Hmotnostní spektrometrie (1)

Hmotnostní spektrometrie (1)

Josef Chudoba

20

40

60

80

100120

140160

180200

220240

260280

300320

340360

380400

m/z

0

100

%

12_Chudoba_HCVDGrigsby_1ACC 12 (0.677)

Magnet EI+

7.22e4

57

43

41

28

27

2932

55

54

71

69

67

67

9785

83

81

79

95

93

111

99

105

125

113 127 137 153 155 165183

197211

225

OBSAH

Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrum – základní pojmy, molekulová hmotnost, izotopy prvků

způsoby měření spekter

Rozlišovací schopnost spektrometru

Ionizační techniky v hmotnostní spektrometrii

Typy hmotnostních spektrometrů

Součásti hmotnostního spektrometru – iontový zdroj

separátor iontů

vakuový systém

způsob dávkování vzorku

Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry – MS)

Analytická technika pro analýzu organických sloučenin

Kvalitativní analýza – identifikace sloučenin (především nízkomolekulární sloučeniny), pomoc při odvození resp. potvrzení struktury molekuly (výšemolekulární sloučeniny)

Kvantitativní analýza – sledování obsahu vybraných analytů v různých matricích

Ale i sledování obsahu kovů (ICP MS)

Speciální aplikace pak např. ISOTOPE RATIO MS

Podstatou MS je detekce nabitých částic (iontů), které vznikají z molekul vzorku při IONIZACI – jedná se o destruktivní metodu – vzorek je při analýze znehodnocen

VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT ?

V hmotnostní spektrometrii se používají různé ionizační techniky, ale v praxi lze ionty vytvořit i z vysokovroucích, vysokomolekulárních sloučenin

Od vodíku (1 Da) po proteiny s molekulovou hmotností v řádech 10 000 Da, záleží na ionizační technice a hmotnostním spektrometru

CO LZE ROZLUŠTIT Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA

1) Hmotnost iontu (popř. molekulovou hmotnost sloučeniny)

2) Přítomnost prvků, které mají výrazné zastoupení izotopů (např. Cl, Br)

3) Při pokročilé fragmentaci molekuly informace o struktuře sloučeniny

4) Je-li hmotnost molekulového resp. pseudomolekulového iontu měřena s dostatečnou přesností tak i možné elementární složení sloučeniny

VZORKY JAKÉHO SKUPENSTVÍ A S JAK VELKOU MOLEKULOU LZE POMOCÍ MS ANALYZOVAT

Hmotnostní spektrum

1 ul, split 1:20

mass731 732 733 734 735 736 737 738 739

%

0

100

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13 Magnet EI+ 6.35e12734.4691

735.4691

736.4769

[ M + H ]+

Izotopické příspěvky

Molekulový resp. pseudomolekulový ion

Osa x: m/z – hmotnost iontu dělena jeho nábojem

Osa y: intenzita (četnost) fragmentů, které detekuje detektor – je vždy normalizována na nejvyšší změřenou intezitu ve spektru – nejvyšší pík má výšku 100 %

m/z

Intenzita

centrovaný (centroid) – především u GC/MS instrumentace - intenzity m/z iontů tvar „čáry“

kontinuální (continous) – u LC/MS instrumentace intenzity m/z iontů tvar chromatografického píku

1 ul, split 1:20

mass731 732 733 734 735 736 737 738 739

%

0

100

%

0

100

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C37H68NO13 Magnet EI+ 6.35e12734.4691

735.4691

736.4769

07_Blazek_PO5_1 (15.245) Is (1.00,1.00) C37H68NO13 Magnet EI+ 6.35e12734.4691

735.4725

736.4753

737.4780

O O

OO

O

OH OH

OHCH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

O

O

OH

CH3 CH3CH3

O

CH3

OH N CH3

CH3

Erythromycin

[ M + H ]+

Hmotnostní spektrum Režim záznamu dat

MOLEKULOVÁ HMOTNOST

Molekolová hmotnost - jednotka dalton (Da)

1 Da = 1 amu (atomic mass unit) = hmotnost 1/12 izotopu 12C

1 Da = 1,660 338 782 x 10-27 kg

Molekulová hmotnost – hmotnost molekuly /prvků/ (jednotka amu)

Molární hmotnost – hmotnost 1 molu molekul (jednotka g/mol)

číselně molární hmotnost a molekulová hmotnost shodné

monoisotopická - v praxi počítána z hmotností nejstabilnějších (nejvíce zastoupených izotopů prvků),

průměrná - zohledňuje hmotnosti všech izotopů prvků

nominální – zaokrouhlená (celočíselná) monoisotopická hmotnost

(m a in lib ) Be n ze n e , b ro m o -10 30 50 70 90 110 130 150 170

0

50

100

12 27 38

51

60

77

104 113 128 143

156Br

(m a in lib ) Be n ze n e10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

50

100

15 2639

51

63 74

78

Br

Monoisotopic Mass = 155.957455 Da

Average Mass = 157.0079 Da

Nom inal Mass = 156 Da

Molecular Form ula = C 6H 5Br

bromobenzene

Monoisotopic Mass = 78.04695 Da

Nom inal Mass = 78 Da

Average M ass = 78.1118 Da

Molecular Form ula = C 6H 6

benzene

V MS spektrech vždy MONOISOTOPICKÁ hmotnost

MOLEKULOVÁ HMOTNOST

Nutné doplňující informace k hmotnostnímu spektru

1) Jaká ionizační technika byla při měření použita

tvrdé ionizační techniky – vlivem přebytku dodané energie se vzniklý molekulový ion dále štěpí

měkké ionizační techniky – malá nebo skoro žádná fragmentace

2) S jakým rozlišením bylo spektrum měřeno

hmotnost s přesností celého čísla (jednotkové rozlišení) – v praxi nejvíce rozšířené u GC/MS přístrojů

hmota s přesností na desetinná místa

3) Jaký experiment

(MS vs MS/MS nebo IN SOURCE fragmentace MS)

Rozlišovací schopnost spektrometru (R) – jak se rozdělí ionty s blízkou hmotností

R = m/ m m … m/z iontu, m . . . rozdíl m/z dvojice sledovaných iontů

Různé definice rozlišení: „valley“ definice vycházející s překryvu píků

„FWHM“ (Full Width at Half Maximum) definice vycházející ze šířky píku

Převzato z materiálu Fischer Scientific

VYSOKÉ rozlišení (HIGH RESOLUTION)

Jsou-li MS spektra měřena s vysokým rozlišením je možné rozdělit sloučeniny se stejnou nominální, ale odlišnou monoisotopickou hmotou

[ M + H ]+

Je naměřená hmotnost iontu (m/z) správná?

Před měřením se provádí kalibrace hmotnostní stupnice pomocí kalibračních standardů – chyba naměřené m/z a skutečné m/z závisí na rozlišovací schopnosti resp. typu spektrometru a kvalitě kalibrace

Chyba při měření hmoty ( macc) macc = m MEASURED - m

TRUE

macc (ppm) = 106 x macc / m TRUE

Kalibrace externí nebo interní - přidavek referenční (lockovací) látky přímo při měření vzorku

Hmotnostní spektrum sloučeniny je vždy závislé na použité IONIZAČNÍ TECHNICE

IONIZACE – měkká (dodaná energie stačí většinou pouze na vytvoření iontu z neutrální molekuly)

Příklad: ionizační techniky rutinně používané při LC-MS analýzách

Elektrosprejová ionazace / ESI /. chemická ionizace za atmosferického tlaku / APCI /

IONIZACE – tvrdá (vysoká energie stačí na vytvoření iontu z neutrální molekuly a na další štěpení vzniklých iontů)

Elektronová ionizace (Electron Impact) s energií elektronů 70 eV / EI + 70 eV / - rutinně používaná při GC-MS analýzách, proměřeny statisíce látek – databáze spekter (NIST, WILLEY)

- kladný i záporný mód (tvorba kladně resp. záporně nabitých iontů)

V praxi pouze kladný mód (tvorba kladně nabitých iontů)

MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption) – pro vysokomolekulární sloučeniny

Vliv použité ionizační techniky na MS spektrum

GC/MS analýza efedrinu

Prvek Izotop % rel. Izotop % rel. Izotop % rel.

Uhlík 12C 100 13C 1,11

Vodík 1H 100 2H 0,016

Dusík 14N 100 15N 0,38

Kyslík 16O 100 17O 0,04 18O 0,20

Síra 32S 100 33S 0,78 34S 4,40

Chlor 35Cl 100 37Cl 32,5

Brom 79Br 100 81Br 98,0

Relativní zastoupení izotopů prvků v přírodě

A+1 prvkyA+2 prvky

A prvky

F, I, P, H(vzhledem k nízké intenzitě A+1)

Informace z MS spektra – zastoupení izotopů prvků

1 ul, split 1:20

mass70 75 80 85 90

%

0

100

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br5.07e1278.9183

80.9163

Br

I (m/z 79) : I (m/z 81) cca 1:1

Cl

I (m/z 35) : I (m/z 37) cca 3:1

1 ul, split 1:20

mass25 30 35 40 45

%

0

100

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl7.58e1234.9689

36.9659

1 ul, split 1:20

mass66 68 70 72 74 76 78 80

%

0

100

07_Blazek_PO5_1 (12.550) Is (1.00,1.00) Cl25.74e1270

72

74

Cl2

1 ul, split 1:20

mass100 110 120

%

0

100

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Cl34.35e12105

107

109

111

Cl3

Br2

1 ul, split 1:20

mass150 160 170

%

0

100

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br25.00e12160

158162

1 ul, split 1:20

mass230 235 240 245 250

%

0

100

07_Blazek_PO5_1 (5.012) Is (1.00,1.00) Br33.80e12239

237

241

243

Br3

(m a in lib ) Be n ze n e , c h lo ro -20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

0

50

100

25 32 38 4351

56 61 74

77

84 97

112

C l

(m a in lib ) Be n ze n e , b ro m o -10 30 50 70 90 110 130 150 170

0

50

100

12 27 38

51

60

77

104 113 128 143

156Br

(m a in lib ) Be n ze n e , io d o -20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

0

50

100

27 37

51

60

77

127 152 176

204I

m/z 77 45,3 %

m/z 112 100 %

m/z 113 6,9 %

m/z 114 32,9 %

m/z 77 100 %

m/z 156 61,8 %

m/z 157 4,1 %

m/z 158 59,8 %

m/z 77 100 %

m/z 204 74,5 %

m/z 205 4,4 %

(m a in lib ) Be n ze n e10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

50

100

15 2639

4049

51

5363 74

78A:m/z 78 100 %

A+1:m/z 79 6,5 %

(m a in lib ) Bip h e n yl20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

0

50

100

27 3951 63

76

89 102 115 128139

154

A:m/z 154 100 %

A+1:m/z 155 12,9 %

Přibližný počet atomů uhlíku ve sloučenině (Cn)

100*1,1*)(

)1(

A

A

I

ICn

Molekulový ion v hmotnostním spektru

Rozpoznání molekulového iontu v MS spektru není vždy jednoduché

EI+ 70 eV u některých látek chybí (vysoký stupeň fragmentace) nebo je jeho intenzita velmi nízká (možnost záměny s ionty pozadí MS spektra)

ESI – tvorba vícenásobně nabitých iontů, tvorba aduktů iontů s Na, K, tvorba dimerů

APCI – možné štěpení (vlivem vyšší teploty ve zdroji)

Existují však pravidla a postupy, které určení molekulového iontu usnadní

EI+ 70 eV: Počet kruhů a dvojných vazeb (RINGS + Double Bonds R+DB); zakázané ztráty iontů, pořadí eluce látek na GC koloně (obvykle vyšší molekulová hmotnost – vyšší bod varu – delší retenční čas)

ESI: Známé adukty, výpočet molekulové hmotnosti ze série vícenásobně nabitých iontů

Chemická pravidla: Dusíkové pravidlo

žádný nebo sudý počet atomů dusíku v molekule-> molekulová hmotnost látky je SUDÉ číslo

lichý počet atomů dusíku v molekule-> molekulová hmotnost látky je LICHÉ číslo

Dusík – m= 14 Da, třívazný prvek

EI+70 eV: 0 nebo sudý počet N: m/z molekulového iontu sudé číslo m/z fragmentů liché číslo

lichý počet N: m/z molekulového iontu liché číslo

m/z fragmentů sudé číslo

ESI+: 0 nebo sudý počet N: m/z [M+H]+ iontu liché číslo

lichý počet N: m/z [M+H]+ iontu sudé číslo

ESI-: 0 nebo sudý počet N: m/z [M-H]- iontu liché číslo

lichý počet N: m/z [M-H]- iontu sudé číslo

Počet kruhů a dvojných vazeb – Rings + Double Bonds (R + DB)Vyjadřuje stupeň nenasycenosti molekuly

R+DB = C – ½ H + ½ N +1

C = počet čtyřvazných atomů – C, SiH = počet jednovazných atomů - H, Cl, Br, F … (halogeny)N = trojvazných atomů N, P, As

Počet dvouvazných se neuvažuje (dvouvazebná S, O), ale třeba DMSO – síra je čtyřvazná

Příklad: fenol C6H5OH R+DB = 6 –1/2*6+1/2*0+1 = 4

1 kruh

3 dvojné vazby

Aromáty : R+DB = minimálně 4

Chemická pravidla:

Využití R+DB a dusíkového pravidla

EI+ 70 eV:

Celočíselná hodnota R+DB ion s lichým počtem elektronů může být molekulový ion

Neceločíselná hodnota R+DB ion se sudým počtem elektronů nemůže být molekulový ion

Využití při strukturní analýze

Elementární analýza z High Res MS spektra

Vždy nutné předpokládat jaké prvky a kolik kterého maximum – org. látky C, H, N, O, popř. S, přítomnost halogenů lze zjistit z izotopického zastoupení, hrubý odhad max. počtu uhlíků (Cn) Cn (max) = Mw/14 (přesněji z izotop. zastoupení)

ELEMENTÁRNÍ ANALÝZA Z HMOTNOSTNÍHO SPEKTRA

O O

OO

O

OH OH

OHCH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

O

O

OH

CH3 CH3CH3

O

CH3

OH N CH3

CH3 Erythromycin C37H67NO13

Mw monoiso = 734,4691 Da

Přesnost měření hmoty: High-RES MS spektrometry 1 – 3 ppm

Příklad vstupní parametry:

Cmax = 52, Hmax = 106, Nmax = 15, Omax = 15

Přesnost měření - chyba hmoty (ppm)

10

5

2

1

38 výsledků

17 výsledků

9 výsledků

4 výsledky

Aplikace „chemických“ pravidel (max. počet kruhů a dvoj.vazeb, dusíkové pravidlo, izotopické zastoupení prvků) snižuje počet nalezených kombinací !! – řešeno softwarově

Výsledek: navržené kombinace CxHy(Nz,Oz,Sz …)

Jakou ionizační techniku vybrat pro jaké sloučeniny?

Elektronová ionizace (EI+ 70 eV) - v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost sloučeniny, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua, není vyrazně omezena přítomností nějakých funkčních skupin ale např. problematické skupiny NH2-CO- (teplotně labilní)

Chemická ionizace (CI) - v praxi hmotnost do cca 1000 Da, nutná teplotní stálost, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua s přídavkem ionizačního plynu (methan, isobutan) – většinou pouze na vybrané typy sloučenin

GC/MS

Elektrosprejová ionizace (ESI) – pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze), sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu (např. mají kyslík nebo dusík v molekule), vhodný pro iontové sloučeniny

Atmosferická chemická ionizace (APCI) - pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze) ale při vyšší teplotě než ESI, sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu

MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION (MALDI) – ionizace vzorku v přítomnosti pevné matrice vzorku laserem – vhodné pro vysokomolekulární, teplotně nestálé sloučeniny i nepolární (polymery, proteiny)

LC/MS

Existuje celá řada dalších ionizačních technik – cílem je vždy vytvořit nabitou částici, která je následně analyzována.

Jak velké molekuly lze analyzovat

Zdroj: Agilent Technologies

Jak velké molekuly lze analyzovat

Kvadrupol (Q)

Iontová past (IT)

V praxi většinou jednotkové rozlišení, maximální m/z cca 1000 – 2000, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter)

TOF (Time of Flight)

Měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~ 40000), maximální m/z až 500 kDa, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter)

ORBITRAPměří i s vysokým rozlišení (Rmax ~100000), maximální m/z ~4 kDa, pomalejší frekvence sběru dat (spekter)

Magnetický sektorměří i s vysokým rozlišení (Rmax ~40000), maximální m/z ~2000, pomalejší frekvence sběru dat (spekter),

GC/MS

GC/MS LC/MS

GC/MS LC/MS

LC/MS

Přístroje hybridní – umožňují provedení tzv. MS/MS měření (více iontových separátorů)

Tripple Quad (QQQ)

Q-TOF

Ion Trap – ORBITRAP

Trojitý quadrupol

Quadrupol – Time Of Flight

iontová past - Orbitrap nebo IT-TOF

GC/MS LC/MS

LC/MS

LC/MS

MALDI 100 - 1000 kDa

ESI až 100 kDa

APCI až 2 kDa

EI+ 70 eV / CI až 1 - 2 kDa

Jak velké molekuly lze analyzovat ?

TOF

ORBITRAP

ION TRAP QUADRUPOLE

Plynový chromatograf

Kapalinový chromatgraf

Direct Insertion (Infussion) Probe

MALDI destička

Iontový zdroj

Iontový separátor

Detektor

AnalyzátorInlet

vakuum

Ionizační techniky:

EI+, CI, APCI, ESI, MALDI

Schéma hmotnostního spektrometru

Režimy snímání dat: MS experiment

SIM (SIR)

TIC

m/z

čas

Intenzita

Full SCAN (Total Ion Current TIC) cyklicky se snímá celé MS spektrum požadovaného rozsahu m/z

Rekonstruovaný chromatogram (RIC) z TICu se vybere požadovaný ion a vykreslí se chromatografický záznam

Selected Ion Monitoring (SIM) cyklicky se snímají jen vybrané ionty citlivější než TIC režim

např. u kvadrupolu detegované absolutní množství analytu činí: TIC řádově ng (10–9g) SIM řádově pg (10–12g) až fg (10-15 g)

Režimy snímání dat: MS/MS experimenty

Kolizní celaIontový zdroj

Detektor

Pouze hybridní MS spektrometry a tripple Quad

Product Ion Scan: Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC detekce

Instrumentace: Tripple Quad, Q-ToF (MS2); Ion Trap (až MS10) s vyšším MSn klesá citlivost!

Precursor Ion Scan: Q1:TIC (m/z1 – m/z2) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce

Instrumentace: nelze na Ion Trap

Constant Neutral Loss Scan: Q1:TIC (m/z1 – m/z2) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC ((m/z1- N) – (m/z2-N)) detekce; N – rozdíl hmotností iontů – hmotnost

odpadající neutrální částice z iontu Instrumentace: nelze na Q-ToF a Ion Trap

Selective Reacrion Monitoring (SRM): Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce

Fragmentace probíhá srážkou iontů s molekulami kolizního plynu (Argon)

Které vlastnosti MS spektrometru jsou v praxi důležité …

Cena, provozní náklady, účel využití !!!

Napojení na separační techniku: GC/MS X LC/MS

Technické parametry:

Single (jeden iont. separátor) x hybridní (více separátorů)

Rozsah scanování m/z (nejnižší a nejvyšší m/z)

Rychlost scanování (počet scanů/s)

Citlivost, dynamický rozsah (pro kvantitativní analýzu)

Rozlišovací schopnost (vysokorozlišující X jednotkové rozlišení)

Kompatibilita s ionizačními technikami (dostupné iontové zdroje)

Vakuum (je-li třeba vyšší stupeň vakua – vyšší cena)

Požadavky na instalaci:

Chlazení pump vakuového systému (vodní nebo vzdušné)

Velikost systému - přenosné x stolní (BENCH-TOP) x velké (hmotnost > 500 kg)

Plyny – např. LC-MS průtok N2 až 500 l/min – nutný generátor N2 nebo zdroj kapalného N2

MS - iontový zdroj a ionizační technika

Electron Impact (EI + 70 eV) – elektronová ionizace

nejpoužívanější u GC/MS, nejvíce prozkoumaná ionizační technika

U většiny látek se hodnota energie pro tvorbu moleku-lového iontu pohybuje okolo 10 eV 70 eV přebytek energie dostatečný pro tvorbu moleku-lového iontu a také pro tvorbu fragmentů z molekulového iontu

Dnes jsou k dispozici obsáhlé databáze (knihovny) spekter

EI+ dnes běžně ve spojení s GC

Látka je ionizována proudem elektronů ve vakuu z plynné fáze

Ionizace probíhá ve vakuuSchéma EI+ ionizačního zdroje


ESI (Electrospray)

V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde v elektrickém poli k tvorbě spreje. V kapičkách kapaliny dojde k povrchové lokalizaci náboje a následné tvorbě iontu. Při této ionizaci vznikají často i vícenásobně nabité ionty a adukty např. (M+Na)+ - ionizace probíhá za atmosferického tlaku


APCI (Chemická ionizace za atmosferického tlaku)

V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde k tvorbě spreje a vypařování látky i mobilní fáze. Na jehlu je vloženo vysoké napětí, výbojem vzniká plazma a v ní ionty zmlžovacího plynu (N2) , mobilní fáze a analytu. Ionty plynu reagují s molekulami mobilní fáze a vzniklé ionty předají náboj analytu.


Zdroj pro APCI a ESI je prakticky konstrukčně shodný, liší se v přítomnosti jehly pro koronový výboj (APCI). Existují i kombinované zdroje ESI/APCI.

U sprayových ionozací vždy záleží na povaze analytu – nutno zvolit pozitivní nebo negativní mód

APCI – první komerční využití – 1986oproti ESI lze použít vyšší průtok mobilní fáze, vyšší teplota, vyšší stupeň fragmentace

ESI – první komerční využití – 19882002 – Nobelova cena za chemii: John Bennett FennKompatibilní pouze s LC s reverzním uspořádáním fází (polární mobilní fáze), tvorba vícenásobně nabitých iontů, ionizace z roztoku, lze analyzovat i soli


MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption)

Roztok vzorku je smíchán s roztokem matrice (nízkomolekulární UV absorbující látka) na spotovací destičce. Ta je vložena do zdroje, kde dochází k tvorbě „pevné směsi“ matrice a vzorku. Účinkem energie dodané laserovým pulzem dochází k ionizaci aduktu matrice-vzorek a následně odtržení matrice. Ionty analytu jsou měřeny obvykle TOF analyzátorem.

Příklad matrice: 2,5-dihydroxybenzoová kyselina, laser 337 nm. Vzorek M roztok, matrice 100 mM roztok

Tvorba obvykle jednonásobně nabitých iontů (M+H)+, (M+K)+, (M+Na)+

Spotovací destičkaNELZE spojit s HPLC!!!

Zdroj:Agilent Technologies

Zdroj:Agilent Technologies

MS - separátory iontů

lineární kvadrupol konstrukčně se jedná o 4 kovové tyče hyperbolického nebo kruhového průřezu, které jsou připojeny ke zdrojům DC a AC napětí. Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, se dostanou do střídavého elektrického pole a začnou oscilovat.

Při vhodném poměru DC a AC složky napětí a dané hodnotě těchto napětí projdou kvadru-polem pouze ionty o určitém poměru m/z. Zařízení se chová jako filtr nastavený na určitou hodnotu m/z. Změnou vkládaných napětí je možné nechat projít filtrem postupně ionty v celém rozsahu hodnot m/z

Iontová past (ion trap) účinkem elektrického pole jsou ionty uzavřeny v ohraničeném prostoru. Iontová past se skládá ze vstupní a z výstupní elektrody kruhového průřezu a z prstencové středové elektrody. Krajní elektrody jsou uzemněny, na středovou elektrodu je vkládáno vysokofrekvenční napětí s proměnnou amplitudou.

Ionty jsou nuceny pohybovat se uvnitř iontové pasti po uzavřených kruhových drahách s rostoucí amplitudou napětí se ionty s rostoucím m/z dostávají na nestabilní trajektorie a opouštějí prostor iontové pasti směrem do detektoru


Průletový analyzátor (time of flight TOF) je tvořen prázdnou trubicí. K časovému rozdělení iontů podle m/z dochází na základě jejich odlišné doby letu z iontového zdroje do detektoru.

Hmotnější ionty se pohybují nižší rychlostí než ionty lehčí a dorazí do detektoru později.Dosažené rozlišení závisí na délce dráhy, kterou ionty v průletovém analyzátoru urazí.

Nutná konstatantní stabilní teplota - st


Magnetický - sektorový hmotnostní analyzátor umožňuje prostorové rozdělení svazku iontů podle hodnoty m/z, konstrukčně se jedná o elektromagnet, mezi jehož pólovými nástavci prochází fokusovaný paprsek iontů z elektrického pole

ionty o rozdílném poměru m/z opisují dráhy o různých poloměrech dochází k prostorové disperzi iontů podle jejich hmotnosti

V

rBzm

.2

./

2

B

V

r


ORBITRAP

Octapole

Svazek iontů je v C-trapu zbržděn kolizí s molekulami dusíku, stlačen a vystřelen do Orbitrapu. Na jeho centrální elektrodě se postupně zvyšuje napětí a ionty se začínají spirálově pohybovat – generují proudový signál, který je pomocí Fourierovy tranformace převeden na MS spektrum

elektroda

Osa z

zm

konstz /

.~


MS - detektor iontů

detektor zařízení, které detekuje ionty separované hmotnostním separátorem

Elektronový násobič konverzní dynóda umožňuje konvertovationty na sekundární elektronya ty dále lavinovým jevem, v tzv. channeltronu tvaru rohu, emitují další elektrony. Měří se vzniklý proud. Elektronásobič je citlivý na přetížení.

Fotonásobičkonverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony. Tyto elektrony při interakci s fosforem emitují fotony. Fotonový signál je zesílen ve fotonásobiči. Fotonásobič je zataven ve skle a je tak velmi rezistentní vůči poškození.

MS - vakuum

EI+ 70 eV, CI, MALDI – vakuum i ve zdroji spektrometru, všechny spektrometry vakuum v analyzátoru: aby byla zachována dlouhá dráha letu nabitých částic (mohly být detekovány)

1. Stupeň vakua rotační olejové vývěvy – vakuum cca 10-

2 mBar – slouží pro provoz pump 2. stupně vakua

Spektrometry mají vždy dvoustupňový systém vakua

2. Stupeň vakua cca 10-5 až 10-8 mBar (1 mBar = cca 100 Pa)

turbomolekulární pumpa difuzní olejová pumpa

MS - vakuum

MS - způsob vnosu vzorku

EI+ 70 eV: GC/MS – kapilární GC kolona (split, splitless, PTV inlet)

evakuvatelný reservoar se septem kapilárou napojený do iontového zdroje

sonda přímého vstupu (Direct insertion Probe - DIP) – vzorek je v mikrovialce v držáku vyhřívané sondy zaveden přímo do iontového zdroje přes vacuum lockESI, APCI: LC/MS – mobilní fáze je pumpou čerpána přes LC kolonu a (popř. přes celu UV detektoru) kapilárou do zdroje (v případě potřeby se průtok před vstupem do MS splituje)

Direct Infusion (DI) - přímý nástřik robotickou stříkačkou (mechanický posuv pístu) kapilárou do zdroje

Flow Injection Analysis (FIA) nástřik přes vebtil do proudu mobilní fáze čerpané pumpou LC chromatografu kapilárou do zdroje

Hmotnostní spektrometr

Přenosný GC-MS HAPSITE (firma Inficon, Inc. U.S.A)

Nasazení v Afganistánu (britské jednotky)


Sektorový hmotnostní spektrometr


Kvadrupolový hmotnostní spektrometr s GC chromatografem


IT-ORBITRAP hybridní MS spektrometr

Documents

Hmotnostní spektrometrie (1)