Influência da espécie de triatomíneo na seleção de

subpopulações em infecções mistas de Trypanosoma cruzi

Renato Santana de Aguiar

Orientadora: Profa. Andréa Mara Macedo

Co-orientador: Prof. Sérgio Danilo Pena

Colaboração: Prof. Egler Chiari

Laboratório de Genética BioquímicaLaboratório de Biologia do Trypanosoma cruzi

A DESCOBERTA

1909Flagelados sangüíneos

P. megistus

PREVALÊNCIA E TRANSMISSÃO

• Vetorial: 80%

• Transfusional: 17%

Modos de Transmissão

• Congênita: 2%

• Outros: 1%

?Cardíaca

Digestiva

Indeterminada

Sinal de Romanã

FASE AGUDA

FASE CRÔNICA

INFECÇÃO HUMANA

A doença de Chagas

indeterminada

cardíaca

digestiva

cardio-digestiva

Fase crônica:

indeterminada

cardíaca

digestiva

cardio-digestiva

Dias, 1985

Ciclos de transmissão

Ciclo silvestre

Ciclo doméstico

Vetores e reservatórios

•Triatoma infestans

•Triatoma brasiliensis

•Panstrongylus megistus

•Triatoma pseudomaculata

•Triatoma sordida

Principais vetores

Principais reservatórios• marsupiais

• desdentados

• roedores

• carnívoros

• lagomorfos

• primatas

Variedade Populacional de T. cruzi

1909

Morfologia

Virulência/patogenicidade

Cinética de crescimento

Susceptibilidade à drogas

Constituição antigênica

Propriedades imunológicas

Infectividade em céls. hospd.

Biológica

Isoenzimas

Z1

Z2

Z3

Gambás e triatomíneos

silvestres

Humanos

Amazônia

Esquizodema

rRNA

Mini-exon

Grupo 1 - ciclo doméstico

Grupo 2 - ciclo silvestre

Protéico

kDNA

DNA nuclear

Simpósio Internacional Comemorativo dos 90 anos da Descoberta da Doença

de ChagasRio de Janeiro, 1999

T. cruzi I

T. cruzi II

T. cruzi

Zimodema 1 (Miles e cols., 1977)Ribodemas II/III (Clark & Pung, 1994)Grupo 2 do rRNA (Souto e cols., 1996)

Zimodema 2 (Miles e cols., 1977)Ribodemas I (Clark & Pung, 1994)Grupo 1 do rRNA (Souto e cols., 1996)

Cepas sem caracterização ou inconclusivas

A doença de Chagas

INFECÇÃOPOLICLONAL

PARASITASPARA ANÁLISE

MOLECULAR

ISOLAMENTO E

MANUTENÇÃO

DE PARASITAS

in vitro

REDUÇÃOPOPULACIONAL

?

ATAT

ATAT

AT

CCGCCGCCG

CCG

CA CA CA CA

CA CA

CA

CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA

CA

Microssatélites de DNA

Taxa de mutação: 10-3 a 10-5

Dispersos em todo o genomaAltamente polimórficos

CA CA CA CA CA CA

GT GT GT GT GT GT

CA CA CA CA CA CA

GT

GT

GTGT GT

CA CA CA CA CA CA

GT

GT

GTGT GT GT GT

CA CA CA CA CA CA

GT GT GT GT

CA

CA

CA CA CA CA

GT GT GT GT

CA CA CA CA CA CA

GT GT GT GT GT

CA

CA

CA CA CA CA

GT GT GT GT GT

Replicação do DNA

Alça na fita moldeAlça na fita nascente

Inserção Deleção

Microssatélites de repetição (CA)n no genoma de T. cruzi

Loco Repetição

MCLE01 (CA)9

MCLE08 (CA)2AA(CA)12

SCLE10 (GT)2(TG)10

SCLE11 (AC)9

MCLF10 (CA)2 A (CA)14

MCLG10 (CA)8

MCLE03 (CT)4(GT)2CTAT(GT)15

MCLE05 (TC)9(GT)4

alelo A

alelo B

alelo C

AA AB AC BB BC CC

Amplificação de microssatélites (PCR)

Avaliar a influência de espécies de triatomíneos provenientes de diferentes ecótopos na seleção de sub-populações em infecções mistas de T. cruzi, através da amplificação de microssatélites de DNA diretamente das fezes de triatomíneos infectados.

ESTABILIDADE DOS MICROSSATÉLITES

Cultivo de 70 gerações do clone CL Brener

Parental10a

geração20a

geração30a

geração40a

geração50a

geração60a

geração70a

geração

Amplificação por PCR

Locos: SCLE10, SCLE11, MCLE01, MCL03, MCL05, MCLE08, MCLG10 e MCLF10

ALF

Detecção de polimorfismos de microssatélites

LASER

PCR

Eletrofluorograma das 70 gerações do clone CL Brener

10a

20a

40a

50a

60a

70a

parental

30a

MCLG10parental

10a

MCL05

40a

30a

20a

70a

60a

50a

Estabilidade dos microssatélites de T. cruzi

TAMANHO DOS ALELOS AMPLIFICADOS (pb)

Gerações Loco

SCLE10

Loco

SCLE11

Loco

MCLE01

Loco

MCLE03

Loco

MCLE05

Loco

MCLE08

Loco

MCLF10

Loco

MCLG10

Parental 239/275 153/153 132/132 279/279 218/228 128/128 184/194 176/176

10a 239/275 153/153 132/132 279/279 218/228 128/128 184/194 176/176

20a 239/275 153/153 132/132 279/279 218/228 128/128 184/194 176/176

30a 239/275 153/153 132/132 279/279 218/228 128/128 184/194 176/176

40a 239/275 153/153 132/132 279/279 218/228 128/128 184/194 176/176

50a 239/275 153/153 132/132 279/279 218/228 128/128 184/194 176/176

60a 239/275 153/153 132/132 279/279 218/228 128/128 184/194 176/176

70a 239/275 153/153 132/132 279/279 218/228 128/128 184/194 176/176

Conclusões

Os microssatélites de repetição (CA)n dos locos: SCLE10, SCLE11, MCLE01, MCL03, MCL05, MCLE08, MCLF10 e MCLG10 do clone CL Brener de T. cruzi não se alteraram nas 70 gerações avaliadas.

Os microssatélites de repetição (CA)n do genoma de T. cruzi são altamente estáveis em condições laboratoriais, sendo portanto, bons marcadores genéticos a serem utilizados nas infecções experimentais em triatomíneos.

ESTUDOS POPULACIONAIS DE ISOLADOS NATURAIS DE T. cruzi

Isolados naturais de T. cruzi

Mico leão dourado (3)Gambá (1)

Humanos (6)Humanos (3)

Triatomíneos (8)Gambá (2)

Silvestres:14Domésticos:14

Humanos (5)

Metodologia

Locos de microssatélites amplificados

SCLE10

SCLE11

MCLE01

MCLF10

MCLG10

Eletroforese em seqüenciador automático de DNA ALF

A B

C D

Perfis de amplificações

A e B (200 pm e Ig 62 / humano) monoclonais

C e D ( RB VII, RB III / Rhodnius brethesi) multiclonais

MCLE01

Infecções mistas em triatomímeos

ReservatóriosNúmero de cepas

Monoclonal Multiclonal Total

triatomíneos silvestres

3 (37,5%) 5 (62,5%) 8

mamíferos silvestres

6 (100 %) - 6

humanos 12 (85,7%) 2 (14,3%) 14

total 21 (75%) 7 (25%) 28

Cepas multiclonais

RBII, RBIII, RBVII, RB VIII, RB X, JJ/AM e

AM16

Coura e cols., 1994

LOCOS DE MICROSSATÉLITES

RB I 255/257 141/145 126/134 192/192 152/154 RB II 253/257 141/147 134/140 182/186/192 154/156 RB III 253/253 141/145 114/122/126/142 186/186 152/152 RB VI 253/253 141/145 130/132 182/192 152/152 RB VII 247/249/255 143/143 110/122/142 190/192 152/154 RB VIII 241/241 147/147 128/128 188/192/194 174/174 RB IX 253/255 143/145 132/132 184/188 174/174 RB X 253/253 141/141 114/122/130/140 188/188 154/158/174 1523 255/255 147/147 134/142 180/188 152/154 1502 255/255 145/145 134/134 190/190 152/152

GLT564 267/267 149/149 130/154 184/190 174/178 GLT593 265/279 149/149 136/154 180/180 176/176 GLT600 253/255 139/143 122/130 186/190 154/154

D7 247/253 143/143 132/138 186/186 154/154 84Ti 267/267 145/149 134/134 186/186 174/182

200pm 269/273 153/153 134/134 184/184 176/178 Ig62 275/275 153/153 126/148 184/184 174/178 Ig539 275/275 153/153 130/148 184/184 172/176 1931 269/269 145/155 138/138 184/184 180/180 803 265/275 149/149 134/150 184/184 172/182

CPI103894 267/291 155/157 134/148 184/184 176/176 OPS27/94 283/291 149/157 130/134 184/184 176/176 CPI95/94 273/275 149/155 122/130 180/180 176/176 CPI11/94 269/291 153/153 128/128 186/186 176/178 PFPI58/94 281/291 149/157 130/134 186/186 176/176

JJ/AM 253/253 141/141 126/130/132/138 188/188 160/160 AM16 253/257/283/291 141/149/157 126/130/134/138 186/186 154/176

SE 253/257 141/157 130/138 182/192 154/154

SCLE10 SCLE11 MCLE01 MCLF10 MCLG10CEPAS

pb

Caracterização da região 3’ do gene 24S rRNA

Gene rRNA 24S

A B C

125 bp -

110 bp -

Grupo 1 Grupo 1/2 Grupo 2

5’ 3’

CPI 95/94

200pm

CPI 103894

CPI 11/94

PFPI 58/94

OPS 27/94

Ig539

Ig62

803GLT593

GLT5641931

84Ti

1523

1502 D7

RBIX

RBVIGLT600

RBI

100

10

093

95

81

111

Grupo 2 rRNA 24S

Grupo 1 rRNA 24S

LEGENDA

Rede de Wagner

Método da Máxima Parcimônia

20 cepas de T. cruzi

Evidências da clonalidade de T. cruzi

Locono de alelos

Variação dos alelos

(pb)

Heterozigosidade esperada

Heterozigosidade observada

MCLE01 12 122-154 0.8481 0.7143

MCLF10 7 180-192 0.7732 0.2381

MCLG10 8 152-182 0.8039 0.4286

SCLE10 13 247-291 0.8900 0.6190

SCLE11 9 139-157 0.8481 0.5238

Cálculo da heterozigosidade (GENETIX, H = 1 - Xi2)

Desvio de equilíbrio de Hardy-Weinberg

Conclusões

Os microsstélites de repetição (CA)n são ferramentas poderosas na avaliação da clonalidade de uma cepa de T. cruzi.

Os maiores índices de infecções mistas foram encontrados em isolados naturais de triatomíneos silvestres.

A maioria dos isolados naturais de pacientes chagásicos são constituídos de apenas uma população de T. cruzi.

Conclusões

Os microssatélites foram capazes de separar os isolados naturais de T. cruzi em dois grupos, fortemente correlacionados com as tipagens realizadas pelo gene do rRNA.

A separação entre os grupos de T. cruzi proposta pelos microssatélites pode ser também correlacionada com os ciclos silvestre e doméstico dos parasitas, exceções feitas às amostras isoladas de primatas.

DESENVOLVIMENTO DE INFECÇÕES MISTAS DE T. cruzi

EM TRIATOMÍNEOS

CL Brener

Col1.7G2

JG

PNM

Mistura

SC

LE

10239 275

255 259

273 275

271 281

Infecções experimentais em triatomíneos

Dipetalogaster maximus

Ninfas de 3° estágio

CL JG PNM

Obtenção de tripomastigotas

sangüíneas

Alimentação de triatomíneos

CL + JG + PNM

JG PNM CL

JG PNM CL

JG PNM CL

200 parasitas/ml67parasitas/ml de cada

Alimentação artificial dos triatomíneos

A parafilme

B recipiente para o sangue

C sangue

D câmara aquecida (37°C)

E conector do banho maria circulante

Coleta do contéudo intestinal dos triatomíneos

Tempo de infecção

30 e 60 dias

Extração de DNA total

Proteinase K

Guanidina 6M

Lise Alcalina

Fervura

Padronização da metodologia

SCLE10

D. maximus infectados com CL Brener (60 dias de infecção)

Infecções mistas de T. cruzi em triatomíneos de diferentes ecótopos

X

Triatoma infestans(doméstico)

Rhodnius neglectus(silvestre)

Infecções em T. infestans

Infecções isoladas200 parasitas/ml

CL BrenerCol1.7G2JGPNM

Infecções mistas

CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG50 parasitas/ml por pop.

30 dias

CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG50 parasitas/ml por pop.

60 dias

CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG200 parasitas/ml por pop.

60 dias

CL Brener Col1.7G2 PNMJGJG PNM

CL Brener Col1.7G2 PNM JGJG PNM

Infecções isoladas em T. infestans - SCLE10

Col1.7G2 JG

CL Brener Col1.7G2 PNMJG CL PNM

CL Brener Col1.7G2 PNMJGJG PNM

Infecções isoladas em T. infestans - SCLE10

CL Brener PNM

Infecções isoladas em T. infestans

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

CL Brener

Infecções realizadas

% d

e f

ezes

po

siti

vas

Col1.7G2 PNM JG

Infecções isoladas em T. infestans

200 parasitas/ml

60 dias

SCLE10

Infecções mistas em T. infestans

CL Brener Col1.7G2 PNM JG CL PNM

CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG50 parasitas/ml

60 dias

T. Infestans infectados

SCLE10

C -C +

C +

Infecções mistas em T. infestans

0102030405060708090

100110

Populações de T. cruzi detectadas

% d

e fe

zes

po

siti

vas

CLBrener Col1.7G2 PNM JG

Infecções mistas em T. infestans

0102030405060708090

100110

Populações de T. cruzi detectadas

% d

e fe

zes

po

siti

vas

(CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG)

CLBrener Col1.7G2 PNM JG

50 parasitas/ml por pop.30 dias

50 parasitas/ml por pop.60 dias

200 parasitas/ml por pop.60 dias

Protocolos de infecção

SCLE10

Ausência do clone CL Brener na infecção mista

Protocolos de infecções

CLBrener+Col1.7G2+PNM+JG

Col1.7G2+PNM+JG

50 parasitas/ml por população

60 dias

01020304050

60708090

100110

Populações de T. cruzidetectadas

% d

e fe

zes

po

siti

vas

Infecções mistas em T. infestansInfecções mistas em T. infestans

01020304050

60708090

100110

CL Brener Col1.7G2 PNM JG

Populações de T. cruzidetectadas

% d

e fe

zes

po

siti

vas

Infecções isoladas em R. neglectus

R.Infecções isoladas em neglectus

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

Infecções realizadas

% d

e fe

zes

po

siti

vas

CL Brener Col1.7G2 PNM JG

200 parasitas/ml

60 dias

SCLE10

Infecções mistas em R. neglectus

CL Brener PNM JGCol1.7G2 JG PNMC +

R. neglectusInfecção mista

60 dias

SCLE10

CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG (50 parasitas/ml por população)

Infecções mistas em R. neglectus

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CL Brener Col1.7G2 PNM JG

Populações de T. cruzi detectadas

% d

e in

set

os

infe

cta

do

s

CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG (50 parasitas/ml por população)

Tempo de infecção

30 dias

60 dias

SCLE10

Reduções populacionais em T. infestans e em R. neglectus

CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG (50 parasitas/ml por população)

infecções

T. infestans30 dias

T. infestans60 dias

R. neglectus30 dias

R. neglectus60 dias

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4número de populações de T. cruzi

detectadas

% d

e fe

zes

infe

ctad

as

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4número de populações de T. cruzi

detectadas

% d

e fe

zes

infe

ctad

as

Conclusões

Padronizamos uma metodologia capaz de identificar e caracterizar populações de T. cruzi presentes em infecções mistas diretamente nas fezes de triatomíneos infectados, utilizando microssatélites de DNA.

As populações de T. cruzi: CL Brener, Col1.7G2, PNM e JG são capazes de estabelecerem consideráveis níveis de infecções quando infectadas isoladamente em ambas espécies de triatomíneos: T. infestans e R. neglectus.

Detectamos uma seleção positiva para o clone CL Brener, em detrimento do desaparecimento gradativo das demais populações de T. cruzi em T. infestans submetidos às infecções mistas.

Não encontramos seleção para nenhuma das populações de T. cruzi presentes nas infecções mistas em R. neglectus, visto que todas as populações do parasita foram encontradas em proporções semelhantes nas fezes dos triatomíneos infectados.

O nível de redução populacional das infecções mistas em T. infestans foi maior do que o encontrado nos R. neglectus.

Todos estes resultados indicam um comportamento diferencial de infecções mistas de T. cruzi em diferentes espécies de triatomíneos.

Conclusões

Agradecimentos

À profa. Andréa Mara Macedo

Ao prof. Sérgio Pena

Aos professores Egler Chiari e Lúcia Galvão

À profa. Mirian Martins

Aos professores: Octávio Fernandes, Liléia Diotaiuti e Bianca Zingales

A todos os amigos do Laboratório de Genética Bioquímica

À Neuzinha, Katita, Miroca e Afonso.

Aos meus pais.