulta evidente, el
costo de la propuesta de Iseman es muy elevado.
El desarrollo del algoritmo aquí propuesto incluye: 1.- para favorecer el
aislamiento: a) la utilización del medio líquido 7H9 “casero”, b) la utilización del
medio sólido 7H11 en su formato de capa delgada en presencia de CO2; 2.-
para permitir la identificación del complejo tuberculosis: una técnica de PCR
que amplifica una región del 16S rRNA micobacteriano; 3.- para realizar la
determinación de sensibilidad a fármacos primarios y secundarios: el
microensayo fluorométrico del alamar azul. Después de familiarizarse,
reproducir y estandarizar en nuestras condiciones de trabajo las técnicas
seleccionadas, se incluyeron en el protocolo 108 muestras pulmonares que
rutinariamente se colectan en el Laboratorio de Neumología del Hospital
General de México.
Como se pudo observar la mayoría de las muestras con sospecha de
tuberculosis fueron negativas por todos los métodos realizados, en el 100% de
las muestras con baciloscopia positiva se logró la recuperación bacteriana en
un tiempo promedio de 6 A 15 días en capa delgada, mientras que en el medio
líquido se logro en un promedio de 6 a 10 días. La combinación de los medios
7H9 y 7H11 permitió un 6.5% de recuperación (7 aislados) del grupo total de
muestras procesadas, mientras que el medio L-J únicamente permitió el 2.7%
de recuperación. El análisis de PCR demostró que todas las cepas pertenecían
al complejo tuberculosis y los resultados de sensibilidad demostraron que 6/7
cepas fueron sensibles a los fármacos primarios (SIRE) y secundarios
analizados, sólo una presentó resistencia a etambutol, resistencia parcial a
isoniacida, en el limite de sensibilidad/resistencia a rifampicina y sensible al
resto de los fármacos ensayados. El tiempo total de realización del algoritmo
desde el procesamiento de la muestra hasta la obtención del resultado de PCR
y Alamar azul se ha realizado en un tiempo máximo de 5 semanas.
Sabemos que el tamaño de muestra por nosotros trabajada es limitada
para proponer o hacer conclusiones finales Sin embargo, la perspectiva de este
trabajo es la de incrementar su tamaño para poder robustecer los hallazgos
hasta ahora obtenidos, esperamos aumentar el estudio a por lo menos 520
especimenes clínicos analizados, siendo este un número estadísticamente
significativo y representativo de total aproximado de muestras que se procesan
en el Laboratorio de Neumología del Hospital General en un año de trabajo.
Después de esto se valorara integralmente el desempeño del algoritmno,
incluyendo costo, eficiencia, ventajas, desventajas.
CONCLUSIONES
1. La determinación de sensibilidad a las quinolonas ciprofloxacina y
enrofloxacina por el método de alamar azul fue exitosa, con alta
sensibilidad y especificidad.
2. La tiacetazona es un fármaco que a altas concentraciones reduce el
alamar azul, por lo que en su determinación es necesario restar siempre
el blanco de fármaco al problema con bacteria.
3. La combinación de medios 7H9 (tubo casero), 7H11 (capa delgada) y
Lowestein-Jensen permiten una recuperación mayor a la obtenida con
uno de los medios solos, dentro de los cuales el de mayor recuperación
en menor tiempo fue el 7H9 seguido de la capa delgada.
4. El medio de capa delgada permite establecer la pureza del cultivo y dar
un diagnóstico compatible con tuberculosis mediante la observación de
la microcolonia bajo el microscopio óptico o invertido.
5. Se estableció un algoritmo que permitió el diagnóstico de tuberculosis a
partir de la colecta de la muestra biológica en un tiempo máximo de 5
semanas, con determinación de sensibilidad a 16 fármacos e
identificación de pertenencia (o no) al complejo tuberculosis.
6. Con el algoritmo de diagnóstico rápido se pudo obtener una
recuperación de 7.4%, de haberse dado el diagnóstico de la manera
tradicional solamente se hubiera tenido una recuperación cercana al 4%.
7. El 100% de las muestras baciloscopia positiva pudieron ser
recuperadas, identificadas y determinarles su patrón de sensibilidad a
fármacos mediante el protocolo de diagnóstico rápido.
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