HLA-B27 pozitivitás vizsgálati lehetőségei

Pálinkás László, Uherkovichné Paál Mária, Berki Timea

Pécsi Tudományegyetem Klinikai Központ

Immunológiai és Biotechnológiai Intézet

HLA-B27Humán Leukocita Antigén B27 az I osztályú hisztokompatibilitási komplexhez (MHC-I) tartozó sejtfelszíni glikoprotein, amely a 6. kromoszóma B lókuszán kódolódik.

Mads Hald Andersen et al. 2005. Journal of Investigative Dermatology

Az MHC-I antigének az összes magvas sejtünk felszínén megtalálható, szerepük az intracelluláris antigének bemutatása a vírussal fertőzött, illetve daganatos sejtek elpusztítására képes CD8+ T –sejteknek.

Heterodimer protein: egy alfa láncból és egy béta 2 mikroglobulin alkotja.

A kaukázusi populációban 8%, az afrikaiban 4%, a kínaiban 2-9% és a japánban 0.1-0.5% hordozza a HLA-B27 antigént.

HLA-B27 és patológia

Gyakori HLA-B27 pozitivitással járó alcsoportok:* Spondylitis ankylopoetika (kaukáziusiaknál ~92%),* reaktív arthritisz (Reiter szindróma) (~60-80%),* gyulladásos bélbetegséggel társuló arthritisz (~60%),* pszoriázishoz tárusló artritisz (~60%),* izolált anterior uveitisz (~50%), * nem differenciált spondylarthropátiák (~20-25%).

Szeronegatív spondylarthropátiák – olyan gyulladásos izületi betegségek, ahol a szerológiai tesztek reuma faktor (RF) negatívak. A RF egy nem specifikus markere más reumás megbetegedéseknek (például a reumatoid artritisznek).

Spondylitis ankylopoeticaA Bechterew kór (más néven spondylitis ankylopoetica, rheumatoid spondylitis) esetén a betegek több mint 90%-a HLA-B27 pozitív. Az ankylosis rigidséget, merevséget jelent, a spondyl pedig a gyulladt gerincoszlopot jelzi.

Főleg fiatal férfiak betegsége, amely fájdalommal és gyulladással jár a keresztcsonti, a csigolyák közötti és a bordák izületeinél. Előrehaladott állapotban a mellkas és a gerinc teljes merevségéhez vezet. Ez nagyon kellemetlen, mivel végül egy görbe testhelyzetbe szorítja a beteget, amely szerencsére a mai kezelések hatására kevéssé gyakori végállapot.

Reiter szindrómaAz izületi gyulladások egy fajtája, reaktív artritisz. A szindrómához tartozik a reaktív artritisz mellett legalább egy nem izületi gyulladás, például: szem, bőr vagy izom érintettség.

A betegek kb. 80%-a HLA-B27 pozitív.

A reaktív artritisz tünetei általában napokkal vagy hetekkel a kiváltóinfekció után jelentkeznek.

A tünetek több hétes – hónapos időtartam alatt néha jelentkeznek, néha elmúlnak.

A reaktív izületi gyulladás sokáig diangosztizálatlan maradhat, mert a tünetek néha nagyon enyhék.

Kiváltó faktorok30-60 nappal az izületi gyulladás előtt:• enterális• urogenitális• néha pulmonális (légúti) infekciók.

Feltételezett infektív ágensek:• Salmonella ssp.• Yersinia enterocolitica• Chlamydia trachomatis

EFI standardok HLA tipizálásra

K2.000 Antigén vizsgálatK2.100 Kontroll sejteket kell vizsgálni minden új reagensnél.

- negatív sejt- pozitív sejt- keresztreagáló sejt

K2.200 Kontroll szérumot kell vizsgálni minden vizsgálatnál.- negatív szérum- pozitív szérum- keresztreagáló szérum

K3.000 Molekuláris technikaMinden vizsgálatnál szükséges

- pozitív DNS- negatív DNS használata.

5.6. kiadás (November 16, 2008)

K fejezet – Betegség asszociációnál egyetlen HLA típus vizsgálata European Federation for Immunogenetics

Áramlási citometria

Fizikai paraméterek

Forward scatter = méret

Side scatter = granularitás

FSC

SSC

LASER (488nm)

LASER

FSC-Height

SS

C-H

eigh

t

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

Mo

Ly

Gr

Áramlási citometria

HLA-B27-FITC

CD3-PE

LASER

BDTM HLA-B27 System

Anti-HLA-B27 – FITC clone GS145.2 (IgG1, kappa)Anti-CD3 – PE clone SK7 (IgG1, kappa)

HLA-B27 szűrő tesztCD3-PE / HLA-B27-FITC

Cut off(setup beads)

Negatív minta

Pozitívminta

FSC-Height

SS

C-H

eigh

t

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

Setup Beads

FSC-Height

CD

3 P

E

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

CD3+

Méret

a-CD3-PE

Granularitás

a-HLA-B27 - FITC

HLA B27 FITC

Cou

nt

0 125 250 375 5000

23

47

70

93

MFI = 140

HLA B27 FITC

Cou

nt

0 125 250 375 5000

5

10

15

20

MFI > 140

HLA B27 FITC

Cou

nt

0 125 250 375 5000

16

31

47

62

MFI < 140

Cell count

Izotípus kontroll teszt

Simultest Control (Beckton Dickinson)Anti-keyhole limpet hemocyanin-FITC clone: X40 (IgG2a)Anti-keyhole limpet hemocyanin-PE clone: X39 (IgG1)

FSC-Height

SS

C-H

eigh

t

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

LyLy

Limfociták kapuzása

Méret

Granularitás

Mouse IgG2a FITC

Mou

se Ig

G1

PE

100

101

102

103

104

101

102

103

104

0,02% 0,02%

99,97% 0,00%

Izotípus (negatív) kontroll

egér IgG2a - FITCegér IgG1 -PE

Konfirmáló HLA-B27 teszt

IOTest® (Bekman Coulter)Anti-HLA-B27-FITC clone: HLA-ABC-m3 (IgG2a)Anti-HLA-B7-PE clone: BB7.1 (IgG1)

HLA B27 FITC

HLA

B7

PE

100

101

102

103

104

101

102

103

104

0,10% 1,86%

1,07% 96,97%

0,10% 1,86%

1,07% 96,97%

a-HLA-B27 - FITCa-HLA-B7 -PE

HLA-B27 Pozitív

HLA B27 FITC

HLA

B7

PE

100

101

102

103

104

101

102

103

104

0,49% 0,00%

99,30% 0,21%

0,49% 0,00%

99,30% 0,21%

a-HLA-B27 - FITC

a-HLA-B7 -PE

HLA-B27 Negatív

Keresztreakció HLA-B7-tel

IOTest® (Bekman Coulter)Anti-HLA-B27-FITC clone: HLA-ABC-m3 (IgG2a)Anti-HLA-B7-PE clone: BB7.1 (IgG1)

HLA-B27 + / HLA-B7 +

HLA B27 FITC

HL

A B

7 P

E

100

101

102

103

104

101

102

103

104

10,73% 89,02%

0,21% 0,04%

a-HLA-B27 - FITCa-HLA-B7 -PE

a-HLA-B27 - FITC

HLA-B27 - / HLA-B7 +

HLA B27 FITC

HL

A B

7 P

E

100

101

102

103

104

101

102

103

104

93,96% 4,90%

1,14% 0,00%

93,96% 4,90%

1,14% 0,00%

a-HLA-B7 -PE

Molekuláris biológiai diagnosztika kétes esetekben

Olerup SSPTM HLA-B*27 alacsony felbontás

+ - Minta 1 Minta 2

100bp

200bp

300bp

400bp500bp GH - ktrl

(450bp)

HLA-B*27(180bp)

Minőségügyi szemlélet

MSZ EN ISO/IEC 17025:2005 Vizsgáló- és kalibrálólaboratóriumok felkészültségének általános követelményei

MSZ EN ISO 15189:2007 Orvosi laboratóriumok. A minőségre és a felkészültségre vonatkozó külön követelmények

2008 óta NAT-1/1552/2008 számon akkreditált vizsgáló laboratórium vagyunk.

Laboratóriumunk minőségirányítási rendszerét a következőISO standardok alapján építette ki:

HLA-B27 programjában.Részt veszünk a (United Kingdom National External Quality Assessment Service)

Vizsgálati eredmények

2009. I. félévében

6625 beteget vizsgáltunk, ebből 305 esetben (5%) kértek HLA-B27 kimutatást.

HLA-B27Negatív(68%)

HLA-B27 pozitív(19%)

Keresztreagáló pozitív(2%)

Keresztreagáló negatív(11%)

Köszönöm a figyelmet!