Inês Filipa Rodrigues Vaz - repositorio-aberto.up.pt · PAMPs: Pathogen- associated molecular patterns Poly (I:C): Polyinosinic-polycytidylic acid P: P-value PCR: Polymerase Chain

Inês Filipa Rodrigues Vaz Influência dos Polimorfismos Genéticos TLR3 rs3775291e TLR7 rs179008 na sobrevivência de doentes com Linfomas Não-Hodgkin

Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em

Oncologia – Especialização em Oncologia

Molecular submetida ao Instituto de Ciências

Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do

Porto

Orientador - Professor Doutor Rui Manuel de

Medeiros de Melo Silva

Categoria - Professor Associado Convidado com

Agregação

Afiliação - Instituto de Ciências Biomédicas Abel

Salazar da Universidade do Porto e Grupo de

Oncologia Molecular e Patologia Viral - Centro de

Investigação do Instituto Português de Oncologia

do Porto

Co-Orientadora - Doutora Ana Luísa Pereira

Teixeira

Afiliação - Grupo de Oncologia Molecular e

Patologia Viral - Centro de Investigação do

Instituto Português de Oncologia do Porto

Informação Técnica

TÍTULO:

Influência dos Polimorfismos Genéticos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 na

sobrevivência de doentes com Linfomas Não-Hodgkin

Tese de Candidatura ao Grau de Mestre em Oncologia - Especialização em Oncologia

Molecular submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade

do Porto

AUTOR: Inês Filipa Rodrigues Vaz

DATA: Dezembro de 2015

EDITOR: Inês Filipa Rodrigues Vaz

MORADA: Rua Pedro Monjardino

LOCALIDADE: Lisboa

CÓDIGO POSTAL: 1600-892 Lisboa

CORREIO ELETRÓNICO: [email protected]

1ª EDIÇÃO: Setembro de 2015

2ª EDIÇÃO: Dezembro de 2015

Agradecimentos

Agradeço à comissão de coordenação do Mestrado em Oncologia, sob a pessoa da

Professora Doutora Berta Silva a oportunidade de ingressar a este mestrado, que me

enriqueceu em conhecimentos sobre Oncologia, uma área que sempre me despertou

curiosidade.

Ao Professor Doutor Rui Medeiros, meu orientador, um grande obrigado pela

oportunidade de realizar a minha Dissertação de Mestrado no grupo de Oncologia

Molecular e por todo apoio, compreensão e disponibilidade ao longo deste ano.

Do mesmo modo, quero agradecer à Doutora Ana Luísa, a minha co-orientadora e ao

grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral por toda a colaboração.

À Ana Bela companheira e amiga, por toda a compreensão e apoio que me deu ao

longo deste ano. Não esquecerei que esteve sempre comigo nos momentos mais difíceis.

À Ana Clara, uma das minhas melhoras amigas, sempre disponível a ajudar e a ouvir.

Agradeço-lhe do fundo do coração toda a ajuda que me deu ao longo desde percurso na

minha vida, mesmo estando longe.

À Inês Marques uma grande amiga de “A” maiúsculo.

Aos meus pais e ao meu irmão, o Nuno, hoje eu não estaria aqui se não fossem eles.

Em especial à minha mãe, o meu alicerce na vida, a quem eu quero dedicar este trabalho

como homenagem pela luta que ela também já travou contra o cancro.

Obrigado a todos, por tudo. Terei sempre presente em mim tudo o que vivi nesta longa

jornada, por contribuir para o que sou hoje esperando que cada vez mais mude para uma

pessoa melhor!

Abreviaturas

AP-1: Activator Protein-1

DNA: Deoxyribonucleic Acid

DAMPs: Damage-associated molecular pattern

dsRNA: Double-Stranded RNA

FADD: Fas-associated death domain protein

GVHD: Graft-versus-host disease

HSCT: Hematopoietic Stem Cell Transplantation

IL-1: Interleucina 1


IL8: Interleucina 8


IRAK: Interleukin-1 Receptor- Associated Kinase

IFNs: Interferões

IFN-β: Interferão β

IFN-α: Interferão α

IRF7: Interferon regulatory factor 7

IRF3: Interferon regulatory factor 3

IKK: I kappa B kinase

MyD88: Myeloid differentiation factor 88

MAPK: mitogen-activated protein kinases

NK: Natural Killer

NHL: Non-Hodgkin Lymphoma

NF-kB: Nuclear factor-kappa B

PAMPs: Pathogen- associated molecular patterns

Poly (I:C): Polyinosinic-polycytidylic acid

P: P-value

PCR: Polymerase Chain Reaction

RNA: Ribonucleic Acid

RE: Reticulo Endoplasmático

RIP1: Receptor interacting proteins 1

ssRNA: Single-stranded RNA

SNPs: Single Nucleotide Polymorphism

TLRs: Toll-like Receptors

TIR: Toll-IL1-receptor

TRIF: TIR-domain-containing adaptor inducing IFN-β

TRAF3: Tumor Necrose Factor Receptor-Associated Factor 3

TRAF6: Tumor Necrose Factor Receptor-Associated Factor 6

Abreviaturas

TNF- α: Tumor Necrose Factor - α

TBK1: TANK-binding kinase 1

TAK-1: Tumor Growth Factor- β- Associated- Kinase

TAB 1: TAK-1-Binding Protein 1

TAB 2: TAK-1-Binding Protein 2

UNC93B1: Uncoordinated 93B1

VIH: Vírus da Imunodeficiência Humana

Índice Geral

RESUMO .......................................................................................................................... 15

ABSTRACT ...................................................................................................................... 19

1. Introdução .................................................................................................................... 23

1.1 O Cancro ..................................................................................................................... 25

1.2 Linfomas ...................................................................................................................... 28

1.3 Sistema Imunitário: Toll-Like Receptors ..................................................................... 31

1.3.1 TLRs Endossomais: TLR3 e TLR7 .......................................................................... 34

1.4 Polimorfismos Genéticos nos genes TLR3 e TLR7 .................................................... 38

2. Objetivos ...................................................................................................................... 41

2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................. 43

2.2 Objetivo Específico ..................................................................................................... 43

3. Materiais e Métodos .................................................................................................... 45

3.1 População em Estudo ................................................................................................. 47

3.2 Procedimento Laboratorial .......................................................................................... 47

3.2.1 Extração do DNA Genómico .................................................................................... 48

3.2.2 Genotipagem dos Polimorfismos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 ..................... 48

3.3 Análise Estatística ....................................................................................................... 50

4. Resultados ................................................................................................................... 51

4.1 Frequência dos polimorfismos genéticos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 em

doentes com NHL ............................................................................................................. 53

4.2 Influência do polimorfismo TLR3 rs3775291 na sobrevivência de doentes com NHL 54

4.3 Influência do polimorfismo TLR7 rs179008 na sobrevivência de doentes com NHL .. 55

5. Discussão .................................................................................................................... 57

6. Conclusão e Perspetivas Futuras ............................................................................. 63

7. Referências Bibliográficas ......................................................................................... 67

Índice das Figuras

Figura 1. Número de novos casos cancro estimados em 2012, em 21 áreas do mundo 25

Figura 2. Esquema das infeções oportunistas mais frequentes, ao longo das diferentes

fases, e do tempo (em dias) após HSCT .......................................................................... 31

Figura 3. Representação esquemática das vias de sinalização intracelular dependentes

de TRIF ............................................................................................................................. 35

Figura 4. Representação esquemática das vias de sinalização intracelular dependentes

de MyD88 .......................................................................................................................... 36

Figura 5. Representação esquemática da indução da apoptose, mediada pelo TLR3 .... 37

Figura 6. Representação de um Real-time PCR para o polimorfismo TLR3 rs3775291 . 49

Figura 7. Influência do polimorfismo TLR3 rs3775291 na sobrevivência A) a um ano e de

B) de longo termo nos doentes com NHL ......................................................................... 54


B) de longo termo em doentes com NHL do género feminino .......................................... 55


B) de longo termo em doentes com NHL do género masculino ....................................... 56

Figura 10. Influência da variante T do polimorfismo TLR3 rs3775291 nas funções

mediadas pelo recetor ....................................................................................................... 61

Índice das Tabelas

Tabela 1. Toll-like Receptors Humanos e os respetivos ligandos .................................... 32

Tabela 2. Características clínicas e patológicas gerais da população em estudo ........... 47

Tabela 3. Características clínicas dos doentes com NHL, relativamente à presença dos

polimorfismos genéticos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 .......................................... 53

Resumo

Resumo

17

Os linfomas são um grupo heterogéneo de doenças malignas com origem em

linfócitos B, linfócitos T e em menor frequência de células natural killer. Os linfomas Não-

Hodgkin (Non-Hodgkin Lymphoma: NHL) são o subgrupo de tumores malignos com

origem linfóide mais frequente. Os principais fatores de risco que condicionam o

desenvolvimento da doença relacionam-se essencialmente com alterações na função do

sistema imunitário. O sistema imunitário tem um papel central na manutenção da

homeostasia do organismo, reconhecendo agentes infeciosos e ao mesmo tempo pode

prevenir condições de inflamação crónica associada ao desenvolvimento de cancro. Os

Toll-like Receptors constituem parte do sistema imunitário inato, podendo ser ativados

por ácidos nucleicos provenientes do genoma de vírus assim como do próprio

hospedeiro, sendo assim fundamentais como uma primeira linha de defesa do

hospedeiro, e também como mediadores da resposta antitumoral.

Diversos estudos têm demonstrado que polimorfismos genéticos funcionais nos genes

TLR3 e TLR7 podem conferir não só maior suscetibilidade para determinadas infeções,

mas também modular o desenvolvimento/progressão tumoral. Deste modo, foi objetivo do

presente trabalho avaliar a influência dos polimorfismos genéticos TLR3 rs3775291 e

TLR7 rs179008 na sobrevivência a um ano e na sobrevivência de longo termo de

doentes diagnosticados com NHL.

Neste trabalho foram analisadas amostras de DNA de cento e vinte e nove (129)

indivíduos com diagnóstico de NHL. A análise dos polimorfismos genéticos TLR3

rs3775291 e TLR7 rs179008 foi efetuada por Real-Time PCR.

Relativamente ao polimorfismo TLR3 rs3775291, a análise das curvas de

sobrevivência de Kaplan-Meier evidenciou que os doentes homozigóticos CC

apresentaram uma sobrevivência de longo termo superior comparativamente aos doentes

portadores dos genótipos CT/TT (352,9 vesus 173,5 semanas, P=0,040). Quanto ao

polimorfismo TLR7 rs179008, observou-se que as doentes homozigóticas AA

apresentaram uma tendência para uma maior sobrevivência de longo termo

comparativamente a doentes portadoras dos genótipos AT/TT (231,4 versus 134,7

semanas, P=0,057). Contudo, não observamos diferenças estatisticamente significativas

na sobrevivência a um ano quanto aos dois polimorfismos estudados. De acordo com os

resultados obtidos podemos admitir que a ocorrência de polimorfismos genéticos

funcionais nos genes codificantes TLR3 e TLR7 podem modular um microambiente

celular podendo promover a progressão da doença após reconstituição total do sistema

imunológico dos doentes com NHL.

Futuramente, a utilização de agonistas destes recetores poderá ser uma estratégia

promissora no tratamento dos doentes com NHL, sendo que a definição de perfis

Resumo

18

genéticos segundo os polimorfismos estudados poderia ser útil na identificação de

subgrupos de doentes que apresentarão maior benefício na realização destas terapias.

Abstract

Abstract

21

Lymphomas are a heterogeneous group of malignancies arising from B and T

lymphocytes and less frequently from natural killer cells. The Non-Hodgkin Lymphoma

(NHL) is the most frequent subgroup of malignant tumors resulting from lymphoid origin.

The leading risk factors that predispose to development of diseases relate essentially to

changes in immune system function. The immune system has a central role not only in

response to external aggressions but in maintenance of cellular homeostasis, recognizing

infectious agents and at the same time it can prevent chronic inflammatory conditions

associated with cancer development. Toll-like Receptors (TLRs) are part of innate

immune system and can be activated by nucleic acids from virus genome and from host.

They represent a first line of defense and mediate the anti-tumoral immune response.

Several studies have been demonstrated that TLR3 and TLR7 genetic polymorphisms

might confer not only more susceptibility to infections but also can modulate tumoral

progression/development. Thus, the aim of the present study was to evaluate the

influence of TLR3 rs3775291 and TLR7 rs179008 genetic polymorphisms in one year

survival and long-term survival in patients diagnosed with NHL.

In this study we analyzed one hundred twenty nine (129) DNA samples from patients

with NHL. Both polymorphisms were analyzed using Real-Time PCR.

Relatively to TLR3 rs3775291 polymorphism, the Kaplan-Meier survival showed that

CC homozygous patients present a higher long-term survival comparing to CT/TT patients

(352.9 versus 173.5 weeks, P=0.040). Regarding the TLR7 rs179008 polymorphism, it

was observed that AA homozygous women presented a long-term survival tendency

comparing to AT/TT woman (231.4 versus 134.7 weeks, P=0.057). Moreover, we did not

observe any statistically significant differences in short-term survival regarding the two

polymorphisms studied.

According to the results, we can admit that occurrence of functional genetic

polymorphism in TLR3 and TLR7 genes can modulate a cellular microenvironmental can

promote disease progression after total immune reconstitution in NHL patients. In the

future, the use of TLRs agonists can be a promising strategy in the treatment of NHL

patients.

1. Introdução

1. Introdução

25

1.1 O Cancro

Atualmente o cancro é considerado um dos maiores problemas de saúde publica, no

mundo, por se revelar uma das principais causas de morte nos países economicamente

desenvolvidos e a terceira causa de morte em países subdesenvolvidos 1.

O crescimento e envelhecimento da população, refletem-se no aumento da esperança

média de vida, o que é considerado um bom indicador de saúde. Dado que, o

envelhecimento é uma característica funcional dos organismos biológicos,

consequentemente acarreta o desenvolvimento de doenças crónicas características, tais

como o cancro 2,3.

A figura 1 representa o número de novos casos de cancro ocorridos em 2012, na

população mundial. Nesse ano estimaram-se 14 090 100 de novos casos e a 8 201 600

de mortes provocadas por esta doença, sendo esperado que venha a aumentar no futuro 4.

Figura 1– Número de novos casos de cancro estimados em 2012, em 21 áreas do mundo.

(Fonte: Global Cancer Statistics 2012 4)

the all-sites cancer incidence rate for both sexes combinedin Western Europe is more than twice as high as that inEastern Africa (Table 2).

Although incidence rates for all cancers combined aretwice as high in more developed compared with less devel-oped countries, mortality rates are only 8% to 15% higherin more developed countries. This disparity primarilyreflects differences in cancer profiles and/or the availabilityof treatment. For example, liver cancer, a highly fatal can-cer, is much more common in less developed countries,thus contributing disproportionately to the overall cancermortality rate in these countries. Similarly, cancers aremore often detected at a later stage in less developed coun-tries (Fig. 3), which contributes to the disparity.

Selected Cancers

Female breast cancer

Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer andthe leading cause of cancer death among females worldwide,with an estimated 1.7 million cases and 521,900 deaths in2012 (Fig. 2). Breast cancer alone accounts for 25% of allcancer cases and 15% of all cancer deaths among females.

More developed countries account for about one-half of allbreast cancer cases and 38% of deaths. Rates are generallyhigh in Northern America, Australia/New Zealand, andNorthern and Western Europe; intermediate in Central andEastern Europe, Latin America, and the Caribbean; and lowin most of Africa and Asia (Fig. 4). International variationin breast cancer incidence rates reflects differences in theavailability of early detection as well as risk factors. Risk fac-tors for breast cancer include reproductive and hormonal fac-tors such as a long menstrual history, recent use of oralcontraceptives, and never having children.12 Giving birth tochildren and breastfeeding decrease the risk of breast can-cer.12 Potentially modifiable risk factors include weight gainafter age 18 years, being overweight or obese (for postmeno-pausal breast cancer), use of menopausal hormone therapy(combined estrogen and progestin), physical inactivity, andalcohol consumption.12,13

Between 1980 and the late 1990s, breast cancer incidencerates rose approximately 30% in Western countries, likelybecause of changes in reproductive factors and the use ofmenopausal hormone therapy and more recently because ofincreased screening.14 Declining incidence rates in the early2000s have been attributed to the reduced use of menopausal

FIGURE 1. Estimated Number of New Cancer Cases in 21 World Areas, 2012.*Region estimates do not sum to the worldwide estimate due to calculation method.Source: GLOBOCAN 2012.

CA CANCER J CLIN 2015;00:00–00

VOLUME 00 _ NUMBER 00 _ MONTH 2015 3

1. Introdução

26

De entre os vários fatores de risco que condicionam o desenvolvimento de cancro, as

mutações hereditárias contribuem para o aparecimento de formas de cancro familiar,

correspondendo a 5-10% dos casos 5. A adoção de determinados estilos de vida, como

por exemplo os hábitos tabágicos, o consumo de álcool, uma dieta desequilibrada, o

sedentarismo, ou a exposição a fatores ambientais como a radiação, poluentes e ainda

microrganismos infeciosos, podem condicionar a ocorrência de formas esporádicas de

cancro 6.

Um cancro pode ser definido como um processo celular, onde as células adquirem

propriedades anormais podendo levar à transformação num fenótipo maligno, com

capacidade de proliferação descontrolada 7. Estas células sofrem múltiplas alterações no

ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid: DNA), resultantes da interação entre a

genética do hospedeiro e a exposição prolongada a fatores ambientais, ocupacionais

entre outros que estão presentes no quotidiano. Deste modo, é possível inferir que uma

grande percentagem de casos de cancro possa ser reduzida, alterando os

comportamentos e estilos de vida de um individuo 5.

O cancro tem como principal origem alterações no genoma, que permitem a aquisição

de novas propriedades ao longo do processo de transformação. As competências

adquiridas pelas células caracterizam-se em dez hallmarks: auto-suficiência em fatores

de crescimento; evasão aos mecanismos supressores de crescimento; evasão ao

sistema imunitário; capacidade replicativa ilimitada; promoção da inflamação; mutações e

instabilidade genómica; resistência à morte celular programada; desregulação energética

das células; indução da angiogénese; capacidade de invasão e de metastização 8.

A carcinogénese é um processo complexo, multifactorial e pode ser dividido em três

fases a iniciação, a promoção e a progressão 9,10. A iniciação é o primeiro evento deste

processo proporcionada pela ação de agentes de diferente natureza, como por exemplo

agentes químicos genotóxicos, provocando alterações no DNA das células 9,11. Caso a

célula não tenha capacidade de reparar o dano sofrido, a exposição continua a agentes

carcinogénicos poderá permitir uma acumulação sucessiva de alterações no genoma,

que conferem vantagens de crescimento celular relativamente às células normais 12,13.

Posteriormente, a célula “iniciada” ao longo de todo processo da carcinogénese vai sofrer

um acumular de alterações genéticas em genes que regulam a proliferação celular (os

proto-oncogenes e os genes supressores tumorais), a morte celular programada e em

genes envolvidos na manutenção da integridade do genoma 14,15.

A segunda fase do processo da carcinogénese constitui a promoção, sendo mediada

por agentes promotores que estimulam a proliferação da célula “iniciada” 16. Estes podem

induzir alterações epigenéticas influenciando a expressão de genes que estimulam o

1. Introdução

27

crescimento celular, e assim, há um aumento da probabilidade de ocorrer erros na

replicação do DNA e de se gerarem novas mutações 17.

No fim da carcinogénese decorre a progressão, uma etapa irreversível, em que as

células do tumor continuam a proliferar progredindo para um fenótipo maligno 10,18. Ao

longo desta fase, as células pré-malignas vão acumulando novas alterações genéticas e,

também, epigenéticas, tornando-se autossuficientes na proliferação, independentemente

da presença ou ausência de estímulos 18. Subsequentemente, as células tornam-se

capazes de invadir os tecidos circundantes até alcançarem os vasos sanguíneos e

linfáticos de modo a invadir outros tecidos à distância – a metastização 17. Outro fator

importante para a progressão tumoral é a neoangiogénese, que consiste na formação de

novos vasos sanguíneos, aumentando o aporte de nutrientes e oxigénio para as células,

estando, também, implicado no processo de metastização, uma vez que pode fornecer

uma rota de entrada das células tumorais na corrente sanguínea11.

O microambiente tumoral engloba um tumor em desenvolvimento e um estroma

constituído por vasos sanguíneos, infiltrado de células inflamatórias e uma variedade de

células de outros tecidos 19. Associado a este microambiente encontra-se um clima

inflamatório que sustenta o desenvolvimento e progressão de um tumor, e ainda um

conjunto de moléculas produzidas pela interação entre o tumor e o estroma 20.

1. Introdução

28

1.2 Linfomas

Os linfomas são um grupo heterogéneo de doenças malignas, com origem em

linfócitos B, linfócitos T e em situações menos comuns provêm de células NK (natural

killer: NK) 21. O processo de carcinogénese ocorre devido à acumulação de alterações

genéticas e epigenéticas nas células percursoras linfóides, resultando na desregulação

dos mecanismos de diferenciação celular 22. A caracterização de um linfoma é baseada

na sua origem celular, nas suas características morfológicas e histológicas, no

imunofenótipo das células e ainda nas alterações genéticas características desta células

malignas 23.

Em 2008, a Organização Mundial de Saúde reformulou a classificação dos tumores

hematopoiéticos e dos tecidos linfóides, diferenciando-os em grupos: neoplasias de

células B maduras; neoplasias de células T e células NK maduras; linfomas de Hodgkin;

neoplasias histociticas e de células dendríticas; doenças linfoproliferativas pós-

transplante 24.

Uma vez que as características histológicas, moleculares e clínicas dos Linfomas de

Hodgkin são diferentes dos outros linfomas, os restantes são denominados de Linfomas

Não-Hodgkin (Non-Hodgkin Lymphoma: NHL) 25.

Os Linfomas de Hodgkin, também conhecidos como doença de Hodgkin, representam

10-12% de todos os linfomas 22,26. Os linfomas de Hodgkin clássicos são identificados

pela presença de células Reed-Sternberg, gigantes e multinucleadas, podendo subdividir-

se em grupos conforme a composição e morfologia das células. Os linfomas de Hodgkin

de predomínio linfocítico apresentam algumas semelhanças com os anteriores, embora

sejam considerados uma entidade distinta devido às diferenças nas suas características

clínicas 27.

Os NHL são o subgrupo de tumores malignos com origem linfóide mais frequente 28. A

nível mundial, em 2012 estimou-se a ocorrência de 385 700 novos casos e 199 700

mortes causadas por esta doença 4.

O desenvolvimento de NHL encontra-se associado a diversos fatores de risco os quais

podem condicionar a função do sistema imunitário. As doenças autoimunes, tais como o

lúpus eritematoso sistémico, doença celíaca ou tiroidite de Hashimoto e doenças

inflamatórias como por exemplo a artrite reumatóide podem contribuir para o

desenvolvimento de NHL 29. Os indivíduos submetidos a fármacos imunossupressores

também podem ter maior predisposição para a doença, uma vez que estes fármacos

afetam a função do sistema imunitário 22,30. Por exemplo a infeção pelo vírus da

imunodeficiência humana (VIH) provoca um descontrolo na imunidade celular, e assim a

infeção mantém-se levando à estimulação persistente dos linfócitos B, podendo estar na

1. Introdução

29

origem de NHL 31. Por outro lado, o vírus Epstein-Barr apresenta capacidade de infectar e

transformar os linfócitos B, sendo importante na etiologia de NHL com origem em células

B 32. O Helicobacter pylori parece estar associado ao aumento do risco de

desenvolvimento de NHL com origem em tecidos linfóides associados à mucosa

(mucosa-associated lymphoid tissue) do estômago. Estes são alguns dos principais

microrganismos patogénicos associados à etiologia de NHL 26.

Os linfócitos B são produzidos na medula óssea e migram até aos órgãos linfóides

secundários (gânglios linfáticos, mucosas e baço) 28,33. Estes tecidos contêm vários

compartimentos organizados em folículos, onde se encontra o centro germinativo, um

microambiente responsável pela proliferação e diferenciação de linfócitos B naive em

células B memória ou plasmócitos 34.

Os linfócitos B naive são estimulados por antigénios e estabelecem interações com

células T Helper, que controlam a proliferação e diferenciação 35,36. Posteriormente, os

linfócitos B migram para os folículos secundários (centro germinativo) sucedendo-se uma

série de eventos celulares com intuito de gerar linfócitos B com capacidade de

reconhecer e produzir anticorpos, com elevada afinidade para antigénios específicos 37.

Os NHL de células B são entidades distintas, derivam da transformação maligna das

células em determinadas fases da diferenciação celular 38. Deste modo, as células

comportam diversas alterações moleculares originadas durante o seu desenvolvimento

no centro germinativo. Por exemplo, alguns NHL apresentam a translocação t(14;18), o

que confere um aumento da expressão do gene BCL-2 o que pode proporcionar

resistência à morte celular programada 39.

Os NHL com origem em células T e NK são considerados um subgrupo raro, derivam

de diferentes subpopulações de células, com funções e perfis moleculares diferentes 40.

Para determinar o estadiamento dos linfomas é usado o sistema Ann Abor, o qual

descreve a extensão da doença no organismo dos indivíduos 41. As opções terapêuticas

dependem de vários fatores, principalmente o tipo de NHL e o seu comportamento clínico

(indolente ou agressivo) e o estadio da doença. De uma forma geral, o tratamento de

NHL consiste em protocolos de quimioterapia, sendo as doses ou a combinação de

fármacos dependente das características clínicas do linfoma. A radioterapia ou

imunoterapia, por exemplo com rituximab podem ser aplicados como monoterapia, em

conjunto ou em combinação com a quimioterapia 26,42.

No tratamento de doentes com NHL pode ser recomendado o transplante de células

estaminais hematopoiéticas (Hematopoietic Stem Cell Transplantation: HSCT), conforme

as características da doença 43. O HSCT é um procedimento realizado no âmbito do

tratamento de algumas neoplasias (tumores hematológicos e tumores sólidos), doenças

hematológicas, imunodeficiências e doenças genéticas 44,45. As fontes de células

1. Introdução

30

estaminais hematopoiéticas provêm da medula óssea, de células estaminais do sangue

periférico e ainda do sangue do cordão umbilical. A colheita das células pode ser feita

com recurso a um aspirado de medula óssea, num bloco operatório, ou pode ser feita por

aférese 46. Esta terapia tem como principal objectivo curar a doença em causa e

restabelecer a função da medula óssea 47.

O HSCT pode ser classificado em autólogo ou alogénico, tendo como base a relação

do dador e do doente 44. O HSCT autólogo consiste na colheita prévia de células

estaminais hematopoiéticas do doente, e posterior administração das mesmas 45. O

HSCT alogénico é um processo mais elaborado e complexo, onde os doentes recebem

um enxerto de células estaminais hematopoiéticas de um dador saudável 46.

Antes de se proceder ao HSCT, os doentes são submetidos a regimes de

quimioterapia ou a regimes de combinação de quimioterapia com radioterapia com o

intuito de erradicar o tumor residual e suprimir o sistema imunitário do doente, a fim de

prevenir a rejeição do enxerto 47,48. A aplicação de regimes mais intensivos nos doentes

relacionam-se com o desenvolvimento de toxicidade sendo a razão de elevadas taxas de

mortalidade, o que limita a sua aplicação em crianças ou doentes com mais de 50 anos

de idade 49. A doença do enxerto-contra-hospedeiro (Graft-versus-host disease: GVHD) é

uma complicação muito frequente após o HSCT alogénico, caracterizada pela reação de

células T dadoras contra antigénios presentes nas células do hospedeiro 50. Para a

profilaxia da doença são administrados fármacos imunossupressores, que causam uma

depressão no funcionamento do sistema imunitário dos doentes, tornando-os

imunocomprometidos 51. Assim, os doentes encontram-se mais suscetíveis a

determinadas infeções oportunistas, existindo uma ordem “cronológica” descrita em

guidelines, que pode ser observada consoante a fase do transplante 49. O esquema

representado na figura 2 representa a prevalência dos vários tipos de infeções

(bacterianas, virais e fúngicas) em cada uma das fases após HSCT.

1. Introdução

31

Figura 2- Esquema das infeções oportunistas mais frequentes, ao longo das diferentes fases, e do

tempo (em dias) após HSCT. (Adaptado de Tomblyn M et al 2009 49)

1.3 Sistema Imunitário: Toll-like Receptors

O sistema imunitário é constituído pela imunidade inata e adquirida, ambas integram a

defesa do hospedeiro contra microrganismos patogénicos 52.

A imunidade inata é a primeira linha de defesa do organismo, contra infeções

provocadas por agentes microbianos, onde os Toll-like-receptors (TLRs) têm um papel

fundamental na deteção destes agentes e posterior indução de uma resposta efetora 53. A

proteína Toll foi inicialmente descoberta na Drosophila melanogaster, sendo

posteriormente identificado em mamíferos recetores homólogos à proteína Toll, cuja

função estava envolvida na resposta inflamatória 54,55.

Os TLRs são uma família de dez recetores que pertencem aos pattern-recognition

receptors e são codificados por genes que se localizam em diferentes cromossomas 55.

Estes recetores têm capacidade de desencadear uma resposta imune contra agentes

infecciosos, uma vez que reconhecem padrões moleculares associados a patogénios

(Pathogen- associated molecular patterns: PAMPs), componentes estruturais de agentes

microbianos (bactérias, vírus, fungos), como por exemplo lipossacarideos, lipoproteínas,

peptidoglicanos, flagelos e oligossacarídeos (tabela 1) 56.

1. Introdução

32

Tabela 1- Toll-Like Receptors Humanos e os respetivos ligandos

TLR’s Ligandos

Compostos PAMPs DAMPs

TLR1 Biológicos triacyl lipopeptides (bactéria)

Sintéticos Pam3Cys-Ser-(Lys)4 (lipoproteína)

TLR2 Biológicos GPI anchors,

glicolipídeos

proteínas do envelope de vírus

peptidoglicanos,

lipoproteínas,

lipopeptídeos,

lipoteichoic acid,

phenol-soluble modulin (bacteria)

zymozan,

lipoarabinomannan (fungi)

Sintéticos Pam3Cys-Ser-(Lys)4 (lipoproteínas)

TLR3 Biológicos dsRNA (virus) Hairpin loops within the

mRNA,

siRNA (hospedeiro)

Sintéticos poly (I : C) (dsRNA sintético)

TLR4 Biológicos lipopolissacarídeos (bactéria)

glycoinositolphospholipids (protozoa)

proteínas do envelope dos vírus

HSP 60,

HSP 70,

sulfato de heparan,

ácido hialurónico,

fibrinogénio (hospedeiro)

TLR5 Biológicos flagelina (bactéria)

TLR6 Biológicos diacyl and triacyl lipopeptide

(bactéria)

TLR7 Biológicos ssRNA (vírus) some ssRNA (hospedeiro)

Sintéticos imidazoquinoline

TLR8 Biológicos ssRNA (vírus) some ssRNA (hospedeiro)

TLR9 Biológicos ilhas CpG de DNA não metiladas

(bacteria, protozoa, virus)

Chromatin-IgG complex

(hospedeiro)

Sintéticos CpG (Oligonucleotidos sintéticos)

TLR10 Não conhecido

* heat-shock protein (HSP)

glycosylphosphatidylinositol (GPI)

1. Introdução

33

Os TLRs envolvidos no reconhecimento deste tipo de PAMPs são os TLR1, TLR2,

TLR4, TLR5 e TLR6 e encontram-se expressos à superfície da membrana celular 57. Os

TLRs também detetam sinais de “perigo” os padrões moleculares associados à lesão

(Damage-associated molecular pattern: DAMPs), ou seja, moléculas endógenas

libertadas por células em necrose ou por tecidos lesados na presença de estímulos

agressivos 58. Os TLRs também detetam ácidos nucleicos e desempenham um papel

fundamental no reconhecimento de vírus: o TLR3 reconhece moléculas de ácido

ribonucleico (Ribonucleic Acid: RNA) de cadeia dupla (doube-stranded RNA: dsRNA),

presentes na maioria dos vírus de RNA e de DNA; o TLR7 e o TLR8 reconhecem

moléculas de RNA de cadeia simples ssRNA (single-stranded RNA: ssRNA); e o TLR9

reconhece no DNA sequências CpG não metiladas 56.

Os TLRs são recetores transmembranares constituídos por um ectodominio rico em

múltiplos resíduos de leucina, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático

homólogo ao recetor da interleucina 1 (IL-1), o domínio TIR. Apesar da homologia

estrutural entre os TLRs, estes são capazes de distinguir diferentes PAMPs e DAMPs

(tabela 1) 59,60. Todos os TLRs reconhecem com especificidade os seus ligandos devido a

variações no número de resíduos de leucina presentes no ectodomínio de cada recetor 61.

Os TLRs podem ser expressos em muitos tipos de células como por exemplo as

células do sistema imunitário provenientes da linhagem mielóide e células provenientes

da linhagem linfóide (células T e células B) e ainda células epiteliais e fibroblastos, tendo

em consideração que a expressão destes recetores varia conforme o tipo de célula 62.

O reconhecimento dos agentes microbianos pelos TLRs promove a sua dimerização,

originando a formação de heterodímeros nos TLR1, TLR2 e TLR6. Por outro lado os

restantes TLRs depois de detetarem os respetivos ligandos formam homodímeros 63.

Deste modo, a interação do ligando-recetor conduz a uma alteração conformacional,

induzindo o domínio TIR e consequente ativação de uma cascata de sinalização

intracelular 64. O domínio citoplasmático TIR pode recrutar duas moléculas adaptadoras

independentes: a molécula adaptadora citoplasmática factor de diferenciação mielóide 88

(myeloid differentiation factor 88: MyD88) ou a molécula adaptadora citoplasmática

indutora de interferão β (IFN-β) (Domain-containing adaptor inducing IFN-β: TRIF), e

assim iniciam diferentes vias de sinalização, que vão levar à transcrição de genes de

citocinas pró-inflamatórias e de genes de interferões (IFNs), respectivamente 65.

Este passo é crucial para a maturação de células do sistema imunitário inato,

nomeadamente células apresentadoras de antigénios responsáveis por estabelecer uma

ligação com a imunidade adquirida 66.

1. Introdução

34

Apesar do papel crucial dos TLRs, na defesa do hospedeiro, a indução inadequada

destes recetores pode conduzir a um estado de inflamação crónica, que proporciona o

desenvolvimento de cancro 67.

1.3.1 TLRs Endossomais: TLR3 e TLR7

Os TLRs endossomais têm um papel de sentinela na entrada de microrganismos nas

células, particularmente vírus. A endocitose de agentes patogénicos ou de material

proveniente de células mortas permite que ácidos nucleicos de diferente origem (PAMPs

e DAMPs) sejam internalizados nos endossomas, o mesmo acontece durante a autofagia

de células infetadas 68,69.

Os TLRs intracelulares localizam-se no reticulo endoplasmático (RE) e sob

estimulação prévia deslocam-se para os endossomas. Estes recetores seguem o tráfego

intracelular comum à via de secreção, em que a partir do RE atravessam o aparelho de

Golgi e deste modo são integrados nos endossomas, onde sofrem processamento e

adquirem funcionalidade 68. Por exemplo, o TLR7 é processado por protéases da família

das furin-like propotein convertases e a expressão destas protéases aumenta perante

estímulos inflamatórios 70. A migração dos TLRs é garantida pela associação destes

recetores com muitas chaperones no RE. A proteína transmembranar UNC93B1

(Uncoordinated 93B1: UNC93B1) é essencial na migração do TLR3 e do TLR7, assim

como outras moléculas adaptadoras que são específicas no transporte de cada recetor 69.

Geralmente, o TLR3 é expresso no interior de muitos tipos de células, incluindo

células da microglia, mastócitos, eosinófilos, macrófagos, células NK, e células

dendríticas, contudo apresenta menor expressão em linfócitos B e T 71.

O gene TLR3 localiza-se no cromossoma 4 e codifica o recetor TLR3, apresentando

capacidade de se ligar a dsRNA e ao análogo sintético polyinosinic-polycytidylic acid

(Poly (I:C)) 55,62.

A estimulação de TLR3 inicia uma via de sinalização intracelular dependente da

molécula adaptadora TRIF. A molécula TRIF, quando ativada, pode recrutar TRAF3

(Tumor Necrose Factor Receptor-Associated Factor 3: TRAF3) ou TRAF6 (Tumor

Necrose Factor Receptor-Associated Factor 6: TRAF6). Ao recrutar TRAF3,

posteriormente este liga-se e ativa TBK1 (TANK-Binding Kinase 1: TBK1) e em seguida

ativa IKK (I kappa B Kinase: IKK), estas são proteínas cínases que em conjunto vão

fosforilar o fator regulador de interferão IRF3 (Interferon Regulatory Factor 3: IRF3), que é

translocado para o núcleo e induz a expressão de genes codificantes de IFNs do tipo I

(INF-�/�) (figura 3) 64. Os interferões tipo I são citocinas inibidoras da replicação dos

1. Introdução

35

vírus e moduladoras da imunidade adaptativa 65,72. A ativação do TLR3 também pode

levar à produção de citocinas pró-inflamatórias (Tumor Necrose Factor (TNF)- �, IL-6 e

IL-12) através da via subsequente a TRAF6, resultando na ativação do fator de

transcrição NF-kB (Nuclear Factor-kappa B: NF-kB) 68.

Figura 3- Representação esquemática das vias de sinalização intracelular dependentes de

TRIF. (Adaptado de Blasius et al 68)

O TLR7 reconhece moléculas de ssRNA, que de uma forma geral provêm do genoma

de vírus ou até mesmo do hospedeiro 56. O gene TLR7 que codifica o recetor TLR7

encontra-se localizado no cromossoma X e é expresso em células dendríticas,

macrófagos e linfócitos B 55,68.

A estimulação de TLR7 (figura 4) leva à ativação de uma cascata de sinalização

dependente de MyD88, este recruta e ativa o complexo proteico de cinases associado ao

recetor da interleucina 1, IRAK (Interleukin-1 Receptor- Associated Kinase: IRAK). O

complexo IRAK, posteriormente, interage com TRAF6 e este ativa TAK-1 (Tumor Growth

Factor-β- Associated- Kinase: TAK-1) que se liga a proteínas adaptadoras (TAK-1-

Binding Protein: TAB), TAB1 e TAB2, constituindo assim um complexo proteico que vai

fosforilar um outro complexo constituído por várias proteínas, IKK.

1. Introdução

36

Consequentemente, o complexo IKK fosforila o inibidor de NF-kB, inativando-o, e

assim permite que NF-kB seja translocado para o núcleo e induza a transcrição de genes

de citocinas pró-inflamatórias 64. Por outro lado, TAK-1 pode fosforilar proteínas da

família MAPK (Mitogen- Activated Protein Kinases: MAPK), culminando na ativação do

fator de transcrição AP-1 (Activator Protein-1: AP-1) 68.

Em alguns tipos de células dendríticas a estimulação de TLR7, pode levar à produção

de IFN- � através de uma via que ativa IRF7 (Interferon Regulatory Factor 7: IRF7) 54.

Figura 4- Representação esquemática das vias de sinalização intracelular dependentes de

MyD88. (Adaptado de Blasius et al68)

A molécula adaptadora TRIF tem propriedades pró-apoptóticas, sendo capaz de

induzir a morte programada das células. TRIF interage com RIP1 (Receptor Interacting

Proteins 1: RIP1), este recruta FADD (Fas- Associated Death Domain Protein: FADD)

associando-se à caspase 8, que ativa uma via mediadora da apoptose celular (figura 5) 72.

A indução da apoptose em células infetadas é um mecanismo de defesa do

hospedeiro, de modo a limitar a disseminação dos agentes patogénicos pelo organismo 73.

1. Introdução

37

Figura 5- Representação esquemática da indução da apoptose, mediada pelo TLR3.

(Adaptado de Vercammen E et al 2008 72)

1. Introdução

38

1.4 Polimorfismos Genéticos nos genes TLR3 e TLR7

Variações nos genes que codificam os Toll-like receptors podem conferir diferente

suscetibilidade para determinadas infeções, contribuindo assim para um risco aumentado

de desenvolvimento de linfomas 74. Assim ao modular as vias de sinalização ativadas por

estes retores promove-se um microambiente oncogénico indutor da progressão tumoral 75. Estas variações genéticas são consequência de polimorfismos genéticos que ocorrem

no genoma do individuo. Os polimorfismos podem ser definidos como variações no DNA

existentes nos indivíduos de uma população cuja variante menos frequente está presente

em pelo menos 1% dessa população 76. A maioria dos polimorfismos no genoma humano

são caracterizados pela alteração de apenas um nucleótido na sequência de DNA e são

denominados de SNPs (Single Nucleotide Polymorphism: SNPs). Os SNPs dependendo

da sua localização podem influenciar a função dos TLRs. Se a variação se encontrar na

região que codifica do ectodominio do recetor pode afetar a ligação deste com o ligando,

enquanto que a presença do SNP na região que codifica o domínio transmembranar ou

no domínio citoplasmático pode alterar a capacidade de transmitir o sinal para o interior

da célula e a sua interação com as moléculas adaptadoras intracelulares, respetivamente 77.

Estudos prévios demonstraram que a presença do polimorfismo genético TLR3

rs3775291 no gene TLR3 consiste na substituição de um C> T na posição 1234 na

sequência de cDNA. A ocorrência deste é responsável pela substituição aminoacídica

leucina à fenilanina na posição 412 na sequencia de aminoácidos 78. De acordo com

Ranjith-Kumar e colaboradores, a localização do polimorfismo TLR3 rs3775291 afeta o

ectodominio do recetor, reduzindo a afinidade da ligação com o agonista, e por sua vez

diminui a atividade da via de sinalização do TLR3 79.

O TLR3 encontra-se sobrexpresso em muitos tipos de cancro influenciando a atividade

das células neoplásicas 80. Um estudo realizado por Castro e os colaboradores

demonstrou que presença do polimorfismo TLR3 rs3775291 está associada a um pior

prognóstico em doentes com cancro coloretal. Os doentes portadores do genótipo TT têm

uma sobrevivência significativamente menor quando comparados com indivíduos

portadores dos genótipos CC e CT 81. A alteração da função mediada pelo recetor na

resposta imunitária e no processo de indução da morte celular podem explicar os

resultados obtidos por este autor e os colaboradores 73,81.

Estudos que caracterizaram o gene TLR7, identificaram o polimorfismo TLR7 rs179008

consiste numa substituição de A>T, na posição 32 de cDNA, sendo responsável por

glutamina à leucina na posição 11 na sequencia de aminoácidos 82. Esta substituição

provoca alterações na sequência de sinal da proteína, prejudicando as modificações pós-

1. Introdução

39

traducionais no recetor, que conferem menor capacidade de ativação ao TLR7 55,82. A

presença deste polimorfismo genético já foi associado à suscetibilidade para algumas

infeções, uma vez que a atividade do recetor encontra-se diminuída, levando à produção

de baixos níveis de INF-� 83. No estudo de Bordignon e colaboradores em que avaliaram

de que modo a presença do polimorfismo rs179008 no gene TLR7 pode influenciar a

suscetibilidade para o desenvolvimento de sarcoidose, uma doença caraterizada pelo

aumento de inflamação. Neste estudo, as mulheres portadoras do alelo T tinham um

risco significativamente menor para o desenvolvimento de sarcoidose, comparativamente

com mulheres portadoras do genótipo AA. Uma vez que o polimorfismo TLR7 rs179008

afeta a função do recetor levando a uma menor produção INF-� e de citocinas pró-

inflamatórias, as mulheres portadoras dos genótipo AT/TT apresentam menor

suscetibilidade relativamente ao da desenvolvimento da doença 84.

Dada a importância destes recetores na vigilância imunológica e na resposta

antitumoral, torna-se relevante analisar a influencia dos polimorfismos genéticos TLR3

rs3775291 e TLR7 rs179008 na sobrevivência de indivíduos com NHL.

2. Objetivos

2. Objetivos

43

2.1 Objetivo Geral:

Compreender a influência dos polimorfismos genéticos TLR3 rs3775291 e TLR7

rs179008 no desenvolvimento de NHL e a sua repercussão na sobrevivência de doentes

com NHL.

2.2 Objetivos Específicos:

1. Frequência dos polimorfismos genéticos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 em

indivíduos com NHL;

2. Analisar a influência do polimorfismo genético TLR3 rs3775291 na sobrevivência a

um ano e de longo termo de doentes com NHL;

3. Analisar a influência do polimorfismos genético TLR7 rs179008 na sobrevivência a

um ano e de longo termo de doentes com NHL;

3. Materiais e Métodos


47

3.1 População em Estudo

O estudo dos polimorfismos genéticos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 foi realizado

com base num estudo do tipo coorte retrospetivo, e a população em estudo foram

doentes com diagnóstico de NHL de células B, seguidos no Instituto Português de

Oncologia do Porto, Francisco Gentil. Todas as amostras biológicas são provenientes de

indivíduos caucasianos, com idade superior a 18 anos e foram utilizadas com o seu

conhecimento e consentimento prévio, de acordo com a declaração de Helsínquia.

Os dados demográficos (idade e género), clínicos e patológicos estão indicados na

tabela 2. Todas as informações foram recolhidas através da consulta dos processos

clínicos dos doentes.

Neste estudo participaram cento e vinte e nove (129) doentes com diagnóstico de NHL

de células B. Dos 129 indivíduos 48,1% são do género masculino e 51,9% são do género

feminino com uma média de idades de 58,3± 15,4.

Tabela 2- Características clínicas e patológicas gerais da população em estudo

Dados clínicos e patológicos Total %

Idade Média ± σ 58,3 ± 15,4

Género Masculino 48,1%

Feminino 51,9%

Estadio* Avançado 63,9%

Não avançado 36,1%

Alto grau Sim 47,2%

Não 52,8%

*Ann Arbor ≥ III

σ- Desvio Padrão

3.2 Procedimento laboratorial

A cada doente do presente estudo foi colhido uma amostra de sangue periférico de

aproximadamente 8 mL, através de uma técnica padronizada de colheita intravenosa,

para tubos contendo uma solução de EDTA.


48

3.2.1 Extração de DNA genómico

Em seguida, procedeu-se ao isolamento de DNA genómico a partir de células

nucleadas do sangue periférico, através do kit de extração GRS Genomic DNA Kit-

BroadRange (GRIPS®). A extração do DNA foi realizada mediante um sistema de colunas

de centrifugação, de acordo com as especificações do fornecedor.

3.2.2 Genotipagem dos polimorfismos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008

Os polimorfismos genéticos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 foram analisados por

discriminação alélica através da técnica Real Time PCR (Polymerase Chain Reaction:

PCR). Os polimorfismos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 foram analisados recorrendo

à tecnologia TaqMan® (Applied Biosystems®) utilizando-se os seguintes assays:

C___1731425_10 e C___2259574_10 em que as sondas marcadas com fluorocromos

eram específicas para cada alelo: TLR3 rs3775291 VIC – alelo T

(ACTTGCTCATTCTCCCTTACACATATTCAACCTAACCAAGAATAAAATCTC), FAM –

alelo C (ACTTGCTCATTCTCCCTTACACATACTCAACCTAACCAAGAATAAAATCTC); e

TLR7 rs179008 VIC – alelo A

(TTTCCAATGTGGACACTGAAGAGACAAATTCTTATCCTTTTTAACATAATC),

FAM – alelo T

(TTTCCAATGTGGACACTGAAGAGACTAATTCTTATCCTTTTTAACATAATC).

A reação de amplificação efetuada para cada amostra, integrou um volume final de 6

µL por caso contendo 2.5 µL de 2x Taqman® Genotyping Master Mix, 0.125 µL de 40x

TaqMan® SNP Genotyping Assays e 2.375 µL de água à qual se adicionou 1 µL de DNA.

Os produtos amplificados foram detetados e analisados recorrendo ao aparelho Real-

Time 7300 ABI e através do software 7300 System Sequence Detection (versão 1.2.3

Applied Biosystems) (figura 6).

A reação de amplificação perfez as seguintes condições: ativação da Taq DNA

Polimerase a 95ºC durante 10 minutos, seguindo-se 45 ciclos de 92ºC por 15 segundos

para desnaturação e de 60ºC durante 1 minuto para emparelhamento dos primers e

extensão. A determinação do genótipo foi efectuada através do respetivo software, tendo-

se obtido uma razão entre a fluorescência dos fluorocromos VIC e FAM, sendo que cada

um deles corresponde a um único alelo.


49

Figura 6- Representação de um Real-time PCR para o polimorfismo TLR3 rs3775291. (Azul:

Homozigóticos C; Vermelho: Homozigóticos T; Verde: Heterozigoticos; Cinzentos: controlos

negativos).

Como controlo de qualidade da genotipagem, foram usados dois controlos

negativos para confirmar a ausência de contaminação e o procedimento de genotipagem

foi repetido em 10% das amostras, com reprodutibilidade total.

Alle

le Y

(TLR

3_al

elo

C)

Allelic Discrimination

Allele X (TLR3_alelo T)

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50

Allele X Allele Y Both NTC UndeterminedMarker: TLR3_rs3775291 Well(s): A1-H12

Page 5 of 5 (05/27/15 15:20:55) TLR3_15.04.2015_AD_2


50

3.3 Análise Estatística

A análise estatística dos resultados foi efetuada com recurso ao software estatístico

IBM® SPSS® Statistics para Windows (version 20.0).

O teste T-student foi usado para comparar as diferenças entre as médias de idade dos

doentes. O teste do χ2 foi aplicado para comparar as diferenças entre as variáveis

categóricas (dados clínicos e patológicos). Para estes dois testes estatísticos, o valor de

P obtido foi considerado estatisticamente significativo quando inferior a 0,05.

No presente estudo foram analisadas a sobrevivência a um ano, definida como o

tempo entre o diagnóstico e um ano após o mesmo, e a sobrevivência a longo termo

definida como o tempo após treze (13) meses até à ultima observação ou morte do

doente. As curvas de probabilidade de sobrevivência foram calculas pelo método

estatístico de Kaplan-Meier. A comparação entre as curvas referentes aos genótipos dos

polimorfismos estudados foram examinados pelo teste de Log-Rank, com um nível de

significância de 5%.

4. Resultados

4. Resultados

53

4.1 Frequência dos polimorfismos genéticos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 em

doentes com NHL

Quanto ao polimorfismo TLR3 rs3775291, a frequência dos genótipos CC, CT e TT foi

de 0,47, 0,42 e 0,11, respetivamente.

Em consequência de problemas inerentes à técnica de genotipagem, na análise

estatística do estudo do polimorfismo TLR7 rs179008 foram apenas contabilizados cento

e vinte e oito (128) doentes com NHL. A frequência dos genótipos AA, AT e TT nas

mulheres foi de 0,68, 0,19 e 0,13, respetivamente. Nos homens a frequência do genótipo

A foi de 0,62 e de 0,38 para o genótipo T.

A seguinte tabela 3 indica distribuição dos genótipos referente aos polimorfismos

TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 conforme as características clínicas e patológicas dos

doentes diagnosticados com NHL. Não houve diferenças estatisticamente significativas

entre a distribuição dos genótipos da amostra em estudo e as características referidas

(P>0,05).

Tabela 3- Características clínicas dos doentes com NHL, relativamente à presença dos

polimorfismos genéticos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008

TLR3 rs3775291 P TLR7 rs179008 P

Genótipo CC CT+TT AA AT+TT

Idade Média ± σ 58,4±14,7 58,1±16,2 0,914B 58,82±15,7 56,9±14,7 0,504

Género Masculino 48,4% 51,6% 0,810C 62,3% 37,7% 0,564

Feminino 46,3% 53,7% 67,2% 32,8%

EstadioA Avançado 48,7% 51,3% 0,820 60,5% 39,5% 0,236

Não

avançado

46,5% 53,5% 71,4% 28,6%

Alto grau 40,0% 60,0% 0,086 67,8% 32,2% 0,548

Baixo Grau 55,2% 44,8% 62,7% 37,3%

A Ann Arbor ≥ III B Teste T-Student C Teste do Χ2

σ- Desvio Padrão

4. Resultados

54

4.2 Influência do polimorfismo TLR3 rs3775291 na sobrevivência de doentes com

NHL

A análise da influência do polimorfismo TLR3 rs3775291 na sobrevivência dos

indivíduos com NHL foi analisada através de curvas de sobrevivência segundo o método

de Kaplan-Meier Meier e a comparação entre genótipos medida pelo teste Log-Rank

(figura 7).

A análise das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier não permitiu observar

qualquer associação estatisticamente significativa entre os genótipos do polimorfismo

TLR3 rs3775291 e a sobrevivência a um ano nos doentes com NHL (P=0,425) (figura

7A). Contudo, verificou-se que os indivíduos portadores dos genótipos CC apresentam

uma maior sobrevivência de longo termo quando comparados com os portadores dos

genótipos CT/TT (352,91 versus 173,48 semanas, P= 0,040) (figura 7B).

Figura 7- Influencia do polimorfismo TLR3 rs3775291 na sobrevivência A) a um ano e de

B) de longo termo nos doentes com NHL.

OS4003002001000

Cum

Sur

viva

l

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Survival Functions

Followupminimun50weeks = 1

alelo T-censoredCC-censoredalelo TCC

TLR3_aleloT

KM OS BY TLR7_Tallele /STATUS=Obito(1) /PRINT NONE /PLOT SURVIVAL /TEST LOGRANK BRESLOW /TREND /COMPARE OVERALL STRATA.

Kaplan-Meier

[DataSet1] C:\Users\R\Desktop\InesVAz\TESTE_LNH_baseC_TLRmir101.sav

Page 6

Sobrevivência de longo termo (Semanas)

Sob

revi

vênc

ia C

umul

ativ

a

Teste Log Rank, P=0,040

Genótipo CC

Genótipos CT/TT

B)

OS50403020100

Cum

Sur

viva

l

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Survival Functions


alelo T-censoredCC-censoredalelo TCC

TLR3_aleloT

Stratum: Followupminimun50weeks = 1

Page 5

Sobrevivência a um ano (Semanas)

Sob

revi

vênc

ia C

umul

ativ

a


Genótipo CC

Genótipos CT/TT

A)

4. Resultados

55

4.3 Influência do polimorfismo TLR7 rs179008 na sobrevivência de doentes com

NHL

A influencia do polimorfismo TLR7 rs179008 na sobrevivência a um ano e de longo

termo foi analisada após estratificação por género.

Não se verificaram diferenças estatisticamente significativas na sobrevivência a um

ano (P=0,854) (figura 8 A) nas mulheres, relativamente ao polimorfismo genético

estudado. Contudo, a análise das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier (figura 8 B)

evidenciam que as mulheres portadoras do genótipo AA têm uma maior sobrevivência de

longo termo. A sobrevivência de longo termo é tendencialmente inferior nas portadoras

dos genótipos AT/TT comparativamente com as mulheres homozigóticas AA (134,27

versus 231,36 semanas, P=0,057).

Figura 8- Influencia do polimorfismo TLR7 rs179008 na sobrevivência A) a um ano e de

B) de longo termo em doentes com NHL do género feminino.

OS50403020100

Cu

m S

urv

ival

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Survival Functions


TLR7_Tallele_lesssignallingtoIFNproduction

other-censored


other

TLR7_Tallele


OS300250200150100500

Cu

m S

urv

ival

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Survival Functions


TLR7_Tallele_lesssignallingtoIFNproduction-censored

other-censoredTLR7_Tallele_lesssignallingtoIFNproductionother

TLR7_Tallele

FILTER OFF.USE ALL.EXECUTE.

Page 12


Genótipo AA

Genótipos AT/TT


Sob

revi

vênc

ia C

umul

ativ

a

B)

OS50403020100

Cum

Sur

viva

l

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Survival Functions



other-censored


other

TLR7_Tallele


OS300250200150100500

Cum

Sur

viva

l

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Survival Functions


TLR7_Tallele_lesssignallingtoIFNproduction-censored

other-censoredTLR7_Tallele_lesssignallingtoIFNproductionother

TLR7_Tallele

FILTER OFF.USE ALL.EXECUTE.

Page 12


Genótipo AA

Genótipos AT/TT


Sob

revi

vênc

ia C

umul

ativ

a

A)

4. Resultados

56

A figura 9 representa a influência do polimorfismo TLR7 rs179008 na sobrevivência

dos doentes com NHL do género masculino.

A análise das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier não revelou quaisquer

diferenças estatisticamente significativas na sobrevivência a um ano (P=0,567) e na

sobrevivência de longo termo (P=0,876) dos doentes com NHL do género masculino.

Figura 9- influencia do polimorfismo TLR7 rs179008 na sobrevivência A) a um ano e de

B) de longo termo em doentes com NHL do género masculino.

OS50403020100

Cum

Sur

viva

l

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Survival Functions

Sexo = masculino

TLR7_Tallele_lesssignallingtoIFNproduction-

other-censored


other

TLR7_Tallele

KM OSlong_after50weeks BY TLR3_aleloT /STRATA=Sexo /STATUS=Obito_longfollowafter50weeks(1) /PRINT MEAN /PLOT SURVIVAL /TEST LOGRANK BRESLOW /COMPARE OVERALL STRATA.

Kaplan-Meier[DataSet1] C:\Users\R\Desktop\R_2015jan-Jun\EmAnalise2015\InesVAz\TESTE_LNH_baseC_TLRmir101.sav

Page 12


Genótipo A

Genótipo T


Sob

revi

vênc

ia C

umul

ativ

a

A)

OS4003002001000

Cum

Sur

viva

l

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Survival Functions

Sexo = masculino

TLR7_Tallele_lesssignallingtoIFNproduction-

other-censored


other

TLR7_Tallele

USE ALL.COMPUTE filter_$=(Followupminimun50weeks = 0).VARIABLE LABEL filter_$ 'Followupminimun50weeks = 0 (FILTER)'.VALUE LABELS filter_$ 0 'Not Selected' 1 'Selected'.FORMAT filter_$ (f1.0).FILTER BY filter_$.EXECUTE.KM OSlong_after50weeks BY TLR7_Tallele /STRATA=Sexo /STATUS=Obito_longfollowafter50weeks(1) /PRINT MEAN /PLOT SURVIVAL /TEST LOGRANK BRESLOW /COMPARE OVERALL STRATA.

Kaplan-Meier[DataSet1] C:\Users\R\Desktop\R_2015jan-Jun\EmAnalise2015\InesVAz\TESTE_LNH_baseC_TLRmir101.sav

Page 9


Sob

revi

vênc

ia C

umul

ativ

a


Genótipo A

Genótipo T

B)

5. Discussão

5. Discussão

59

Nos últimos anos observou-se um investimento significativo na área da epidemiologia

molecular com foco na definição de novos biomarcadores moleculares de risco de

desenvolvimento de cancro e preditivos do comportamento tumoral 85. A integração de

técnicas da biologia molecular em estudos epidemiológicos oferece a oportunidade de

compreender melhor a etiologia do cancro, identificar populações em risco de

desenvolver a doença, estabelecer medidas de quimioprevenção, e compreender os

mecanismo moleculares da doença 86. De facto, a identificação de polimorfismos

genéticos funcionais que afetam a dinâmica da célula, podem permitir um melhor

conhecimento dos processos moleculares envolvidos no desenvolvimento e progressão

tumoral, e no futuro poderão ser uma ferramenta útil no desenho de novas terapias

dirigidas 85.

O conhecimento sobre mecanismos moleculares envolvidos na carcinogénese e

progressão tumoral têm aumentado continuamente, tendo-se apostado na identificação

de genes responsáveis por manter a integridade celular e dos tecidos. O sistema

imunitário tem um papel central não só na resposta a agressões externas como também

na manutenção da homeostasia do organismo, tendo um papel fundamental na

prevenção do cancro. Desta forma, o sistema imunitário reconhece agentes infeciosos,

sendo responsável por eliminá-los ao mesmo tempo que pode prevenir condições de

inflamação crónica associadas ao desenvolvimento de cancro. Cumulativamente, este

sistema é capaz de detetar e eliminar células com fenótipo neoplásico 87. Os TLRs

constituem parte do sistema imunitário inato, constituindo não só a primeira linha de

defesa do hospedeiro contra agentes patogénicos como também têm a capacidade de

serem ativados por DAMPs libertados por células tumorais em necrose. Os TLRs

apresentam a capacidade de promover a carcinogénese e a progressão tumoral

condicionando a secreção de citocinas pro-inflamatórias, anti-apoptóticas, proliferativas,

podendo este efeito ser exercido por via autócrina ou parácrina 88. O TLR3 e o TLR7 são

recetores localizados no interior das células, ancorados à membrana dos endossomas. A

utilização de diferentes moléculas adaptadoras permite a indução de vias que levam à

produção de uma grande variedade de citocinas pró-inflamatórias 89. O TLR3 expresso

em células dendríticas e apresenta a capacidade de ser ativado por mRNA proveniente

de células em necrose, ocorrendo um aumento de sinalização desta via e

consequentemente maior secreção de TNF-α 90,91. Do mesmo modo se dá a ativação do

TLR7 promovendo a estimulação de células NK, que desempenha funções antitumorais e

antivirais 92. Os TLRs são também recetores cruciais na ativação e maturação de células

B, influenciando a sua diferenciação em células B de memória e plasmócitos 93.

De acordo com Pradere o TLR3 tem a capacidade de ativar múltiplas cascatas de

sinalização pro-inflamatórias incluindo o NF-kB, AP-1 e IRF3/7, sendo a produção de

5. Discussão

60

IFNs do tipo I os principais mediadores da resposta antitumoral 88. Polimorfismos

genéticos funcionais nos genes que codificam estes recetores podem contribuir para o

desequilíbrio de fenótipos celulares, uma vez que condicionam a ativação de vias de

sinalização intracelular 74. Em situações de NHL, estas alterações nos TLR3 e TLR7

podem condicionar o desenvolvimento tumoral, com impacto na sobrevivência dos

doentes.

Relativamente aos polimorfismos analisados no presente estudo, observou-se que os

doentes portadores dos genótipos CT/TT quanto ao polimorfismo TLR3 rs3775291

apresentam uma sobrevivência de longo termo inferior comparativamente aos portadores

CC (P=0,040). De acordo com Ranjith-Kumar, a ocorrência desta transição no exão 4

resulta numa alteração da função do TLR3 79. Um estudo in vitro realizado com células

HEK293 transfetadas com plasmídeos com a alteração +1234T, apresentam uma

atenuação da ativação da via do TLR3. De facto, estudos prévios têm associado a

variante T a um risco aumentado de desenvolvimento de carcinoma de células

escamosas da cavidade oral e de carcinoma hepatocelular 94. Cumulativamente, também

foi observado que os indivíduos diagnosticados com cancro colorectal e portadores do

genótipo TT apresentam maior risco de morte pela doença 81. De acordo com a literatura,

este polimorfismo está também associado a uma suscetibilidade para infeções pelo vírus

da hepatite B, aumentando também o risco de desenvolvimento de pneumonias

associadas à infeção pelo vírus Influenza A/H1N1 em crianças 95-97.

Num estudo realizado por Chen, observou-se que mulheres chinesas com cancro da

mama e portadoras do genótipo TT apresentavam uma sobrevivência livre de progressão

de doença inferior 98,99. Segundo o estudo de Castro e colaboradores, a presença do

polimorfismo TLR3 rs3775291 destabiliza a formação de dímeros uma vez que esta

variação altera a ligação recetor-ligando 81. Esta alteração está associada a uma redução

da capacidade de ligação ao dsRNA e inibindo a via de indução da apoptose e a via de

ativação de NF-KB e de IRF3 98. Deste modo, colocamos a hipótese que os indivíduos

portadores dos genótipos CT/TT apresentam menor capacidade/eficiência de ativação da

via de sinalização do TLR3, o que conduzirá a uma menor secreção de citocinas pro-

inflamatórias e IFNs. A produção de IFN do tipo I promove a estimulação de células NK e

células dendríticas, levando-as a exercer a sua ação efetora diretamente nas células

neoplásicas e o estabelecimento de uma resposta imune adquirida específica 88. Por

outro lado, a atenuação da ativação do TLR3 pode comprometer a ocorrência da

apoptose. O estudo realizado por Paone e os colaboradores permitiu verificar que a

ativação do TLR3 por poly I:C/dsRNA tem a capacidade de induzir a apoptose em linhas

celulares de cancro da próstata, revelando o seu potencial no controlo da progressão

tumoral 100,101. A ativação do TLR3 pelo agonista sintético por Poly(I:C) apresenta uma

5. Discussão

61

capacidade pró-apoptótica desencadeando um efeito antitumoral em células de

diferentes modelos tumorais, o que revela o seu elevado potencial no tratamento de

outros tipos de tumores 98,102,103. Deste modo, podemos concluir que o polimorfismo TLR3

rs3775291 poderá comprometer a resposta antitumoral e consequentemente a

sobrevivência de longo termo nos doentes com NHL (figura 10).

A imunossupressão a que estes doentes são submetidos é consequência das

abordagens terapêuticas, resultando na diminuição da imunovigilância, sendo necessário

até um período de 12 meses após a terapia para que ocorra a reconstituição do tecido

hematopoiético 49. De acordo com Worch e colaboradores, a reconstituição imunológica

começa usualmente 6 meses após o início da terapia ocorrendo a recuperação normal

entre os 9 e 12 meses 104. Esta evidência está de acordo com os resultados obtidos em

que apenas foi observado um efeito estatisticamente significativo do polimorfismo na

população em estudo após 12 meses do início do tratamento.

Figura 10 – Influência da variante T do polimorfismo TLR3 rs3775291 nas funções mediadas

pelo recetor

Relativamente ao TLR7, este também desempenha um papel essencial na resposta

anti-tumoral 105.

No presente estudo, de acordo com a análise do polimorfismo TLR7 rs179008

verificámos que as doentes portadoras do genótipo AT/TT apresentam uma tendência

para uma sobrevivência de longo termo inferior de 134,3 semanas comparativamente a

doentes portadoras do genótipo AA, em que se observou uma sobrevivência de longo

termo de 231,4 semanas (P=0,057). Segundo Hedge e Bernstein, a transição Gln>Leu

ocorre na sequência de sinal do TLR7 da região N-terminal, condicionando a localização

5. Discussão

62

e modificações pós-translacionais do recetor, alterando assim a sua funcionalidade 106. O

polimorfismo TLR7 rs179008 tem sido alvo de diversos estudos, estando associado a

resultados controversos, em consequência da falta de replicabilidade dos mesmos. De

acordo com o estudo realizado por Schott e colaboradores, as mulheres portadoras da

variante T apresentam maior suscetibilidade à infeção pelo vírus da hepatite C, não

respondendo à administração de IFN-α, o que sugere uma diminuição da resposta

antiviral associada à ativação do TLR7 107. Cumulativamente, esta variante tem sido

associada a diminuição da expressão de IFN-α, IL-29/INFλ, IL10R e IL28R 82. A produção

de INF do tipo I é crucial na resposta antitumoral, a estimulação do TLR7 e a

consequente produção de IFN-α é uma terapia eficaz no tratamento de melanoma, do

carcinoma de células renais e da leucemia de células pilosas 88,108. De facto, a

estimulação do TLR7 em células T CD4+ com o agonista sintético resiquimod aumentou a

produção de IFN-α, IL2 e IL10, assim como a proliferação destas células

independentemente da presença de células apresentadoras de antigénios 109. Por outro

lado, a literatura sugere que a estimulação do TLR7 é responsável pela modelação da

expansão policlonal das células B e ainda da sua diferenciação em células

apresentadoras de antigénios, podendo ativar células T citotóxicas e iniciar assim uma

resposta antitumoral específica 110. De facto, Dilillo e colaboradores verificaram que a

depleção das células B, num modelo de melanoma, promove o crescimento tumoral, e

está associado ao comprometimento da ativação de células T CD8+ e CD4+ 110. Deste

modo, podemos concluir que o polimorfismo genético TLR7 rs179008 poderá

comprometer a ativação do recetor e consequentemente a resposta antitumoral,

refletindo-se na diminuição da sobrevivência de longo termo dos doentes com NHL.

Aparentemente, ocorre um efeito mais significativo nas mulheres na presença do

polimorfismo estudado comparativamente aos homens. A incompleta inativação de um

dos cromossomas X poderá potenciar o efeito desta transição no TLR7 no género

feminino 111.

De acordo com os resultados, podemos admitir que a ocorrência de polimorfismos

genéticos funcionais nos genes codificantes TLR3 e TLR7 podem modular um

microambiente celular podendo promover a progressão da doença após reconstituição

total do sistema imunológico dos doentes com NHL. Futuramente, a utilização de

agonistas destes recetores poderá ser uma estratégia promissora no tratamento dos

doentes com NHL, sendo que a definição de perfis genéticos segundo os polimorfismos

estudados poderia ser útil na identificação de subgrupos de doentes que apresentarão

maior benefício na realização destas terapias.

6. Conclusão e Perspetivas Futuras

6. Conclusão e Perspetivas Futuras

65

Nos últimos anos, estudos de imunologia têm revelado que o sistema imunitário tem a

capacidade de detetar células tumorais, desencadeando uma resposta antitumoral.

De modo a compreender o papel do sistema imunitário no combate ao

desenvolvimento de cancro, a epidemiologia molecular tem realizado vários estudos com

intuito de compreender a influencia de determinados genes no controlo de vias

envolvidas na estimulação de células do sistema imunitário. Vários estudos mencionam

que os polimorfismos TLR3 rs3775291 e TLR7 rs179008 afetam o reconhecimento de

PAMPs e DAMPs e a posterior indução de uma via de sinalização intracelular que

culmina na produção de citocinas pró-inflamatórias e IFNs. A indução dos TLRs é crucial

na estimulação de células apresentadoras de antigénios, importantes no estabelecimento

da imunidade adquirida essencial no desenvolvimento de uma resposta anti-tumoral

específica. O presente estudo procurou determinar de que modo os polimorfismos TLR3

rs3775291 e TLR7 rs179008 influenciam a sobrevivência de doentes com NHL.

Na análise do polimorfismo TLR3 rs3775291, o presente estudo mostrou que os

doentes portadores dos genótipos CT/TT apresentam menor sobrevivência de longo

termo comparativamente com os portadores do genótipo CC. Quanto ao polimorfismo

TLR7 rs179008, a sobrevivência a longo termo das mulheres portadoras dos genótipos

AT/TT foi tendencialmente inferior comparativamente com as portadoras do genótipo AA.

Deste modo podemos concluir que a presença dos polimorfismos TLR3 rs3775291 e

TLR7 rs179008 diminui o tempo de sobrevivência de doentes com NHL após a

reconstituição do sistema imunológico.

No futuro, seria relevante a replicação deste trabalho, numa amostragem superior, a

fim de validar a influência dos polimorfismos estudados no prognóstico clínico dos

doentes com NHL. Seria importante que futuramente se pudesse compreender melhor o

papel dos TLR3 e TLR7 no desenvolvimento e diferenciação dos linfócitos B. Assim,

poder-se-á correlacionar de que forma os polimorfismos TLR3 rs3775291 e TLR7

rs179008 afetam o desenvolvimento das diferentes entidades de NHL de células B.

O recurso a agonistas dos TLRs tem permitido compreender melhor o seu modo de

funcionamento e o seu papel no combate a microrganismos patogénicos e ao cancro.

Consequentemente, tem proporcionado novos horizontes para a imunoterapia, podendo

vir a ser estudado se o uso de fármacos agonistas do TLR3 e TLR7 são benéficos no

tratamento de doentes com NHL.

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Inês Filipa Rodrigues Vaz - repositorio-aberto.up.pt · PAMPs: Pathogen- associated molecular patterns Poly (I:C): Polyinosinic-polycytidylic acid P: P-value PCR: Polymerase Chain