IDENTIFICACIÓN DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES …

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IDENTIFICACIÓN DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES BACTERIANAS Y FUNGOSAS QUE AFECTAN AL TUBÉRCULO SEMILLA DE PAPA VARIEDAD

DIACOL CAPIRO EN COLOMBIA

SANDRA CATALINA SALGADO HERNÁNDEZ

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar el título de

MICROBIÓLOGA AGRÍCOLA Y VETERINARIA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Santafé de Bogotá, D.C. Noviembre 2000

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______________________ ________________________ Director Trabajo de Grado Codirector Trabajo de Grado Dr. Luis Lago Castro Dra. Sandra Molina Doctorado en Ciencias Ingeniera Agrónoma Biológicas y Agrícolas PhD.

__________________ Asesora Dra. Marcela Franco Microbióloga



3




______________________ ________________________ JURADO 1 JURADO 2 Dra. Clemencia de la Rotta Dra. Jimena Sánchez

Ingeniera Agrónoma Bacterióloga, M.Sc. Microbiología- M.Sc. Fitopatología Fitopatología



4




______________________ ______________________ Dr. Carlos Corredor, PhD Dra. Aura Rosa Manascero

Decano Académico Directora Carrera Facultad Ciencias PUJ Facultad Ciencias PUJ



5

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de julio de 1946:

¨La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus tesis de grado ̈

6

A Dios por ser mi guía.

A mis padres por permitirme la

oportunidad de realizar este sueño y

por su apoyo constante.

A mis amigos Lina y Cesar por su gran

amistad y ayuda incondicional.

A Mario por el esfuerzo y colaboración que

me proporcionó para culminar este trabajo.

7

RESUMEN

El presente estudio se realizó con la empresa Mc Cain Andina S.A. con el objetivo

de identificar y reportar las principales enfermedades causadas por bacterias y

hongos, que afectan al tubérculo semilla de papa Solanum tuberosum spp.

andigena variedad Diacol Capiro, categorías Básica, Registrada, Mejorada y

Certificada en los departamentos de Cundinamarca, Boyacá, Antioquia y Nariño.

Los tubérculos semilla se evaluaron por medio de la observación directa de los

signos y los síntomas. El método aplicado para tal fin se realizó por medio de la

implementación de escalas visuales de evaluación, que permitieron reportar el

grado de severidad de las enfermedades presentes, al igual que la incidencia de

cada enfermedad en la población observada, teniendo en cuenta las variables:

Zona geográfica de procedencia y Categoría de la semilla.

Para el diagnóstico de laboratorio de las diferentes patologías se llevaron a cabo

métodos de reconocimiento y muestreo haciendo una correlación de los síntomas

expresados tanto en condiciones de campo como en almacenamiento, junto con

8

técnicas de aislamiento y cultivo para microorganismos patógenos; estos se

aislaron, sembraron y multiplicaron para la posterior observación al microscopio.

Se practicaron pruebas de patogenicidad para la identificación de Erwinia y

pruebas bioquímicas para identificación de bacterias. Como resultado se obtuvo el

aislamiento de las bacterias: Erwinia carotovora var. carotovora, E. carotovora var.

atroseptica y E. chrysantemi, y de los hongos Rhizoctonia solani, Fusarium spp.,

F. oxysporum, F. avenaceum, Geotrichum spp., Spongospora subterranea fue

identificada a partir de agallas de raíces.

Para la bacteria Ralstonia solanacearum se aplicaron dos métodos de evaluación:

Primero, el Hot Box (caja caliente) a 30°C, metodología que se logró aplicar

gracias a la realización de este trabajo; empleada para minitubérculos semilla

Super Élite, como una herramienta que permite evidenciar la expresión de

síntomas causados por esta bacteria. Segundo, la Prueba Inmunoenzimática

(ELISA-NCM) aplicado en muestras procedentes de Antioquia y Cundinamarca,

con el fin de utilizarse como prueba de diagnóstico para detectar la presencia de la

bacteria.

9

AGRADECIMIENTOS

Expreso mis agradecimientos a:

Dr. LUIS LAGO CASTRO, Doctor en Ciencias Biológicas y Agrícolas y Director de

la investigación, por sus valiosas orientaciones, enseñanzas y su gran apoyo

durante la realización de este trabajo.

Dra. SANDRA MOLINA, Ingeniera Agrónoma, fitopatóloga de la Sección de

Sanidad Vegetal del ICA y Codirectora, por su dedicación y constante

colaboración en las labores realizadas en el laboratorio.

Dra. MARCELA FRANCO, Microbióloga, docente de la Pontificia Universidad

Javeriana y asesora, por facilitarme la debida orientación para la organización de

este trabajo.

Dra. JIMENA SÁNCHEZ, Bacterióloga. Msc., Profesora Fitopatología de la

Pontificia Universidad Javeriana, por estar siempre presta a ofrecerme su

10

incondicional ayuda y colaboración de forma constante para la investigación de

este proyecto.

A Mc Cain Andina por los aportes técnicos y científicos proporcionados para llevar

a cabo la realización de este trabajo.

A todo el personal del Laboratorio de Sanidad Vegetal del ICA por estar siempre

dispuesto a brindarme su apoyo y colaboración en las labores realizadas.

A todas aquellas personas que de una u otra forma colaboraron en la realización

del presente trabajo.

11

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

RESUMEN

1. INTRODUCCIÓN 1

2. REVISIÓN DE LITERATURA 4

2.1. GENERALIDADES DEL CULTIVO DE LA PAPA EN 4 COLOMBIA

2.1.1. Historia 4

2.1.2. Clasificación taxonómica 5

2.1.3. Morfología de la planta 6

2.2. PRINCIPALES ENFERMEDADES QUE AFECTAN AL 8 CULTIVO DE LA PAPA 2.3. PRINCIPALES ENFERMEDADES CAUSADAS POR 11 BACTERIAS Y HONGOS TRANSMITIDAS POR SEMILLA 2.3.1 Bacterias 11

2.3.1.1. Ralstonia solanacearum 11

2.3.1.2. Erwinia carotovora var. atroseptica - E. carotovora var. 14 carotovora - E.chrysantemi

12

2.3.1.3. Streptomyces scabies 18

2.3.2. Hongos 20

2.3.2.1. Rhizoctonia solani 20

2.3.2.2. Spongospora subterránea 23

2.3.2.3. Fusarium spp., F. oxysporum, F. avenaceum 26

2.3.2.4. Geotrichum spp. 28

2.4. VARIEDAD DE LA PAPA 30

2.5. SEMILLA DE PAPA 31

2.5.1. Importancia del cultivo de semilla de papa en Colombia 32

2.5.2. Categorías de la semilla de papa 33

2.5.3. Localización de los cultivos de semilla evaluados 34

2.6. IMPLEMENTACIÓN Y UTILIZACIÓN DE ESCALAS DE 37 INCIDENCIA Y SEVERIDAD 2.7. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO 38

2.7.1. Visual 38

2.7.2. Microbiológico 39

2.7.3. ELISA 39

2.7.4. PCR 40

3. JUSTIFICACIÓN 41

4. OBJETIVOS 44

4.1. GENERAL 44

4.2. ESPECÍFICOS 44

13

5. MATERIALES Y MÉTODOS 46

5.1. MATERIAL EXPERIMENTAL 46

5.2. MÉTODOS 47

5.2.1. Tratamiento de los tubérculos semilla de papa 47

5.2.2. Recolección de las muestras 48

5.2.3. Reconocimiento de las enfermedades 49

5.2.3.1. Reconocimiento visual o directo 50

5.2.3.2. Reconocimiento en el laboratorio 51

5.2.4. Técnica de aislamiento 51

5.2.5. Pruebas bioquímicas para identificación de bacterias 53

5.2.6. Pruebas de patogenicidad para identificación de Erwinia 56

5.2.7. Métodos de evaluación para Ralstonia solanacearum 57

5.2.7.1. Hot box 57

5.2.7.2. ELISA (NCM) 58

5.2.8. Análisis de los datos 60

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 61

6.1. RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LOS PATÓGENOS EN EL LABORATORIO 61

6.1.1. Bacterias 61

6.1.2. Hongos 64

6.2. EVALUACIÓN DE ENFERMEDADES MEDIANTE LAS 73

14

ESCALAS DE SEVERIDAD 6.2.1. Grados de severidad de las escalas visuales 73

6.2.2. Incidencia de las enfermedades según la distribución 73 Geográfica

6.2.3. Incidencia de las enfermedades según la categoría de la 82

semilla

6.2. EVALUACIÓN DE Ralstonia solanacearum 85

6.3. APORTES DE LA TESIS A McCAIN ANDINA 86

7. CONCLUSIONES 88

8. RECOMENDACIONES 90

BIBLIOGRAFÍA 92

15

ÍNDICE DE TABLAS

Pág.

TABLA 1. Enfermedades bacterianas del cultivo de la papa 9

TABLA 2. Enfermedades fungosas del cultivo de la papa 10

TABLA 3. Enfermedades virosas del cultivo de la papa 10

TABLA 4. Cultivos localizados en Cundinamarca 35

TABLA 5. Cultivos localizados en Boyacá 35

TABLA 6. Cultivos localizados en Antioquia 36

TABLA 7. Cultivo localizado en Nariño 36

TABLA 8. Resultados pruebas bioquímicas para bacterias 63

TABLA 9. Grado de severidad en la escala de Rhizoctonia solani 73

TABLA 10. Grado de severidad en la escala de Spongospora

Subterránea 74

TABLA 11. Incidencia de las enfermedades en campo en Cundinamarca 75

TABLA 12. Incidencia de las enfermedades en campo en Boyacá 75

TABLA 13. Incidencia de las enfermedades en campo en Nariño 75

16

TABLA 14. Incidencia de las enfermedades en bodega en Boyacá 79

TABLA 15. Incidencia de las enfermedades en bodega en Antioquia 79

TABLA 16. Incidencia de las enfermedades en campo según la 83 categoría en Cundinamarca

TABLA 17. Incidencia de las enfermedades en campo según la 83 categoría en Boyacá

TABLA 18. Incidencia de las enfermedades en campo según la 83 categoría en Nariño

TABLA 19. Incidencia de las enfermedades en bodega según la 83 categoría en Boyacá

TABLA 20. Incidencia de las enfermedades en bodega según la 84 categoría en Antioquia

17

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág.

FIGURA 1. Ralstonia solanacearum. Síntomas en tubérculos 13

FIGURA 2. Erwinia carotovora var. atroseptica. Pata negra en el tallo 17

FIGURA 3. Erwinia carotovora var. atroseptica. Pudrición en 17 tubérculos

FIGURA 4. Streptomyces scabies. Síntomas en tubérculos. 19

FIGURA 5. Esclerocios de Rhizoctonia solani en tubérculos. 22

FIGURA 6. Rhizoctonia solani. Agrietaduras en tubérculos. 22

FIGURA 7. Spongospora subterranea. Agallas en raíces 24

FIGURA 8. Spongospora subterranea. Verrugas en tubérculos. 24

FIGURA 9. Fusarium. Síntomas en tubérculos. 27

FIGURA 10. Geotrichum spp. Síntomas en tubérculos 29

FIGURA 11. Desarrollo de la coloración de ELISA (NCM). 59

FIGURA 12. Colonias de Erwinia. 62

FIGURA 13. Erwinia. Coloración de Gram 62

FIGURA 14. Prueba de patogenicidad de Erwinia 63

18

FIGURA 15. Rhizoctonia solani en PDA. 65

FIGURA 16. Hifas de Rhizoctonia solani. 65

FIGURA 17. Quistosoros Spongospora subterranea. 66

FIGURA 18. Fusarium spp. en PDA. 67

FIGURA 19. Fusarium oxysporum en PDA. 68

FIGURA 20. Fusarium avenaceum en PDA. 68

FIGURA 21. Conidias de Fusarium spp. 69

FIGURA 22. Clamidosporas Fusarium oxysporum . 70

FIGURA 23. Macroconidias de Fusarium avenaceaum. 70

FIGURA 24. Geotrichum spp. en PDA. 71

FIGURA 25. Geotrichum spp. Observación microscópica. 72

19

ÍNDICE DE ANEXOS

Pág.

ANEXO 1. Ciclo de la enfermedad de Erwinia. 98

ANEXO 2. Ciclo de la enfermedad de Rhizoctonia solani. 99

ANEXO 3. Ciclo de la enfermedad de Spongospora subterránea 100

ANEXO 4. Ciclo de la enfermedad de Fusarium oxysporum 101

ANEXO 5. Mapa zonas productoras de papa en Colombia 102

ANEXO 6. Escala de severidad para Rhizoctonia solani (Kühn) 103

ANEXO 7. Escala de severidad para Spongospora 104

subterranea (Wallr).

ANEXO 8. Agar PDA. 105

ANEXO 9 Agar Nutritivo. 106

ANEXO 10. Coloración de Gram. 107

ANEXO 11. Prueba Oxido/Fermentación (O/F). 109

ANEXO 12. Caldo para producción de indol - Reactivo Kovac´s. 110

ANEXO 13. Prueba de reducción de compuestos de sacarosa – 111 Reactivo Benedict.

ANEXO 14. Soluciones empleadas en la prueba ELISA (NCM). 112

20

ÍNDICE DE GRÁFICAS

GRÁFICA 1. Grados de severidad de la escala de Rhizoctonia solani

GRAFICA 2. Grados de severidad de la escala de Spongospora subterranea

GRAFICA 3. Incidencia de las enfermedades en campo en Cundinamarca

GRÁFICA 4. Incidencia de las enfermedades en campo en Boyacá

GRÁFICA 5. Incidencia de las enfermedades en campo en Nariño

GRÁFICA 6. Incidencia de las enfermedades en bodega en Boyacá

GRÁFICA 7. Incidencia de las enfermedades en bodega en Antioquia

21

1. INTRODUCCIÓN

La papa es un cultivo que se siembra en casi todo el mundo y es afectado por

infinidad de patógenos, entre ellos las bacterias y los hongos. Generalmente se ha

reportado que la semilla de papa se mueve activamente dentro de un país a otro y

de un continente a otro y puede transmitir las enfermedades de generación en

generación, por lo tanto, muchos de los patógenos que en la actualidad

conocemos, están presentes donde quiera que se cultive papa.

La papa forma parte de las 20 especies que alimentan al 90% de la población

mundial y está dentro de las 6 que constituyen la fuente vital de la mitad de los

habitantes del mundo, ocupando el tercer lugar después del trigo y el arroz

(Carranza, J. 1995). Aproximadamente 90.000 productores cultivan anualmente en

Colombia cerca de 180.000 has de papa, de las cuales se usan 250.000 toneladas

para semilla. De ésta cerca del 97% es de sanidad dudosa. Los cultivadores

utilizan de 1 a 2.5 toneladas de semilla/ha equivalente al 10% de la producción

total nacional (Dilmer, J. 1997). Actualmente la producción total de papa en

Colombia es de 3 millones de toneladas: 80% para consumo fresco, 8% para

22

procesamiento, 8% para semilla y un 3-7% queda desperdiciado en el suelo

(Papa. 1999).

La producción anual de papa en Colombia es de 2´750.000 ton, de las cuales solo

el 1% (27.500 ton), es semilla Certificada. Los agricultores que utilizan la papa

como un renglón importante en sus actividades económicas, no utilizan semilla

Certificada, únicamente un 3% lo hace, por lo tanto un alto porcentaje de

agricultores en el país se ve obligado a sembrar semestre tras semestre la misma

semilla, trayendo como consecuencia la degeneración de la misma, el

establecimiento de patógenos y la disminución de los rendimientos de las

cosechas (Zapata, J. L.1999).

Las enfermedades bacterianas y fungosas, aunque en pocos casos son de

carácter letal, generalmente reducen el vigor y las posibilidades de usar los

tubérculos como semilla; además os problemas de origen viral son una de las

principales causas de disminución en la productividad de esta especie vegetal.

Algunos microorganismos dependen de la papa para su supervivencia y

diseminación, probablemente fueron introducidos con el material inicial traído

desde su centro de origen; estos microorganismos usualmente son comunes en

cualquier sitio en donde se cultive papa, otros son encontrados en algunas

especies vegetales, cultivadas o no y afectan la papa en condiciones favorables

(Zapata, 1999).

23

Cuando los tubérculos son infectados por bacterias y hongos, las semillas

vegetativas que se utilizan, dan lugar a plantas infectadas en la siguiente etapa;

estas en su mayoría se ven anormales y producen mucho menos que las plantas

sanas. Uno de los principales objetivos en la producción de semilla de papa es

obtener tubérculos libres de patógenos, por tales razones es importante tener en

cuenta las condiciones sanitarias óptimas que debe tener el tubérculo semilla,

para evitar la transmisión y diseminación de enfermedades causadas por hongos y

bacterias, que disminuyen la productividad del cultivo y permiten establecer un

sistema de control de calidad en la producción de semilla de papa en Colombia.

Adicionalmente los aspectos sociales juegan un papel importante, ya que la

mayoría de los cultivos en Colombia se ubican en áreas de minifundio,

caracterizado por estar en manos de campesinos de bajos recursos y tecnología

de producción muy escasa.

24

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. GENERALIDADES DEL CULTIVO DE LA PAPA EN COLOMBIA

2.1.1. HISTORIA

La papa es nativa de la Cordillera Andina de Sudamérica, este cultivo es propio de

regiones frías o templadas. Es la planta dicotiledónea más importante como fuente

de alimentación humana; fue introducida en España pero no se conoce la fecha en

que esto sucedió. Se considera que las papas introducidas a Europa fueron del

grupo Andígena, conclusión que se dedujo por el tipo disponible en Europa en el

siglo XVI. La papa llegó a Irlanda en 1663 y fue allí aparentemente donde fue

cultivada por primera vez, con el fin del aprovechamiento de los tubérculos. En

aquel tiempo la papa llegó a ser un producto muy importante en la alimentación de

los habitantes (FEDEPAPA, 1997).

25

2.1.2. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

El cultivo de papa está constituida por un número de especies o híbridos que

pertenecen a la familia solanaceae, sección tuberarium, con aproximadamente

150 especies tuberíferas. La más común es Solanum tuberosum compuesta por

las subespecies andígena y tuberosum. La clasificación taxonómica de la papa se

basa en caracteres florales, lo que permite clasificarla de la siguiente forma (Luján,

L. 1991):

DIVISIÓN: Angiospermas

CLASE: Dicotiledónea

SUBCLASE: Metaclamidea

ORDEN: Tubifloras

FAMILIA: Solanaceae

SUBFAMILIA: Solanoideae

TRIBU: Solaneae

GÉNERO: Solanum

SUBGÉNERO: Papa

SECCIÓN: Petota

SUBSECCIÓN: Papa

26

2.1.3. MORFOLOGÍA DE LA PLANTA

RAÍCES: Cuando las plantas crecen a partir de tubérculos-semilla forman raíces

adventicias fibrosas, primero en la base de cada brote y luego encima de los

nudos en la parte subterránea de cada tallo. La papa tiene un sistema radicular

débil, por eso es necesario un suelo de buenas condiciones; un buen desarrollo

del sistema radicular proporciona una mayor área de absorción de agua y

nutrientes (FEDEPAPA, 1997).

TALLOS: El sistema de tallos de la papa consta de tallos principales o aéreos,

estolones y tubérculos:

• Tallos aéreos: Son herbáceos, erguidos y resultan del desarrollo de las yemas

localizadas en los ojos de los tubérculos, el número varía de acuerdo al tamaño

del tubérculo madre. Su función es transportar ascendentemente el agua y

nutrientes a través del xilema y la translocación de los productos fotosintéticos

por medio del floema.

• Estolones: Son tallos laterales que crecen horizontalmente dentro del suelo a

partir de las yemas de la parte subterránea de los tallos principales. La longitud

de los estolones es uno de los caracteres utilizados para diferenciar variedades.

27

• Tubérculos: Es un órgano de almacenamiento de materiales de reserva y por su

contenido de agua y nutrientes es el más apropiado para la propagación

vegetativa de la planta de papa. La producción asexual de la papa a partir de

tubérculos-semilla, permite mantener casi inalterable su constitución genética,

pero facilita el establecimiento y diseminación de enfermedades causadas por

virus que reducen la capacidad productiva de la planta (FEDEPAPA, 1997).

El tubérculo se compone de las siguientes zonas:

• Peridermo: Es la piel, controla la pérdida de humedad e impide la entrada de

patógenos.

• Corteza: Es una estrecha capa de tejido parenquimatoso que se encuentra

debajo del peridermo, contiene proteínas, gránulos de almidón y pigmentos.

• Anillo vascular: Es delgado y está formado por el xilema y floema por el cual

circula el agua y los elementos fotosintetizados respectivamente.

• Parénquima de reserva: Es el tejido de almacenamiento que abarca la mayor

parte del tubérculo (FEDEPAPA, 1997).

28

HOJAS: Son compuestas, la forma varía desde orbicular hasta lancelolada, de

color verde oscuro.

FLORES: Constan de un cáliz, corola , estambres, pistilo; el conjunto de estambres

forman el órgano masculino llamado androceo y el pistilo es el órgano femenino

llamado gineceo.

FRUTO: Es una baya esférica, globular, ovoide o cónico alargada. Color verde

pálido u oscuro (FEDEPAPA, 1997).

2.2. PRINCIPALES ENFERMEDADES QUE AFECTAN AL CULTIVO DE LA

PAPA

Las enfermedades de una planta pueden ser consideradas como una interacción

entre el hospedante (papa) y un agente causal de enfermedad, la cual afecta en

forma adversa la productividad y utilización del cultivo. Esta interacción está

influenciada por el medio ambiente que actúa ya sea sobre uno de ellos o sobre

ambos, planta y patógeno; frecuentemente los efectos adversos del medio

ambiente son suficientes para iniciar una enfermedad. Según la literatura se han

registrado a nivel mundial por lo menos 40 enfermedades fungosas, 6 bacteriales,

30 virales, 5 por nemátodos y 40 enfermedades no parasíticas. Obviamente no

todos se presentan en la misma distribución geográfica (FEDEPAPA. 1997).

29

Se denominan enfermedades no parasíticas o no infecciosas las que son

causadas por el ambiente, tales como heladas, temperaturas elevadas, deficiencia

o exceso de minerales en el suelo, anegamientos, gases industriales, entre otros,

siendo todos estos elementos estudiados por el área de fisiología vegetal

(FEDECAFE, 1990).

A continuación se mencionan las principales enfermedades y patógenos que

atacan el cultivo de la papa:

Tabla 1. Enfermedades bacterianas del cultivo de papa (Hooker, W.J. 1980).

ORGANISMO NOMBRE COMÚN Ralstonia solanacearum (E.F. Smith) Marchitez bacteriana,

Dormidera. Erwinia carotovora var. atroseptica (Van Hall) Dye

Pierna negra, pata negra.

Erwinia carotovora var. carotovora (Jones) Dye

Pudrición blanda.

Erwinia chrysantemi Pudrición blanda. Corynebacterium sepedonicum Pudrición anular. Streptomyces scabies (Thaxter) Sarna común.

Tabla 2. Enfermedades fungosas del cultivo de papa (Hooker, W.J. 1980).

ORGANISMO NOMBRE COMÚN Rhizoctonia solani (Kühn) Costra negra, Rhizoctoniasis. Spongospora subterranea (Wallr) Lagerth Roña polvosa. Fusarium spp., F. solani, (Mart) F. oxysporum, F. avenaceum

Pudrición seca, Marchitez por Fusarium.

Phytophtora infestans (Mont) De Bary Tizón tardío, gota. Verticillium albo-atrum (Reinke y Berth) Marchitez temprana. Rosellinia spp. Mortaja blanca, Torbó. Alternaria solani (Sorauer) Tizón temprano. Pythium spp. Pudrición acuosa. Synchytrium endobioticum (Schilb) Veruga. Roña negra. Tabla 3. Enfermedades virosas del cultivo de papa (Hooker, W.J. 1980).

30

CLASIFICACIÓN NOMBRE DEL AGENTE CAUSAL Luteovirus Virus del Enrollamiento de hojas de la papa.

PLRV Carlavirus Virus S de la papa. PVS Potexvirus Virus X de la papa. PVX Potyvirus Virus Y de la papa. PVY Closterovirus Virus del Amarillamiento de venas de la papa.

PYVV

2.3. PRINCIPALES ENFERMEDADES CAUSADAS POR BACTERIAS Y

HONGOS TRANSMITIDAS POR SEMILLA

Las enfermedades causadas por agentes transmisibles se llaman enfermedades

infecciosas o parasitarias, entre las principales enfermedades bacterianas y

fungosas transmitidas por la semilla se describen las siguientes:

2.3.1. BACTERIAS

2.3.1.1 Ralstonia solanacearum E.F. Smith

Nombre común: Marchitez bacteriana, pudrición parda (Holt, J. 1994).

REINO: Prokaryotae.

DIVISIÓN: Bacteria.

FAMILIA: Pseudomonaceae.

GÉNERO: Ralstonia.

ESPECIE: solanacearum.

31

Organismo causal (Agrios, G. 1996).

Esta bacteria inicialmente se llamaba Pseudomonas solanacearum pero su nueva

nomenclatura es Ralstonia solanacearum. Es un bacilo Gram-negativo recto o

curvo con dimensiones de 0.5 a 1 x 1.5 a 4 µm, se desplazan por medio de uno o

muchos flagelos polares, no produce pigmentos fluorescentes. Algunas razas son

habitantes comunes del suelo.

Razas de Ralstonia solanacearum en solanáceas (López, C. 1993):

• Raza 1 : Afecta solanaceas en general, muy virulenta para papa, es clásica en

tierras bajas tropicales y requiere temperaturas altas (sobre 28°C).

• Raza 2 : Afecta papas, en menor proporción tomate. Típica de tierras altas

tropicales. Algunas cepas pueden causar infecciones latentes a bajas

temperaturas, es muy virulenta en tierras cálidas. Las razas 1 y 2 son las que

más predominan en Colombia.

• Raza 3: Afecta papa y tomate pero no es de muy alta virulencia.

•• Raza 4: Es de baja virulencia en papa (López, C. 1993).

32

Síntomas (Hooker, 1980).

FOLLAJE: Se observa marchitez y amarillamiento. Las hojas marchitas palidecen,

toman una coloración verde claro y finalmente se tornan de color castaño.

TALLO: Flácidos. En los tallos jóvenes se puede observar unas rayas oscuras y

angostas que se producen por la colonización del microorganismo en los haces

vasculares infectados. Un signo propio es la presencia de gotitas brillantes de color

castaño grisáceo que exudan del xilema cuando se hace un corte transversal en el

tallo, hay hilos delgados de mucosidad.

TUBÉRCULOS: Se observa a través del peridermo como una decoloración gris

parduzca. Si se cortan transversalmente los tubérculos muestran una decoloración

vascular que puede extenderse desde el xilema hacia la médula y hacia la corteza.

Al hacer una ligera presión, emanan del anillo vascular gotitas blanquecinas de

mucus bacteriano. Los ojos que se encuentran en la base del

tubérculo se oscurecen formándose un exudado pegajoso en estos o en la unión

con el estolón.

33

Figura 1. Ralstonia solanacearum. Síntomas en tubérculos.

Ciclo de la enfermedad y diseminación (Hooker, 1980).

La bacteria es transmitida mediante la siembra de tubérculos infectados, por lo

que se establece cuarentena de tubérculos para semilla en las áreas donde se

presente, también por contacto entre raíces en el suelo, a través de agua que fluye

y mediante el movimiento de suelo contaminado sobre herramientas, equipo y

zapatos. Le favorecen las temperaturas altas, raramente se encuentra en áreas

donde la temperatura media del suelo está por debajo de 15 °C. El desarrollo

óptimo de la mayoría de las razas se realiza entre 30 a 32°C, sin embargo las

razas 1 y 2 de Colombia se desarrollan bien a temperaturas bajas. La enfermedad

se presenta en tipos diferentes de suelo, que varían de arenoso a arcilloso pesado

y en amplio rango de pH. En un campo dado, la enfermedad se localiza

generalmente por focos, asociados a menudo con mal drenaje.

34

Control (Hooker, 1980).

La enfermedad se controla por temperaturas de suelo altas o bajas (promedios

inferiores a 14ºC y superiores a 40ºC y su dispersión se reduce mediante el cultivo

asociado con otros cultivos no susceptibles. Se reduce con enmiendas de suelo

con mucha materia orgánica, solarización, fumigación, labranza mínima, control de

nemátodos, siembra en época fría y el uso de variedades resistentes. Usar semilla

libre de la enfermedad. Practicar rotación de cultivos.

2.3.1.2. Erwinia carotovora var. atroseptica. Eca. (Van Hall) Dye

Nombre común: Pierna negra, pata negra (Holt, J.1994).

REINO: Prokaryotae.


FAMILIA: Enterobacteriaceae.

GÉNERO: Erwinia.

ESPECIE: carotovora

VARIEDAD: atroseptica.

Erwinia carotovora var. carotovora. Ecc. (Jones) Dye.

Erwinia chrysantemi. Echr.

Nombre común: Pudrición blanda (Holt, J.1994).

35

REINO: Prokaryotae.


FAMILIA: Enterobacteriaceae.

GÉNERO: Erwinia.

ESPECIES: carotovora - chrysantemi.

VARIEDAD: carotovora.


Son bacilos Gram-negativos rectos, con dimensiones de 0.5 a 1.0 x 1.0 a 3 µm, se

desplazan por medio de varios o muchos flagelos perítricos. Son las únicas

bacterias fitopatógenas que son anaeróbicas facultativas, son pectolíticas.

Síntomas (Hooker, 1980).

FOLLAJE: Clorótico, los foliolos tienden a enrrollarse, luego se marchitan y

mueren.

TALLO: Muestra una necrosis de apariencia de tinta negra (pata negra), el daño

puede abarcar todo el tallo o solo a unos pocos centímetros de la base. La parte

afectada toma consistencia blanda viscosa.

36

TUBÉRCULOS: Presentan una ligera decoloración vascular al extremo del estolón

que se comunica con la planta, en el estado inicial y una gran descomposición que

afecta todo el tubérculo en estado avanzado. Las lesiones son de formas

circulares, húmedas, ligeramente hundidas, de color canela a castaño. El centro

del tubérculo es hueco y el tejido tiene consistencia blanda, viscosa y pegajosa

producto del exudado bacteriano, este va de color crema a café oscuro. Olor

desagradable.

.

Figura 2. Eca. Pata negra en tallo. Figura 3. Eca. Pudrición en tubérculos.

Ciclo de la enfermedad y diseminación (López, C. 1993).

El inóculo primario se encuentra sobre o dentro de la semilla. Después de la

siembra, el tubérculo madre se va deteriorando durante el desarrollo de la planta,

liberando hacia el suelo gran cantidad de bacterias y produciendo plantas

infectadas. La bacteria puede movilizarse por medio de agua de riego y

contaminar los tubérculos de plantas vecinas. La infección comienza por la

penetración de la bacteria por las lenticelas, agrietaduras o heridas y puede

37

sobrevivir en tubérculos contaminados durante todo el período de almacenaje. La

bacteria persiste en el suelo por períodos cortos, pero esto depende de las

condiciones de temperatura y la humedad del suelo; ya que estos favorecen su

crecimiento. Eca crece en climas fríos y Ecc y Echr en temperaturas superiores a

10°C y climas templados. (Anexo 1). El ataque se produce en el almacén o en el

suelo antes de la cosecha y los tubérculos semilla se deterioran después de la

siembra. La invasión de Fusarium spp. a la semilla puede predisponer el tejido a

pudrición blanda y favorecer el desarrollo de Pierna negra.

Control (Hooker, W.J. 1980).

Usar semilla sana. Evitar inundaciones en el terreno o un riego excesivo. Eliminar

residuos de cosecha para que no sirvan de reservorio de la bacteria.

2.3.1.3. Streptomyces scabies (Thaxter).

Nombre común: Sarna Común (Agrios, G. 1996).

REINO: Prokaryotae.


CLASE: Actinomicetes.

GÉNERO: Streptomyces.

ESPECIE: scabies.

38


Se encuentra registrada en Colombia. Los Streptomycetes están clasificados

como bacterias, pero tienen gran similitud con los hongos por su morfología

filamentosa. Este es un organismo aeróbico con micelio muy delgado, colonias

compactas. Produce un micelio aéreo que forma cadenas de conidios no móviles.

Las células constan de filamentos ramificados cenocíticos (no septados), los

cuales a menudo tienen forma de espiral y producen conidios en

cadena sobre hifas aéreas por la segmentación de las hifas. Es un habitante

común del suelo.

Síntomas (Hooker, W.J. 1980).

TALLO: Las lesiones son de color castaño a canela, cuando se originan en las

lenticelas tienen forma de lente alargado.

TUBÉRCULOS: Las lesiones son circulares entre 5 a 8 mm de diámetro, pueden

adoptar formas irregulares o como cráteres. El tejido toma coloración del canela

claro al castaño y puede ser como una capa corchosa superficial. Las lesiones

hundidas son de color castaño oscuro casi negro.

39

Figura 4. Streptomyces scabies. Síntomas en tubérculos.

Ciclo de la enfermedad y diseminación (Hooker, W.J. 1980).

Los tubérculos en crecimiento son infectados a través de las lenticelas jóvenes y

también a través de los estomas, además por las heridas. La enfermedad se

transmite debido al cultivo de semilla infectada. El organismo sobrevive en el suelo

por períodos largos sobre material vegetal en descomposición. La siembra

continua de papa en el mismo campo aumenta la severidad del problema. Se

establece mejor en suelos secos.


Usar semilla libre de enfermedad. Prolongar el tiempo entre siembras sucesivas

de papa. Mantener niveles altos de humedad en el suelo durante y después del

establecimiento de los tubérculos por unas 4 a 9 semanas de acuerdo con la

variedad, prácticas culturales de cultivo y clima. Empleo de fertilizantes sulfurados

y ácido formantes para aumentar la acidez del suelo.

40

2.3.2. HONGOS

2.3.2.1. Rhizoctonia solani Kühn

Nombre común: Costra negra, Rhizoctoniasis (Agrios, G. 1996).

REINO: Fungi.

DIVISIÓN: Eumycota.

SUBDIVISIÓN: Deuteromycotina.

CLASE: Agonomycetes.

ORDEN: Agonomycetales (Myceliales).

GÉNERO: Rhizoctonia.

ESPECIE: solani.

Organismo causal (Barnett, H.L. 1972).

Es un hongo de micelio estéril por tener esporas ausentes. Las hifas son gruesas,

septadas, capaces de anastomosarse (fusión de hifas).


FOLLAJE: Las hojas se enrollan hacia arriba como si estuvieran cerrándose y

algunas veces tornan a amarillo.

41

TALLO: Se presenta estrangulamiento del tallo. En la superficie de los tallos,

exactamente por la línea del suelo, se forma una capa tenue blanco y le da una

apariencia polvorienta. Se presentan tubérculos aéreos a lo largo del tallo.

RAÍCES: Se observa un sistema radicular muy pobre, por consecuencia del

estrangulamiento del tallo.

TUBÉRCULOS: En la superficie de los tubérculos maduros se observan

esclerocios de color negro o castaño oscuro, estos son chatos y superficiales o

grandes e irregulares en forma de terrones (costra negra), difíciles de remover.

Además presentan agrietaduras, malformaciones (llamadas muñecos),

concavidades y necrosis en el extremo de unión con el estolón color castaño

rojizo.

Figura 5. Esclerocios de Figura 6. R. solani Agrietaduras R. solani. en tubérculos.

42

Ciclo de la enfermedad y diseminación (Hooker, W.J. 1980).

El patógeno es un habitante del suelo y se mantiene allí en forma de esclerocios y

sobre los tubérculos, o como micelio en restos vegetales en el suelo, los

esclerocios germinan e invaden los tallos de papa a través de las heridas. La

formación de esclerocios sobre los tubérculos depende de las condiciones

ambientales, el desarrollo máximo ocurre después de que se ha matado la planta,

cuando los tubérculos permanecen aún enterrados. La forma de transmisión es

por la siembra de tubérculos semilla fuertemente infestados con esclerocios que

además favorecen el incremento del inóculo en el suelo, al igual que almacenar

tubérculos con grandes cantidades de tierra. (Anexo2). La temperatura del suelo

baja (18°C), el alto nivel de humedad y sobre todo la falta de drenaje favorecen el

crecimiento del patógeno.


Usar semilla libre de esclerocios en alto grado. Rotación de cultivos. Verdear la

semilla mediante almacenamiento con luz indirecta. Evitar excesos de humedad

en el suelo. No demorar la cosecha. Aplicación de fungicidas del grupo de los

benzimidazoles.

43

2.3.2.2. Spongospora subterranea f.sp. subterranea (Wallr)

Nombre común: Roña polvosa (Agrios, G. 1996).

REINO: Fungi

DIVISIÓN: Myxomycota

CLASE: Plasmodiophoromycetes

ORDEN: Plasmodiophorales

GÉNERO: Spongospora

ESPECIE: subterránea

Organismo causal (Hooker, W.J. 1980).

Este hongo es un parásito obligado y por esta razón no es posible aislarlo en

medios de cultivo. Aun cuando pueda sobrevivir en el suelo como esporas

latentes durante muchos años, solo pueden desarrollarse y reproducirse en un

número limitado de hospedantes.

Síntomas (Garcés, E. 1996).

RAÍCES: Se presenta inicialmente pequeñas manchas necróticas que se

transforman en verrugas color blanco crema, para luego convertirse en agallas

que se disponen en hilera en forma de rosario ubicadas en la parte axial de las

raíces, es decir a un lado. Son de color castaño oscuro cuando están

desarrolladas. Estas agallas se forman como resultado de la proliferación de las

44

células huésped (hiperplasia) por lo cual se forma un tejido tumoral sobre las

raíces.

TUBÉRCULOS: En la superficie se producen verrugas color castaño púrpura

formando lesiones levantadas en forma de granitos. La lesión se expande

formando áreas con cavidades o verrugas grandes generando así la forma

ulcerosa de la roña. Debajo de la lesión se forma una depresión superficial llena

de una masa polvorienta de esporas de color castaño oscuro a naranja.

Figura 7. S. Subterranea. Agallas Figura 8. S. Subterranea. Verrugas

en raíces. en tubérculos.

Ciclo de vida y diseminación (Hooker, W.J. 1980).

Cuando la temperatura es favorable y la humedad abundante, la espora latente

produce una zoospora que infecta a un pelo radical y produce un plasmodio, este

último se transforma en un zoosporangio que produce abundantes zoosporas

secundarias que, quizás después de haberse apareado, penetran en la raíz o en

45

los tejidos de un tubérculo, producen un plasmodio y ocasionan la enfermedad

característica. El plasmodio se propaga en los tejidos del hospedante y finalmente

produce esporas de reposo invernantes, las masas de esporas se conservan en el

suelo y diseminan la infección hacia las raíces y tubérculos, las lesiones

verrugosas facilitan el ingreso de otros patógenos. (Anexo 3). El inóculo se

disemina por el viento, el agua y por los tubérculos portadores de esporas. La

temperatura baja del suelo, el alto nivel de humedad favorecen al patógeno. Altos

contenidos de materia orgánica favorecen la acción del hongo. Durante el

almacenaje la roña puede derivar en pudrición seca (Fusarium spp.) o formar un

mayor número de pústulas.


Los mejores estados para evaluar la presencia de roña en los cultivos son:

floración, post-floración y maduración. Usar semilla libre de la enfermedad. No

almacenar tubérculos enfermos junto con los sanos. La rotación de cultivos por 3 a

10 años que ha sido recomendada, depende de las condiciones de clima y suelo.

Siembra en suelos porosos y bien drenados. El azufre da buenos resultados pero

su uso es limitado porque acidifica demasiado el suelo. El remojo de los

tubérculos-semilla infectados en soluciones de formaldehído o bicloruro de

mercurio reduce la cantidad del inóculo.

46

2.3.2.3. Fusarium spp., F. oxysporum, F. avenaceum (Mart)

Nombre común: Pudrición seca, Marchitez por Fusarium (Agrios, G. 1996).

REINO: Fungi.



CLASE: Hyphomycetes.

ORDEN: Hyphales (Moniliales).

GÉNERO: Fusarium.

ESPECIES: oxysporum, avenaceum, spp.

Organismo causal (Barnett, H.L. 1972)

Hongo que produce esporas asexuales que se forman en esporodoquios, incluye

las macro y microconidias., algunas especies producen clamidosporas.


RAÍCES: Pudrición del sistema radicular.

FOLLAJE: Amarillamiento que comienza en las hojas inferiores y progresa hacia la

parte superior de la planta. Marchitez.

47

TALLO: Pudrición de la médula y amarillamiento de la parte inferior del tallo.

Formación de tubérculos aéreos. Decoloración vascular en las partes ubicadas por

encima o por debajo del suelo.

TUBÉRCULOS: La pudrición seca comienza en la porción próxima al estolón. En

la superficie de los tubérculos se forma una depresión y se arrugan. Además

lesiones decoloradas húmedas castaño a canela, de forma circular en cualquier

parte de la superficie del tubérculo. Al hacer un corte se observa que el tejido

vascular toma una coloración castaño, gris a rosado. En estado avanzado se

observan copitos blancos algodonosos en la superficie.

Figura 9. Fusarium. Síntomas en tubérculos.

Ciclo de vida y diseminación (Agrios, G. 1996).

Este hongo habita normalmente en el suelo y allí puede permanecer por varios

años, pero el inóculo primario se mantiene en la semilla a partir de la cual se

propaga en el almacenamiento. Se encuentra en el suelo en forma de micelio y en

48

cualquiera de sus formas de conidias, pero lo hace con mayor frecuencia en forma

de clamidosporas, sobre todo en las regiones templadas frías. (Anexo 4). La

enfermedad se transmite por el inóculo que se encuentra superficialmente o dentro

del tubérculo que se siembra y la infección se realiza a través de las raíces y

progresa hacia el tallo. El suelo, el viento y el agua que corren dispersan el

inóculo, crece a temperaturas de 20 a 30°C.


Cicatrización oportuna de los tubérculos. Selección, manejo de semilla y

condiciones óptimas de almacenamiento que permitan una buena cicatrización de

las heridas. Tratamientos con fungicidas como carbendazim y metiltiofanato en

espolvoreo.

2.3.2.4 Geotrichum spp.

Nombre común: Pudrición gomosa o pegajosa (Agrios, G. 1996).

REINO: Fungi.



CLASE: Hyphomycetes.

ORDEN: Hyphales (Moniliales).

GÉNERO: Geotrichum

49

ESPECIE: spp.

Organismo causal (Barnett, H.L. 1972).

El micelio es septado, conidióforos ausentes. Las colonias llamadas artrosporas

son hialinas, cortas, cilíndricas y con las terminaciones cerradas formadas por la

segmentación de las hifas.

Síntomas (Asscheman, E. 1996).

TUBÉRCULOS: La pudrición se desarrolla desde la superficie hacia el interior del

tubérculo. Los tejidos afectados producen un olor típico parecido a leche agria,

toma una consistencia de goma o caucho que se torna a color rosado cuando se

expone al aire, los síntomas son similares a la pudrición rosada.

Figura 10. Geotrichum spp. Síntomas en tubérculos.

Ciclo de vida y diseminación (Asscheman, E. 1996).

Este hongo es un habitante común del suelo y es un patógeno débil ya que es un

organismo que afecta de forma secundaria en el proceso infeccioso. Penetra en

50

los tubérculos a través de heridas, después de la cosecha. Se comunmente en la

piel del tubérculos, afecta tubérculos que han estado saturados de agua en el

cultivo y por esta razón crece como microorganismo secundario cuando hay

pudriciones húmedas causadas por Erwinia carotovora. Igualmente aparece

cuando hay problemas de pudriciones secas causadas por Fusarium. El exudado

que se escapa de los tubérculos afectados puede causar pudrición húmeda a los

tubérculos adyacentes.


Evitar estancamiento de aguas en el cultivo y realizar un efectivo drenaje.

Almacenar los tubérculos separadamente si es posible. Los tubérculos afectados

pueden colocarse a secar y ser almacenados en frío. El control químico no es

posible.

2.4. VARIEDAD DE LA PAPA

Colombia ha sido uno de los pocos países de América Latina que se inclinó desde

un comienzo por el establecimiento de un programa completo de producción de

semilla, incluyendo la creación de sus propias variedades mediante la

implementación de un programa de mejoramiento genético. El cultivo de la papa

ha sido sometido a mejoramiento de calidad por medio de la producción de

51

numerosas variedades en busca de tubérculos resistentes a determinadas

enfermedades y fenómenos ambientales que afectan su producción.

En este estudio se evaluó la variedad Diacol-Capiro: Conocida también como

R12 negra, utilizada como materia prima por la industria, como producto de

exportación y para consumo en fresco. Esta se cultiva en zonas altas, crece

lentamente y presenta mediana resistencia a la gota, a la marchitez bacteriana y a

los virus PVX y PVY, es susceptible a la roña polvosa. Para la industria de la papa

frita, esta variedad es muy apetecida (FEDEPAPA. 1997).

2.5. SEMILLA DE PAPA

La semilla de papa es una unidad biológica que tiene que cumplir un papel muy

importante, el cual es dar origen a una nueva planta productiva, es la estructura

botánica (en este caso asexual), capaz de reproducir la especie. La propagación

continua de papa por medio del tubérculo-semilla, sin la aplicación de un manejo

adecuado, facilita la transmisión y diseminación de enfermedades causadas por

microorganismos patógenos que afectan la calidad del cultivo (FEDEPAPA. 1997).

52

2.5.1. IMPORTANCIA DEL CULTIVO DE SEMILLA DE PAPA EN COLOMBIA

El cultivo de papa en Colombia es una de las principales fuentes de alimento,

debido a que está entre los países que tienen mayor producción de este tubérculo

en Latino América, principalmente en regiones frías o templadas y su cultivo es de

un gran valor económico a pesar de tener algunos problemas de producción,

almacenaje y utilización.

En el país se desarrolla el método de propagación de este producto por medio del

tubérculo-semilla de papa para la producción comercial, y una de las mayores

limitantes para la producción de semilla es encontrar suelos libres de problemas

fitosanitarios. Después del suelo, la semilla es el recurso natural más importante

para obtener un alto rendimiento por unidad de superficie y desde el punto de vista

de producción, la semilla representa cerca del 20% de los costos totales. El

incremento en los costos de producción, así como la diseminación de plagas y

enfermedades de importancia económica y la competencia con variedades

importadas para industria, nos lleva cada día a mejorar la calidad de la semilla de

papa en Colombia (Alvarado, L. 1998).

53

2.5.2. CATEGORÍAS DE LA SEMILLA DE PAPA

Según la Resolución No. 03303 del 20 noviembre 1997 del Instituto Colombiano

Agropecuario ICA División Semilla para la producción de semilla de papa, se

admiten las siguientes categorías:

Fase I: Material inicial Fase II: Básica

Super élite Registrada

Elite Mejorada

Certificada

Fase I:

Super élite: Los lotes de semilla estarán conformados por un número no superior

a 1000 minitubérculos.

Élite: Los lotes de semilla estarán conformados por un peso máximo de 100 Kg.

Fase II:

Semilla Básica o fundamental: Es la que se ha producido por la supervisión de

un programa técnico de mejoramiento y que constituye la fuente del aumento

inicial o recurrente de la semilla Básica (FEDEPAPA, 1997).

Semilla Registrada: Es la que se ha cosechado de plantas que proceden de

materiales de semilla Básica o Registrada y tratada con el fin de mantener la

identidad original y la pureza genética (FEDEPAPA, 1997).

54

Semilla Mejorada: Es la que no cumple los requisitos de la categoría Certificada,

mantiene la identidad varietal y buena capacidad de producción (FEDEPAPA,

1997).

Semilla Certificada: Es la producida bajo la supervisión de un servicio de

Certificación, puede originarse de una semilla Básica, Registrada o Certificada,

mantiene su identidad varietal y cumple los requisitos establecidos para esta

categoría. Se obtiene por empresas o agricultores y se constituye en la tercera

generación en campo de la semilla Elite que ha sido purificada y saneada por

técnicas de biotecnología (Pineda, R. 2000).

2.5.3. LOCALIZACIÓN DE LOS CULTIVOS

Las condiciones agroecológicas bajo las cuales se siembra papa en Colombia son

muy diversas. Se siembra desde los 2.000 hasta los 3.500 msnm con

temperaturas medias que oscilan entre los 10 y 15ºC y precipitaciones entre 500 y

2500 mm/año (Corpoica.1995). El principal sistema de producción de semilla de

papa en Colombia esta dado por las condiciones del clima, especialmente en los

páramos que están localizados a alturas superiores a los 3.000 metros sobre el

nivel del mar. Allí los productores siembran papa para utilizarla en sus cultivos

como semilla debido a los altos costos que conlleva obtener semilla Certificada

(Papa. 1997).

55

Los cultivos de Mc Cain de los cuales se tomaron las muestras evaluadas, se

encuentran ubicados en los siguientes departamentos (Anexo 5):

Cundinamarca: se encuentran páramos que se encuentran a alturas entre los

2.500 y 3.000 msnm. Su temperatura va de los 10 a 15 ºC.

Tabla 4. Cultivos localizados en Cundinamarca.

Municipio Altura (msnm)

Categoría semilla

Calera 3000 Certificada Chocontá 3000 Registrada, Certificada

Boyacá: Su temperatura va de los 10 a 15ºC. En el altiplano el clima es frío y seco

y en las partes más altas se presenta clima de páramo; el clima templado y menos

lluvioso es el más óptimo para el cultivo de la papa.

Tabla 5. Cultivos localizados en Boyacá

Municipio Altura (msnm) Categoría semilla Ventaquemada 3000 Básica, Registrada,

Mejorada Umbita 3000 Certificada Paipa 3100 Mejorada Tunja 2900 Mejorada

Antioquia: Su temperatura va de 15 a 20ºC, su clima va desde frío, hasta cálido y

húmedo, pasando por un amplio sector de clima templado.

56

Tabla 6. Cultivos localizados en Antioquia

Municipio Altura (msnm) Categoría semilla Jordán 2850 Básica

Nariño: Su temperatura va de 5 a 10ºC en algunas zonas y de 10 a 15ºC en otras;

las temperaturas son bajas en las cuencas medias de los ríos.

Tabla 7. Cultivo localizado en Nariño

Municipio Altura (msnm) Categoría semilla Pasto (Río Bobo) 2900 Certificada

Las bodegas donde se encuentra almacenada la semilla evaluada y los

invernaderos - casa malla de donde provenían las muestras de minitubérculos

Super Élite utilizadas para el Hot Box y ELISA, se encuentran ubicados en

Cundinamarca en Corpoica Tibaitatá. Las bodegas tienen una temperatura de

15ºC y una humedad relativa de 70 y 80%.

2.6. IMPLEMENTACIÓN Y UTILIZACIÓN DE ESCALAS DE SEVERIDAD

La observación de sintomatología y evaluación visual de las muestras, aunque en

la mayoría de los casos es subjetivo, son algunos de los métodos más empleados

al momento de realizar un diagnóstico debido a que permiten evidenciar los

efectos producidos por la acción del patógeno, y esto se convierte en una

57

herramienta útil para diferenciarlos. Aunque para ello es necesario realizar las

respectivas técnicas de laboratorio que brinden un resultado confirmatorio.

Las escalas proporcionaron una forma ágil para cuantificar los niveles de infección

producidos por Rhizoctonia solani (Anexo 5) y Spongospora subterranea. (Anexo

6); esta última se estableció con la realización de este trabajo. Las escalas

evalúan por síntomas la severidad de la enfermedad que presentan los tubérculos

en el momento de hacer el diagnóstico visual en niveles de 0 a 3 (Bucasof, S.M.

1972):

• Grado 0: Tubérculos sanos.

• Grado 1: La superficie del tubérculo presenta máximo (5) manchas o verrugas

producidas por el patógeno.

• Grado 2: La superficie del tubérculo presenta más de (5) manchas o verrugas

producidas por el patógeno, pero estas no ocupan más de la mitad de la

superficie.

• Grado 3: Las manchas ocupan más de la mitad de la superficie del tubérculo.

58

2.7. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

El proceso del diagnóstico está basado en una interacción entre la parte teórica de

la cual partimos inicialmente y la parte práctica por medio de un exámen detallado

de laboratorio para distinguir, determinar e identificar el agente causal de la

enfermedad. Es importante tener en cuenta que al diagnosticar una enfermedad

se debe determinar primero si ésta es ocasionada realmente por un patógeno o

por un factor fisiológico.

2.7.1. Visual

En algunas enfermedades, el diagnóstico puede realizarse rápidamente bajo

condiciones de campo al presentarse signos y síntomas visibles de la enfermedad,

por ejemplo con los hongos. El hecho de comparar estos síntomas observados,

con libros que incluyen las enfermedades que se sabe atacan a plantas de papa

hospedantes, permite reducir la gama de posibilidades y con frecuencia ayuda a

determinar la causa de las enfermedades.

2.7.2. Microbiolólogico

Para este tipo de diagnóstico algunas veces se aplican los Postulados de Koch, en

el caso de que una enfermedad no se encuentre registrada. Esto es necesario

para establecer la relación entre un microorganismo y una enfermedad específica.

Sin embargo, también se puede recurrir a pruebas más aclaratorias de laboratorio

59

y patogenicidad, para establecer la identidad del agente causal de la enfermedad

(French, R. E. 1982).

2.7.3. ELISA

Inicialmente se aplicaba únicamente para enfermedades virales, pero como se

puede ver con Ralstonia solanacearum se está aplicando también en bacterias

con la misma precisión, al igual que en Erwinia. Las ventajas de este método

radican en su gran sensibilidad, en el gran número de muestras que pueden

analizarse, y en que los resultados obtenidos son cuantitativos. Debido a ello esta

prueba está desplazando a las demás técnicas de serología para el diagnóstico

(Priou, S. 1999).

2.7.4. PCR

La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica capaz de generar “in

vitro” grandes cantidades de un determinado fragmento de DNA, a partir de

cantidades mínimas del mismo. La gran sensibilidad, versatilidad y sencillez de

este método ha revolucionado los procesos evolutivos de determinados aspectos

diagnósticos. Por ejemplo este método permite ejecutar rápidamente la

identificación de Ralstonia solanacearum aproximadamente 7 horas después de

su inoculación (Roncal, J. 1999).

60

3. JUSTIFICACIÓN

El cultivo de papa en Colombia es una de las principales fuentes de alimento

debido a que es uno de los países mayores productores de este tubérculo,

principalmente en las regiones de Cundinamarca y Boyacá. Su cultivo es de un

gran valor económico, es por esta razón que es necesario establecer y justificar

medidas preventivas apropiadas que solucionen los problemas tanto en la

producción de semillas de papa, como en su utilización.

Se hace necesario controlar la situación fitosanitaria de los tubérculos utilizados

como semilla, ya que en Colombia se desarrolla el método de propagación de este

producto por medio del tubérculo-semilla de papa para la producción comercial;

sin la aplicación de un manejo adecuado, se facilita la transmisión y diseminación

de enfermedades, que cultivo tras cultivo van reduciendo la capacidad productiva

(Hooker, W.J. 1980).

Las enfermedades pueden limitar severamente la eficiencia del cultivo expresada

en toneladas por hectárea, así como su calidad en una etapa posterior; es por esta

61

razón que se hace indispensable contribuir al conocimiento de las patologías que

afectan el tubérculo-semilla así como su diseminación en el país. Por ello la

realización de métodos de diagnóstico se efectúa con el fin de evaluar la presencia

de las enfermedades tanto bacterianas como fúngicas que afectan el valor del uso

del tubérculo semilla de papa para posteriormente adoptar un sistema de control

apropiado para la producción de semilla (Tamayo, A. 2000).

En el país, la papa es uno de los cultivos que consume el mayor volumen de

insecticidas y fungicidas; la labor de control de plagas y enfermedades representa

alrededor del 16% de los costos totales de producción del cultivo (Corpoica 1995).

La semilla además de ser el origen del cultivo, es el insumo más determinante en

el aumento de la productividad y competitividad. Si la semilla no se encuentra en

un óptimo estado fisiológico y libre de enfermedades y plagas, su desarrollo y tasa

de multiplicación se verán severamente reducidas ya que las enfermedades

constituyen un factor limitante real de la producción económica del cultivo.

El aporte de este trabajo es dar a conocer las patologías del tubérculo semilla de

papa, así como contribuir al desarrollo del conocimiento que estos temas

requieren. Esto repercutirá en un gran beneficio económico para la industria

productora de papa del país, pues se podrá contar con una valiosa herramienta

para el control oportuno de los patógenos .

62

4. OBJETIVOS

4.1. GENERAL

Conocer e identificar los principales problemas patológicos ocasionados por

bacterias y hongos que afectan los tubérculos semilla de papa variedad Diacol

capiro en Colombia, así como la severidad del problema.

4.2. ESPECÍFICOS

♣ Establecer escalas visuales de evaluación para severidad de las enfermedades

presentes en tubérculos-semilla y determinar el porcentaje de incidencia en la

población observada.

♣ Aplicar un procedimiento sencillo de evaluación de la infección latente de

bacterias y hongos mediante técnicas de laboratorio.

63

♣ Proponer un sistema de control de calidad en la producción de semilla de papa.

64

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. MATERIAL EXPERIMENTAL

• Tubérculos semilla de papa Solanum tuberosum spp. andigena, variedad Diacol

Capiro de las categorías: Básica, Registrada, Mejorada y Certificada.

• Raíces con agallas extraídas de la planta de papa.

Reconocimiento de los patógenos en el laboratorio

Se analizaron 23.400 muestras: 5400 a nivel de campo y 18.000 en bodegas.

Hot Box

120 muestras de minitubérculos-semilla categoría Super Élite procedentes de

Cundinamarca.

65

ELISA (NCM)

408 muestras:160 de tubérculos-semilla Básica procedentes de Antioquia (Jordan)

y 248 de minitubérculos-semilla categoría Super Élite procedentes de

Cundinamarca.

5.2. MÉTODOS

5.2.1. TRATAMIENTO DE LOS TUBÉRCULOS SEMILLA DE PAPA

Los tubérculos semilla que llegan a las bodegas se someten a un proceso de

clasificación para separar los tubérculos que presentan daño mecánico,

descomposición, malformaciones, tamaños muy pequeños (llamados riche), etc,

para ser descartados; es importante anotar que las muestras se analizaron antes

de realizarse la clasificación. Los tubérculos seleccionados se vuelven a empacar

en sacos y son sometidos a tratamiento químico con ¨Vitavax¨ el cual protege los

tubérculos contra el daño de chizas, babosas y otros microorganismos

contaminantes; además se les aplica Baculovirus (Virus de la granulosis), es un

compuesto biológico que controla la polilla guatemalteca Tecia solanivora, se

utiliza en cantidades de 5gr por Kg de papa.

66

Después los sacos se almacenan en el cuarto frío a 6°C hasta que sea el tiempo

conveniente de comenzar la brotación; este método proporciona condiciones de

latencia con el fin de retardar el desarrollo de los brotes en las semilla (Potato

Research. 1990). Luego se sacan de allí y se trasladan a la bodega de brotación,

aquí permanen de uno a dos meses que es el tiempo sufiicente para que la semilla

haya brotado lo necesario para cuando sea el momento de ser sembrada.

5.2.2. RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS

Actualmente en Colombia no existe un método específico para realizar el proceso

de muestreo, por lo tanto se realizó uno con base en la metodología aplicada en la

República de Cuba.

En Campo

En cada uno de los cultivos de Cundinamarca, Boyacá y Nariño, el muestreo se

realizó recorriéndolos en zig-zag; en una hectárea a partir de una esquina se

escogieron 5 puntos al azar. De cada uno de los puntos se extrajeron las plantas

que se encuentran a lo largo de 3 m lineales de distancia. Se contaron el número

de plantas y tubérculos totales de cada punto, y el número de tubérculos que

presentaron sintomatología sospechosa de enfermedad se llevan para posterior

67

análisis de laboratorio. Algunos de los aspectos que se tomaron en cuenta para

tomar las muestras en campo fueron:

• Indispensable la observación de los síntomas generales de la planta completa,

para correlacionar los resultados tanto de parte aérea como de la parte

subterránea.

• Al extraer plantas enfermas, se observaron las plantas vecinas para relacionar

si hay diseminación del patógeno en ellas.

En bodega

En la recepción de los cargamentos de semilla de papa para almacenamiento, se

muestreó el 2% de los sacos que conformaban todo el lote, (antes de realizarse la

clasificación). Se contó el número total de tubérculos de cada saco y el número de

tubérculos con sintomatología sospechosa de cada enfermedad para llevar a

posterior análisis de laboratorio.

5.2.3. RECONOCIMIENTO DE LAS ENFERMEDADES

La evaluación e identificación de las enfermedades se llevó a cabo en dos etapas:

Primero, el reconocimiento visual o directo por medio de la observación de

68

síntomas con la utilización de las escalas visuales para calificar severidad y

segundo, la confirmación por medio del reconocimiento en el laboratorio.

5.2.3.1. Reconocimiento visual o directo

En campo: En los casos en que el cultivo no se encontraba en época próxima a

cosecha, se logró observar la sintomatología de la planta, siendo esto una

herramienta útil que facilitó evidenciar los problemas patológicos tanto en la parte

aérea como en los tubérculos. Estos se limpiaron totalmente retirando los excesos

de tierra para apreciar mejor los síntomas y se hicieron cortes transversales para

observar lesiones internas.

En bodegas: La evaluación de los tubérculos se hizo antes de realizar la

clasificación de la semilla. Se vaciaron totalmente los sacos sobre un costal y se

valoró visualmente uno por uno los tubérculos que conformaban la muestra. Se

hicieron cortes transversales para observar lesiones internas. Se contó el número

de tubérculos que presentaba cada una de las afecciones para calcular el

porcentaje de incidencia de cada enfermedad.

En ambos casos el estudio se basó en la observación de las muestras,

describiendo los signos y síntomas que éstos presentaban para caracterizar el tipo

de enfermedad. Para la evaluación y cuantificación se utilizaron documentos

ilustrados y principalmente las escalas de severidad para determinar el grado de

69

enfermedad; las escalas empleadas en este estudio, se aplicaron para evaluar las

enfermedades ocasionadas por Rhizoctonia solani y Spongospora subterranea;

para ésta última se creó una escala que no existía anteriormente y se introdujo

con la realización de este trabajo. (Anexo 7).

5.2.3.2. Reconocimiento en el laboratorio

Los análisis llevados a cabo para la identificación y confirmación de los agentes

etiológicos, se realizaron en el Laboratorio de División Sanidad Vegetal del ICA

Seccional Cundinamarca. El material recolectado se lavó con agua corriente y se

examinó al estereoscopio, con el fin de observar estructuras características del

patógeno y para seleccionar las partes del tejido más apropiadas para el

respectivo aislamiento. Para Rhizoctonia solani y Spongospora subterranea se

hicieron raspados y cortes muy finos del tejido afectado para hacer montajes

directos con azul de lactofenol para la posterior observación microscópica.

5.2.4. TÉCNICA DE AISLAMIENTO

Bacterias (Polo, C. 1997)

Las muestras se lavaron con agua corriente para retirar el exceso de suelo, se

hicieron cortes de tejido que incluyen material enfermo y sano, se sumergieron en

una solución jabonosa con agitación constante, se lavaron con agua destilada

70

estéril. A continuación los trozos se colocaron en un tubo con agua destilada

estéril y se agitaron para que la bacteria se homogenice en el líquido. Se tomó una

asada del inóculo, se hizo el aislamiento en agar nutritivo (Anexo 8) y se incubaron

a 22°C. Se realizaron observaciones a las 24, 48 y 72 horas.

Hongos (Polo, C. 1997)

Las muestras se lavaron con agua corriente para retirar el exceso de suelo, se

hicieron cortes de tejido que incluyen material enfermo y sano, se sumergieron en

una solución jabonosa con agitación constante, se lavaron con agua destilada

estéril. A continuación se pasaron por hipoclorito de sodio al 5% y luego se lavaron

dos veces con agua destilada estéril, se secaron sobre papel filtro estéril

previamente flameado al mechero; las herramientas empleadas se esterilizaron

frecuentemente. Por último se sembraron los trozos de tejido sobre la superficie

del Agar PDA (Anexo 9) y se incubaron a 22°C. Se realizaron observaciones a las

24, 48 y 72 horas.

Purificación de las colonias

Una vez observada la presencia de colonias se realizaron pases o repiques en

agar nutritivo y agar PDA, con el fin de obtener la purificación de las bacterias y

estimular la esporulación de los hongos respectivamente. Para las bacterias, en

71

ciertas ocasiones se realizaron diluciones del inóculo primario con el fin de obtener

una mayor purificación para verificar los bacilos gram-negativos.

Identificación de las colonias

Se observaron características macroscópicas de las colonias como: color,

aspecto, tipo de crecimiento, pigmentación del micelio, difusión de éste en el

medio, formación de estructuras reproductoras. A continuación se hicieron

observaciones microscópicas: en el caso de las bacterias, inmediatamente

después de la purificación se realizó coloración de Gram (Anexo 10) para

confirmar la presencia únicamente de bacilos Gram-negativos causantes de la

patología; y para los hongos se hicieron improntas con cinta transparente y

colorante azul de lactofenol para observar sus estructuras.

5.2.5. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

CATALASA (Schaad, N.W. 1988).

INOCULACIÓN: Se utilizaron cultivos jóvenes de 24-48 horas de crecimiento, se

tomó una colonia aislada y se colocó sobre unas gotas de peróxido de hidrógeno

(H2O2) al 3%, dispuesta en una lámina portaobjeto.

LECTURA: La reacción positiva se observó por la producción de burbujas.

72

OXIDASA (Schaad, N.W. 1988).

INOCULACIÓN: Se utilizó una cepa fresca con un crecimiento aproximado de 24

horas, se tomó una colonia aislada y se inoculó en la zona reactiva de la tira. Los

resultados falsos positivos pueden ser causados por el material del cual está

hecho el asa, por esto es conveniente usarlas desechables. Al cabo de 20 a 60

segundos se observó el color .

LECTURA: Comparar el resultado con la escala colorimétrica, si aparece un color

morado azuloso en la zona de inoculación indicó positivo y el color blanco - crema

indica negativo.

OXIDO / FERMENTACIÓN (O/F) (Koneman, E. 1983).

INOCULACIÓN: Se utilizó una cepa fresca con un crecimiento aproximado de 24

horas, se inocularon dos tubos por carbohidrato, Se cubrió uno de los tubos con 1

cm. de vaselina o parafina estéril, para crear condiciones de anaerobiosis. Se

incubó por 24 horas a 27 °C (Anexo 11).

LECTURA:

Reacción O

Tubo 1: Producción de ácido, color amarillo en el tubo sin parafina

Tubo 2: Color azul o verde en el tubo con parafina.

Positivo para Ralstonia.

73

Reacción F

Tubo 1 y 2: Producción de ácido, color amarillo en ambos.

Positivo para Erwinia.

Reacción negativa: Sin cambio en ninguno de los tubos.

PRODUCCIÓN DE INDOL (Concepción, S. 1981).

INOCULACIÓN: Se utilizó un cultivo joven de 24 horas de crecimiento y se sembró

e incubó a 35°C por 24 horas (Anexo 12).

LECTURA: Después del tiempo de incubación se agregó 1 ml del reactivo de

Kovac`s al tubo. Si se observa la producción de un anillo rojo en la superficie,

entonces demuestra un resultado positivo.

REDUCCIÓN DE COMPUESTOS A PARTIR DE SACAROSA (Concepción, S.

1981).

INOCULACIÓN: Se utilizó un cultivo joven de 24 horas de crecimiento y se sembró

en el caldo. Se incubó a 26 °C por 48 horas (Anexo 13).

LECTURA: Después del tiempo de incubación se agregó 1.5 ml del reactivo de

Benedict al tubo, se colocó en agua hirviendo y si al cabo de 10 minutos toma una

coloración amarillo lechoso, entonces evidencia el resultado positivo.

74

5.2.6. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD PARA IDENTIFICACIÓN DE Erwinia

El objetivo de esta prueba se basa en comprobar los postulados de Koch, los

cuales nos permiten establecer la relación causal entre el patógeno (Erwinia) y

una enfermedad específica (pata negra - pudrición blanda). Se busca confirmar

que los síntomas de la enfermedad presentes en los tubérculos enfermos de los

cuales se aisló inicialmente el patógeno, se manifiesten de igual manera en los

tubérculos inoculados (Garcés, E. 1996).

Se tomó un tubérculo sano de la misma variedad Diacol Capiro, se lavó con agua

jabonosa para remover residuos de suelo, se hizo una desinfección con hipoclorito

de sodio al 5%. Se cortaron varias rodajas del tubérculo y se hizo una pequeña

incisión con pinzas estériles en el centro de cada de ellas para inocular allí la

suspensión bacteriana, se colocaron en una cámara húmeda, Dicha suspensión

se obtuvo con una dilución 10º. Se incubó a 22°C por 48 a 72 horas y se observó

los síntomas de la pudrición causada por Erwinia. Enseguida se procedió a

realizar las respectivas bioquímicas (French, R.E. 1982).

75

5.2.7. MÉTODOS DE EVALUACIÓN PARA Ralstonia solanacearum

La marchitez bacteriana es una enfermedad de gran importancia en Colombia y es

por esta razón que se hizo necesario la aplicación de dos métodos de evaluación

para este patógeno: El Hot Box y el ELISA (NCM).

5.2.7.1. HOT BOX (Caja Caliente) (Lago, L. 1999).

Es un sistema de monitoreo de la semilla en el cual se pretendió crear una

situación anormal de almacenamiento para que aparecieran las patologías

causadas por Ralstonia solanacearum, se determinó el porcentaje de infección

latente que puede tener la semilla producida. Consistió en un cuarto oscuro de

30°C de temperatura con estantes que contienen pequeñas cajas plásticas sin

orificios para evitar contaminación de una muestra a la otra; en ellas se

depositaron las muestras. Se tomaron 20 tubérculos-semilla de cada lote de

Semilla Super Élite y se colocaron separadamente cada uno para evitar contacto

entre ellos. Después de 3 a 5 días se observaron las muestras. Si se observa que

los tubérculos han estallado indica resultado positivo para Ralstonia.

76

5.2.7.2. PRUEBA INMUNOENZIMÁTICA EN MEMBRANA NITROCELULOSA

ELISA-NCM PARA LA DETECCIÓN DE Ralstonia Solanacearum EN PAPA

(Priou, S. 1997).

El ELISA (NCM) es una prueba inmunoenzimática en la que se utilizaron

membranas de nitrocelulosa en lugar de placas de microtitulación como soporte

para las muestras y reactivos empleados. La realización de esta prueba es un

proceso esencial para el monitoreo de Ralstonia en tubérculos para certificación

de semilla y evaluación para la resistencia a la marchitez bacteriana.

Procedimiento:

1. Se colocó una pequeña cantidad de extracto del tubérculo (20µl) sobre la

membrana de nitrocelulosa (dot - blotting).

2. Se bloqueó el área de la membrana donde no están colocadas las muestras (1

hora de incubación).

3. Se añadió los anticuerpos de conejo específicos de Ralstonia solanacearum

(Rs). ( 2 horas de incubación).

4. Se añadió los anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados (=GAR-IgG

conjugado). (1 hora de incubación).

5. Se añadió el sustrato que reacciona con las enzimas y produce una reacción de

coloración ( de 5 a 20 min.) (Anexo 14).

77

Estos pasos se realizaron a temperatura ambiente. Antes de efectuar la prueba

ELISA-NCM se realizará un proceso de enriquecimiento incubando (48 hrs) los

extractos del tubérculo en un caldo semi-selectivo (SMSA modificado), esto

aumenta la sensibilidad.

Interpretación de resultados: La reacción enzimática produce una coloración

púrpura en las muestras positivas, las cuales varían en intensidad de claro a

oscuro según la concentración de Ralstonia en las muestras. Por consiguiente, el

control positivo (106 bact/ml) sería morado oscuro y el control diluido (108 bact/ml)

sería morado claro. Sólo las muestras de color morado oscuro de la misma

intensidad que los controles positivos (106 y 107 bact/ml) se consideran infectadas

con Ralstonia. la intensidad de la coloración es proporcional a la concentración de

bacterias.

Figura 11. Desarrollo de la coloración del ELISA (NCM).

78

5.2.8. ANÁLISIS DE LOS DATOS

Este es un estudio de tipo descriptivo y los datos se obtuvieron realizando un

muestreo al azar. El análisis estadístico aplicado en todos los resultados, se

obtuvo calculando la tasa de prevalencia expresada en porcentaje, de cada

enfermedad según la zona geográfica de procedencia y la categoría de la semilla.

79

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LAS PATÓGENOS EN EL

LABORATORIO

Con la realización de este estudio y mediante el diagnóstico visual y confirmatorio

en el laboratorio, se evidenció la presencia de los siguientes patógenos: Erwinia

carotovora var. atroseptica, E. carotovora var. carotovora y E. chrysantemi,

Rhizoctonia solani, Spongospora subteranea, Fusarium spp., F. oxysporum, F.

avenaceaum y Geotrichum spp., en los tubérculos-semilla de papa Solanum

tuberosum, variedad Diacol Capiro de los departamentos de Cundinamarca,

Boyacá, Antioquia y Nariño; demostrando así que el cultivo de la papa es afectado

por una gran cantidad de patógenos, entre otros naturales.

6.1.1. BACTERIAS

Pierna negra. Erwinia carotovora var. atroseptica. Eca. (Van Hall) Dye.

Pudrición blanda. Erwinia carotovora var.carotovora. Ecc.

Erwinia chrysantemi. Echr.

80

Descripción macroscópica

Las bacterias crecieron en agar nutritivo a 22°C a las 24 horas. Las colonias eran

pequeñas, cremosas, color blanco crema, casi translúcidas.

Figura 12 . Colonias de Erwnia.

Observación microscópica

Al realizar la coloración de Gram (Anexo 10) se observaron bacilos Gram-

negativos rectos pequeños.

Figura 13. Coloración de Gram de Erwinia

81

Pruebas de patogenicidad

Se realizaron pruebas de patogenicidad en Eca y Ecc para confirmar

sintomatología y se obtuvieron resultados positivos en ambos casos. Luego se

procedió a realizar las respectivas pruebas bioquímicas.

Figura 14. Prueba de patogenicidad en rodajas de papa

Pruebas bioquímicas de las bacterias

Los siguientes son los resultados obtenidos de las respectivas pruebas

bioquímicas aplicadas a las bacterias Eca, Ecc, Echr:

Tabla 8. Resultados pruebas bioquímicas para bacterias

PRUEBA Eca Ecc Echr Catalasa + + + Oxidasa - - - O/F F F F Producción de Indol - - + Reducción de comp. a partir de sacarosa

+ - -

82

Sarna común. Streptomyces scabies. (Thaxter).

Al tomar las muestras en el cultivo de papa, por medio del reconocimiento visual,

se observaron los síntomas característicos de Streptomyces, pero al procesar las

mismas en el laboratorio no se obtuvo el aislamiento de este microorganismo.

Debido a que comúnmente los síntomas son confundidos con: fisuras causadas

por Rhizoctonia solani, o por problemas fisiológicos cuando en el cultivo se

presentan épocas de sequía y son seguidas por una lluvia intensa formando

agrietaduras; además de las lesiones similares causadas por nemátodos

(Asscheman, E. 1996). Por esta razón es importante e indispensable la realización

de análisis confirmatorios de los resultados, por medio de los aislamientos de los

microorganismos en el laboratorio.

6.1.2. HONGOS

Costra negra. Rhizoctonia solani. (Kühn).


Creció lentamente a los 6 días, formó un micelio poco algodonoso de color canela

a castaño oscuro, adherido al medio, de crecimiento radial. Se observaron

esclerocios pequeños de color café oscuro en medio del micelio.

83

Figura 15. Rhizoctonia solani en agar PDA


Es un hongo de micelio estéril por tener esporas ausentes las hifas eran gruesas,

septadas, fusionadas. Las principales características fueron: sus ramificaciones en

ángulo recto, constricciones en el punto de origen de la ramificación de la hifa,

formación de una septa en la rama cerca de su origen (Barnett, H.L. 1972).

Figura 16. Hifas de Rhizoctonia solani.

84

Roña polvosa. Spongospora subterranea.(Wallr).


Al hacer el raspado de las agallas de las raíces, se encontraron masas de esporas

llamadas quistosoros, eran ovoides, irregulares o alargados, constituidos por un

conglomerado de esporas (quistes) de descanso fuertemente aglutinadas entre si.

La espora individual es poliédrica, delgada, color castaño amarillenta.

Figura 17. Quistosoros de Spongospora subterranea.

Pudrición seca. Fusarium spp., F. oxysporum, F. avenaceum (Mart)


• Fusarium spp.: Comenzó a crecer rápidamente de 1 a 2 días. Con micelio aéreo

poco extenso y muy algodonoso, de color blanco totalmente, no produce

pigmento difusible alguno.

85

Figura 18 . Fusarium spp. En PDA.

• Fusarium oxysporum: Creció rápidamente de 2 a 3 días. Con micelio aéreo

extenso y algodonoso. La superficie del medio inicialmente era sólo de color

blanco (la mayor parte), pero conforme maduraba se observó color rosa pálido -

lila. En el reverso de la caja se observó el pigmento difusible púrpura oscuro.

Figura 19. Fusarium oxysporum en agar PDA.

• Fusarium avenaceum: Creció rápidamente de 2 a 3 días. El micelio aéreo es

denso y algodonoso. Inicialmente era solo de color blanco y a medida que va

creciendo toma color rojo carmín y/o café oscuro, producto del pigmento que se

86

difunde por debajo del medio; por encima de éste el color se observó más

tenue.

Figura 20. Fusarium avenaceum en PDA.


• Fusarium spp.: Produce esporas asexuales que se forman en esporodoquios,

incluye macro y microconidias levemente encorvadas y con extremos más o

menos puntiagudos.

Figura 21. Conidias de Fusarium spp.

87

• Fusarium oxysporum: Las microconidias son cortas, abundantes, generalmente

de una célula simple, ovaladas o en forma arriñonada, nacen en cabezas

falsas. Las macroconidias tienen generalmente 3 septas, son abundantes,

ligeramente curvas, de pared delgada y delicada, con una célula basal o apical

en forma de pezuña. Las monofiálides de donde salen las microconidias son

cortas, ramificadas y algunas no ramificadas. La principal característica es que

produce clamidosporas, son de pared gruesa y formadas por una o dos

células, son y se forman en la parte terminal del micelio más viejo.

Figura 22. Clamidosporas de Fusarium oxysporum.

• Fusarium avenaceum: Las microconidias son generalmente escasas. Las

macroconidias tienen de 3 a 5 septas, son muy largas, delgadas, con la pared

delgada, con una célula apical que se elonga y también pueden ser

encorvadas. La célula basal tiene forma de pezuña. Tiene monofiálides

ramificadas y no ramificadas. No produce clamidosporas.

88

Figura 23. Macroconidias de Fusarium avenaceum (Hooker, H.L. 1980).

La observación e identificación de las especies de Fusarium se realizaron con

base en los libros (Nelson, P.E. 1981), (Singleton, L.D. 1992).

Geotrichum spp. Pudrición gomosa.


Creció rápidamente de 2 a 3 días. Forma una colonia color blanco, grande

redondeada que crece de forma muy adherida sobre el medio, su consistencia es

polvosa y no filamentosa como los demás hongos.

Figura 24. Geotrichum spp. En Agar PDA.

89


El micelio es septado, conidióforos ausentes. Las colonias llamadas artrosporas

son hialinas, cortas, cilíndricas y con las terminaciones cerradas formadas por la

segmentación de las hifas (Barnett, H.L. 1972).

Figura 25. Geotrichum spp. Observación microscópica.

6.2. EVALUACIÓN DE ENFERMEDADES MEDIANTE LAS ESCALAS DE

SEVERIDAD

6.2.1. GRADOS DE SEVERIDAD DE LAS ESCALAS VISUALES SEGÚN LA

DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

90

De las 23.400 muestras evaluadas tanto a nivel de campo como en condiciones de

almacenamiento, se encontraron 561 con Costra negra que equivale a un 23.9%

de incidencia, con los siguientes grados de severidad:

Tabla 9. Grado de severidad para la escala de Rhizoctonia solani:

DEPARTAMENTO GRADO 1

GRADO 2

GRADO 3

+ T.P. % + T.P. % + T.P. % Cundinamarca 21 9 0.9% 0 0 0 0 0 0 Boyacá 383 164 16.4

% 157 67 6.7% 0 0 0

Antioquia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Nariño 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Según la tabla 9 se observa que el mayor porcentaje de severidad de Costra

negra fue en Boyacá del grado 1 con un 16.4% sobre el total de la incidencia

(Gráfica 1). El grado 1 es el máximo grado de tolerancia en el que puede

sembrarse los tubérculos con fin de semilla, aunque no es lo más óptimo, ya que

por pocos que sean la cantidad de esclerocios presentes en los tubérculos, esto

contribuye al establecimiento del patógeno; de todas formas el grado de severidad

fue bajo ya que la mayoría de las muestras presentaron grado 1.

De las 23.400 muestras evaluadas tanto a nivel de campo como en condiciones de

almacenamiento, se encontraron 11 muestras con Roña polvosa que equivale al

0.5% de incidencia, con los siguientes grados de severidad:

T

91

abla 10. Grado de severidad para la escala de Spongospora subterranea. DEPARTAMENTO GRADO

1 GRADO

2 GRADO

3

+ T.P. % + T.P. % + T.P. % Cundinamarca 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Boyacá 0 0 0 9 4 0.4% 0 0 0 Antioquia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Nariño 2 0.8 0.08% 0 0 0 0 0 0 En la tabla 10 se encontró que en Boyacá el grado 2 fue el que mostró mayor

porcentaje de severidad de la Roña polvosa con un 0.4% (Gráfica 2), lo cual es

debido seguramente a que los cultivos muestreados se encontraban próximos a

época de cosecha, y las agallas maduras de las raíces ya se habían desintegrado

fácilmente, liberando los quistosoros del patógeno en el suelo y por ende se

evidenció fuertemente la aparición de las verrugas en los tubérculos.

6.2.2. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES SEGÚN LA DISTRIBUCIÓN

GEOGRÁFICA

EN CAMPO

El total de muestras evaluadas fue de 5.400, distribuidas así:

CUNDINAMARCA: 2.700 muestras.

Tabla 11. Incidencia de las enfermedades en campo en Cundinamarca ENFERMEDAD CASOS

POSITIVOS TASA

PREVALENCIA PORCENTAJE

Pata negra 1 0.4 0.04% Pudrición blanda 0 0 0% Pudrición seca 3 1 0.1% Costra negra 21 8 0.8% Roña polvosa 0 0 0% Pudrición gomosa 0 0 0%

92

BOYACÁ: 1.800 muestras. Tabla 12. Incidencia de las enfermedades en campo en Boyacá

ENFERMEDAD CASOS POSITIVOS

TASA PREVALENCIA

PORCENTAJE

Pata negra 0 0 0% Pudrición blanda 0 0 0% Pudrición seca 0 0 0% Costra negra 33 18 1.8% Roña polvosa 9 5 0.5% Pudrición gomosa 0 0 0% NARIÑO: 900 muestras. Tabla 13. Incidencia de las enfermedades en campo en Nariño

ENFERMEDAD CASOS POSITIVOS

TASA PREVALENCIA

PORCENTAJE

Pata negra 27 3 0.3% Pudrición blanda 0 0 0% Pudrición seca 0 0 0% Costra negra 0 0 0% Roña polvosa 2 0.2 0.02% Pudrición gomosa 0 0 0% En este trabajo se hace mayor énfasis en los resultados obtenidos a nivel de

campo, puesto que la semilla es el principal material de propagación del cultivo y

por ende, es necesario conocer las condiciones en que ésta se produce, para

evitar la transmisión y diseminación de enfermedades. Sin embargo es importante

tener en cuenta la incidencia de las enfermedades en las bodegas de semilla, ya

que en el almacenamiento se pueden presentar patógenos que posteriormente

ocasionan problemas en los suelos cuando se siembra la semilla en estas

condiciones.

El microorganismo que presentó mayor incidencia en los tubérculos-semilla

analizados a nivel de campo fue Rhizoctonia solani, debido a que esta variedad

93

de papa presenta susceptibilidad hacia este hongo fitopatógeno. De acuerdo al

análisis de incidencia de Costra negra, se encontró que el mayor porcentaje se

presentó en Boyacá con un 1.8% (Gráfica 4). Este microorganismo puede estar

presente en el suelo dado que es un habitante natural de allí. Los resultados

indican que este agente causal se estableció con mayor incidencia en este

departamento, probablemente debido a que en los suelos de esta zona, el hongo

pudo haber permanecido en el suelo en forma de esclerocios, los cuales al

sembrar en el cultivo, germinan e invaden a través de las heridas; luego se

desarrollan nuevos esclerocios en los tubérculos formados y este hongo se ve

favorecido por siembras sucesivas de papa con el uso de semilla contaminada,

con lo cual se incrementa significativamente el inóculo en el suelo (Alvarado, L.F.

1998). Es importante señalar que esta enfermedad es un problema en Colombia

por el tipo de suelo y su incremento puede afectar la brotación de los tubérculos.

Entre los factores que afectan el crecimiento y desarrollo de los tubérculos están:

la temperatura, humedad y el tipo de suelo; estas condiciones fueron tomadas en

cuenta al momento de tomar las muestras en los cultivos. La incidencia de Pata

negra (Eca) sólo se presentó en condiciones de campo y obtuvo el mayor

porcentaje en Nariño con un 0.3% (Gráfica 5). Este cultivo presentaba un suelo

arcilloso, el cual posee mayor capacidad de retención de humedad, además no

presentaba un buen drenaje; esto confirma por qué cuando en un suelo hay

exceso de agua, las lenticelas de los tubérculos se abren exageradamente y dan

94

origen a la entrada de agentes patógenos, especialmente de bacterias (López,

C.A. 1993). Los mejores suelos empleados para cultivar son los francos, franco-

arenosos, bien drenados y con alto contenido de materia orgánica.

A nivel de campo no se presentó Pudrición blanda (Ecc - Echr), debido a que

Ecc difiere principalmente de Eca porque esta última principalmente se evidencia

con más frecuencia en los cultivos y la primera en condiciones de

almacenamiento; un deficiente almacenamiento de la semilla, como la falta de

maduración de los tubérculos, presencia de heridas, condiciones de alta humedad,

falta de luz indirecta y de oxígeno, favorecen la incidencia de esta enfermedad en

los tubérculos (Guerrero, O. 1997).

La mayor incidencia de Roña polvosa causada por Spongospora subterranea

en condiciones de campo se encontró en Boyacá con un 0.5% (Gráfica 4). La

incidencia varía entre los cultivos debido probablemente a las condiciones de

temperatura y precipitación durante el desarrollo de los cultivos de papa, que

determinan el período de susceptibilildad de las plantas a la roña y las condiciones

del suelo favorables para el desarrollo de la enfermedad (Guerrero, O. 1997).

Según un estudio en campo realizado por Guerrero, O. (2000), se observó que los

mejores estados para analizar y evaluar la presencia de la roña en el cultivo son

floración, posfloración y maduración, ya que en estas épocas se obtuvieron los

95

mayores porcentajes de infección del hongo en las raíces de las plantas. Las

muestras de raíces con Roña evaluadas en uno de los cultivos de Boyacá, fueron

tomadas en época de maduración del cultivo, (aproximadamente a las 18

semanas) esto permitió observar la presencia de agallas. El hecho de que la

planta infectada no presente síntomas en el follaje, hace que este patógeno se

esté diseminando en forma no perceptible a nuevos campos productores, adicional

a ello el problema de que este patógeno es un parásito obligado y necesita de

condiciones in vivo (especialmente el suelo), para sobrevivir.

En el departamento de Nariño sólo se encontraron las enfermedades Pata negra y

Roña polvosa con un porcentaje de incidencia de 0.3% y 0.02% respectivamente

(Gráfica 5), lo cual indica que tal vez por la ubicación del cultivo, la altitud, la

temperatura, entre otros aspectos, otras etiologías no presentan índices de

enfermedad como en algunos lugares muestreados.

EN BODEGAS DE SEMILLA


BOYACÁ: 12.000 muestras.

Tabla 14. Incidencia de las enfermedades en bodega en Boyacá ENFERMEDAD CASOS

POSITIVOS TASA


Pata negra 0 0 0% Pudrición blanda 42 35 3.5% Pudrición seca 217 181 18.1% Costra negra 507 422 42.2%

96

Roña polvosa 9 7 0.7% Pudrición gomosa 0 0 0%

ANTIOQUIA: 6.000 muestras.

Tabla 15. Incidencia de las enfermedades en bodega en Antioquia ENFERMEDAD CASOS

POSITIVOS TASA


Pata negra 0 0 0% Pudrición blanda 35 6 0.6% Pudrición seca 137 23 2.3% Costra negra 0 0 0% Roña polvosa 0 0 0% Pudrición gomosa 7 1 0.1% Según los resultados obtenidos de las muestras tomadas en bodega, se observó

que Fusarium spp. fue el patógeno más frecuente en condiciones de

almacenamiento, aunque ello también depende de las condiciones climáticas. Este

hongo es el principal patógeno que afecta los tubérculos en condiciones de

almacenamiento (Asscheman, 1996). La mayor incidencia se encontró en Boyacá

con un 18.1% (Gráfica 6).

Según Beukema, H.P.(1979), bajo condiciones de clima de páramo, los tubérculos

de algunas variedades provenientes de Solanum tuberosum se deterioran más

fácilmente en el almacenamiento. Las pérdidas que sufre la semilla durante el

almacenamiento se relacionan con la pérdidad de peso y la calidad de la misma,

entre la cosecha y el momento en que los brotes alcanzan su estado óptimo para

la siembra; los tubérculos se infectan durante el almacenamiento a través de

heridas causadas por daños mecánicos o por golpes, por esta razón es importante

97

separar los tubérculos que estén cortados y no emplearlos con fines de semilla. La

pudrición seca es uno de los principales problemas que afecta los tubérculos en

el almacenamiento, por eso es indispensable aislar los tubérculos infectados de

los sanos, ya que al igual que en el caso de la pudrición gomosa, también

participan otros patógenos como Erwinia que aumentan la severidad del daño.

El porcentaje de incidencia más alto de todo el estudio fue de Costra negra, se

presentó en condiciones de almacenamiento en Boyacá con un 42.2% (Gráfica 6).

El período de almacenamiento generalmente es mayor al del tubérculo a nivel de

campo, quedando de esta forma más tiempo expuesto a la acción del patógeno y

permitiéndose el desarrollo de otros microorganismos en estas condiciones

(Zapata, J.L. 1999).

La Pudrición blanda (Ecc) se presentó únicamente en condiciones de bodega y

su mayor nivel de incidencia se observó en el Departamento de Boyacá con un

3.5% (Gráfica 6). A pesar de ello sus principales síntomas se ven expresados en

condiciones de almacenamiento y bajo estas circunstancias generalmente los

niveles de daño son superiores allí que los de campo, debido a que en las

bodegas la bacteria encuentra condiciones más favorables para su multiplicación y

no está expuesta a factores naturales en el cultivo que limitan su crecimiento

(López, C. 1993).

98

El departamento de Boyacá arrojó la mayor incidencia de Roña polvosa con un

0.7% (Gráfica 6), según los muestreos realizados a lo largo del estudio se logró

observar que esta zona es de las que actualmente presenta los más altos niveles

de incidencia de esta enfermedad probablemente debido a la presencia latente de

este microorganismo en los suelos de determinados cultivos.

La mayoría de los patógenos que afectaron los tubérculos, se hallan naturalmente

en el suelo donde quiera que se cultive papa. Según Alvarado, L.F.(1998) la

contaminación de los suelos con microorganismos patógenos se vuelve un

problema endémico con el hecho de sembrar en el mismo lote cultivos sucesivos,

contribuyendo así al establecimiento de enfermedades hasta convertirlos en

habitantes naturales de una finca o región. Este es el caso principalmente de

Geotrichum spp., él es microorganismo común del suelo y es un patógeno débil

secundario que en condiciones de almacenamiento puede interactuar tanto con

Fusarium como con Erwinia y producir problemas de pudriciones mayores; lo cual

explica por qué este hongo se obtuvo únicamente en las muestras tomadas en

bodegas en Antioquia con una incidencia del 0.1% (Gráfica 7).

6.2.3. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES SEGÚN LA CATEGORÍA DE LA

SEMILLA

99

EN CAMPO


CUNDINAMARCA: 2.700 muestras.

Tabla 16. Incidencia de las enfermedades en campo en Cundinamarca. Municipio Categoría Pata

negra P. blanda

P. seca Costra negra

Roña polvosa

P. gomosa

Calera Certificada 0.04% 0 0.1% 0 0 0 Chocontá Certificada 0 0 0 0.8% 0 0 Chocontá Registrada 0 0 0 0 0 0 BOYACÁ: 1.800 muestras. Tabla 17. Incidencia de las enfermedades en campo en Boyacá. Municipio Categoría Pata

negra P. blanda

P. seca

Costra negra

Roña polvosa

P. gomosa

Ventaquemada Básica 0 0 0 1% 0 0 Ventaquemada Registrada 0 0 0 0.8% 0.5% 0 NARIÑO: 900 muestras. Tabla 18. Incidencia de las enfermedades en campo en Nariño. Municipio Categoría Pata

negra P. blanda

P. seca

Costra negra

Roña polvosa

P. gomosa

Pasto Certificada 0.3% 0 0 0 0.02% 0

EN BODEGAS DE SEMILLA


BOYACÁ: 12.000 muestras.

Tabla 19. Incidencia de las enfermedades en bodega en Boyacá. Municipio Categoría Pata

negra P. blanda

P. seca

Costra negra

Roña polvosa

P. gomosa

Ventaquemada Mejorada 0 0.2% 8.4% 8.2% 0 0 Umbita Certificada 0 3.3% 0 4.9% 0 0 Paipa Mejorada 0 0 6% 18.4% 0 0 Tunja Mejorada 0 0 3.7% 10.7% 0.7% 0

100

ANTIOQUIA: 6.000 muestras.

Tabla 20. Incidencia de las enfermedades en bodega en Antioquia. Municipio Categoría Pata

negra P. blanda

P. seca Costra negra

Roña polvosa

P. gomosa

Jordan Básica 0 0.6% 2.3% 0 0 0.1%

Aún cuando la evaluación de la incidencia por categorías de semilla no fue un

objetivo de este estudio, observaciones realizadas reflejan que la categoría

Mejorada en el departamento de Boyacá, fue la que presentó mayor

susceptibilidad a la mayoría de las enfermedades; principalmente para Costra

negra demostrando el mayor porcentaje con un 18.4%. Los lotes sembrados con

semilla mejorada no se encuentran inscritos o bajo vigilancia del ICA, sin embargo

pueden venderse entre agricultores, pero no en puntos de venta, donde solo se

debe vender semilla Certificada, esto no quiere decir que este tipo de semilla no

sea en muchos casos de buena calidad.

Boyacá demostró ser el departamento más afectado por la mayoría de las

enfermedades, probablemente debido al bajo uso de semilla Certificada; esto se

atribuye a que muchas zonas productoras particularmente Nariño y Boyacá,

presentan condiciones ideales para la auto producción de semillas aparentemente

buenas, pues buena parte de los cultivos están ubicados por encima de los 3000

msnm lo cual les permite obtener semilla de características relativamente buenas

debido al clima. Sin embargo en este estudió se demostró que la semilla

sembrada con fines de Certificada, también presenta problemas patológicos que

101

seguramente fueron adquiridos en los suelos cultivados. El departamento de

Boyacá es uno de los más grandes productores de papa en Colombia, esto es

importante tenerlo en cuenta ya que de esta región se evaluó el mayor número de

muestras y por ende los porcentajes de incidencia son más altos.

Para la categoría Básica, el mayor porcentaje de incidencia lo obtuvo la

enfermedad Pudrición seca en Antioquia con el 2.3%, este departamento es el

mayor productor de semilla Básica del país y como esta categoría proviene de la

pre-básica, es probable que las enfermedades presentes provengan de la semilla.

6.3. EVALUACIÓN DE Ralstonia solanacearum

HOT BOX

De las 120 muestras de minitubérculos evaluados, se observó que después de 5

días a 30°C no presentaron cambio alguno. No se encontró ninguno positivo.

ELISA (NCM)

De las 408 muestras sometidas a esta prueba, todas arrojaron resultados

negativos para Marchitez bacteriana.

Los resultados negativos obtenidos en las dos pruebas realizadas para el

diagnóstico de esta bacteria (Hot Box y ELISA), demuestran que el nive l de

102

incidencia en de esta enfermedad es nulo en los cultivos evaluados; prueba de ello

se confirma en que este patógeno tampoco fue aislado en el laboratorio. Es

importante tener en cuenta que la Marchitez bacteriana es una de las principales

enfermedades reportadas en Colombia y es por esta razón que deben aplicarse

pruebas adicionales comparado con los demás patógenos, sin embargo en este

estudio no se encontró esta enfermedad.

6.4. APORTES DE LA TESIS A McCAIN ANDINA

VISITA DE SUPERVISIÓN A NARIÑO

Gracias al trabajo que se venía realizando en la empresa, como un aporte técnico,

surgió la necesidad de realizar una visita de supervisión a los cultivos de semilla

principalmente y a los cultivos comerciales ubicados en el departamento de Nariño

en las zonas de Río Bobo, El encanto, Pupiales. El principal motivo de este aporte

fue informar sobre el estado fitosanitario en el que se encuentraba un cultivo de

semilla Certificada, localizado en Pasto (Río Bobo); el cual presentaba una gran

incidencia de Pata negra causada por Erwinia carotovora var. atroseptica. Por tal

razón se tomaron muestras de tubérculos de las plantas afectadas para realizar el

posterior análisis de laboratorio.

Allí mismo se realizó una entrevista con el Dr. Omar Guerrero en ICA Pasto con el

objetivo de suministrarme asesoría sobre el tema de la Roña polvosa causada por

Spongospora subterranea. Se conoció la metodología empleada en el laboratorio

103

de Sanidad Vegetal de ICA Pasto para el diagnóstico de las muestras con roña

polvosa y así mismo se determinó que dicho organismo es difícil ser aislado de

tubérculos de papa, por ello la forma mas empleada para hacerlo es de las agallas

de las raíces; tal procedimiento ya fue establecido en las evaluaciones de plantas

infectadas.

104

7. CONCLUSIONES

• Con la realización de este estudio se reportó en la variedad Diacol capiro, la

presencia de las siguientes enfermedades: Pata negra causada por Erwinia

carotovora var. atroseptica, pudrición blanda por E. carotovora var. carotovora y

E. chrysantemi, Costra negra por Rhizoctonia solani, Roña polvosa por

Spongospora subterranea, Pudrición seca por Fusarium spp., F.oxysporum y

F.avenaceum y Pudrción gomosa por Geotrichum spp.

• Mediante las escalas se determinó la severidad de Rhizoctonia solani y

Spongospora subterránea. El primero presentó el mayor porcentaje en el

departamento de Boyacá del grado 1 con un 16.4% (Gráfica 1) y el segundo en

Boyacá del Grado 2 con un 0.4% (Gráfica 2).

• El microorganismo que presentó los mayores porcentajes de incidencia del

estudio, fué Rhizoctonia solani, principalmente en las 12.000 muestras tomadas

105

en bodega provenientes del Departamento de Boyacá se observó un 42.2% de

incidencia (Gráfica 6).

• El porcentaje de incidencia más alto en condiciones de campo fue de Costra

negra en Boyacá con un 1.8% (Gráfica 4) y en condiciones de bodega fue de

Costra negra en Boyacá con un 42.2%. (Gráfica 6).

• La categoría Mejorada en el departamento de Boyacá, fue la que presentó

mayor susceptibilidad a la mayoría de las enfermedades, en condiciones de

almacenamiento; principalmente para Costra negra demostrando el mayor

porcentaje con un 18.4% sobre 12.000 muestras tomadas en este

departamento.

• Con la evaluación de las muestras tomadas en las bodegas se concluyó que al

igual que Rhizoctonia solani, Fusarium spp. fue el microorganismo más

frecuente en ellas, puesto que este hongo es el principal patógeno que afecta

los tubérculos en condiciones de almacenamiento.

• No se reconoció la presencia de la enfermedad Marchitez bacteriana o

Dormidera en los cultivos seleccionados ni en la semilla almacenada en las

bodegas.

106

• Finalmente con este proyecto se inició la aplicación de un sistema de control de

calidad en la producción de semilla de papa, ya que este aporte beneficia de

gran manera la economía de la industria papera.

107

8. RECOMENDACIONES

• Es indispensable organizar un historial de la semilla sembrada en cada uno de

los cultivos, que permita conocer la procedencia de la misma, las condiciones

en las cuales se produjo y el estado fitosanitario del cultivo. Esto con el fin de

detectar el origen del problema patológico y poder concluir si la enfermedad se

transmitió de un cultivo al otro por la semilla o se encontraba allí como habitante

del suelo en forma de estructuras reproductivas.

• Diseñar e implementar el uso de claves para facilitar la identificación de las

enfermedades bacterianas, fungosas y virosas en el campo, observando la

sintomatología de las plantas y los tubérculos en el cultivo.

• En el análisis de muestras con Spongospora subterranea se debe aplicar un

diagnóstico microbiológico del suelo, adicional a ello surge la necesidad de

realizar pruebas de patogenicidad y bioensayos inoculando el suelo de las

108

plantas para confirmar la observación de los síntomas causados por este

hongo.

• Implementar y aplicar el uso de la escala de severidad de Spongospora

subterranea diseñada en este trabajo como un medio de soporte para la

evaluación de la Roña polvosa.

• Como Rhizoctonia solani fue el hongo que demostró mayor prevalencia en este

estudio, sería importante llevar cabo la aplicación en campo de un tratamiento

biocontrolador por medio de cepas antagónicas de Trichoderma. Con ello se

obtienen elevados porcentajes de brotes de papa libres de Rhizoctonia y

porcentajes bajos de tubérculos afectados por este patógeno cuando el suelo

se trata con dicho hongo (Avila, C.1994).

• Para la metodología de la Prueba de ELISA en la detección de Ralstonia

solanacearum, se recomienda realizar el aislamiento y evaluación del patógeno

a partir de muestras de suelo naturalmente infestadas, ya que esta bacteria

puede permanecer allí latente. La prueba de ELISA tipo sandwich usando

anticuerpos dobles (ELISA - DAS) con un proceso de post-enriquecimiento,

demuestra ser una técnica de detección apropiada para ello (Priou, S. 1999).

109

• Se recomienda diseñar un modelo de manejo integrado que incluya el control

cultural, genético (razas resistentes), biológico y químico, el cual esté basado

en un perfecto entendimiento del ecosistema de los patógenos del suelo, con el

objetivo de crear las bases de un programa de manejo de las enfermedades.

110

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Rionegro; 1999: 27p.

115

ANEXO 1. CICLO DE VIDA DE Erwinia

(Agrios, G. 1996).

116

ANEXO 2. CICLO DE VIDA DE Rhizoctonia solani

(Agrios, G. 1996).

117

ANEXO 3. CICLO DE DE VIDA DE Spongospora subterranea

(Hooker, W.J. 1980).

118

ANEXO 4. CICLO DE VIDA Fusarium oxysporum

(Agrios, G. 1996).

119

ANEXO 5. MAPA DE ZONAS PRODUCTORAS DE PAPA EN COLOMBIA

FEDEPAPA, 2000.

120

ANEXO 6. ESCALA DE SEVERIDAD PARA Rhizoctonia solani

Grado 1 Grado 2 Grado 3

121

ANEXO 7. ESCALA DE SEVERIDAD DESpongospora subterranea

Grado 1

Grado 2

Grado 3

122

ANEXO 8. AGAR PDA

COMPOSICIÓN gr/ml

Papa picada 25 gr

Agar - Agar 2.0 gr

Glucosa 2.0 gr

Agua destilada 100 ml

PREPARACIÓN:

Se cocina la papa en agua destilada hasta la liberación total del almidón, luego se

filtra para eliminar los residuos de papa, se lleva a 100 ml de agua y se adiciona

agar - agar y la glucosa; se calienta para homogenizar los componentes, y se

autoclava a 15 libras durante 2 horas.

Para obtener un mejor crecimiento de los hongos y evitar la contaminación de

bacterias se agrega una gota de ácido láctico a la preparación.

123

ANEXO 9. AGAR NUTRITIVO

COMPOSICIÓN:

Peptona de carne 5gr

Extracto de carne 3gr

Agar-agar 12gr

PREPARACIÓN:

Disolver 20 gr/L y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 ºC. Las placas con

medio de cultivo preparado son claras e incoloras hasta con una tonalidad

amarillenta.

124

ANEXO 10. COLORACIÓN DE GRAM

COMPOSICIÓN:

SOLUCIÓN DE OXALATO DE AMONIO - CRISTAL VIOLETA

Solución A:

Cristal violeta 2 gr

Alcohol etílico (95%) 20 ml

Solución B:

Oxalato de amonio 0.8 gr


Mezclar las soluciones A y B. Almacenar durante 24 horas antes de su uso. Filtrar

la solución con papel filtro.

SOLUCIÓN DE LUGOL

Iodo 1 gr

Yoduro de potasio 2 gr


Permitir que la solución de iodo se disuelva durante la noche en un lugar oscuro.

A la vez macerar en un mortero el iodo y el yoduro de potasio, secos y adicionar

125

poca agua. Continuar macerando con la solución de iodo y enjuagar con agua en

un frasco ámbar.

DECOLORANTE

Alcohol etílico al 95% (agente más lento)

CONTRASTANTES

Solución Stock:

Safranina O 2.5 gr

Alcohol etílico 100 ml

Solución de trabajo:

Solución Stock 10 ml


Mezclar las dos soluciones y guardar en frasco ámbar.

PROCEDIMIENTO:

Agregar a la lámina unas gotas de cristal violeta y dejar por 1 minuto. Lavar.

Agregar unas gotas de lugol por 1 minuto. Lavar.

Agregar dos gotas de alcohol al 95% por 30 segundos. Lavar.

Agregar unas gotas de safranina por 1 minuto. Lavar.

126

ANEXO 11. PRUEBA OXIDO FERMENTACIÓN (O/F)

COMPOSICIÓN:

Peptona de caseina 2 gr

Extracto de levadura 1 gr

Cloruro de sodio 5 gr

Hidrógenofosfato dipotásico 0.2 gr

Azul de bromotinol 0.08 gr

Agar-agar 2.5 gr

Carbohidrato 10 gr

Agua destilada 1 Litro

PREPARACIÓN:

Se debe disolver 11 g/L y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Dejar enfriar aproximadamente a 50 °C e incorporar 100 ml/L de cada solución al

10% de glucosa, lactosa, sacarosa y maltosa. Las soluciones de azúcares se

esterilizan por filtración con membrana millipore de 0.45µ Ajustar el pH a 7.0.

Distribuir por cada azúcar en tubos con 5 ml de la solución. Dejar enfriar.

127

ANEXO 12. CALDO PARA PRODUCCIÓN DE INDOL

COMPOSICIÓN:

Peptona de carne 8.6 gr

Cloruro de sodio 6.4 gr


PREPARACIÓN:

Mezclar todos los ingredientes calentando suavemente para disolución completa.

Ajustar el pH a 7.0. Dispensar en tubos en cantidad de 4-5 ml. Autoclavar a 121°C

por 15 minutos.

REACTIVO DE KOVAC`S

COMPOSICIÓN:

Alcohol isoamílico 150 ml

Para-dimetil-amino-benzaldehído 10 gr

Ácido hidroclorhídrico concentrado 50 ml

PREPARACIÓN:

Disolver el aldehído en el alcohol y agregar lentamente el ácido. El reactivo de

Kovac`s debe conservarse en refrigeración aproximadamente por 2 meses en

frasco ámbar.

128

ANEXO 13. PRUEBA REDUCCIÓN DE COMPUESTOS DE SACAROSA

COMPOSICIÓN:

Peptona 10 gr

Sacarosa 40 gr


PREPARACIÓN:

Mezclar todos los ingredientes calentando suavemente para disolución completa.

Ajustar el pH a 7.0. Dispensar en tubos en cantidad de 4-5 ml. Autoclavar a

121°C por 15 minutos.

REACTIVO DE BENEDICT

COMPOSICIÓN:

Citrato de sodio 17.3 gr

Carbonato de sodio 10 gr

Sulfato de cobre 5 H2O 1.73 gr


PREPARACIÓN:

Homogenizar los ingredientes y guardar en frasco ámbar en un lugar fresco.

129

ANEXO 14. SOLUCIONES EMPLEADAS EN LA PRUEBA ELISA (NCM)

1. SOLUCIÓN TAMPÓN DE EXTRACCIÓN: SOLUCIÓN TAMPÓN CITRATO pH

5.6

COMPOSICIÓN:

Paquete A: Ácido cítrico 0.1M (1.995g)

Paquete B: Citrato de sodio 0.1M (11.907g).

PREPARACIÓN:

Disolver el paquete A en 1 litro de agua destilada y luego añadir lentamente el

contenido del paquete B agitando. Ajustar pH a 5.6. Esterilizar por 20 minutos a

120ºC.

2. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO SMSA

COMPOSICIÓN:

Medio basal:

Bacto peptona 10 g

Glicerol 5 ml

Ácido casamino 1 g

Esterilizar en autoclave y enfriar a 50ºC y añadir las siguientes soluciones de

antibióticos esterilizadas con filtro. (por litro):

130

Soluciones de antibióticos:

Sulfato de polimixina al 1% 10ml

Cicloheximida al 1% 10ml

Bacitracina al 1% 2.5ml

Penicilina G al 0.1% 500µl

Cloranfenicol al 1% 500µl

Cristal violeta al 1% 500µl

Cloruro tetrazolio trifenil 2,3,5 al1% 5ml

PREPARACIÓN:

Diluir 20 ml de caldo de enriquecimiento SMSA 10X añadiendo 180ml de agua

destilada estéril y verter 500µl de SMSA 1X a tubos eppendorf estériles de 1.5ml.

3. SOLUCIÓN TAMPÓN TBS pH 7.5

COMPOSICIÓN:

Paquete 1:

Tris 0.02M 2.42g

NaCl 0.5M 29.22g

NaN3 0.01% 0.10g

HCl 18.5% 6ml

131

PREPARACIÓN:

Disolver el contenido del paquete 1 en 995 ml de agua destilada. Mezclar

completamente. Añadir HCl hasta alcanzar el pH 7.5. Completar a 1 litro con agua

destilada.

4. SOLUCIÓN DE BLOQUEO

COMPOSICIÓN:

Leche en polvo sin grasa 0.43g

PREPARACIÓN:

Disolver esto en 30 ml de solución tampón TBS.

5. TAMPÓN DE ANTICUERPOS

COMPOSICIÓN:


PREPARACIÓN:


6. SOLUCIÓN DE ANTICUERPOS DE Rs

COMPOSICIÓN:

IgG de conejo específico de Rs 0.6 ml

132

PREPARACIÓN:

Al tampón de anticuerpos añadir, agitando simultáneamente 100µl de la IgG de

conejo.

7. SOLUCIÓN TAMPÓN DE LAVADO T-TBS

COMPOSICIÓN:

Tween 20 250µl

Solución TBS 500ml

PREPARACIÓN:

Homogenizar muy bien los ingredientes.

8. TAMPÓN DEL CONJUGADO

COMPOSICIÓN:


PREPARACIÓN:


9. SOLUCIÓN DEL CONJUGADO

COMPOSICIÓN:

133

Anticuerpos de cabra anti-conejo 0.6ml

(45 µl diluidos en 555 µl de solución tampón 0.5X PBS).

PREPARACIÓN:

Al tampón del conjugado añadir, agitando simultáneamente 100µl de los

anticuerpos de cabra anti-conejo. La concentración final será de 1:4000.

10. SOLUCIÓN TAMPÓN SUSTRATO pH 9.6

COMPOSICIÓN:

Tris 0.1M 1.21g

NaCl 0.1M 0.58g

MgCl2 6H2O 5mM 0.10g

PREPARACIÓN:

Disolver en 100ml de agua destilada. Mezclar completamente y ajustar pH con

unas gotas de HCl.

11. SOLUCIONES NBT/BCIP

NBT: Nitroblue Tetrazolio.

BCIP: Sal de Toluidina de 5-bromo, 4-cloro, 3-indolil.

DMF/NBT: 70% Dimetilformamida en agua.

DMF/BCIP: 100% Dimetilformamida.

134

COMPOSICIÓN:

Sustratos:

1.NBT 30mg

2.BCIP 15mg

Disolventes:

1.DMF/NBT (70% DMF en agua) 1ml

2.DMF/BCIP (100% DMF) 1ml

PREPARACIÓN:

NBT: Al sustrato 1 agregar 800µl del disolvente 1. Disolver con agitador.

BCIP: Al sustrato 2 agregar 800µl del disolvente 2. Disolver con agitador.

12. SOLUCIÓN SUSTRATO NBT/BCIP

PREPARACIÓN:

Tomar 100µl de la solución NBT y añadirla gota a gota con agitación en un frasco

oscuro que contenga 25 ml de la solución tampón sustrato.

1

Cun

dina

mar

ca

Boy

acá

Ant

ioqu

ia

Nar

iño

GRADO 1

GRADO 2

GRAD0 3

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18P

OR

CE

NTA

JES

DEPARTAMENTOS

GRÁFICA 1. GRADOS DE SEVERIDAD PARA LA ESCALA DE Rhizoctonia solani

1

Cun

dina

mar

ca

Bo

yacá

Ant

ioqu

ia

Nar

iño

GRADO 1

GRADO 2

GRADO 3

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

DEPARTAMENTOS

GRÁFICA 2. GRADOS DE SEVERIDAD PARA LA ESCALA DE Spongospora subterranea

1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8P

OR

CE

NTA

JES

Pata negra Pudriciónblanda

Pudrición seca Costra negra Roña polvosa Pudricióngomosa

ENFERMEDADES

GRÁFICA 3. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN CAMPO EN CUNDINAMARCA

2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8P

OR

CE

NTA

JES


Pudriciónseca

Costra negra Roña polvosa Pudricióngomosa

ENFERMEDADES

GRÁFICA 4. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN CAMPO EN BOYACÁ

3

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3P

OR

CE

NTA

JES


Pudrición seca Costra negra Roña polvosa Pudricióngomosa

ENFERMEDADES

GRÁFICA 5. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN CAMPO EN NARIÑO

4

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45P

OR

CE

NTA

JES


Pudriciónseca


ENFERMEDADES

GRÁFICA 6. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN BODEGA EN BOYACÁ

5

0

0,5

1

1,5

2

2,5P

OR

CE

NTA

JES


Pudriciónseca


ENFERMEDADES

GRÁFICA 7. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN BODEGA EN ANTIOQUIA

6

Documents

IDENTIFICACIÓN DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES …