ACTIVIDAD ENZIMTICA. DETERMINACIN DEL Km y Vmax. EFECTO DE ACTIVADORES E INHIBIDORES

ACTIVIDAD ENZIMTICA. DETERMINACIN DEL Km y Vmax. EFECTO DE ACTIVADORES E INHIBIDORES

IntroduccinLas enzimas son un tipo particular de protenas encargadas de acelerar las reacciones bioqumicas de la clula. Por tal motivo, a las reacciones bioqumicas se les llama comnmente reacciones enzimticas.1

La vida depende de la existencia de catalizadores poderosos y especficos: los enzimas. Prcticamente todas las reacciones bioqumicas son catalizadas por una enzima. Con la excepcin de unas pocas molculas de ARN cataltico, todas las enzimas conocidas son protenas. Muchos necesitan de coenzimas no proteicos o cofactores para desempear su accin cataltica.2

El rasgo distintivo de una reaccin catalizada enzimticamente es que tiene lugar dentro de los confines de una bolsa de la enzima denominada sitio activo. La molcula fijada en el sitio activo y sobre la que acta el enzima se denomina sustrato. La superficie del sitio activo del enzima est revestida con residuos aminocidos con grupos constituyentes que se unen al sustrato y catalizan su transformacin qumica. El complejo enzima-sustrato, cuya existencia fue propuesta por primera vez por Charles-Adolphe Wurtz, es de importancia central en la accin de las enzimas.3

Las enzimas son extraordinariamente eficientes y aceleran las reacciones hasta varios miles de veces, lo cual es fundamental para la vida de la clula. Gracias a la gran capacidad catalizadora o cataltica de las enzimas se puede alcanzar en las reacciones la velocidad necesaria para el aprovechamiento de la energa y la realizacin de sus mltiples funciones.4

Por las razones expuestas, la importancia de las enzimas es enorme, y su estudio constituye una parte esencial para entender el funcionamiento de un organismo, as como sus alteraciones patolgicas y el mecanismo de accin de muchas enzimas. Por ello, en esta prctica, tenemos como objetivo fundamental determinar la actividad enzimtica de la fosfatasa alcalina, y a su vez tenemos como objetivos especficos: estudiar el efecto de la concentracin del sustrato en la actividad de la fosfatasa alcalina; determinar la Km y Vmax; estudiar el efecto de inhibidores y activadores sobre la velocidad de reaccin enzimtica.Marco TericoENZIMAS:En gran porcentaje, las protenas sintetizadas en las clulas, funcionan como enzimas o catalizadores biolgicos. Las enzimas son los biocatalizadores de la gran mayora de las reacciones bioqumicas, de naturaleza orgnica y estado coloidal, elaboradas por clulas vivas, pero actan independientemente de stas.Clasificacin de enzimas.Las enzimas pertenecen a seis grupos que aparecen a continuacin:1. Oxidoreductasas, actan en reacciones de oxidoreduccin y se las llama tambin deshidrogenasas.2. Transferasas, transfieren grupos funcionales de un compuesto a otro. Las quinasas representan un grupo especializado que transfiere grupos fosfato.3. Hidrolasas, rompen un enlace adicionando una molcula de agua.4. Liasas, rompen enlaces por mecanismos distintos a la hidrlisis o la oxidacin. Las decarboxilasasy aldolasas son ejemplos de liasas.5. Isomerasas, catalizan reacciones de interconversin de ismeros.6. Ligasas, unen molculas utilizando energa proveniente del ATP. Tambin se llaman sintetasas.Hay enzimas que para actuar necesitan un componente no proteicoACTIVADORESAlgunas enzimas para actuar requieren un componente adicional que se llama cofactor. Los cofactores pueden ser inorgnicos (Fe+2, Mn+2, Zn+2, etc.) o molculas orgnicas complejas llamadas coenzimas. Las coenzimas derivan de vitaminas o son la vitamina misma.CINETICA ENZIMATICA.Una reaccin enzimtica puede esquematizarse como:Sustrato + enzima = complejo enzima sustrato = enzima sustratoS + E = ES = E + PAl comienzo de la reaccin, no hay producto y la velocidad hacia adelante puede medirse como la tasa o velocidad inicial (Vi). Esto es posible cuantificarlo, como la desaparicin del producto. Con una cantidad constante de enzima, conforme aumente la concentracin de sustrato desde cero, la velocidad de la reaccin se incrementa. El aumento en la velocidad contina, hasta que la enzima se satura con substrato. Entonces, alcanza una velocidad mxima (Vmax). Despus de esto, la velocidad no aumentar ms, incluso en presencia de substrato adicional, a menos que se aada ms enzima. La mayor parte, pero no todas las enzimas de un substrato, presentan esta clase de relacin, entre la velocidad inicial de reaccin y la concentracin de substrato.

ECUACIN DE MICHAELIS-MENTENRelaciona la velocidad inicial (Vi), con la concentracin de substrato S y la velocidad mxima (Vmax).

Donde Km, la constante de Michaelis, es la concentracin de sustrato que producir la mitad de la velocidad mxima.Cuando la concentracin de substrato es pequea, comparada con la capacidad de fijacin de la enzima, no toda sta se encontrar en el complejo enzima-substrato, que a su vez, es proporcional a la cantidad de substrato disponible. Cuando esto ocurre, la relacin se describe como de primer orden con respecto al substrato.Cuando la S es muy grande, en comparacin con la capacidad de fijacin de la enzima, casi toda sta se encontrar en el complejo enzima-substrato, y la velocidad de la reaccin, no cambiar con la adicin de ms substrato. Por tanto, la velocidad inicial de

la reaccin, estar prximo a la velocidad mxima. Estas reacciones se conocen como de orden cero con respecto al substrato.Grficamente, Km y Vmax. Pueden determinarse, utilizando una versin lineal de la ecuacin de Michaelis-Menten, la ecuacin de Lineweaver Burk:

Una grfica de 1/V contra 1/S, produce una lnea recta, donde: la intercepcin de Y = 1/Vmax, la intercepcin de X = - 1/Km y la pendiente m = Km/Vmax. 5

LAS ENZIMAS ESTAN SUJETOS A INHIBICIN REVERSIBLE O IRREVERSIBLElos inhibidores enzimticos son molculas que interfieren en la catlisis, enlentecindolas o deteniendo las reacciones enzimticas. Los enzimas catalizan, virtualmente, todos los procesos celulares por lo que no es sorprendente que los inhibidores enzimticos se encuentren entre los agentes farmacuticos ms importantes. Por ejemplo, la aspirina inhibe el enzima que cataliza el primer paso de la sntesis de prostaglandinas, compuestos que intervienen en muchos procesos, algunos de los cuales producen dolor. El estudio de los inhibidores enzimticos tambin ha proporcionado informacin valiosa sobre mecanismos enzimticos y ha ayudado a definir algunas rutas metablicas. Hay dos amplias clases de inhibidores enzimticos: reversibles e irreversibles.Un tipo de inhibicin reversible frecuente es la que se denomina inhibicin competitiva.Inhibicin competitiva: compite con el sustrato por el sitio activo del enzima. Mientras el inhibidor (I) ocupa el sitio activo impide la fijacin del sustrato al enzima. Muchos inhibidores competitivos son estructuralmente similares al sustrato que se combinan con el enzima formando un complejo EI, que no conduce a catlisis. Incluso combinaciones transitorias de este tipo afectaran negativamente a la eficacia del enzima. Al considerar la geometra molecular de los inhibidores que se parecen al sustrato podemos llegar a menudo a conclusiones sobre qu regiones de un sustrato normal interaccionan con el enzima. La inhibicin competitiva se puede analizar cuantitativamente mediante cintica del estado estacionario. En presencia de un inhibidor competitivo, la ecuacin de Michaelis.

Debido a que el inhibidor se une de manera reversible al enzima, se puede cambiar el sentido de la competicin en favor del sustrato simplemente aadiendo ms sustrato. Cuando [S] excede de sobrenadante a [I] se minimiza la probabilidad de que se fije una molcula de inhibidor, por lo que l reaccin muestra una Vmax normal.Inhibidor Acompetitivo : es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato en el sitio activo y que, a diferencia del inhibidor competitivo, solo se une al complejo ES. En presencia de un inhibidor acompetitivo, la ecuacin de Michaelis cambia a

y

Inhibidor mixto: tambin se fija a un sitio distinto al sustrato, pero se fija tanto a E como a ES.Inhibidor no competitivo: un inhibidor no competitivo afecta a Vmax pero no Km.

INHIBIDORES IRREVERSIBLES.Estos inhibidores se unen de manera covalente, destruyen un grupo funcional del enzima que es esencial para su actividad o forman una asociacin no covalente muy estable. Es frecuente la formacin de un enlace covalente entre un inhibidor irreversible y un enzima. Los inhibidores irreversibles son tambin muy tiles para estudiar los mecanismos de reaccin. Los aminocidos con funciones catalticas clave en el sitio activo pueden ser identificados, en ocasiones, determinando qu aminocido se ha unido covalentemente a un inhibidor despus de la inactivacin del enzima.Un caso especial de inhibidores irreversibles son los inactivadores suicidas. Estos compuestos son relativamente poco reactivos hasta que se unen al sitio activo de un enzima especfico. Un inactivador suicida pasa a travs de los primeros pasos de la reaccin enzimtica normal, pero a continuacin se convierte en un compuesto muy reactivo que se combina irreversiblemente con el enzima en lugar de ser transformado en producto normal. 6 ResultadosEnsayo N01.- Efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de reaccin de la fosfatasa alcalina.TUBOSABSORBANCIA

BLANCO0,113

PATRON0,885

N010,143

N020,171

N030,229

N040,295

N050,317

N060,414

N070,386

N080,463

Absorbancia real:TUBOSABSORBANCIA

BLANCO0.113

PATRON0.772

N010,030

N020,058

N030,116

N040,182

N050,204

N060,301

N070,273

N080,350

De la solucin patrn diluida 0.025 mg/mL de fosforo se tom 1.5 mL y se llev a 5 mL0.025 mgP x 1.5 mL = Cf x 5 mlCf = 7,5 x 10-3 mgP

0.02 x 1x10-4 L = C1 x 0.01 LC1 = 2 x 10-4 mol/L

C1 = 0.2 x 10-3 mol/L

TUBO 1

df

TUBO 2

C2 = 0.4x 10-3 mol/L0.02 x 2x10-4 L = C1 x 0.01 LC1 = 4 x 10-4 mol/L

0.02 x 5x10-4 L = C1 x 0.01 LC1 = 10 x 10-4 mol/L

C3 = 1 x 10-3 mol/L

TUBO 3

0.02 x 1x10-3 L = C1 x 0.01 L

C4 = 2 x 10-3 mol/L

TUBO 4

0.02 x 2x10-3 L = C1 x 0.01 L

C5 = 4 x 10-3 mol/L

TUBO 5

TUBO 6

0.02 x 3x10-3 L = C1 x 0.01 L

C6 = 6 x 10-3 mol/L

0.02 x 4x10-3 L = C1 x 0.01 L

C7 = 8 x 10-3 mol/L

TUBO 7

C8 = 1 x 10-2 mol/L

0.02 x 5x10-3 L = C1 x 0.01 LC1 = 10 x 10-3 mol/L

TUBO 8

1. Calcular los mg de fsforo liberado por la enzima en cada tubo.

Muestra 1:(0.030 x 0.0075)/0.772= 2.9x10-4 mg de fsforo liberado

Muestra 2:(0.058 x 0.0075)/0.772= 5.6x10-4 mg de fsforo liberado

Muestra 3:(0.116 x 0.0075)/0.772= 1.12x10-3 mg de fsforo liberado

Muestra 4:(0.182 x 0.0075)/0.772= 1.77x10-3 mg de fsforo liberado

Muestra 5:(0.204 x 0.0075)/0.772= 1.98x10-3 mg de fsforo liberado

Muestra 6:(0.301 x 0.0075)/0.772= 2.92x10-3 mg de fsforo liberado

Muestra 7:(0.273 x 0.0075)/0.772= 2.65x10-3 mg de fsforo liberado

Muestra 8:(0.350 x 0.0075)/0.772= 3.4x10-3 mg de fsforo liberado

2. Graficar V (mg de P liberado/minuto) vs (moles / litro de sustrato) y 1/V vs 1/S. obtener Km y Vm de cada una de las grficas.

V 1:(2. 9x10-4)/30= 9.7x10-6 mg/min V 2:(5.6x10-4)/30= 1.86x10-5 mg/minV 3:(1.12x10-3)/30= 3.73x10-5 mg/minV 4:(1.77x10-3)/30= 5.90x10-5 mg/minV 5:(1.98x10-3)/30= 6.60x10-5 mg/minV 6:(2.92x10-3)/30= 9.70x10-5 mg/minV 7:(2.65x10-3)/30= 8.80x10-5 mg/minV 8:(3.40x10-3)/30= 1.1x10-4 mg/min

Blanco Patrn T 1T 2T 3T 4T 5T 6T 7T 8

Abs 0.1130.7720,030,0580,1160,1820,2040,3010,2730,350

S -0.2 x 10-30.4x 10-31 x 10-32 x 10-34 x 10-36 x 10-38 x 10-31 x 10-2

mg-2. 9x10-45.6x10-41.12x10-31.77x10-31.98x10-32.92x10-32.65x10-33.4x10-3

V-9.7x10-61.86x10-53.73x10-55.9x10-56.6x10-59.7x10-58.8x10-51.1x10-4

T1T2T3T4T5T6T7T8

1/S5 x 1032.5x 1031 x 1030.5x 1030.25x 1030.17x 1030.125x 1031x 102

1/V0.10x1060.54x1050.27x1050.17x1050.15x1050.10x1050.11x1050.91x104

Ensayo N02.- Efecto de los activadores y de los inhibidores en las reacciones enzimticas.

TUBOSABSORBANCIA

BLANCO0.153

PATRON0.772

N010.870

N021.330

N030.558

N040.710

Absorbancia real:

TUBOSABSORBANCIA

BLANCO0.153

PATRON0.772

N010.717

N021.177

N030.405

N040.557

De la solucin patrn diluida 0.025 mg/mL de fosforo se tom 1.5 mL y se llev a 5 mL0.025 mgP x 1.5 mL = Cf x 5 mlCf = 7,5 x 10-3 mgP

1. Calcular los mg de fsforo liberado en cada caso con el activador Mg+2, con los inhibidores EDTA y fenilalanina, y sin la adicin de alguno de ellos

1 solo con glicerofosfato:(0.717 x 0.0075)/0.772= 6.96x10-3 mg de fsforo liberado2 Mg +2 :(1.177 x 0.0075)/0.772= 1.14x10-2 mg de fsforo liberado3 EDTA :(0.405 x 0.0075)/0.772= 3.93x10-3 mg de fsforo liberado4 Fenilalanina:(0.557 x 0.0075)/0.772= 5.41x10-3 mg de fsforo liberado

Discusin de Resultados En toda reaccin catalizada por un enzima, si se mantiene constante la concentracin de la E, la velocidad de la reaccin aumenta exponencialmente al incrementarse la concentracin del sustrato, ya que al existir ms molculas de sustrato es ms probable el encuentro con el enzima y la formacin del complejo E-S.(7), es por eso que nos damos cuenta cmo va aumentando en los primeros tubos la velocidad de manera significativa y gradualmente pero esto no ocurre en los ltimos tubos sino al contrario la velocidad va aumentando de a pocos y si hubiramos puesto concentraciones mayores de sustrato llegara un momento en que esta velocidad ya no vari pues ya habra alcanzado la velocidad mxima. Este aumento de velocidad es rpido para concentraciones bajas de sustrato y, a medida que este aumenta, se va haciendo ms lento hasta que la concentracin del sustrato alcanza un cierto valor, a partir del cual, aunque aumente la concentracin del mismo, no aumenta la velocidad de la reaccin. Esto es debido a que el enzima est saturada por el sustrato; es decir, todas las molculas del enzima estn unidas al sustrato formando el complejo E-S. Cuando ocurre esto, se dice que la reaccin ha alcanzado la velocidad mxima.(7).

El cido tricloro actico es un cido fuerte que inactiva a la enzima paralizando la reaccin para que la enzima no actu sobre el sustrato (8) es por eso que en laboratorio era necesario agregar el ATC al instante ya que si no se le agregaba los valores de la velocidad hubieran alcanzado la velocidad mxima y no hubiera sido posible determinar ni notar el efecto que tiene la concentracin del sustrato en la velocidad de reaccin de la fosfatasa alcalina.

La solucin de cloruro de magnesio es un importante activador de la reacciones enzimticas (9) es por eso que en el tubo 2 que fue al que se le agreg la solucin de cloruro de magnesio se encuentra una mayor absorbancia ya que activa a la enzima y por lo tanto ocurre una mayor liberacin de fosforo que es notado en la lectura del espectrofotmetro.

Fishaman Inglis y Krant establecieron que solamente la fosfatasa alcalina de origen intestinal es inhibida por la L-fenilalanina, aproximadamente un 80 90 % (10) y esto fue corroborado en la parte experimental ya que la absorbancia disminuy notablemente respecto al tubo 1 que es el que no contena ningn inhibidor, ni activador, es por eso que en el tubo 4 se obtuvo una menor absorbancia. El EDTA tiene un efecto quelante es por eso que envuelve los metales y no deja activar a la enzima y por lo tanto acta como un inhibidor (10) esto ocurri en el tubo 3 y donde tambin se not notablemente una disminucin en la absorbancia con respecto al tubo1.

En el ensayo 1 ocurrieron unas desviaciones en la grfica en el tubo 5 y tubo 7 esto pudo deberse a que no hubo una buena preparacin de la solucin, o un buen agitamiento para homogenizar la solucin, como tambin a una mala medida de parte de uno de los integrantes de la mesa.

Conclusiones Se entendi el efecto que tiene la concentracin del sustrato en la atividad de la fosfatasa alcalina. Se determin mediante el mtodo grfico de Michaelis- Mentin y Liwernever Burk la Vmx y el km. Se comprob el efecto inhibidor del EDTA y la L-fenilalanina as como tambin el efecto activador de la solucin de cloruro de magnesio en la reaccin enzimtica.

Cuestionario1. Se mide la cintica de una enzima como funcin de la concentracin de sustrato en presencia y ausencia del inhibidor (I), a concentracin 2mM.[S] (mM)Velocidad (umol/L. min)

Con inhibidorSin inhibidor

310.44.1

514.56.4

1022.511.3

3033.822.6

9040.533.8

a. Cules son los valores de Vmax y Km en ausencia de inhibidor?y en su presencia?1/V0 = 1/Vmx + Km/Vmx (1/[s])V = b + mxSegn grficaLa velocidad mxima es constante tanto para el que tiene el inhibidor y para el que no tiene el inhibidor.

1/Vmx = 0.021 Vmx= 47,6

Km inhibidor = -1/Km= -0.03 Km sin inhibidor = -1/Km= -0.09 Km= 33,33 Km= 11.11

b. De que tipo de inhibicin se trata?Se trata de una inhibicin competitiva ya que la velocidad se mantiene constante y el Km aumenta.

c. Cul es la constante de unin de este inhibidor?Ki = Km ( 1 + 2x 10-3/KI)33.33 = 11.11 (1 + 2x 10-3/KI)KI = 0.334d. Cuando [S] = 10uM e [I]= 2mM Qu fraccin de las molculas estn unidas al sustrato? y al inhibidor?

Con Inhibidor:

V= 11.3 umol/L.minmg/tiempo=11.3mg=11.3 x 30mg= 339

Sin inhibidor:V= 22.5 umol/L.minmg/tiempo= 22.5mg= 22.5 x 30mg= 675

Fraccin de molculas:

Si 675 mg 100%339mgXX=50.22%

2. Una enzima tiene Km de 6.3 X10-5 M y V max de 20uM/L.min Qu velocidad se observar en presencia de 2 x 10-4 M sustrato y 5x10-4 M de : a) un inhibidor competitivo, b) un inhibidor no competitivo, c) un inhibidor acompetitivo. En estos tres casos Ki es 3 x 10-4 M.

Inhibidor competitivo

V= 2 x 10-5

Inhibidor no competitivo

V= 7.5 x 10-6

Inhibidor acompetitivo

V= 6.8 x 10-4

Referencias Bibliogrficas1. Ofelia, Grajales M. Apuntes de Bioqumica vegetal, Bases para su aplicacisn fisiolgica. Primera Ed. Mexico. Universidad Autonoma de Mxico. Pag. 42. 2005.2. Nelson DL, Cox MM. Lehninger: Principios de Bioqumica. 5ta ed. Barcelona (Epaa). Pag.185. 2009.3. Nelson DL, Cox MM. Lehninger: Principios de Bioqumica. 5ta ed. Barcelona (Epaa). Pag.186. 2009.4. Pea, Antonio. Bioqumica. 2da ed. Mxico.Editorial Limusa S.A. pag. 179. 2004.5. Dorothy E, Schumm, Ph. D. Principios de Bioqumica. Ed. El Manual Moderno S.A. Mxico. 1989.6. Nelson DL, Cox MM. Lehninger: Principios de Bioqumica. 5ta ed. Barcelona (Epaa). 2009.7. 2bachillerato.es, atencin primaria en la red (pgina web). La web de 2 de bachillerato (acceso: 20 de mayo del 2013). Disponible en: http://www.2bachillerato.es/biologia/tema5/p8.html.8. Williams, E. y J. Hazel. 1994. Membrane fluidity and hemilayer temperature sensitivity in trout heaptocytes during brief in vitro cold exposure. Am. J. Physiol. 266 (3): R773-R780.9. Villar Palas V, Cabezas Fdez Campo JA, Santos Ruiz A. Cintica y mecanismos de la reaccin enzimtica. En: Tratado de Bioqumica. 5 Ed. Barcelona: Augusta S.A.; 1977. p. 683-710. 10. Ciuti R, Rinaldi G. Serum and plasma compared for use in 19 common chemical tests performed in the Hitachi 737 Analyzer. Clin Chem 1989; 35: 1562-3.

ACTIVIDAD ENZIMTICA. DETERMINACIN DEL Km y Vmax. EFECTO DE ACTIVADORES E INHIBIDORESPgina 7