INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA - UNCP

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

FACULTAD DE AGRONOMÍA

INFORME DE PRÁCTICAS PRE PROFESIONALES

Presentado por:

BULLÓN CASTILLO, Erika Wendy

HUANCAYO – PERÚ

2012

ÍNDICE PRIMERA PARTE

INTRODUCCIÓN 3

OBJETIVOS 4

I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5

1.1 TÉCNICAS Y EQUIPOS DE LABORATORIO 5

1.2 EXTRACCIÓN DE DNA 8

1.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS 10

1.4 CORTES HISTOLÓGICOS DE TEJIDO VEGETAL 12

1.5 RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS 15

II. LUGAR DE EJECUCIÓN Y UBICACIÓN GEOPOLÍTICA 18

III. PLAN Y CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DESARROLLADAS 19

IV. DESCRIPCIÓN DE LAS PRÁCTICAS 20

4.1 RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO 20

4.2 EXTRACCIÓN DE DNA 24

4.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS 27

4.4 CORTES HISTOLÓGICOS DE TEJIDO VEGETAL 32

4.5 RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS 35

V. CONCLUSIONES 43

VI. RECOMENDACIONES 44

VII. BIBLIOGRAFÍA 45

VIII. ANEXOS 46

2

INTRODUCCIÓN

El presente informe de Prácticas Pre-profesionales describe las actividades realizadas

en el Instituto de Biotecnología e Ingeniería Genética de la Universidad Nacional del

Centro del Perú, realizado desde el 31 de enero al 31 de marzo de 2011 para cumplir

un requisito académico y optar el grado de bachiller en Agronomía

Además se tiene en cuenta que en Biotecnología e Ingeniería Genética, la

investigación está tomando mayor importancia en su contexto cognoscitivo y práctico a

través de la creatividad e innovación científica.

En este marco académico juega un rol importante este Instituto, donde se logra mejorar

las capacidades y habilidades de uso y manejo de herramientas adecuadas para la

investigación genética de la Agronomía. Asimismo se trabajó diversas técnicas

científicas en distintas investigaciones que sirvieron de motivación para ampliar los

conocimientos en biotecnología y biología.

También se describen las actividades realizadas que fueron, extracción de DNA de

tejidos vegetales, cultivo de bacterias y microorganismos, análisis de bacterias

colifecales en agua potable de la UNCP, reconocimiento de proteínas y cortes

histológicos vegetales; entre otros. Las que se consideraron relevantes por su utilidad

necesaria y esencial para el desarrollo integral de la agricultura en nuestro país fueron

la extracción de DNA y el cultivo de bacterias y microorganismos.

.

3

OBJETIVOS:

Objetivo General:

Ensayar algunas actividades prácticas relevantes en el laboratorio de genética y

biotecnología aplicadas a la solución de problemas agronómicos.

Objetivos Específicos:

Reforzar habilidades y destrezas en el manejo de laboratorio en biotecnología

que permita la incorporación de esta área en la investigación científica de acuerdo con

las necesidades de la Región Central.

Adquirir herramientas adecuadas de la biotecnología para utilizarlas en el

campo de acción del ingeniero agrónomo en la investigación genético-científica.

4

I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1 TÉCNICAS Y EQUIPOS DE LABORATORIO

1.1.1 TÈCNICA DE MICROSCOPÍA

Conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los objetos de estudio

que por su pequeñez están fuera del rango de resolución del ojo normal. Si bien el

microscopio es el elemento central de la microscopía, el uso del mismo requiere

para producir las imágenes adecuadas, de todo un conjunto de métodos y técnicas

afines pero extrínsecas al aparato.

Tipos de Microscopía:

Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a

observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y

revelan detalles que no aprecian de otra manera.

Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La

luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente

coloreados.

El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un

cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se

encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja

en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como un

fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como

una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para

analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con

iluminación normal.

- Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el

contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal

para especímenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina

el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo

oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y

5

entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de

anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un

cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones

minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo

visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos,

por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina.

1.1.2 MATERIALES VOLUMÉTRICOS

- Pipetas y pipeteadores

Se usan para medir volúmenes de líquidos de forma más precisa que con una

probeta. Y son más versátiles, sobre todo al manejar volúmenes pequeños.

Las pipetas de bulbo son útiles para medir volúmenes que no requieren de

mucha precisión. Las pipetas volumétricas vienen en distintos tamaños, desde 1

ml hasta 200 ml, y con distintas formas, de acuerdo al uso que se les dé.

- Micropipetas

Son extremadamente útiles en los laboratorios de biotecnología. Estas permiten

medir con precisión volúmenes tan pequeños como 0.1 μl hasta 1 ml. Estas

requieren de unos pipeteadores especiales que deben ser tratados con mucho

cuidado para evitar que se descalibren. Los pipeteadores son de distintos tipos.

La mayoría pueden servir muestras individuales. También pueden usarse para

muestras múltiples, por medio de multicanales: pipetas que sirven 8 o 12

muestras a la vez.

- Fiolas: Existen de diferentes denominaciones, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y

1000 ml, este material no debe calentarse a temperaturas altas ya que se

dañara su aforo afectando en su precisión.

- Buretas: Existen las microburetas de 10 ml y las normales de 25, 50, 100 ml.

Obviamente tiene mayor precisión las de menor volumen. Siempre llenarse

más arriba del cero y luego abrir la llave para que la solución pase al pico,

6

tener cuidado de que no queden burbujas. Es importante que antes de utilizar

una bureta se compruebe su buen funcionamiento.

1.1.4 TÉCNICAS Y EQUIPOS PARA MARCADORES MOLECULARES

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos

nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Para la

separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida(fibras cruzadas, como una

malla). Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se

moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se moverán

mejor y más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes

quedarán cerca del lugar de partida.

- Aparatos de electroforesis

Son cámaras que contienen un circuito eléctrico expuesto a un líquido

electrolítico, llamado amortiguador. El aparato se usa para separar mezclas de

moléculas grandes de acuerdo a su carga y/o su tamaño. La técnica consiste en

inocular la muestra en un medio semisólido, la fase estacionaria, que se somete

a un campo eléctrico, en una cámara donde en un extremo se encuentra un

filamento que actúa como polo positivo, y en el extremo opuesto hay otro

filamento formando el polo negativo. Las moléculas con cargas netas positivas

se moverán hacia el polo negativo y las de carga negativa se irán hacia el polo

positivo. Dependiendo del tipo de electroforesis, las moléculas que viajen hacia

uno de los polos se separarán por tamaño, viajando más en la fase estacionaria

las moléculas más pequeñas. El tipo y concentración de la fase estacionaria

dependerá del tipo de moléculas que nos interesa correr.

- Centrífugas

Son muy útiles para precipitar células y moléculas. Vienen en distintos tamaños

y con distintas capacidades en el manejo de muestras. Este aparato somete la

muestra a fuerzas de aceleración que obligan a las moléculas a concentrarse en

7

el fondo del envase utilizado, separándolas del medio en que se encuentran.

Incluso, bajo ciertos métodos se puede generar un gradiente de concentraciones

dentro del mismo tubo, separando distintas moléculas a distintos niveles o fases

dentro del tubo. Con ayuda de jeringas, se puede perforar la pared del tubo y

extraer del mismo sólo aquella fase donde se encuentren las moléculas de

interés.

1.2 EXTRACCIÓN DE DNA

1.2.1 ADN

Es una molécula compleja formada por cientos y miles de nucleótidos distintos en

secuencias diversas formando una cadena larga. En el hombre la dotación haploide de

cromosomas presenta una molécula de ADN con una longitud total de

aproximadamente dos a tres cuartos de billón de nucleótidos. En el ácido nucleico, los

nucleótidos se unen unos a otros mediante el enlace azúcar-fosfórico-azúcar-fosfórico,

etc. (S-P) con las purinas y las pirimidinas unidas como grupos laterales a las

moléculas de azúcar.

- Secuencia del ADN

El ADN es un polímero de desoxirribonucleótidos formados por miles o incluso

millones de residuos monoméricos. Los desoxirribonucleótidos están formados de

una base de purina (adenina, guanina) o de pirimidina (citosina, timina) unida

covalentemente al átomo de carbono 1´ de la 2´- desoxirribosa. Una unión

fosfodiéster une el grupo 5´- hidroxilo de la desoxirribosa al grupo 3´- hidroxilo de

un desoxirribonucleótido adyacente para formar un esqueleto repetido. La

secuencia específica distingue al ADN de un gen al de otro. La secuencia de base

representa el contenido de información del ADN. La cadena de

polidesoxirribonucleótido tiene polaridad. Un grupo 5´- hidroxilo se encuentra hacia

el extremo 5´, y el grupo 3´- hidroxilo hacia el extremo 3´; la dirección 5´→ 3´ de

una molécula de ácido nucleico es muy importante. Tal polaridad se puede

encontrar aun en el ADN circular que no tiene un extremo 5´- hidroxilo ó 3´-

hidroxilo libre.

8

- Desnaturalización del ADN

Es el cambio físico del ADN cuando se somete a: pHs extremos, cambios de

temperatura, disminución de la constante dieléctrica del medio acuoso por

incorporación de alcoholes, cetonas, etc., exposición a la urea, amidas y otras

soluciones similares. Cuando la temperatura alcanza el punto de fusión del ADN,

la agitación térmica es capaz de separar las dos hebras y producir una

desnaturalización. Dos conjuntos de fuerzas son las responsables de mantener la

estructura de la doble hélice del ADN: Los puentes de hidrógeno están entre los

pares de base y las interacciones del apilado son las bases sucesivas. Cuando

cualquiera de los dos conjuntos de fuerza se interrumpen, la estructura duplo

helicoidal nativa experimenta su transición a una forma con lazos al azar,

denominada ADN desnaturalizado o monofilar. En la desnaturalización de la

estructura del ADN dúplex se distinguen dos etapas:

a. Las dos hebras se desarrollan parcialmente pero permanecen unidas por lo

menos mediante un corto segmento de la estructura duplo helicoidal con algunas

bases complementarias todavía en registro. Los segmentos desenrollados de las

hebras adoptan una conformación cambiante y al azar.

b. En la segunda etapa ambas hebras se separan por completo una de otra, si en

este estado se enfrían rápidamente cada una de las hebras se doblan sobre sí

misma para formar unos segmentos duplo helicoidales intracatenarios.

- Renaturalización del ADN

Este es un proceso reversible, ya que al bajar la temperatura se puede producir

una renaturalización. Las cadenas del ADN separada se renaturalizarán o

reasociarán cuando se alcance la temperatura fisiológica y las condiciones de

salinidad adecuada. La desnaturalización de un ADN homogéneo es fácilmente

reversible si el proceso de desenrollamiento no ha pasado de la primera etapa.

Mientras un segmento duplo helicoidal esté uniendo a las dos hebras con los pares

de base en su sitio, los segmentos desplegados de las dos hebras volverán a

enrollarse espontáneamente reformando un dúplex completo instantáneamente se

9

produce un retorno a la conformación nativa, que es la de mínima energía libre.

Sin embargo, si las dos hebras se han separado por completo la renaturalización

es más lenta.

1.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS

1.3.1 Medios de Cultivo:

Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o

en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos

nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la

sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a

partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio

de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras

muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una

colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la

original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá

como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

- Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de

contener como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas.

En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias

inductoras del crecimiento. Todas estas sustancias se suministraban

originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos

de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación

a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios

es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible

de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen

utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los

10

aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la

peptona.

- Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido se puede modificar su consistencia añadiendo

productos como albúmina, gelatina o agar, con lo cual se obtendrían medios en

estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran

inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente

a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros

tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y

comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está

ampliamente extendido en el laboratorio.

- Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de

oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados

sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán

adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio,

los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas

parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los

anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de

las citadas condiciones.

- Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en

los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las

estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que

mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que

se deseque el medio.

11

1.3.2 Conteo de Bacterias

Principales métodos de recuento del número de bacterias en una

muestra

El número de bacterias puede determinarse directamente por recuento del

número total de células o indirectamente por la estimación del número más

probable, por filtración o por el recuento de células viables en placa (células

capaces de dividirse en un medio de cultivo sólido, también se refieren como

unidades formadoras de colonias, UFCs).

- Recuento directo de bacterias al microscopio

Es una técnica para determinar el número total de organismos de una

muestra: Se utilizan cámaras de recuento (cámara de Petroff-Hauser) y

visualización al microscopio. Es un método rápido del número total de células

de una muestra pero no distingue entre viables o no viables.

- Recuento directo con contadores electrónicos

Se utiliza el contador Coulter recuenta el número de células suspendidas en

un líquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente eléctrica. Se

puede determinar a su vez el tamaño de las células pero tampoco distingue

entre viables, muertas o partículas.

- Recuento del número de bacterias viables mediante el método de

dilución y siembra en placa por siembra en superficie

Es la siembra de un volumen conocido de la dilución de la muestra sobre la

superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este método todas las

colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta

técnica para el recuento de bacterias aerobias.

1.4 CORTES HISTOLÓGICOS VEGETALES

La Técnica Histológica abarca varios procedimientos a los que se somete un tejido

para proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubre objeto con

12

imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajo microscopía óptica o

electrónica. Para la obtención de cortes para observar a microscopio, hay que seguir

un protocolo en el que se incluye la obtención de la muestra, su corte y montaje.

1.4.1 Fijación

Es el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de las células, y por tanto de

los tejidos, son fijados en cuanto a su estado físico, y parcialmente en su estado

químico, de manera que puedan resistir el tratamiento sucesivo con varios reactivos sin

pérdida, distorsión importante, o descomposición. La mayoría de los agentes fijadores

actúan desnaturalizando o precipitando las proteínas, que forman entonces una

esponja o malla que tiende a englobar los otros componentes celulares. En

condiciones ideales, un fijador debe penetrar rápidamente al tejido, su acción debe ser

inmediata, y debe causar una pérdida y una alteración química y física mínima de las

células y de sus componentes; debe además ser barato, estable y de fácil manejo.

El tiempo de fijación oscila entre 30 minutos a 12 horas dependiendo del grosor del

tejido, las células libres requieren solo de 30 minutos, tejido delgado de 2 horas y más

grueso hasta de 12 horas, entre más delgado sea el tejido mejor se fijará.

1.4.2 Deshidratación

Los tejidos contienen gran cantidad de agua, tanto intra como extracelular, que debe

ser eliminada y reemplazada por parafina. Este proceso debe realizarse mediante el

uso de alguna sustancia que se mezcle con el agua y tenga cierta afinidad con ella, de

manera que pueda penetrar fácilmente entre las células de los tejidos. El alcohol etílico

es el mejor agente para la deshidratación, esto se logra utilizando alcoholes en distinta

concentración, empezando por el 70%. La deshidratación es también indispensable

antes de que puedan montarse los cortes teñidos.

1.4.3 Aclaramiento o limpieza

Permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado por un líquido que disuelva la

parafina con la cual el tejido va a ser impregnado. Los aclaradores además de eliminar

el alcohol, tienen la propiedad de volver transparentes los tejidos. Ello se debe a sus

13

elevados índices de refracción, y a los cambios ópticos que se producen cuando el

agente aclarante penetra entre los elementos tisulares muy refractantes; es decir, el

índice de refracción de los agentes aclarantes es aproximadamente igual al de los

tejidos. La mayoría de las sustancias verdaderamente aclarantes son aceites

esenciales. Los buenos agentes aclarantes deben eliminar pronto el alcohol y aclarar

rápidamente sin endurecimiento; no deben disolver los colorantes de anilina, ni

evaporarse demasiado rápido en los baños de parafina.

1.4.4 Corte

Se debe cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de

la luz. La mayor parte de los preparados para microscopía óptica tienen un grosor entre

5 a 10 micrómetros. Para un estudio riguroso se utiliza un aparato llamado

MICROTOMO, con cuchillas de acero.

Microtomo para cortes ultradelgados: Para la microscopía electrónica, los cortes deben

tener de 50 a 120 µm; para ello existen microtomos especiales.

1.4.5 Coloración

Proceso por el cual un cuerpo toma color bajo la acción de un colorante y no

desaparece con lavados de la misma sustancia en que se disolvió el colorante.

Las estructuras contenidas en las preparaciones histológicas, poseen poco contraste o

carecen de él completamente, por lo que no van a poder ser distinguidas al

microscopio. Este inconveniente queda salvado por la propiedad que tienen los

distintos componentes celulares y tisulares de incorporar con variable intensidad

sustancias colorantes. En la Técnica Histológica corriente se usan principalmente

colorantes como Hematoxilina y Eosina.

Tipos de colorantes: a) Colorantes naturales, extraídos de productos animales o

vegetales, como el carmín, la hematoxilina, la orceína y la safranina; b) Colorantes

artificiales, conocidos como colorantes de anilina, colorantes de carbón o colorantes

sintéticos.

14

1.4.6 Decoloración

Este paso se hace con objeto de llevar a cabo la diferenciación, es decir, por lo general

los cortes se tiñen con exceso con hematoxilina y es preciso quitar el colorante de

aquellas estructuras celulares que no son específicas de la hematoxilina y que la

retienen con poca intensidad. Para ello se utiliza una solución de alcohol-agua que se

prepara uno a uno. Luego se procede a lavar con agua destilada.

1.4.7 Montaje

Los cortes una vez teñidos pueden ser conservados por muchos años una vez que son

protegidos del medio exterior utilizando resinas sintéticas o bálsamo de Canadá.

El medio de montaje clásico es el Bálsamo del Canadá, el cual prácticamente se ha

dejado de utilizar debido a que ha sido superado por los medios sintéticos como el

DPX y otros.

1.5 RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS

1.5.1 REACCIONES COLOREADAS ESPECÍFICAS (BIURET):

Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que

se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los

aminoácidos.

El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa, y el Cu, en un medio

fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de

color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de

proteínas.

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la

condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Esta reacción

está dada por aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos grupos carbamino (-

CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno. El

reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia

de Na (OH) o KOH). La reacción se basa en la formación de un complejo de

15

coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del

nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. Esta última reacción provoca un

cambio de coloración: violeta púrpura o violeta rosado. Debe señalarse que el color

depende de la naturaleza de las proteínas; proteínas y péptidos dan un color rosado; la

gelatina da un color azul.

1.5.2 REACCIÓN XANTOPROTEICA

Esta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptófano.

Esta reacción se debe a la presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. Los

complejos de la molécula proteica que son de importancia en esta reacción son la

tirosina y el triptófano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza

en el laboratorio. Para esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico

presente en los aminoácidos obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo, que se

vuelven anaranjado en medio fuertemente alcalino (formación de ácido picrámico o

trinitrofenol). No puede realizarse esa reacción para identificar albúmina en orina, por el

color anaranjado de la reacción final. Las proteínas que tienen en su composición estos

aminoácidos también darán la reacción. La positividad se reconoce por la aparición de

un color amarillo o verde debido a la formación de nitrocompuestos.

1.5.3 DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR CALOR Y pH EXTREMOS

Efecto del pH sobre la estructura de las proteínas

Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero además de afectar a la

envoltura acuosa de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los grupos

ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta alteración de la

carga superficial de las proteínas elimina las interacciones electrostáticas que

estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitación. La solubilidad

de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y

desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la

formación de agregados.

16

Efecto de la temperatura sobre la estructura de las proteínas

Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo

que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan.

Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y

desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrófobo interacciona

con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína

desnaturalizada.

1.5.4 REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

Aminoácidos con azufre

Los dos aminoácidos azufrados son esenciales, la metionina estrictamente, mientras

que la cisteína puede formarse a partir de la metionina (no al revés). Las dietas

basadas en leguminosas pueden ser deficientes en estos aminoácidos. Además,

ambos son bastante inestables frente a condiciones de oxidación. La cisteína es muy

importante en el mantenimiento de la estructura terciaria y cuaternaria de la mayoría de

las proteínas mediante la formación de puentes bisulfuro, en dímeros de la cisteína

formados por oxidación.

Prueba o reacción de los grupos SH:

Es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y las proteínas que los

contienen, se reconocen por la formación de una coloración negra o gris. Los

Aminoácidos azufrados como Metionina, Cisteína y Cistina se reconocen por la

formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se

forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino.

17

II. LUGAR DE EJECUCIÓN Y UBICACIÓN GEOPOLÍTICA

LUGAR DE EJECUCIÓN DE LAS PRÁCTICAS: Instituto de Biotecnología e Ingeniería

Genética – U.N.C.P.

El Instituto de Biotecnología e Ingeniería Genética (I.B.I.G.) está ubicado en el pabellón

“G” de la Universidad Nacional del Centro del Perú en la provincia de Huancayo.

UBICACIÓN GEOGRÁFICA:

 Latitud : 12°43´00´´ S

 Longitud :   75°06´05´´ O

 Altitud: :  3.244 m.s.n.m.

UBICACIÓN GEOPOLÍTICA

Región : Junín

Departamento : Junín

Provincia : Huancayo

Distrito : El Tambo

Dirección : Km. 5 Av. Mariscal Castilla, Ciudad Universitaria

Pabellón “G” 3er Piso. Teléfono (064)481082-anexo Centro de

investigación.

18

III. PLAN Y CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DESARROLLADAS

MESES2011

FEBRERO MARZO

SEMANAS 1°

2°

3°

4°

1°

2°

3°

4°

ACTIVIDADES

Reconocimiento de equipos de laboratorio X X

Extracción de DNA de tejidos vegetales,

equipos de marcadores molecularesX X

Cultivos de bacterias y microorganismos X X X

Cortes histológicos de tejido vegetal X

Reconocimiento de proteínas X

Repaso de todas las prácticas X

Fecha de inicio : 31-01-11

Fecha de culminación : 31-03-11

19

IV. DESCRIPCIÓN DE LAS PRÁCTICAS

4.1 RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO

Antes de empezar a trabajar en un laboratorio, es necesario conocer las normas de

seguridad y el uso adecuado de reactivos, estos alcances fueron dados por el Ing. a

cargo de este laboratorio y fueron seguidas en todas las prácticas realizadas.

4.1.1 Normas de Seguridad para la Utilización del Espacio en Prácticas de

Laboratorio

Usar guardapolvo de laboratorio para cada práctica y no utilizar calzado

destapado.

Usar guantes, mascarilla y gorra, cuando se requieran.

No pipetear con la boca, usar un pipeteador.

No llevarse los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respirar directamente sobre

ningún reactivo pues sus vapores pueden ser tóxicos.

No ingerir alimentos o bebidas en el laboratorio.

No usar durante las prácticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o

collares.

No ubicar bolsos, mochilas o paquetes, en los lugares de trabajo.

4.1.2 Utilización de Reactivos

Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona

que lo preparó y la fecha de preparación.

No arrojar por los sumideros, ácidos, bases o algún otro reactivo, depositarlos

en los recipientes de desecho.

Evitar derrames de sustancias en las mesas de trabajo, así se previene que

algún compañero se queme la piel o se deteriore la ropa.

20

No arrojar al piso ningún reactivo.

No arrojar al piso papeles u otros elementos. Utilizar el recipiente para la

basura.

4.1.3 Asepsia en el Laboratorio

Mantener el ambiente libre de organismos infecciosos y contaminantes que

pueden ser perjudiciales para la salud.

Al ingresar al laboratorio se debe usar guardapolvo para prevenir la

contaminación del ambiente de trabajo.

La limpieza de mesas y repisas se realiza utilizando algodón empapado con

alcohol e hipoclorito de sodio para así dejar el medio libre de contaminantes, y

finalmente se pulveriza con alcohol de 70°.

Toda prueba de manipulación de microorganismos se debe hacer con un

mechero al lado para calcinar los residuos que quedan en los instrumentos de

manipulación, para evitar su diseminación o contaminación.

4.1.4 Reconocimiento de Materiales y Equipos de Laboratorio

Bisturí: Es un instrumento con hoja de filo cortante, su mango puede ser de madera,

plástico o metal. Viene a ser por sus dimensiones un instrumento en forma de cuchillo

pequeño y que su uso se ha extendido para practicar incisiones en tejidos blandos.

Placa Petri: Sirve para observar microorganismos en el laboratorio.

Placa Petri Gradilla

Porta objetos: Pueden ser laminillas de cristal con ligeras hendiduras, o sin ellas, en

donde son depositadas las sustancias que posteriormente se observarán al

microscopio.

21

Cubreobjetos: Sirven para cubrir las muestras de animales, plantas o

microorganismos que serán observados al microscopio y prevenir su contaminación.

Estufa eléctrica: Se utiliza para secado de sustancias y esterilización. Alcanza

temperaturas ente 250 y 300º C.

Gotero: Consiste en un pequeño tubo de vidrio y en uno de sus extremos tiene un

capuchón de hule, que permite succionar o arrojar las soluciones. Debe mantenerse

siempre limpio; por tanto, hay que lavarlo después de cada manipulación.

Gradilla: Apoyar tubos de ensayo.

Mechero de Alcohol: Puede ser cualquier recipiente que contenga alcohol, mecha, el

tapón de rosca agujerado donde sobresalga la mecha y un tapón para cubrir la mecha

una vez que se ha utilizado.

Mechero de alcohol Pipetas

Pipeta (para llenado): Tienen una sola marca y miden una sola cantidad determinada

de líquido; las hay de varias formas y generalmente consiste en un tubo de cristal con

un ensanchamiento cilíndrico en el centro; en el extremo inferior está estirado y con un

orificio de salida en la punta. Las pipetas de este tipo, conocidas como volumétricas,

tienen capacidad para 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100 y 200 mililitros. Para transvasar un

volumen fijo y un líquido determinado, resulta más exacto usar las pipetas que los

matraces y las buretas.

Tubo De Ensayo: Están elaborados de vidrio; se usan para contener diversas

sustancias en pequeños volúmenes; para preparar cultivos de bacterias y hongos; para

realizar diferentes experimentos y pueden ser de diferentes medidas.

22

Tubos de ensayo

Probeta Graduada: Las probetas son instrumentos para medir volúmenes y su uso es

muy frecuente. Este tipo de recipientes son los más usados en los laboratorios. Es un

tubo de cristal con pie, en éste caso cerrada por un extremo y destinada a contener

líquidos o bien gases, se usan para medir los líquidos o sustancias en centímetros

cúbicos.

Probeta Vaso de precipitado

Varilla De Cristal: Sirve para lograr una perfecta mezcla de las combinaciones que

deseamos obtener, ya sea entre líquidos o bien entre líquido y polvo químico o sea

sólido. Desempeña también la función de un poderoso agitador.

Vaso De Precipitado: Son de vidrio y los hay de diferentes tamaños, están graduados

y tienen pico, pueden ser también de plástico. Útiles para hacer mezclas o soluciones,

preparar colorantes, realizar evaporaciones o para que contengan líquidos.

Centrifuga: Una centrífuga es una máquina que pone en rotación una muestra para

separar por fuerza centrífuga sus componentes o fases (generalmente una sólida y una

líquida), en función de su densidad.

23

Centrífuga

Destilador de agua: Este aparato tiene un sistema que logra destilar como su mismo

nombre lo dice el agua.

Horno: Este instrumento de laboratorio sirve para darle temperatura a ciertas

sustancias y como tienen temporizador mantiene el calor en una temperatura

constante.

Horno

4.2 EXTRACCIÓN DE DNA DE TEJIDOS VEGETALES

4.2.1 FUNDAMENTO:

La extracción de DNA se fundamenta en que es una molécula que puede ser extraída

de cualquier parte de los organismos, por ejemplo en los vegetales, de la raíz, tallo,

hojas, etc. La extracción de muestras celulares (tejidos) se basa en el hecho de que los

iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas de los enlaces fosfodiéster del

DNA lo que permite su disolución y posterior extracción de la célula.

24

4.2.2 EXPERIMENTO: EXTRACCIÓN DE DNA DE TEJIDOS VEGETALES

MATERIALES

1. Materiales de vidrio

Vasos de precipitado de 150 ml y 250 ml (10 u)

Tubos de ensayo

Gradillas

Varillas de vidrio

Pipeta

2. Reactivos

Agua pura (millipore)

Amortiguador salino: (NaCl 0,15 M)

Bicarbonato sódico

Solución detergente BX-31

Alcohol isoamílico a 0°C

Alcohol de 96°

3. Equipos

Homogenizador

Centrífuga y microcentrífuga

Freezer

Balanza analítica

Agitador magnético

Vortex

4. Muestras biológicas vegetales

Homogenatos de tomate, papaya.

TÉCNICA

1. Preparación de la solución tampón

En 120 ml de agua pura Millipore disolver 1,5 g de cloruro de sodio (pm) y 5 g

de bicarbonato de sodio, luego se añade 5 ml de solución detergente BX-31

(Biomol). Mantener el preparado en el freezer a baja T°, evitar el contacto con

el medio ambiente.

25

2. Preparación de la muestra biológica

Elegir la muestra de la que se va extraer el DNA, (tomate, papaya) y

homogenizarla a 800 rpm verificando que el homogenato tenga una

consistencia coloidal.

3. Extracción y precipitación de DNA

En un recipiente limpio mezclar cuidadosamente 5 ml del homogenato con 10

ml del tampón frío y llevar al vórtex agitando durante 2 minutos. Centrifugar a -

19°C y 3000 rpm durante 5 min.

4. Precipitación final

Retirar 2,5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo limpio y esterilizado,

luego añadir con micropipeta 2,5 ml de alcohol isoamílico enfriado previamente

a 0° escurriendo lentamente el alcohol por la cara interna del tubo teniéndolo

inclinado hasta que el alcohol quede flotando sobre el tampón. Se deja reposar

unos 10 min, luego se agregan unas 3-4 gotas de alcohol etílico de 70° y se

deja reposar 10-15 min.

5. Extracción de la “medusa” de DNA

Introducir la punta de una varilla de vidrio fina en la interfase entre el alcohol y

el tampón. Remover la varilla hacia adelante y hacia atrás hasta que poco a

poco se enrollen las “fibras” de DNA. Luego de un minuto retirar la varilla

atravesando la capa de alcohol con lo cual el DNA quedará adherido a su

extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado. Transferir

cuidadosamente la muestra a un portaobjeto limpio y estéril, dejar secar y

observar al microscopio.

RESULTADO Y DISCUSIÓN

Se realizó la extracción de DNA de los homogenatos de tomate y papaya, lo

cual se evidenció por la presencia de algunas fibras blanquecinas inmersas en

un líquido transparente, éstas correspondían al DNA extraído. Sin embargo

para estudios más estrictos se requiere utilización de enzimas especiales que

degraden el ARN y así se obtenga DNA puro.

26

Esta práctica evidenció la utilidad de realizar una correcta extracción de DNA en

una investigación biotecnológica ya que a partir de ella, es posible conocer con

exactitud la cantidad de genes presentes en cualquier cultivo. Además es muy

útil en investigaciones sobre caracterizaciones moleculares de cualquier

especie vegetal que hoy en día se hacen cada vez más frecuentemente.

4.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS

4.3.1 FUNDAMENTO:

El cultivo de microorganismos consiste en brindarles las condiciones físicas, químicas,

nutritivas y ambientales adecuadas para que éstos se multipliquen en forma

controlada, lo que requiere conocer los medios de cultivo adecuados para cada

microorganismo, las técnicas de su preparación y los cuidados que se requieren.

4.3.2 EXPERIMENTO: CONTEO DE BACTERIAS COLIFORMES AEROBIAS

TOMADAS DE LA LAGUNA DE OXIDACIÓN DE LA UNCP

MATERIALES

Medio de cultivo líquido: AGP: Agar, Glucosa, Peptona.

Proporciones para 1 L de agua destilada millipore:

- Agar: 14 g

- Glucosa: 5 g

- Peptona: 5 g

Microorganismo: 5 Cepas K-13 de Escherichia coli

TÉCNICA

1. Selección de materiales, equipos e insumos.

Autoclave Agar

27

Glucosa Peptona

2. Limpieza y asepsia personal: Lavado de manos, uso de mascarilla y gorra.

3. Esterilización de materiales.

Vía húmeda: en autoclave a 120°C por 20 minutos.

Vía seca: Horno Pasteur a 200°C por 20 minutos.

4. Preparación del medio de cultivo

Pesar 14 g de agar, 5 g de glucosa y 5 g de peptona bacteriana.

Medir 1 L de agua en una probeta y verter en un vaso de precipitación.

Disolver la glucosa y la peptona en vasos de precipitación separados

utilizando 100 ml en cada uno de ellos.

Disolver el agar en agua fría en un vaso de precipitación removiendo con

una varilla.

Verter las disoluciones en un vaso de precipitación y enrasar a 1 L.

Autoclavar a 120°C durante 20 minutos.

Verter en dos vasos de precipitación de 500 ml.

5. Dispensado

Verter en cada placa Petri el medio de cultivo hasta 1/3 de su capacidad

aproximadamente. Esta operación se realiza en cámara de flujo laminar.

Tapar el frasco del medio con papel metálico.

Dejar enfriar durante 5 minutos hasta solidificarse e identificar la placa:

clave, fecha, iniciales.

6. Siembra

Abrir la placa Petri dentro de la cámara de flujo.

Flamear el asa de Kolle hasta rojo vivo en un mechero de alcohol o

bunsen.

28

Sumergir el asa en el inóculo, dejar unos segundos.

Sembrar sobre el tapiz de agar sin rasgarlo según la técnica indicada:

puntos, estrías, doble estría, etc.

Cerrar la placa dentro de la cámara de flujo.

7. Incubación

Programar la incubadora a 37,5 °C

Trasladar la placa a la incubadora y deslizarla suavemente en forma

invertida.

Incubar durante 24 a 48 horas.

RESULTADO Y DISCUSIÓN

Luego de 24 horas se procedió a sacar las placas Petri (2 por alumno) y no se

observó crecimiento de coliformes en ninguna de ellas, por lo que se esperó 24

horas más y luego de revisar las placas en esta ocasión, algunas presentaron

crecimiento de colonias de bacterias de E. coli, y algunas otras se contaminaron

seguramente debido a algún error humano en la siembra del inóculo en la cámara

de flujo laminar.

La práctica capacitó al alumno en la preparación de un medio de cultivo para

microorganismos lo cual es muy útil para la realización de innumerables trabajos

de investigación que requieren el cultivo de microorganismos. Asimismo, fue

interesante observar colonias de bacterias E. coli presentes en la laguna de

oxidación de la UNCP.

4.3.3 EXPERIMENTO: DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE BACTERIAS

COLIFORMES FECALES TOTALES EN EL AGUA POTABLE DE LA UNIVERSIDAD

NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

MÉTODOS:

Método de Recuento por Dilución en Tubo: Necesita T° del agar de 40°C.

Protocolo IBIG

29

- Preparar el medio de cultivo: esterilizar en autoclave

- Preparar diluciones hasta 10-3

- Preparar dos, tres o cinco tubos por dilución según sea el caso.

- En la cámara de flujo dispensar en placas Petri el medio sin solidificar.

- Añadir con una pipeta 1 ml de dilución según sea el caso a cada placa

Petri.

- Incubar a 37°C durante 24-36 horas.

- Para evaluar contar el número de colonias/placa y multiplicar por el

factor de dilución.

TÉCNICA

Se tomó muestras de agua en frascos de vidrio previamente esterilizados de 12

pabellones de la UNCP, y se siguió el siguiente protocolo:

- Esterilizar las placas Petri por 20 min en el horno a 200°C.

- Lavar botellas, cada una por espacio de 2 minutos.

- Traer muestras de agua codificadas (fecha, pabellón)

- Preparación del medio de cultivo siguiendo el protocolo antes

mencionado.

- Preparar diluciones hasta 10-2.

Diluciones:

- Echar 9 ml de agua millipore en un tubo de ensayo.

- Agregar al tubo 1ml del agua de la zona muestreada (d1:10 -1), y diluir a

partir de éste en un segundo tubo (d2:10-2) echando 1 ml del primer tubo. Cada

dilución cuenta con dos repeticiones (h1, h2). Este procedimiento se hace para

todas las muestras.

- Preparar el medio de cultivo siguiendo el protocolo ya mencionado.

- Previo a la siembra esterilizar los instrumentos antes de su utilización.

- En la cámara de flujo dispensar el medio de cultivo (no esperar a que se

solidifique)

- Agregar con pipeta 1 ml de dilución a cada placa Petri

- Incubar por 24-36 h a 37°C.

30

- Evaluar: contar el N° de colonias.

En la práctica realizada, se utilizó el método “Recuento del número de bacterias

viables mediante el método de dilución y siembra en placa”

Conteo de Bacterias por el Método de Conteo Directo

El número de *UFC contadas dentro de la cuadrícula se multiplican por el inverso del factor de dilución, por ejemplo si el factor de dilución es 1 x 10-1, una colonia representaría: 1x1x10 = 10 UFC /ml.La cantidad de coliformes fecales totales recomendada por las Guías de la OMS es de 0 UFC (unidades formadoras de colonias) /100ml ó 0 UFC / ml.

RESULTADO Y DISCUSIÓN:

PABELLÓN d1 d2

H1 H2 H1 H2

A 19 19 100 100

B 6 6 0 0

C 0 0 2 2

E 0 0 1 1

F 0 0 0 0

G 0 0 0 0

I 2 2 0 0

IBIG 2 2 100 100

COMEDOR 0 0 2 2

CAFETERÍA 1 1 1 1

BIBLIOTECA 0 0 0 0

ED.INTELIGENTE 0 0 0 0

Datos por ml de agua muestreada.

31

* UFC: Unidad formadora de colonias.

Se observó una mayor cantidad de bacterias colifecales por ml en el pabellón A, en

promedio en la dilución 1: 190 UFC por ml, debido a que las tuberías del servicio de

agua potable probablemente estén más desgastadas en esa zona a comparación de

otras áreas de la UNCP o tal vez haya una rotura; en la dilución 2 se contaron 100 UFC

en promedio en las placas, este resultado es muy posiblemente debido a un error

humano, ya que normalmente en la dilución 1 debiera haber mayor número de UFC

que en las diluciones posteriores. Para una conclusión certera se recomienda hacer un

nuevo análisis para descartar el error humano. Así mismo, se observa presencia

considerable de bacterias en el IBIG en la dilución 2, lo cual se podría explicar de la

misma manera que el caso anterior. En el pabellón B se encontró 60 UFC/ml en la

dilución 1, mientras que en la dilución 2 no se hallaron UFC. En la cafetería se

encontró 10 UFC/ml en la dilución 1 y en la dilución 2: 100 UFC/ml, lo cual también

supondría un error humano. En el comedor en la dilución 2 se obtuvo 200 UFC/ml Por

tanto, en ambos casos se estaría superando el límite establecido por la OMS de 0

bacteria/ml, lo cual también tendría que corroborarse con un nuevo análisis de agua

para descartar el error humano.

La determinación de bacterias coliformes totales presentes en el agua potable de la

UNCP fue un ejemplo práctico del agua que muchos consumen a veces sin precaución

directamente del caño y generó un interés particular en realizar estudios más

detallados en todo tipo de agua, por ejemplo en el agua de riego de cultivos.

4.4 CORTES HISTOLÓGICOS DE TEJIDO VEGETAL

4.4.1 FUNDAMENTO:

La técnica histológica fundamental comprende la preparación de los tejidos para su

estudio microscópico, lo cual se logra sometiendo a la totalidad o a una parte

seleccionada del tejido por examinar, a una serie de procesos: fijación, deshidratación,

aclaración, corte y tinción.

32

4.4.2 EXPERIMENTO: CORTES HISTOLÓGICOS DE TEJIDOS VEGETALES

MATERIALES:

Equipos y herramientas:

- Microscopio compuesto.

- Portaobjetos.

- Cubreobjetos.

- Pipeta pasteur o gotero.

- Frasco gotero con agua.

- Hoja de Gillette.

- Aguja de disección.

Reactivos e Insumos:

- Colorante: eosina, fucsina, azul de metileno.

- Alcohol.

- Clorox.

- Fijador de Carnoy.

- Bálsamo de Canadá.

- Esmalte de uñas.

- Etiquetas.

Material Biológico:

- Tejidos vegetales: raíz, hojas, tallo de algún cultivo.

TÉCNICA:

1. Obtención de la muestra

Escoger un órgano de la planta para trabajar: hoja, tallo o raíz.

2. Fijación:

En un frasco de vidrio o plástico se utiliza el fijador de Carnoy, el cual contiene

ácido acético y alcohol 3:1 respectivamente. Colocar aquí los cortes realizados y

mantener 12 horas mínimo en maceración.

33

3. Deshidratación:

En un frasco colocar agua destilada para enjuagar las muestras. En 4 placas de

Petri hacer 4 soluciones con alcohol y agua destilada en diferentes

concentraciones como se indica en el siguiente cuadro:

Concentracione

s Tiempo

Alcohol Agua

1 1 (15 min)

1 2 (15 min)

1 3 (15 min)

1 4 (15 min)

La muestra vegetal se lava en el frasco lavador antes de pasarla a la siguiente

concentración.

4. Aclaración o limpieza:

Generalmente se utiliza el disolvente orgánico Xilol, pero es muy fuerte. Por ello

usamos Clorox, ya que en este caso es más apropiado. La proporción utilizada

para el lavado es: 1:9 (clorox, agua) por 1 min.

5. Corte:

Seccionar manualmente en fragmentos que midan de 2 a 4 cm de longitud

utilizando hoja de Gillette y aguja de disección. En el caso de la hoja, incluir la

nervadura central. Cortar transversal o longitudinalmente el órgano elegido,

procurando que los cortes sean finos, sin desgarramientos y de un solo golpe.

En el caso de la raíz hacer un corte de 25 aproximadamente. Observar al

microscopio los cortes, eligiendo los mejores para montarlos.

6. Coloración:

Se puede usar variados colorantes tales como, azul de metileno, verde, fucsina,

etc. Colocar 1 a dos cortes sobre un portaobjetos y proceder a teñirlos con el

34

colorante elegido utilizando un gotero para añadir dos a tres gotas sobre cada

corte y dejar en coloración por 3 min. Observar al microscopio y descartar los

cortes que no satisfagan.

7. Decoloración:

Para poder aclarar los tejidos se procede a colocar los cortes en una solución de

alcohol y agua al 50% dispuesta en una placa Petri por alrededor de un minuto.

8. Montaje:

Poner una gota de bálsamo de Canadá en un portaobjetos. El bálsamo se puede

reemplazar con glicerina. Encima del bálsamo colocar el pequeño corte de tejido

vegetal. Luego sellar las orillas con esmalte de uñas. Etiquetar.

9. Etiquetado:

Anotar en la etiqueta los datos correspondientes: nombre del cultivo, órgano, tipo

de corte: transversal, longitudinal, sagital, etc., iniciales de quién realizó la

preparación y la fecha.

4.5 RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS

4.5.1 FUNDAMENTO:

Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones

coloidales que pueden precipitar formándose coágulos al ser calentadas a

temperaturas superiores a 70ºC o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos,

alcohol, etc.

La coagulación se debe a la desnaturalización de las proteínas (pérdida de estructura)

y en muchos casos es irreversible.

4.5.2 EXPERIMENTO: RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS

MATERIALES:

Materiales de Vidrio

- Tubos de ensayo

- Gradillas

- Mechero

35

- Vasos de precipitado de 250 ml

- Pipetas

- Gotero

Reactivos

- Ácido nítrico concentrado

- Acetato de plomo al 5%

- Alcohol de 96°

- Solución de sulfato cúprico (SO4Cu) al 1%

- Hidróxido de sodio al 20%

- Hidróxido de sodio al 40%

Muestras Biológicas

- Clara de huevo

- Leche

- Gelatina de postre.

METODOLOGÍA

Determinación cualitativa experimental y análisis de las muestras al aplicar

reactivos específicos.

TÉCNICA:

I. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

1. SULFATO CÚPRICO AL 1%: En un vaso precipitador disolver 2,5 g de

Sulfato cúprico y aforar con agua destilada hasta 250 ml.

2. ACETATO DE PLOMO AL 5%: En un vaso precipitador disolver 2,5 g de

Acetato de plomo y aforar con agua destilada hasta 50 ml.

3. NA (OH) al 20%: En un vaso precipitador disolver 10 g de Na (OH) y

aforar con agua destilada hasta 50 ml. Esta solución provocará una reacción

exotérmica de óxido.

II. EXPERIMENTOS

A) REACCIÓN XANTOPROTEICA (Reacción coloreada)

36

Fundamento

Esta reacción se debe a la formación de un compuesto aromático nitrado de

color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico

concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con

aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia

de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un alcali vira a un

color anaranjado oscuro.

Técnica

Se separa la clara de la yema de huevo en un vaso de precipitado.

Tomar una muestra y agregar en un tubo de ensayo 2-3 ml de albúmina

(clara de huevo). Añadir lentamente por las paredes del tubo 1 ml de ácido

nítrico(HNO3).

Calentar a baño maría a 100°C y luego enfriar en agua fría.

Agregar por las paredes del tubo cuidadosamente, inclinando el tubo y

despacio unas gotas de una disolución de Na (OH) al 40%.

Resultados

En la muestra de clara de huevo se observó una interfase con forma de anillo

naranja al añadir HNO3 y calentarlo, luego la solución tomó un color amarillo

suave, y al añadir Na (OH) tomó un tono anaranjado. Así mismo se observó

una solidificación de la clara de huevo color blanco en la base del tubo de

ensayo. Dado que los resultados de esta prueba Xantoproteica dan positivos,

queda demostrada la presencia de proteínas en ambas muestras. El hecho de

que la clara solidifique en contacto con el HNO3 es debido a que al cambiar el

pH de la disolución, las proteínas que en ella hay se desnaturalizan y se

vuelven insolubles.

37

Albúmina con HNO3 Albúmina, luego de la adición de Na (OH).

B) DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR CALOR y pH EXTREMOS

Fundamento

Muchas proteínas se desnaturalizan por calor, que afecta las interacciones

débiles como enlaces de hidrógeno. El cambio es abrupto, la pérdida de la

estructura en una parte de la proteína desestabiliza el resto. La acción de los

extremos de pH afecta a las proteínas mediante la acción de los iones de H- y

OH+.

Técnica

En dos tubos de ensayo agregar 5 ml de cada proteína (albúmina y leche).

Añadir a ambos tubos 0,5 ml de ácido nítrico respectivamente, y colocarlos

en baño maría de agua hirviendo por 10 min.

Enfriar a temperatura ambiente y observar los resultados.

En un tercer tubo agregar 10 ml de albúmina y luego gota a gota añadir 5 ml

de alcohol de 96°.Observar los resultados.

Resultados

En el primer experimento con HNO3 al poner ambos tubos en baño maría, se

observa como la albúmina se precipita solidificándose casi completamente y se

torna color blanco amarillento, mientras que en el caso de la leche se observa

un precipitado leve amarillento.

38

Albúmina con HNO3 Leche con HNO3

Albúmina con alcohol

Al agregar alcohol a la albúmina, se observan estructuras blanquecinas que

semejan fibras de algodón en la superficie de la solución.

C) REACCIÓN BIURET (Reacción coloreada)

Fundamento

El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos

cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de

composición desconocida. Cuando una proteína se pone en contacto con un

alcali concentrado se forma este complejo denominado Biuret cuya fórmula es

NH2-C-N-C-NH2 que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida

produce un color violeta característico.

39

Técnica

Colocar en un tubo de ensayo 3 ml de albúmina (clara de huevo)

Añadir 2 ml de solución de Na (OH) al 20%, y a continuación 4-5 gotas

de solución de SO4Cu al 1%.

Agitar para que se mezcle bien y observar los resultados.

Al agregar la solución cúprica se observará una coloración lila

(proteínas) y celeste en forma de anillo en la superficie. La reacción es la

siguiente:

“Proteína + alkali NH2 –C-N-C- NH2 + SO4 Cu”

Resultados:

Al colocar la clara de huevo en un tubo de ensayo y añadirle la solución de

SO4Cu al 1% de color azul turquesa, se observó un color azul fuerte. Luego al

añadirle a esta mezcla el Na (OH) al 20%, se vuelve la disolución de un color

azul más claro. Luego de agitarlo se puede observar que la mezcla se torna

color violeta, lo que nos indica que efectivamente hay presencia de proteínas

gracias a la reacción del Biuret, por la coordinación del Cu en medio alcalino,

con los enlaces peptídicos de las proteínas de la clara del huevo.

Albúmina con reactivo de Biuret

40

D) REACCIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

Fundamento

Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro

de plomo. Esta reacción se basa en la separación mediante un alcali, del azufre

de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo,

forma el sulfuro de plomo.

Técnica

Poner en un tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de solución muestra (gelatina

diluida).

Añadir 2 cc. de solución de Na (OH) al 20%.

Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%.

Calentar el tubo cuidadosamente hasta ebullición.

Si se forma un precipitado color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro

de plomo utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos sirve para

identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.

Resultados

Apenas se formó un anillo pequeño color negruzco en la superficie de la

solución con gelatina lo que nos indica una presencia mínima de aminoácidos

azufrados en esta sustancia. Por tanto, en este caso el resultado de la reacción

es negativo, y esto muestra que en la gelatina comercial de postre carece de

proteínas que tienen aminoácidos con azufre.

41

Gelatina con anillo gris en la superficie

DISCUSIÓN

Esta práctica fue muy interesante ya que permitió observar prácticamente a los

componentes proteicos de algunos alimentos y conocer las distintas reacciones que se

generan al añadir determinadas sustancias a éstos, como el ácido nítrico, o el hidróxido

de sodio en la reacción xantoproteica. La aplicación práctica fue diferenciar a las

proteínas de los alimentos de los demás componentes que existen en ellos, es por eso

que se utilizó alimentos con alto contenido proteico para una mejor visualización de las

proteínas.

42

V. CONCLUSIONES

En las prácticas realizadas en el Instituto de Biotecnología e Ingeniería

Genética de la UNCP se realizaron actividades relacionadas con

investigaciones genéticas y científicas las cuales permitieron aplicar las teorías

aprendidas en estas áreas.

Las prácticas llevadas a cabo en el IBIG incluyeron extracción de DNA,

preparación de medios de cultivo para microorganismos, determinación de

bacterias coliformes fecales totales en agua potable, reconocimiento de

proteínas, entre otras.

En cada una de las prácticas se desarrollaron habilidades en el manejo de

instrumentos de laboratorio, así como también se aprendieron técnicas de

experimentación e investigación.

En la práctica de determinación de bacterias coliformes fecales totales en el

agua potable de la UNCP se aprendió un método sencillo de análisis de agua y

ello motivó a realizar mayores investigaciones relacionadas al tema.

En la práctica de reconocimiento de proteínas se observaron algunas de las

propiedades de las proteínas tanto físicas como fisicoquímicas, así como

también las reacciones específicas para cada aminoácido que las constituye.

Las actividades realizadas dentro y fuera del laboratorio ayudaron al practicante

a afianzar los conocimientos adquiridos en genética y biotecnología en la

universidad.

43

VI. RECOMENDACIONES

Se recomienda a los alumnos de Agronomía realizar prácticas en el Instituto de

Biotecnología e Ingeniería Genética de la UNCP ya que es importante tener una

visión integral de la carrera para llegar a ser mejores profesionales.

La UNCP debiera destinar un mayor presupuesto al IBIG ya que es

fundamental ampliar el laboratorio e implementarlo con el material necesario

para poder recibir mayor cantidad de alumnos de todas las carreras.

Los estudiantes de la Facultad de Agronomía deberían tener mayor y mejor

preparación en áreas de la genética y biotecnología, para ser competitivos en la

ciencia y en la empresa.

Se recomienda a la facultad de Agronomía de la UNCP crear la cátedra de

Biotecnología Agraria para actualizar científicamente la carrera de Agronomía

en la Región Central.

44

VII. BIBLIOGRAFÍA

BEREZOV T.T, Korovkin B.F: “Chemistry of Proteins”. En Biochemistry, 1ª ED.

Mir Publishers Moscow Moscú, Rusia, 1992. pp. 19 – 64

CARLSON, S. (1998). Deshilando el tejido de la vida. Investigación y Ciencia. 266, 84-85

LEHNINGER, A. L. Principios de bioquímica. Barcelona: Ed. Omega, 2ª ed.,

1993.

GONZÁLEZ DE BUITRAGO JM, Arilla E, Rodríguez-Segade M, Sánchez A:

Alteraciones de la digestión de proteínas y de la absorción y metabolismo de

losaminoácidos. Bioquímica Clínica, 1ª ED.McGraw-Hill Interamericana, Madrid,

España, 1998.181–190.

MURRAY, Robert K. MAYES, Peter A. GRANNER, Daryl K. Bioquímica de

Harper.13 edición. Ed. el manual moderno. México. DF. 1993. Pág. 19-20

“Recuento de bacterias”, Proyecto Prácticas online de microbiología para

farmacéuticos, Universidad de Granada, 2010 en:

http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/recuento-de-bacterias-

viables/recuento-text

http://www.oas.org/dsd/publications/classifications/

Armoniz.EstandaresAguaPotable.pdf

http://www.ipb.csic.es/servicios/Microscopia/uploads/3/6/2/2/3622788/

microscopia_a_grandes_rasgos.pdf

45

VIII. ANEXOS

Equipo del IBIG

DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES EN AGUA POTABLE DE LA UNCP

Placas esterilizándose en estufa Muestras de agua potable

46

Medio de cultivo dispensándose en placas Petri Cámara de flujo laminar

Diluciones de agua muestreada Dilución de agua añadida al medio de cultivo

47

RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS

Grupo trabajando en laboratorio Muestra de clara de huevo

Reacción xantoproteica de albúmina Reacciones de proteínas

48