Hisztopatolgiai s ksrletes terpis vizsglatok slyos

koponya-agysrls ksrletes modelljeiben

Doktori (PhD) rtekezs

Kvesdi Erzsbet

Tmavezet: Dr. Bki Andrs

Elmleti Orvostudomnyok, Doktori Iskola vezetje: Dr. Szolcsnyi Jnos

Ksrletes Neurolgia, Programvezet: Dr. Gallyas Ferenc (2006.03.31-ig)

Klinikai Orvostudomnyok, Doktori Iskola vezetje: Dr. Komoly Smuel

Klinikai Idegtudomnyok, Programvezet: Dr. Komoly Smuel

Pcsi Tudomnyegyetem, ltalnos Orvostudomnyi Kar, Idegsebszeti Klinika

2010

1

1. FONTOSABB RVIDTSEK JEGYZKE ............................................................ 4

2. BEVEZETS, IRODALMI HTTR ....................................................................... 5

2.1. A koponyasrls epidemiolgija .......................................................................... 5

2.2. A baleseti agysrlsek osztlyozsa ...................................................................... 6

2.3. Diffz axonlis krosods ....................................................................................... 7

2.3.1. Axon duzzads/axonballon kpzds (AD/B) ...................................................... 8

2.3.2. Az ultrastrukturlis (neurofilament) kompakci (neurofilament compaction, NFC)

........................................................................................................................................ 9

2.4. Diffz idegsejt-krosods (stt idegsejt kpzds) ............................................ 11

2.5. Sejthall mechanizmusok agysrlsben................................................................. 13

2.6. A diffz axonlis krosods terpis befolysolst clz vizsglatok .................. 14

2.6.1. Az agyalapi mirigy adenilt-ciklz aktivl polipeptid ........................................ 14

2.6.2. A poli (ADP-ribz)-polimerz gtlsa ................................................................. 15

3. CLKITZSEK ....................................................................................................... 17

4. AZ AGYALAPI MIRIGY ADENILT-CIKLZ AKTIVL POLIPEPTID

(PACAP) NEUROPRTEKTV HATSNAK IMMUNHISZTOKMIAI

VIZSGLATA A CENTRLIS FOLYADK-PERKUSSZIS (CFP) PATKNY-

MODELLLEL VGZETT AGYSRLS ESETBEN ............................................. 18

4.1. Bevezets ................................................................................................................. 19

4.2. Anyagok s mdszerek ............................................................................................ 19

4.2.1. Ksrleti llatok .................................................................................................... 19

4.2.2. A centrlis folyadk perkusszis modell kivitelezse patknyon ........................ 20

4.2.3. I.c.v. PACAP kezels ........................................................................................... 21

2

4.2.4. Immunhisztokmia ............................................................................................... 21

4.3. Eredmnyek ............................................................................................................. 22

4.4. Megbeszels, kvetkeztetsek ................................................................................. 25

5. AZ L-2286-EGY J POLI (ADP-RIBZ) POLIMERZ INHIBITOR

NEUROPROTEKTV HATSNAK VIZSGLATA MARAMROU-FLE IMPAKT

ACCELERCIS PATKNY MODELLEL VGZETT KOPONYATRAUMA

ESETBEN .................................................................................................................... 28

5.1.Bevezets .................................................................................................................. 29

5.2. Anyagok s mdszerek ............................................................................................ 30

5.2.1. Ksrleti llatok .................................................................................................... 30

5.2.2. Marmarou-fle impakt accelercis modell patknyon........................................ 31

5.3. Immunisztokmia .................................................................................................... 31

5.4. Magatartsvizsglatok ............................................................................................. 32

5.5. Eredmnyek ............................................................................................................. 34

5.5.1. Immunhisztokmia ............................................................................................... 34

5.5.2. Magatartsvizsglatok .......................................................................................... 37

5.6. Megbeszls, kvetkeztetsek ................................................................................. 42

6. TRANZIENS FOKLIS AGYI ISZKMIA OKOZTA STT IDEGSEJTEK

SORSA NEM-NEKROTIKUS ES NEM EXCITOTOXIKUS SZVETI

KRNYEZETBEN: NEUROBIOLGIAI KVETKEZTETSEK ............................ 44

6.1. Bevezets ................................................................................................................. 45

6.2. Anyagok s mdszerek ............................................................................................ 45

6.2.1. Ksrleti llatok .................................................................................................... 45

3

6.2.2. Patkny tranziens foklis agyi iszkmia modell ................................................... 45

6.2.3. Szvettani feldolgozs .......................................................................................... 46

6.3. Eredmnyek ............................................................................................................. 47

6.3.1. Fnymikroszkpos megfigyelsek ....................................................................... 47

6.3.2. Elektronmikroszkpos megfigyelsek .................................................................. 51

6.4. Megbeszls, kvetkeztetsek ................................................................................. 55

7. J EREDMNYEK SSZEFOGLALSA .............................................................. 57

8. AZ RTEKEZS ALAPJT KPZ PUBLIKCIK ........................................... 59

9. EGYB EREDETI KZLEMNYEK ...................................................................... 60

10. KSZNETNYLVNTS .................................................................................. 63

11. IRODALOMJEGYZK ........................................................................................... 64

4

1. FONTOSABB RVIDTSEK JEGYZKE

AD/B axonduzzads/axonballon-kpzds

AIF apoptzis-indukl faktor (apoptosis-inducing factor)

APP amiloid prekurzor protein (amyloid precursor protein)

CSpT kortikospinlis plya (corticospinal tract)

CT komputer tomogrfia (computed tomography)

DAB diamino-benzidin

DAI diffz axonlis krosods (diffuse axonal injury)

DVI diffz vaszkulris krosods (diffuse vascular injury)

ER endoplazmatikus retikulum

FGF fibroblaszt nvekedsi faktor (fibroblast growth factor)

FP folyadk perkusszi (fluid percussion)

GCS Glasgow kma skla (Glasgow Coma Scale)

i.c.v. intracerebroventrikulris

MLF medilis hosszanti kteg (medial longitudinal fascicle)

MRI mgneses rezonancis kpalkots (magnetic resonance imaging)

NAD nikotinamid adenin-dinukleotid

NFC neurofilament kompakci (neurofilament compaction)

PACAP agyalapi mirigy adenilt-ciklz aktivl polipeptid (pituitary adenilate

cyclase activating polypeptide)

PARP poli (ADP-ribz)-polimerz

PBS foszft puffer (phosafate buffered saline)

TAI traums axonkrosods (traumatic axonal injury)

TBI traums agykrosods (traumatic brain injury)

TNF tumor nekrzis faktor

UC ultrastrukturlis kompakci (ultrastructural compaction)

VIP Vazoaktv intestinlis peptid (vasoactive intestinal peptide)

5

2. BEVEZETS, IRODALMI HTTR

2.1. A koponyasrls epidemiolgija

A fejlett ipari trsadalmakban a 35 v alatti aktv, munkakpes populcit rint

vezet hallok, megelzve a klnbz daganatos valamint szv s rrendszeri

betegsgeket, a koponyasrls okozta agyi krosods. Mg a nyugati trsadalmakban a

koponyasrls kvetkeztben ltrejv hallozs 20-25%-ot tesz ki, addig ez

Magyarorszgon elri a 45%-ot [127]. Az Egyeslt llamokban ksztett felmr

tanulmny szerint vente 100.000 ilyen jelleg srlsbl 180-250 eset vgzdik

halllal [21]. Eurpban 1.600.000 koponyasrlst szenvedett beteg rszesl krhzi

elltsban, ebbl az agysrlt pciensek arnya vente 100.000 emberbl 235 f, s

66.000 koponyasrlt esete halllal vgzdik.

Koponyasrlsek legfkppen autbalesetek, eless, erszakos behatsok s

klnbz sportgakbl fakad srlsek okozataknt jnnek ltre. A leginkbb

veszlyeztetett demogrfiai csoport a frfiak, s a htrnyos terleteken-, illetve egyedl

lk [21]. Sajnlatos mdon nem csak az elbb emltett rtegek veszlyeztetettek,

hanem a gyerekek s a fiatal felnttek is. Kt ves kornl fiatalabb gyermekeknl

leginkbb maga a koponyasrls okoz hallt, gyakran az n. shaken baby szindrma

jn ltre [30, 79].

A nagyban motorizlt trsadalmakban, gy az Egyeslt llamokban a

koponyasrltek elltsnak kzvetett s kzvetlen kltsge jelents, utbbiban az vi

60 millird USA dollrt is elri [50]. A fejlett eurpai orszgokban a slyos

koponyasrltek krhzi elltsnak kltsge pciensenknt elri a 6.000 Eurt [15],

mely a teljes kezelsi kltsgeknek csak egy kis hnyadt teszi ki. Egy koponyasrlt

beteg lete vgig tart kezelsnek sszkltsge az Egyeslt llamokban elrheti a

200.000 USA dollrt is. Felmrsek alapjn 2020-ra a koponyasrls globlisan a

harmadik leggyakoribb vezet hallokk fog vlni [99].

A National Institute of Health felmrse szerint az Amerikai Egyeslt

llamokban (USA) 1,4 milli baleseti agysrls trtnik vente, melybl 50.000

hallos kimenetel, 235.000 ignyel krhzi kezelst, s 5,3 milli ember l

koponyasrlsre visszavezethet tarts egszsgkrosodssal [85].

6

2.2. A baleseti agysrlsek osztlyozsa

A baleseti agysrlseket tbbfle mdon osztlyozhatjuk. A srls

slyossgnak meghatrozsra leggyakrabban hasznlt mdszer a Teasdale s mtsai.

ltal kialaktott Glasgow kma skla (Glasgow Coma Scale, GCS) [149]. A

pontrendszer hrom reakcit rtkel ki: a szem kinyitst, a mozgst s a verblis

megnyilvnulsokat. Az sszestett rtkek alapjn megklnbztetnek: enyhe

(GCS=13-15), kzpslyos (GCS=9-12), valamint slyos (GCS=3-8) srlseket.

A koponyasrlsek klasszikus felosztsa szerint megklnbztetnk nylt (a

dura mater srl) s zrt srlseket (a dura mater intakt marad) [1]. A nylt srlsek

lehetnek penetrl, vagyis a koponyacsontot s az agyburkokat tszakt srlsek,

valamint az agyvz-tr s a klvilg indirekt kzlekedst eredmnyezk.

A srls patomechanizmusa alapjn az irodalom megklnbztet elsdleges s

msodlagos elvltozsokat. Az elsdleges elvltozsok a srls pillanatban a

mechanikai erk hatsra jnnek ltre, amelyek rinthetik az ereket, axonokat, ideg-s

gliasejteket foklis (gcos) vagy p agyszvetben elszrtan (diffz) elfordul mdon.

A kt tpus a srltek nagy rsznl egyidejleg fordul el. A msodlagos elvltozsok a

klnbz tpus elsdleges elvltozsokhoz kapcsoltan, az agy vr-, s oxign

elltsnak kvetkezmnyeknt jnnek ltre (1. bra).

7

Agyi srlst kvet elsdleges elvltozsok

I. Diffz: - axonlis krosods (diffuse axonal injury, DAI)

axonduzzads/axonballon-kpzds

ultrastrukturlis (neurofilament) kompakci

- vaszkulris krosods (diffuse vascular injury, DVI)

II. Foklis: - intrakranilis vrzs

- szubdurlis vrzs

- extradurlis vrzs

- szubarachnoidlis vrzs

- axonlis krosods

- kontzi

- lacerci

Msodlagos elvltozsok

I. Diffz: - hipoxis-iszkmis krosods

- agyduzzads

II. Foklis: - hipoxis-iszkmis krosods

- agyduzzads

1.bra: Elsdleges s msodlagos agyi elvltozsok osztlyozsa

2.3. Diffz axonlis krosods

A disszertci els kt fejezetnek clterlete a DAI vizsglata. DAI a

koponyatrauma hatsra ltrejv axonlis elvltozsok sszessge, amelyek az p

axonok kztt elszrtan, tbbnyire p parenchimlis krnyezetben figyelhetek meg.

Olyan balesetek esetben jhet ltre, mint pdul motorbicikli, szemlygpkocsi, vagy

gzolsos balesetek, ahol accelerci-decelerci hatsra bred nyrerk jtszanak

fszerepet [127]. A komputer tomogrfin (computer tomography, CT) az elvltozsok

kicsi, petekilis vrzsek formjban, elssorban a szrke- s a fehrllomny hatrn,

valamint a corpus callosum-ban s a hossz plyk agytrzsi szakaszn figyelhetek

8

meg [32]. Annak ellenre, hogy a mgneses rezonancis kpalkots (magnetic

resonance imaging, MRI) megknnyti a kimutatst [14], a DAI teljes bizonyossggal

csak szvettani vizsglattal diagnosztizlhat [64]. Gennarelli munkja alapjn a DAI

50%-ban felels a balesetek utni tarts tudatzavarrt illetve 35%-ban a mortalitsrt a

nem trfoglal jelleg traums agykrosods (traumatic brain injury, TBI) esetekben

[64].

A DAI-nak kt morfolgiailag jl elklnthet megjelensi formja ismert: az

axonduzzads/axonballon-kpzds, valamint az ultrastrukturlis (neurofilament)

kompakci. Korbbi elkpzels szerint mindkt megjelensi forma kivltsban

ugyanazok a tnyezk jtszanak szerepet s ugyanazokat az axonokat rintik. jabb

megfigyelsek szerint a kt elvltozs kt jl elklnthet axon-populciban

figyelhet meg [92, 140].

A DAI vizsglathoz klnbz llatksrletes modelleket alkalmaznak.

Mindazonltal ezek nem kpesek a humn viszonyokat, pldul a humn DAI teljes

kiterjedst s idbeni lefolyst 100%-ban utnozni, ezrt az llatksrletekben

modellezett axonkrosodst traums axonkrosodsnak (traumatic axonal injury, TAI)

nevezzk, a DAI elnevezst pedig a humn esetekre hasznljuk [102].

2.3.1. Axon duzzads/axonballon kpzds (AD/B)

A diffz axonkrosods jelensgt, mint a slyos traums agysrlsek

kvetkezetes velejrjt Strich s munkatrsai rtk le elszr. Megfigyeltk, hogy a

slyos koponya-agysrltek post mortem vizsglata sorn a fehrllomnyban az p

axonok kztt elszrt ballonszer axontgulatok lthatak, amely tgulatoktl disztlis

axon-szakaszon Waller-fle degenerci s mielin-degradci is megfigyelhet [142,

143]. Elmletk szerint a krkp korai szakaszban a trauma ltal ltrejtt mechanikus

erk vezetnek az axon szakadshoz, az rintett proximlis axonvg kvetkezmnyes

retrakcijhoz valamint az axoplazma kiboltosulshoz, ltrehozvn ezzel a retrakcis

axonballont. A retrakcios axonballon utn, a disztlis axon-szakasz Waller-fle

degenercija jn ltre [142]. Mg Strich a megfigyelt elvltozsokat, mint a

fehrllomny diffz degenercijt vagy traums idegrost szakadst definilta,

addig a manapsg hasznlt elnevezs, -a diffz axonlis krosods-, Adams-tl szrazik

[3]. Strich ta Adams s kollgi hangslyoztk elszr -szemben ms kutatkkal-,

hogy a krkp kialakulsban az axonkrosods a koponyasrls elsdleges

kvetkezmnye, s nem pedig a msodlagos krosods (dma, hipotenzi s/vagy

9

hipoxia) kvetkeztben alakul ki [68]. Adams s mtsai. megfigyelsei alapjn a DAI a

fltekei fehrllomnyban, a corpus callosum-ban, az agytrzsi hosszplykban, illetve

kisebb gyakorisggal a kisagyban fordul el foklis krosods nlkl (1-es fokozat).

Foklis lzikkal pedig a corpus callosum-ban (2-es fokozat), illetve a rostralis

agytrzsben (3-as fokozat).

Povlishock s munkatrsai szerint ezen axonlis krosodst a kzpslyos illetve

a slyos koponyatrauma ltal kivltott nyrerk indtjk el. Megllaptottk, hogy a

DAI nem a trauma pillanatban azonnal s vglegesen kialakul axonszakadsknt

alakul ki, hanem a krosodott axonok nagy rszben egy idben fokozatosan

elrehalad folyamat [115]. Azta ez az elmlet szmos llatfajban s

traumamodellben, valamint humn szvetmintkon is is beigazoldott [18, 20, 31, 32,

47, 64, 66].

A folyamat sorn a krosodott axonszakaszokban a srlst kveten

gyakorlatilag azonnal (

10

oldalkarok szma. Elkpzelsk szerint az NFC mechanizmusa a kvetkez:

koponyatrauma hatsra az rintett axon egy rvid (tmrjnl alig hosszabb)

szakaszn makromolekulkat (pl. tormagykr-peroxidz) [110, 111] tereszteni kpes

mret prusok nylnak meg (mechanoporci). Ezltal megsznik az axolemmnak az

ionhztartst szablyoz szerepe; az axonba kalcium ionok ramolnak be. A

nagymrtkben megnvekedett kalcium koncentrci kvetkeztben aktivldik a

kalpain-nev cisztein protez, amely a nem-erithroid alfa-II spektrint 145 kD s 150 kD

mret egysgekre bontja (kalpain-medilta spektrin proteolzis, CMSP), amelyek

specilis immunhisztokmiai eljrssal kimutathatak [135]. A spektrin a

szubaxolemmlis citoszkeleton alkotrsze [12, 65, 109], amely az ankyrin fehrjn

keresztl kapcsoldik a klnbz membrnfehrjkhez, valamint az axolemmhoz [38,

159], tovbb megtalhat a mitokondriumok krl is [41, 65]. A spektrin bontsa

eleinte csak a csak a szubaxolemmlis tr s a mitokondriumok krl zajlik (15-30

perc), majd tovatevdik az rintett axon citoszkeletlis hlzatra [26], melynek

emsztdse tovbbi permeabilitsi zavart s tovbbi intraaxonlis proteolitikus kaszkd

aktivldst eredmnyez, amely vgl irreverzibilis axonkrosodst okoz [25, 26]. Az

NFC kimutatsra a kzepes mret neurofilament M-alegysge elleni RMO-14

antitestet talltk hasznlhatnak, amely a neurofilament oldalkarok defoszforilldsa

sorn szabadd vlt neurofilament-M alegysg rod domn-jhez kpes ktdni [87,

117]. Kezdeti elkpzelsek szerint a citoszkeletlis elvltozsok ugyanazokat az

axonokat rintik, mint az axonduzzads/ballonkpzds; mgpedig: a neurofilamen-

kompakci kvetkezmnyeknt ll le az elre-irnyul intra-axonlis transzport, amely

az axon-duzzads/ballonkpzds okozja. Erre abbl kvetkeztettek, hogy az intra-

axonlis transzportzavart mutat APP-pozitv axonok, s a neurofilament-kompakcit

mutat RMO-14-pozitv axonok ugyanazon anatmiai rgikban fordultak el, s

befolysolsuk ugyanazon intervencikkal volt lehetsges [23, 24, 81, 104, 106]. jabb

megfigyelsek szerint az AD/B s a NFC az estek tbbsgben kt klnbz axon-

populcit rint, s csak kis rszben figyelhet meg ugyanazon krosodott axonon bell,

azaz egymstl fggetlen jelensgekrl van sz [92, 140].

A neurofilament-kompakci mechanizmusnak j alapra val helyezst az a

megfigyels tette szksgess, hogy koponya-trauma utn azonnal perfzisan-fixlt

llatok agyban, st post mortem vgzett koponyatraumt szenvedett llatok agyban

is megtallhat volt egy specilis ezstz eljrssal. Elektron-mikroszkpis vizsglat

igazolta, hogy, stt idegsejtek kpzdnek koponyatrauma hatsra az enzimatikus

11

folyamatok szmra szlssgesen kedveztlen krlmnyek kztt is [58]. Ebben az

esetetben a kompaktldott axonokban a mikrotubulusok pnek ltszottak, a

neurofilament oldalkarok sem tntek el, csak megrvidltek. Ez arra utal, hogy a

koponyatrauma utni els rkban ksrletesen tallt kalcium-induklt, kalpain-medilt

spektrin proteolzis nem okozja, hanem kvetkezmnye az ultrastrukturlis

kompakcinak. Minthogy a kompakci nemcsak a neurofilamenteket rinti, hanem az

axon valamennyi ultrastrukturlis elemt, clszer a neurofilament kompakci helyett

az ultrastrukturlis kompakci terminus technikust alkalmazni. Az ezstz eljrssal

kimutathat volt, hogy az ultrastrukturlis kompakci az axon viszonylag hossz (akr 1

mm-nl is hosszabb) szakaszt rinti, de - disztlis irnyban - ltalban nem a teljes

hosszsgt, s - proximlis irnyban - ltalban nem ri el az axon eredsi dombot.

Egy specilis koponyatrauma mdszer segtsgvel ultrastrukturlis axon-

kompakcit sikerlt elidzni egybknt p agykreg elre kivlasztott terletn [107].

Ezen mdszer alkalmazsval kiderlt, hogy a kompaktldott axonoknak csupn egy

hnyada degenerldik, msik hnyaduk nhny ra leforgsa alatt visszanyeri eredeti

struktrjt [61]. Az axonokban vgbemen ultrastrukturlis kompakci felttelezett

mechanizmusa megegyezik az idegsejtek szmjban s dendritjeiben vgbemen (s a

kvetkez alfejezetben trgyalt) ultrastrukturlis kompakcijval, ezrt ott trgyaljuk.

2.4. Diffz idegsejt-krosods (stt idegsejt kpzds)

Tbb mint szz ve rtk le [52], hogy klnbz neurolgiai betegsgekben

meghaltak agyban olyan idegsejtek tallhatk, amelyek magja, citoplazmja s a f

dendritjei nagymrtkben zsugorodottak, valamint ersen ktik a neurohisztolgiban

hasznlatos bzikus festkeket (hiperbazofilia). Ezrt ezeket a sejteket tradicionlisan

stt idegsejteknek nevezik [28]. A 80-as ve eleje ta szmos neurolgiai

megbetegeds llatksrletes modellje esetben is lertk a stt idegsejtek jelenltt. A

hipoglikmia s a hiperglikmia hatsra kpzdtt stt idegsejtekrl kimutattk,

hogy mind elpusztulni, mind pedig regenerldni kpesek [4, 10]. Status epilepticus

esetben ugyanez a helyzet [9, 136]. Foklis iszkmia utni reperfzi esetben pedig az

iszkmis gc szli terletein lehet megfigyelni ezen elvltozst [36, 72, 76, 80, 101,

134, 134]. Ngy-r iszkmia esetben a reperfzi utn fleg a hilus s a hippocampus

CA1 rgijban, valamint a cortex terletn figyelhet meg elszrt stt llapoton

keresztli sejtpusztuls [36, 72, 80]. Gallyas s mtsai. a 90-es vek elejn megfigyeltk,

12

hogy mind in vivo, mind pedig post mortem mechanikai trauma hatsra is kpzdnek

stt idegsejtek s axonok [62].

Elektronmikroszkpos vizsglatok [58] szerint a frissen kpzdtt stt

idegsejtek ultrastrukturlis elemei pnek tnnek, de szorosan egyms mell tmrlnek

(ultrastrukturlis kompakci). Az rintett sejtek elektron-denzitsa megemelkedik,

trfogata pedig mintegy felre cskken a plazma-membrn felszakadsa nlkl. Az

endoplazmatikus retikulum (ER) ciszterni sszeszklnek, a Golgi-ciszternk viszont

kitgulnak. Nem vltozik a mitokondriumok s a multivezikulris testek trfogata. Az

rintett idegsejtek egy hnyada nhny ra alatt visszanyeri eredeti morfolgijt

(recovery), egy msik hnyada viszont elpusztul. Azon az alapon, hogy a frissen

ultrastrukturlis kompakcit szenvedett idegsejtek s a frissen ultrastrukturlis

kompakcit szenvedett axonok fny- s elektron-mikroszkpos sajtossgai azonosak,

kpzdsi mechanizmusukat is azonosnak tartjk [58].

A stt idegsejtekre jellemz, hogy ha szmja kompaktldik, akkor

dendritfja is, s fordtva. Az axonoknak mindig viszonylag hossz szakaszai

kompaktldnak. E jelensgek csak gy magyarzhatak, hogy a kompaktlds

minden egyes szma-dendrit domn, vagy axon egyetlen pontjn indul meg, majd

onnan terjed r az egszre. Ezt a folyamatot gy magyarzzk [55, 58] gy

magyarztk, hogy az idegsejtek (s ms sejtek) citoplazmjban egy - az

ultrastrukturlis elemekhez lehorgonyzott - mikro-trabekulris gl-struktra tallhat,

amely nem-kovalens ktsek formjban energit trol, s amely kpes - egy ponton

val inicils utn - sszehzdssal jr, tovaterjed fzistalakulsra (glbl-gl

fzistalakuls) a trolt energia hatsra. A glbl-gl fzistalakuls a polimer-

kmiban ismert jelensg [6, 148]. Az erre kpes gleknek kt, vagy tbb metastabil

llapota van s a klnbz energiaszint metastabil llapotokhoz eltr polimer-

molekula konformci, eltr vztartalom s egymstl eltr trfogat tartozik.

Megfelel aktivcis energia kzlsvel a magasabb energij metastabil struktra egy

pontja tbillen az alacsonyabb energiartk, m ugyanakkor energetikailag stabilabb

llapotba. Az itt felszabadul energia a szomszdos pontokon aktivcis energiaknt

szolglva lncreakcit indt el (domin-elv). A stt idegsejtek esetben a

fzistalakuls inicildhat patometabolikus folyamat (iszkmia, hipoglikmia,

epilepszis roham vagy mechanikai behats) ltal. A gl-struktra sszehzdsa

magval vonja a hozz horgonyzott ultrastrukturlis elemeket, s folyadkot prsel ki a

szma-dendrit domnbl illetve az rintett axon-szakaszokbl [58].

13

2.5. Sejthall mechanizmusok agysrlsben

Koponyasrls sorn az elsdleges krosods mellett msodlagos folyamatok is

elindulnak. A klnbz llatksrletes modellekben az erbehats nagysgtl, nemtl,

letkortl, sejttpustl s agyi rgitl fggen klnbz sejthall-mechanizmusok

aktivldnak. Az elmlt vtizedben egyre tbb, a sztrk, a neurodegeneratv betegsgek,

valamint a neurotrauma terletn szletett kutatsi eredmny krdjelezi meg a jelenleg

is rvnyben lv nekrzis- apoptzis paradigma helyessgt [67].

A klasszikus lers alapjn a nekrzis a sejthrtya integritsnak megsznsvel,

duzzadssal, vgl a sejtorganellumok sztessvel jr folyamat.

Az apoptzis a klasszikus definci szerint a filogenezis sorn konzervlt,

fiziolgis folyamat, amelynek szerepe a szveti homeosztzis fenntartsa.

Jellegzetessge a kromatin-kondenzci, mag-fragmentci, a sejtzsugorods, vgl az

apoptotikus testek kpzdse, amelyeket makrofgok takartanak el. Mivel az apoptzis,

szemben a nekrzissal energia ignyes folyamat, ezrt az apoptozis elssorban az

iszkmis vagy traums srls nekrotikus kzpontja krl elhelyezked szli

(penumbra) terleten fordul el. Kulcsenzime a kaszpz, amely mitokondrilis

krosods valamint hallreceptorok segtsgvel aktivldhat. Az apoptzisnak ismert

kaszpztl fggetlen formja is, amelyben klnbz faktorok mint az az AIF vagy

endonuklez G (mitochondrialis nuklez) mediljk a tpusos programozott sejthall

fenotpus megjelenst [151, 157].

Egyes kutatsi eredmnyek alapjn a sejtet rt behats erssgtl (mechanikai

energia), a kalcium-felszabaduls mrtktl, illetve az intracellulris ATP-szinttl fgg

[44], hogy a sejt melyik sejthall utat vlasztja. Felttelezik, hogy az egyik t gtlsa a

msik irnyba tereli a sejtpusztulst [19, 51, 112]. Mind a nekrzis, mind az apoptzis

csak abbl a genetikailag elre meghatrozott eszkzkszletbl vlogathat, amelybl a

fiziolgis mkdsek is, gy az lettani s a klnbz noxk ltal elindtott patolgis

folyamatok a genotpusukban s ez ltal a fenotpusukban is hasonlthatnak egymshoz.

Egyes szerzk szerint a nekrzis s az apoptzis egy kpzeletbeli spektrum kt

szln helyezkedik el, amely kztt brmilyen hibrid elfordulhat [157]. Ms kutatk

nekrzis, nekrzis-szer, apoptzis-szer, s apoptzis kategrikat hasznlnak

[88]. Mindezek alapjn ugyan klnbz sejthall-tpusokrl beszlnk, de ezek viszont

gyakran ugyanazokat a jeltviteli utakat hasznljk [54].

14

Az elpusztult stt idegsejtek vagy az apoptotikushoz hasonlan (a

kompaktldott struktra homogenizldik, majd membrnnal krlvett

fragmentumokra bomlik, amelyeket fagocitl sejtek kebeleznek be), vagy pedig a

nekrotikushoz hasonlan (a kompaktldott ultrastruktra fellazul, majd elemei

sztzilldnak, vgezetl elbb a plazma-membrn, majd a mag-membrn eltnik)

takartdik el a szvetbl [56]. Ismeretes, hogy az apoptotikus sejtek citoplazmja a

biokmiai folyamatok lejtszdsa s a mag-kromatin kondenzldsa utn

ultrastrukturlis kompakcit szenved. Azon az alapon, hogy a kompakcit szenvedett

apoptotikus sejtek fny- s elektron-mikroszkpos sajtossgai megegyeznek a stt

idegsejtekvel felttelezik [55], hogy az ultrastrukturlis kompakci mechanizmusa

mindkettben ugyanaz. gy a stt idegsejt kpzds nem ms, mint a fiziolgis

apoptzis szmra genetikailag kdolt ultrastrukturlis kompakci nem-apoptotikus

(nem-kdol, tves) indtsa.

Az ultratrukturlis kompakcit szenvedett apoptotikus sejtek is eltakarthatdnak a

nekrotikushoz hasonl ton [55]. Ezrt el kell vlasztani a sejt-hall folyamatt a

meghalt sejtek eltakartsnak folyamattl. Az elbbi lehet nekrotikus, apoptotikus,

egyb [67], vagy a stt-idegsejt llapoton keresztli; az utbbi pedig apoptotikushoz-

hasonl, vagy nekrotikushoz-hasonl [55].

2.6. A diffz axonlis krosods terpis befolysolst clz vizsglatok

Az elz fejezetekbl kitnik, hogy az axon-duzzads/ballonkpzds egy rk

alatt kialakul folyamat eredmnye, az ultrastrukturlis kompakcit szenvedett axonok

pedig regenercira kpesek, a DAI mindkt formjban lehetsg nylik a krosods

mrsklsre.

Mivel a dolgozat az agyalapi mirigy adenilt-ciklz aktivl polypeptid

(PACAP) s egy poli (ADP-ribz)-polimerz (PARP) inhibitor, az L-2286 terpis

hatsval foglalkozik, gy e bevezet rszletesen csak a PACAP s a PARP inhibitorok

hatsmechanizmust trgyalja.

2.6.1. Az agyalapi mirigy adenilt-ciklz aktivl polipeptid

A PACAP szerkezetileg a vazoaktv intesztinlis peptid (VIP)/szekretin/glkagon

csaldba tartozik, melyet elsknt a hipotalamusz-bl izolltak [98]. A fehrje a

hipofzis-ben nveli az adenilt-ciklz aktivitst, neuromodulcis funkcija mellett a

kzponti-, illetve a perifris idegrendszer terletn neurotrfikus s neuroprotektiv

hatst fejt ki [7]. Antiapoptotikus hatst igazolta, hogy a gerincvel srls extradural

15

static weight compression modelljben a szignifiknsan cskkentette a gerincveli

apoptzist [77], tovbb gerincvel tmetszs modelljben kivdte a tumor nekrozis

faktor (TNF) felszabadulst [78]. In vitro mind antiapoptotikus, mind

gyulladscskkent hatsait lertk. A kisagy granulris sejtjeiben szignifiknsan gtolta

a kaszpz-3 aktivldst [153], mikroglilis pro-inflammatorikus citokin s nitrogn-oxid

felszabadulst [40, 78, 84], illetve serkentette az anti-inflammatorikus IL-10 citokin

termeldst [63]. A PACAP tbb olyan gn mkodst indtja be, amelyek a

neurotoxicits elleni vdekezsben szerepet jtszanak, ilyen pldul a citokrm P450 s

az fibroblaszt nvekedsi faktor (fibroblast growth factor, FGF) [152].

A PACAP ksrletes krlmnyek kztt gtolta a mitokondrilis kalcium

felvtel hatsra ltrejv akonitz enzim inaktivldst, ezzel megtartva ennek a

neuronok mkdkpessghez nlklzhetetlen enzimnek a funkcijt [145].

In vivo vizsglatok szerint a PACAP tjut a vr-agy gton [13]. A PACAP

hatsosnak bizonyult patknyon ksrletesen elidzett globlis s foklis agyi iszkmia

eltt, valamint utn adva, tovbb retina-degenerci esetben is [8, 11]. Viselkeds-

vizsglatok alapjn kimutattk, hogy Huntington-kr llatksrleti modellje esetben a

PACAP-al elkezelt patknyokban hiperkinzia nem alakult ki, s az aszimmetrikus

mozgs is megsznt a kezels utni 10. napon [146]. A Parkinson-kr llatksrletes

modelljben a PACAP-al trtn elkezels cskkentette a hipokinzia slyossgt,

valamint teljes felgygyulshoz s az aszimmetrikus jelek megsznshez vezetett a

kezels utni 10. napon [123].

2.6.2. A poli (ADP-ribz)-polimerz gtlsa

A PARP egy kromoszmlis enzim, amely olyan folyamatok mkdsben vesz

rszt, mint a DNS javts [37], s a programozott sejthallnak, az apoptzisnak a

ltrejtte. Oxidatv stressz hatsra kialakul DNS trs kvetkeztben aktivldik,

melynek eredmnyeknt a nikotinamid adenin-dinukleotidrl (NAD+) ADP-ribz

egysgeket transzferl nukelris fehrjkre. Ez a rendkvl energia ignyes folyamat,

halmozott stressz hatsra kialakul tlmkdsvel a NAD+ deplcijt, ATP vesztst

s a sejt energia-homeosztzisnak sszeomlsa rvn nekrotikus ton bekvetkez

sejthallhoz vezet [27]. Mikzben a PARP hossz tv gtlsa elvileg mutagenezist s

karcinogenezist induklhat, az akut szakban hozzjrulhat az energia-hztarts

rendezdshez s az energia-homeosztzis fenntartshoz.

16

A PARP kzponti szerepet jtszik a kaszpztl-fggetlen, apoptzis-indukl

faktor (apoptosis-inducing factor, AIF) kzvettette apoptzis ltrejttben, valamint az

NF-kappaB-ton keresztl gyulladsos citokinek s meditorok felszabadulst is

befolysolja [83].

Az elmlt vek sorn fny derlt arra, hogy a PARP aktivldsa szerepet

jtszhat a kaszpz-fggetlen apoptzis ltrejttben [43, 158], ezrt a PARP gtlk

fontos terpis lehetsgnek szmtanak a koponyasrls okozta agyi krosods sorn

ltrejv nekrzis, illetve apoptzis ltrejttnek cskkentsben [128].

Korbbi vizsglatok tbbfle PARP gtlk, mint pldul benzamid analg

vegyletek (3-aminobenzamid) s az isoquinolin szrmazkok hatst vizsgltk

koponyasrls okozta agyi krosods esetben [16, 17, 86, 128]. A klnbz

llatksrletes modelleken vgzett sikeres ksrletek eredmnyeinek alapjn remnyeink

szerint a PARP gtl vegyletek is fontos szerepet jtszhatnak a ksbbi klinikai

kezelsek sorn.

17

3. CLKITZSEK

Amint a Bevezetsben tallhat tblzatbl kitnik, a koponya-trauma hatsa

rendkvl sszetett, komplex folyamatainak kvetse mg in vitro modellksrletekn,

vagy egyszer llatksrletes, rgcsl modellen sem knny. ppen ezrt a

koponyatrauma patolgis hatsnak egyes rszleteire prbltunk fkuszlni a jelen

disszertci alapjt kpez vizsglatokban, mely krdseket a rendelkezsnkre ll

mdszerek hasonlsga is sszekapcsolja. Minthogy a msodlagos koponyatraums

elvltozsok kz tartoz iszkmis krosods elfordulsa s lokalizcija

rapszodikus, radsul tovbb bonyoltja a fenti kpet, az iszkmit egy jl

reproduklhat nem-koponyatraums modellben vizsgltuk.

A munka sorn feltett alapvet krdsek az albbiak voltak:

Van-e neuroprotektv hatsa a hipofzis adenilt-ciklz aktivl polipeptidnek

(PACAP-nak) a centrlis folyadk-perkusszis (CFP) patkny-modellel vgzett traums

agysrls esetn?

Van-e neuroprotektv hatsa az L-2286-nak (egy j fejleszts PARP-

inhibitornak) a Marmarou-fle impakt accelercis patkny-modell vgzett traums

agysrls esetben?

Mi a sorsa a tranziens foklis agyi iszkmia okozta stt (ultrastruktulis

kompakcit szenvedett) idegsejteknek nem-nekrotikus s nem-excitotoxikus szveti

krnyezetben?

18

4. AZ AGYALAPI MIRIGY ADENILT-CIKLZ AKTIVL POLIPEPTID

(PACAP) NEUROPRTEKTV HATSNAK IMMUNHISZTOKMIAI

VIZSGLATA A CENTRLIS FOLYADK-PERKUSSZIS (CFP) PATKNY-

MODELLLEL VGZETT AGYSRLS ESETBEN

A fejezet alapjul szolgl publikci:

Kvesdi, E.; Tams, A.; Regldi, D.; Farkas, O.; Pl, J.; Bukovics, P.; Dczi, T.; Bki,

A.: Posttraumatic administration of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in

central fluid percussion injury in rats. Neurotox. Res. 2008, 13:71-8

19

4.1. Bevezets

A PACAP szerkezetileg a szekretin/glkagon/vazoaktv intestinlis peptid

csaldba tartozik. Elsknt birka hipotalamusz-bl izolltk adenilt-ciklz aktvl

hatsa alapjn [98]. Tbb tanulmny szerint szmos in vivo s in vitro neuroprotektv

hatsa ismert [7, 137, 154]. Sajnlatos mdon az in vivo neuroprotektv hats pontos

mechanizmusa nem tisztzott mg pontosan. Az in vivo tanulmnyok a PACAP

apoptzis s gyullads gtl hatst bizonytjk. Agyi granulris sejtekben

szignifiknsan kpes gtolni a kaszpz-3 aktivtst [154], valamint hatst gyakorol a

mitokondrilis tjrhatsgra, ugyanis gtolja az akonitz enzim mitokondrilis

klcium-felvtel induklta inaktivldst. Az akonitz egy kulcsfontossg

mitokondrilis enzim, amely befolysolja az idegsejtek letkpessgt [145].

Korbbi kutatsok alapjn a PACAP hatsosnak bizonyult patkny ksrletes

globlis s foklis agyi iszkmia esetben srls eltti, illetve utni kezelsek esetben

[124, 125, 150], Parkinson-krban s retinlis degenerci esetben is [11, 121, 123,

150].

Az utbbi nhny vig csak kevs tanulmny foglalkozott a PACAP esetleges

neuroprotektv tulajdonsgnak vizsglatval trauma okozta agy, illetve gerincvel

srls esetben. A gerincveli krosodst okoz extradural static weight

compression modelljben szignifiknsan cskkentette az apoptotikus sejtek szmt a

srlt gerincvelben [77].

Az elmlt vekben pcsi kutatk vizsgltk a PACAP neuroprotektv hatst

diffz krosodst okoz trauma modellben patknyon [49, 147]. A korbban agyi

iszkmiban hatsos dzis (125 g, srls eltti intavns kezels) nem volt hatsos,

m az intracerebroventrikulris (i.c.v.) kezels hatsosnak bizonyult [49].

A vizsglatunkban hasznlt dzis a fenti munkacsoport kutatsi eredmnyein

alapul, miszerint az i.c.v. 100 g PACAP kpes szignifiknsan cskkenteni a krosodott

axonok denzitst a kortikospinlis plya (corticospinal tract, CSpT) terletn.

4.2. Anyagok s mdszerek

4.2.1. Ksrleti llatok

A ksrleteket 350-380 g-os hm Wistar patknyokon vgeztk, amelyeket a

Pcsi Idegsebszeti Klinika kutatlaboratriumnak llathzban standard krlmnyek

kztt tartottuk, tellel s vzzel ad libitum elltva. Az llatok tartst s kezelst az

llatksrletek vgzsrl szl 243/1998. szm kormnyrendelet elrsainak

20

megfelelen vgeztk. A ksrleteket a Pcsi Tudomnyegyetem llatksrletekkel

foglalkoz Etikai Bizottsga (engedlyszm: BA 02/2000-26/2001) engedlyezte.

4.2.2. A centrlis folyadk perkusszis modell kivitelezse patknyon

sszesen 21 felntt Wistar patknyt (350-380g) hasznltunk a vizsglatokhoz.

Ebbl 18 llat rszeslt az elre meghatrozott mtti protokoll [42, 97] alapjn

kzpslyos (2 atm) CFP okoza koponyasrlsben, mg 5 llaton csak magt a mttet

vgeztk el, de traumt nem kaptak (l-mttt csoport).

A mtti eljrs sorn az llatokat 5 percig elaltattuk 4% isoflurn (Abbot

Laboratories (Magyarorszg) Kft.), 70% N2O s 30% O2 keverkvel. Intubls utn a

mtt alatt a patknyokat mlyen altattuk 1-2% isoflurn, 70% N2O s 30% O2

elegyvel, altatgp segtsgvel (Inspira ASV, Harvard Apparatus USA). Az llatok

testhmrsklett minden mtt alatt llandan mrtk s 37 C-on tartottuk egy

specilis ftpad segtsgvel (FHC BOWDOINHAM ME 04008 USA Temperature

Control). Az artris oxign szaturcit az egyik hts vgtagon elhelyezett pulzus-

oximter (NONIN 8600 V) segtsgvel folyamatosan ellenriztk egszen az llatok

bredsig a mttek utn. Intubls utn az llatokat sztereotaxis kszlkben

rgztettk, majd a fejtet brn ejtett hosszanti bemetszssel feltrtuk a koponya

Lambda s Bregma varratok kztti rszt. Kt 1 mm-es lyukat frtunk a koponya jobb

oldali frontlis s occipitalis rszbe 1 mm-re a Bregma s Lambda varratoktl, majd

ezekbe a korona jobb rgztse cljbl kismret csavarokat rgztettnk; 4,8 mm

tmrj koponyalket frtunk a Lambda s Bregma varratok kztti kzpvonalon a

durt srtetlenl hagyva. A korona f rszeknt a lyuk felett manyagbl kszlt

gynevezett sapkt rgztettnk, majd fogszati akrill segtsgvel a kt korbban mr

rgztett csavarokat s a sapka krli terleteken a sapka magassgval megegyez

szintig kialaktottuk a koront. Az akrill megszradsa utn a sapkt fiziolgis

soldattal tltttk fel. A ksrlet llatokat kzvetlenl a trauma kpzse eltt levettk

az altatgprl, majd az llatok a FP berendezsre felhelyezve kzpslyos (2 atm)

koponyatraumban rszesltek. A trauma utn az llatok a spontn lgzs visszatrsig

megfigyels alatt lltak, s ha 20 mp alatt nem trt vissza a spontn lgzs, akkor

llegeztet gpre kerltek, ahol 100% O2-t kaptak a lgzs normalizldsig. A mtt

vgn az llatok fejbrt sszevarrtuk, s egyesvel visszahelyeztk a sajt ketreckbe.

21

4.2.3. I.c.v. PACAP kezels

A hatanyag kezelt csoportban esetben (n=8) 30 perccel a trauma utn

folyamatos altats alatt a Bregmt 0:0 koordintj pontnak tekintve (Paxinos s

Watson, 1997) az AP:-1,0; L: 1,5; V:-3,5; agyterlet felett fogszati fr segtsgvel,

mikroszkpos kontroll alatt megnyitottuk a koponyt, s i.c.v. kezelssel 100 g

PACAP-ot 5l fiziolgis soldatban feloldva juttattunk be a jobb oldali agykamrba.

Mg a vehikulum kezelt csoport (n=8) esetben ezzel megegyez mdon fiziolgis

soldatot kapott.

4.2.4. Immunhisztokmia

Trauma utn kt rval az llatokat intraperitonilis pentobarbiturttal

tlaltattuk. Ezt kveten szven keresztl elbb fiziolgis soldattal, majd 4%-os

paraformaldehiddel perfundltuk ket. Az agyakat a gerincvel agytrzsi szakaszval

egytt eltvoltottuk a fixlt llatokbl s egy jszakn keresztl fixl oldatban troltuk

(4%-os paraformaldehid). Az agytrzsi rszbl egy medilis 5mm szles blokkot

vgtunk ki specilis agyfeldaraboldst segt eszkzzel (Braintree Scientific Inc.),

majd vibratm segtsgvel 30 m-es szeletekre vgtuk. Ezeket 0,1 M-os foszft

pufferben troltuk az immunhisztokmiai protokoll elvgzsnek megkezdsig. Az gy

elksztett metszeteket kt rszre osztottuk a ktfle immunhisztokmiai vizsglathoz.

A krosodott axonlis transzport vizsglathoz bta-amiloid prekurzor protein

C-terminusra (APP) hat poliklonlis antitesttel imunhisztokmiai vizsglatot

vgeztnk. Az APP a gyors axonlis transzporttal szlltdik. A koponyatrauma okozta

agysrls kvetkeztben ltrejv axonlis krosods sorn az axoplazmatikus

transzport krosodik s az APP felhalmozdik a krosods helyn [22, 23, 26, 74, 92,

117, 118]. Az RMO-14 antitest a trauma kvetkeztben konformci vltazson tesett

neurofilamentumok M alegysgn tallhat rod-domn-hez ktdve a citoszkeleton

krosodsnak (NFC) kimutatsra alkalmas [23, 87, 105, 117].

Az agyszeleteken 30 percig 0,5 %-os hidrogn-peroxidal trtn endogn

peroxidz blokkolsa utn a szeletek 3x10 percig trtn foszft pufferes (phosafate

buffered saline, PBS) mossa kvetkezett. Ezutn Stone lersa alapjn [141] citrt-

pufferben antign-feltrs kvetkezett. jbli 3x10 percig tart PBS-es moss utn a

httrgtls miatt a metszeteket PBS s a Vectastain ABC standard "Elite" kit (Vector)

1%-os lszrumban inkubltuk 35 percig. Ezutn a primer antitesttel trtn kezels

22

kvetkezett, ami APP jells esetben nyl-anti-APP s lszrum keverkt (1:500),

mg RMO-14 jells esetben egr monoklonlis RMO-14 antitest s lszrum

keverkt (1:500) jelenti egy jszakn t trtn inkublssal. Msnap 3x10 percig tart

PBS-es moss utn a szekunder antitestel 1 rn t tart inkubls kvetkezett. jbli

3x10 perces PBS ben trtn moss s avidin biotin-peroxidz komplexel trtn

inkubls utn a szeleteket 3x10 percig PBS-ben mostuk. Ezutn az immunhisztokmiai

komplexet a lthatv ttel miatt 0,05%-os diamino-benzidin (DAB) s 0,01%-os

hidrogn peroxid oldattal elhvtuk. A DAB-al trtn elhvs utn a metszeteket mg

1x10 percig PBS-ben mostuk, majd a metszetek desztilllt vzbl val trgylemezre

felhzsa s 30 percig tart szradsa utn lefedtk a fnymikroszkpos vizsglathoz.

A szvettani vizsglatok elemzse Image-Pro Plus v5.0.1 segtsgvel

Az APP illetve RMO-14 immunopozitv axonokat fnymikroszkp (Nikon),

hozzkapcsolt digitlis fnykpezgp (Spot Rt), valamint szmtgpes kpvizsgl

programmal (Image-Pro Plus v5.0.1) elemeztk. A korbbi lersok alapjn a DAI

legfkppen rintett terlete a CSpT s a medilis hosszanti kteg (medial longitudinal

fascicle, MLF) agytrzsi szakasza, ezrt ezeket a terleteket elemeztk az

immunhisztokmiai protokoll elvgzse utn. llatonknt 6 agytrzsi szakaszrl

ksztettnk digitlis kpet 20-szoros nagytsban. 45.000 m2-es terleten mind a

CSpT, mind az MLF terletn a krosodott axonokat sszeszmoltuk.

Statisztikai analzis

A PACAP s a vehikulummal kezelt csoport kztti krosodott axonok

denzitsbeli (tlag/mm2) klnbsgt Student-fle t-prbval hasonltottuk ssze.

Szignifiknsnak tekintettk a klnbsget, ha a p rtk kisebb volt, mint 0,05.

4.3. Eredmnyek

Az l-mttt llatok immunhisztokmiai vizsglatnak fnymikroszkpos

elemzse krosodott axonokat nem mutatott ki. Az APP immunopozitv axonok

morfolgiai kpe megduzzadt, rszben sztszakadt axondarabokat mutatott. Az RMO-

14 immunopozitv axonok lobulltak s rszben vagy teljes mrtkben sztszakadtak a

fnymikroszkpos kpen. Ezek a megfigyelsek megegyeznek a ms kutatk ltal

korbban mr hasonl tllsi idt kveten lert krosodott axon-alakokkal [22, 24,

23

139]. Sem az APP, sem az RMO-14 immunoreaktv axonok morfolgiai jellege nem

klnbztt a PACAP-, illetve a vehikulum kezelt csoportban.

Az eredmnyek fnymikroszkpos valamint statisztikai elemzse sorn

megllaptottuk, hogy a kzpslyos CFP okozta koponyatrauma utn 30 perccel

trtn i.c.v. PACAP kezels szignifiknsan cskkentette mind az APP, mind az RMO-

14-immunopozitv axonok denzitst a CSpT-ben a vehikulummal kezelt llatokhoz

viszonytva. Ezzel szemben az MLF-ben szignifikns klnbsget nem tapasztaltunk

sem az APP, sem az RMO-14-immunopozitv axonok denzitsban a PACAP s

vehikulummal kezelt csoport kztt (2-5. bra).

2. bra: Megduzzadt, rszben sztszakadt APP immunopozitv axonok

fnymikroszkpos kpe a kortikospinlis pyban (CSpT, A s B) s a medilis

longitudinlis ktegben (MLF, C s D) a PACAP (A s C) illetve vehikulummal kezelet

(B s D) llatok esetben.

24

3.bra: Lobullt, rszben vagy teljes mrtkben sztszakadt RMO-14 immunopozitv

axonok a kortikospinlis pyban (CSpT, A s B) s a medilis longitudinlis ktegben

(MLF, C s D) a PACAP (A s C) illetve vehikulummal kezelet (B s D) llatok

esetben.

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

vehikulum-CSpT PACAP-CSpt vehikulum-MLF PACAP-MLF

AP

P im

mum

orea

ktv

axo

nok

den

zt

sa

*

4. bra: APP immunopozitv axonok tlagos denzitsa CSpT s a MLF terletn a

PACAP s vehikulummal kezelet llatok esetben. Az adatok tlag/mm2 SEM-ben

kifejezve (*p< 0,05 a vehikulum kezelt csoporthoz viszonytva).

25

100

150

200

250

300

350

vehikulum-CSpT PACAP-CSpt vehikulum-MLF PACAP-MLF

RM

O-1

4 im

mu

nor

eakt

v a

xon

ok

den

zt

sa

*

5. bra: RMO-14 immunopozitv axonok tlagos denzitsa a CSpT s az MLF terletn

a PACAP s vehikulummal kezelet llatok esetben. Az adatok tlag/mm2 SEM-ben

kifejezve (*p< 0,05 a vehikulum kezelt csoporthoz viszonytva).

4.4. Megbeszels, kvetkeztetsek

Munknk az els olyan tanulmny, amely a CFP modellben bizonytotta a

PACAP neuroporotektv hatst DAI esetben. Eredmnyeink jl mutattk, hogy a

kzpslyos CFP modell okozta srls utn 30 perccel trtn i.c.v. 100 g PACAP

kezels szignifiknsan kpes volt cskkenteni a krosodott axonok denzitst a CSpT-

ben. Megfigyelseink altmasztjk azokat a korbbi tapasztalatokat [137], melyek

szerint a diffz TAI impakt acceleris modellje esetben, a PACAP hatkony

gtlszerknt mkdik az axonlis krosods kvetkeztben ltrejv intraaxonlis

transzportzavar s NFC kivdsben.

Megfigyelseink ezen kvl jl egybevgnak azokkal a korbbi tanulmnyokkal,

amelyek a PACAP neuroprotektv hatst vizsgltk klnbz in vitro s in vivo

vizsglatok sorn. E szerint in vitro krlmnyek kztt a klnbz sejtvonalakon

vgzett ksrletek sorn hatkony apoptzist gtl hatssal rendelkezik [132, 137], in

vivo mind az tmeneti (tranziens), mind a tarts (permanens) foklis iszkmia

llatksrletes modellek esetben cskkenti az elhalt agyterlet nagysgt [125, 137].

Teljes agyi iszkmia esetben az i.c.v. vagy intravns PACAP kezels gtolja az

iszkmia okozta sejtpusztulst a hippokampusz CA1 regijnak terletn [133]. A

Parkinson-kr llatksrletes modelljben a subtancia nigra dopamintermel

26

sejtcsoportjait megvdi a programozott sejthalltl (apoptzis), valamint ezzel egytt

javtja funkcionlis kimenetelt [122, 123].

Habr azok a folyamatok, melyekben a PACAP in vivo neuroprotektv

tulajdonsga rvnyesl egyelre mg nem tisztzottak, az in vitro tanulmnyok szerint

a PACAP mind apoptzis-, mind gyulladsgtl hatssal rendelkezik. TAI esetben a

PACAP szignifiknsan gtolja a kaszpz aktivtst valamint az apototikus kaszkd

ltrejttben kulcsfontossg szerepet jtsz molekulk mkdst [25, 48]. Ez a hats

szintn megfigyelhet idegsejtkultrkban s in vivo retina-sejttenyszetben is [120,

137]. A TAI ltrejttben fontos szerepet jtszik az intraaxonlis mitokondriumok

integrtsnak megvltozsa [24, 25, 106]. A kros mitokondrilis klcium akkumulci

inaktivlja az akonitz enzim mkdst, amely a f mitokondrilis enzim s

befolysolja az idegsejtek letkpessgt. A PACAP ezt az inaktivcit gtolva kpes

befolysolni ezt a megvltozott mitokondrilis integrtst [145].

A ksrlet f megllaptsa, hogy CFP utn 30 perccel trtn i.c.v. 100 g

PACAP kezels szignifiknsan cskkenti mind az APP, mind az RMO-14

immunopozitv axonok denzitst.

Mg az axonlis transzportzavar nem csak az egyetlen axonpusztulshoz vezet

t, mgis az anterogrd transzport ilyen jelleg krosodsa, valamint az ennek

kvetkeztben ltrejv axonszakads megakadlyozsa a DAI egyik lehetsges

kulcsfontossg kezelsi mdjaknt azonosthat. Megjegyzend viszont, hogy a

PACAP neuroprotektv tulajdonsga csak a CSpT terletn volt szignifikns. Ezen

plyarendszeren a krosodott axonok denzitsa valamint az tmrjk s lefutsuk ms,

mint ami a medilis hosszanti kteg terletn lv axonokra jellemz [92, 140], ez

rszben magyarzhatja az eredmnyekben tapasztalt eltrst. Annak ellenre, hogy az

utbbi vekben kiterjed kutats folyt olyan j hatanyagok kifejlesztsre s

tesztelsre, amelyek kpesek gtolni a DAI ltrejttt okoz patobiolgiai

mechanizmusokat, egyetlen klinikai vizsglatban alkalmazott hatanyag sem bizonyult

hatkonynak. Ezrt az aprlkos preklinikai kivlaszts felttlenl szksges ahhoz,

hogy a ksbbiekben a klinikai tesztelsek sorn a kivlasztott szer maximlis

hatkonysgot nyjtson.

Vizsglatainkat sszegezve azt szndkoztuk bemutatni, hogy a PACAP

axonoprotektv hatssal rendelkezik, mely nem csak az impakt accelercis, hanem a

CFP llatksrletes modellben kivltott DAI esetben is igazolhat. A korbbi, valamint

27

a most bemutatott eredmnyek alapjn a PACAP potencilis jelltnek szmt, mint

lehetsges hatanyag a koponyasrls okozta agyi krosodsok klinikai kezelsben.

28

5. AZ L-2286-EGY J POLI (ADP-RIBZ) POLIMERZ INHIBITOR

NEUROPROTEKTV HATSNAK VIZSGLATA MARAMROU-FLE

IMPAKT ACCELERCIS PATKNY MODELLEL VGZETT

KOPONYATRAUMA ESETBEN

A fejezet alapjul szolgl publikci:

Kvesdi, E.; Bukovics, P.; Besson, V.C.; Pl, J.; Nyirdi, J.; Lckl, J.; Smegi, B.;

Dczi, T.;Herndi, I. and Bki, A.: A novel PARP inhibitor L-2286 in a rat model of

impact acceleration head injury: an immunohistochemical and behavioral study. Int J

Mol Sci. 2010 Mar 26;11(4):1253-68.

29

5.1.Bevezets

A PARP egy kromoszmlis enzim, amely a sejtmagban tallhat, s fontos

szerepet jtszik a sejtek letciklusban [34, 39, 158]. Olyan folyamatok mkdsben

vesz rszt, mint pldul a DNS javts [37], s a programozott sejthallnak, az

apoptzisnak a ltrejtte [70].

A fehrje hrom f strukturlis domnbl ll [126]:

1. DNS kt domn, amely kt cink ujjat tartalmaz

2. automodifikcis domn

3. katalitikus domn

A katalitikus domn felels a NAD+ nikotinamidd s ADP-ribzz trtn

talaktsrt [75]. Normlis krlmnyek kztt a PARP a DNS-t javt

folyamatokban jtszik szerepet, ezrt mkdsnek gtlsa a rkos betegek

kemoterpis kezelsben hasznosthat [69]. PARP tlmkds esetben az ADP-ribz

nagymrtk polimerizcijhoz vezet, melynek kvetkeztben a NAD+ szintje

nagymrtkben lecskken az intracellulris ATP szinttel egytt, ami nekrotikus ton

bekvetkez sejthallhoz vezet [100]. A PARP mkdsnek ilyen jelleg aktivldsa

fontos az olyan agyi szveti krosodsok ltrejttnek folyamatban, amelyek

sszefggsben vannak a megnvekedett oxidatv stresszel, agyi iszkmival [45, 46],

Parkinson-krral, amit 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hoznak ltre [34],

valamint gerincveli srls esetben is [129].

A PARP kzponti szerepet jtszik a kaszpztl-fggetlen, AIF kzvettette

apoptzis ltrejttben. Az AIF egy evolcisan konzervlt mitokondrilis flavoprotein,

amely a mitokondrilis membrn depolarizcija utn szabadul fel [144]. Az

idegsejtekben az AIF-medilta apoptzis in vivo krlmnyek kztt oxidatv stressz

[43, 158] ksrletes koponyatrauma okozta agysrls s agyi iszkmia esetben jn

ltre. Az utbbi vekben fny derl arra, hogy a PARP aktivldsa szerepet jtszhat a

kaszpz-fggetlen apoptzis ltrejttben. Ezrt a PARP gtlk fontos terpis

lehetsgnek szmtanak koponyasrls okozta agyi krosods sorn ltrejv nekrzis

illetve apoptzis ltrejttnek cskkentsben [128]. A PARP gtlk neuroprotektv

hatsnak bizonyultak szlts, folyadk perkusszis koponyatrauma modellben,

valamint a Parkinson-kr llatksrletes modelljeiben [2, 34, 46, 73, 86].

Az olyan PARP gtlkat, mint a benzamid analg vegyletek s az isoquinolin

szrmazkok, mr korbban is alkalmaztk a PARP mkdsnek vizsglatra

koponyasrls okozta agyi krosods esetben [16, 17, 86, 128]. A klnbz

30

llatksrletes modelleken vgzett sikeres ksrletek eredmnyeinek alapjn a PARP

gtl vegyletek is fontos szerepet jtszhatnak a ksbbi klinikai kezelsek sorn.

Ksrletnk sorn egy j fejleszts quinazolinone szrmazk PARP gtl, az L-

2286 (2-[(2-piperidin-1-yletil)thio]quinazolin-4(3H)-one) (6.bra) hatst vizsgltuk

Marmarou-fle impakt accelercis modell okozta koponyasrls [53, 90] esetben a

diffz axonlis krosodsra specifikus immunhisztokmiai mdszerekkel, valamint

magatartsvizsglatokkal.

6. bra. Az L-2286 szerkezeti kplete [108]

A vizsglat els lpse az L-2286 dzis-hats grbjnek meghatrozsa volt. A

msodik lpsben az gy meghatrozott hatsos dzis hatst vizsgltuk trauma utn

kzvetlenl, illetve 30 perccel trtn kezels utn egyrszt APP s RMO-14

immunhisztokmiai vizsglattal az agytrzsben, msrszt klnbz

magatartsvizsglatokkal.

5.2. Anyagok s mdszerek

5.2.1. Ksrleti llatok

A ksrleteket sszesen 68 darab 300-350 g-os hm Wistar patknyokon

vgeztk, amelyeket a Pcsi Tudomnyegyetem, Termszettudomnyi Kar, Ksrletes

llattani s Neurobiolgiai Tanszk llathzban standard krlmnyek kztt

tartottunk, tellel s vzzel ad libitum elltva. Az llatok tartst s kezelst az

llatksrletek vgzsrl szl 243/1998. szm kormnyrendelet elrsainak

megfelelen vgeztk. A ksrleteket a Pcsi Tudomnyegyetem llatksrletekkel

foglalkoz Etikai Bizottsga (engedlyszm: BA 02/2000-21/2006) engedlyezte.

31

5.2.2. Marmarou-fle impakt accelercis modell patknyon

A mtti eljrs sorn az llatokat 5 percig elaltattuk 4% isoflurn (Abbot

Laboratories (Magyarorszg) Kft.), 70% N2O s 30% O2 keverkvel. Intubls utn a

mtt alatt a patknyokat mlyen altattuk 1,5 % isoflurn, 70% N2O s 30% O2

elegyvel altatgp segtsgvel (Inspira ASV, Harvard Apparatus USA). Az llatok

testhmrsklett minden mtt alatt llandan mrtk s folyamatosan 37 C-on

tartottuk egy specilis ftpad segtsgvel (FHC BOWDOINHAM ME 04008 USA

Temperature Control). Az artris oxign szaturcit az egyik hts vgtagon

elhelyezett pulzus-oximter (NONIN 8600 V) segtsgvel folyamatosan ellenriztk

egszen az llatok bredsig a mttek utn. Intubls utn az llatokat sztereotaxis

kszlkben rgztettk, majd a fejtet brn ejtett hosszanti bemetszssel feltrtuk a

koponya Lambda s Bregma varratok kztti rszt. A koponya felszn alapos

letiszttsa utn a Lambda s Bregma kraniometris pontok kztti tr kzepre, a

kzpvonalba egy rozsdamentes fmkorongot (10mm tmrj s 3mm vastagsg)

rgztettnk, amivel kivdhet egy esetleges koponyatrs. A slyos koponyasrls

ltrehozsa cljbl kt mter magassgbl 450g slyt ejtettnk az llat

koponyacsontjhoz rgztett fmkorongra. Trauma utn a korongot eltvoltottuk a

koponya felsznrl, majd a mtt utn az llatok a spontn lgzs visszatrsig

megfigyels alatt lltak, s ha 20 mp-ig nem trt vissza a spontn lgzs, akkor azonnal

vissza lettek helyezve az altatgpre, ahol 100% O2-t kaptak a lgzs

normalizldsig. A mtt vgn az llatok fejbrt sszevarrtuk, s egyesvel

visszahelyeztk a sajt ketreckbe. Az l-mttt llatokon ugyan ezt a mtti eljrst

alkalmaztuk, de traumban nem rszesltek.

5.3. Immunisztokmia

I.c.v. L-2286 dzis-hats grbjnek megllaptsa APP immunhisztokmiai

vizsglattal

Harminc perccel a trauma utn folyamatos altats alatt dzisonknt 5-5 llatot

10, 50 illetve 100 g/patkny 5 l fiziolgis soldatban feloldott, i.c.v. adott L-2286-al

kezeltnk a kvetkez koordintk alapjn a Bregmt 0:0 koordincis pontnak

tekintve: AP:-1,0; L: 1,5; V:-3,5;. A vehikulum kezelt csoport (n=5) ugyanekkora

mennyisg fiziolgis soldatot kapott a hatanyaggal kezelt csoportokkal megegyez

mdon. Trauma utn 2 rval ezeket az llatokat a 4.2.5. Immunhisztokmia-rszben

32

ismertetett eljrsnak vetettk al azzal a klnbsggel, hogy csak az APP-

immunopozitv axonok denzitst hatroztuk meg a CSpT agytrzsi szakaszban.

Terpis ablak meghatrozsa i.c.v. 100 g/patkny L-2286 esetben

A vizsglat kvetkez rszben az llatok egy rszt kzvetlenl (n=6), a msik

rszt 30 perccel a trauma utn (n=6) az elbb ismertetett mdon i.c.v. 100 g/patkny

L-2286-tal kezeltnk, melyet a jobb oldali agykamrba juttattunk (oldszer: 5l

fiziolgis soldat). A kt kezelsi idpontnak megfelelen a 2 vehikulum kezelt

csoportot (n=6;6) ezzel megegyez mdon 5l/patkny fiziolgis soldattal kezeltk.

Az immunhisztokmiai vizsglathoz a trauma utn 2 rval ezeket az llatokat is a

4.2.5. Immunhisztokmia-rszben ismertetett eljrsnak vetettk al.

A szvettani metszetek elemzse Image-Pro Plus v 5.0.1. segtsgvel

Az APP immunopozitv axonokat fnymikroszkp (Nikon), illetve

hozzkapcsolt digitlis fnykpezgp (Spot Rt), valamint szmtgpes kpvizsgl

program segtsgvel (Image-Pro Plus v5.0.1) elemeztk. llatonknt 6 agytrzsi

szakaszrl ksztettnk digitlis kpet 10-szeres nagytsban. 180.000 m2-es terleten

mind a CSpT, mind az MLF terletn a krosodott axonokat sszeszmoltuk.

Statisztikai analzis

Az L-2286, illetve vehikulum kezelt csoport kztti krosodott axonok

denzitsbeli (tlag/mm2) klnbsgt mindkt vizsglati idpontban Student-fle t-

prbval hasonltottuk ssze. Szignifiknsnak tekintettk a klnbsget, ha a p rtk

kisebb volt, mint 0,05.

5.4. Magatartsvizsglatok

Beam-balance teszt

A mtt eltt 1 nappal minden egyes ksrleti llatot addig edzettk, amg

kpesek lettek az egyenslyukat megtartani 60 mp-ig egy 1,5cm szlessg fbl

kszlt gerendn, amit 60cm magassgban helyeztnk el egy szivacsprna felett.

Minden ksrleti csoportban lv llatot mtt utn 1 rval s a mttet kveten 1-7

napig naponta egyszer teszteltk, majd az egyes csoportok napi eredmnyeit rtkeltk.

A kvetkez besorolsi rendszer alapjn rtkeltk az egyes llatok

teljestmnyt [33]:

33

1. egyenslyi helyzetet vesz fel a gerendn

2. megfogja a gerenda oldalt s/vagy egyenetlen mozgsokat tesz

3. tkarolja a gerendt vagy csszkl rajta leess nlkl

4. megksrli az egyenslyi helyzet felvtelt, de ekzben leesik

5. fgg a gerendn, majd leesik

6. egyltaln nem ksrli meg a fentmaradst a gerendn

Open-field teszt

Az open-field tesztet a trauma utni spontn lokomotoros aktivits vizsglatra

hasznltuk. Az eszkz egy 70x70cm alapterlet s 50cm magassg a lda, amelynek

az alja 16 egyenl mret ngyzetre van osztva. A centrlis zna a doboz kzepn lv

2x2 ngyzet, a perifris zna a kls maradk 3x4 ngyzet. A vizsglat napjn fl

rval a tesztels eltt az llatokat a vizsglszobba vittk. Ezutn minden egyes

llatot 5 perces idtartamra az open-field kzepre helyeztk s videokamera

segtsgvel rgztettk az egyes llatok tevkenysgt. A crossingok (min. 3 lb egy

ngyzetben) s gaskodsok szmt rtkeltk az 5 perces vizsglati idtartam alatt.

Emelt keresztpall teszt

Az emelt keresztpall teszt a szorongs vizsglatra alkalmas. Az eszkz 1m

magassgban helyezkedik el. Ngy, kzpen egymsba nyl egyenl mret karbl ll

(45 cm hossz s 10 cm szles 1-1 kar), amelybl 2 kar 3 oldala teljesen nyitott (nyitott

kar), viszont a msik 2 kar 3 oldala 30cm magas fallal van krlvve (zrt kar). A

vizsglat napjn fl rval a tesztels eltt az llatokat a vizsglszobba vittk. Ezutn

minden egyes llatot 5 perces idtartamra a berendezs kzepre helyeztnk s

videokamera segtsgvel rgztettk az egyes llatok tevkenysgt. A felvtelek

alapjn a kvetkez paramtereket vizsgltuk az egyes csoportokban: fejbedugsok

(head dip) szma a nyitott karba, a mells kt lbbal val belpsek szma a nyitott

karba, valamint a nyitott illetve zrt karban tlttt idtartam.

Statisztikai analizis

A magatartsvizsglatok sorn az egyes csoportokban szerepl llatok adatait

sszestettk. A beam-balance teszt eredmnyeit nem-parametrikus Dunn-fle poszt

teszttel kiegsztett egyutas ANOVA teszttel rtkeltk. Az open-field s az emelt

34

keresztpall tesztek adatait Dunnett-fle poszt teszttel kiegsztett egyutas ANOVA-

teszttel rtkeltk. Minden esetben a klnbz csoportok kztti eredmnyek

sszehasonltsakor *p

35

8.bra APP-IR axonok a CSpT terlet 2 rval a koponyasrls utn vehikulum (A)

illetve i.c.v. 100 g/patkny L-2286-al trtn kezels esetben (B).

A szvettani vizsglatok msodik rszben az els vizsglat sorn hatsosnak

bizonyult dzist vizsgltuk a trauma utn kt klnbz idpontban trtn kezels utn

immr nem csak APP, hanem RMO-14 immunhisztokmiai analzissel is.

Az APP immunhisztokmiai analzis fnymikroszkppal trtn elemzse sorn

megllaptottuk, hogy mind a trauma utn kzvetlenl, mind a 30 perccel trtn i.c.v.

100 g/patkny L-2286-al trtn kezels a vehikulummal kezelt llatok eredmnyeihez

kpest szignifiknsan cskkentette a krosodott axonok denzitst (krosodott axonok

szma/mm2) mind a CSpT-ben, mind az MLF-ben. A kt kezelsi idpont kztt

statisztikai klnbsg nem volt kimutathat (9. s 11. bra).

Az RMO-14 immunopozitv axonok esetben az elbbiekhez hasonlan mindkt

idpontban trtn kezels hatsosnak bizonyult, vagyis mind az azonnali, mind a

trauma utn 30 perccel trtn kezels szignifiknsan cskkentette az RMO-14

immunopozitv axonok szmt mindkt vizsglt agyterleten. Megjegyzend viszont,

hogy ellenttben az APP immunhisztokmiai vizsglattal, ebben az esetben a kt

kezelsi idpont kztt szignifikns klnbsg volt kimutathat, miszerint a slyos

trauma utn kzvetlenl beadott 100 g/patkny L-2286 nagyobb mrtkben kpes

36

cskkenteni az RMO-14 immunopozitv axonok szmt, ami mind a CSpT, mind az

MLF terletn egyarnt megfigyelhet volt (10. s 11. bra).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

vehikulum L-2286 azonnali

kezels

L-2286 30 min kezels

AP

P im

mu

nre

akt

v ax

onok

tl

ag d

enz

tsa

CSpT

MLF

** ** ** **

9. bra APP immunoreaktv axonok denzitsa a CSpT s MLF terltn. Az adatok

tlag/mm2 SEM-ben kifejezve (** p

37

vehikulum L-2286 azonnali

kezels

P rtk a

vehikulumhoz

kpest

L-2286 30

percel a

trauma utn

p rtk a

vehikulumhoz

APP immunopozitiv

axonok

CSpT 345,6141,56 72,508,54 p

38

beam-balance beli teljestmnyhez kpest- az els vizsglati idpont teljestmnyt

leszmtva a teljes vizsglat alatt szignifiknsan jobban tejestettek.

A kt kezelsi mdot sszehasonltva megllapthatjuk, hogy a beam-balance

tesztben ugyan mindkett javtja a krosodott motoros funkcikat, de a trauma utn 30

perccel trtn i.c.v. 100 g/patkny L2286-al trtn kezels hatsosabbnak tnik,

mint a trauma utn azonnal trtn kezels ( 12. s 13. bra).

0

1

2

3

4

5

6

7

1 ra 1 nap 2 nap 3 nap 4 nap 5 nap 6 nap 7napId

rt

k

l-mttt

vehikulum

0 min

30 min

*

** * **

***

****

12.bra Az i.c.v. 100 g/patkny L-2286 hatsa a beam-balance tesztben. Az adatok

beam-balance rtek SEM-ben kifejezve (*p

39

l-mttt vehikulum p rtk az l-

mttthz kpest

L-2286

azonnali kezels

p rtk a

vehikulumhoz

kpest

L-2286 30 perccel

a trauma utn

p rtk a

vehikulumhoz

kpest

Beam-balance

1 ra (rtk) 1 6 p

40

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Dara

bszm

/5 p

erc

l-mttt

vehikulum

0 min

30 min

*

14.bra L-2286 hatsa a mosakodsok szmra az open-field tesztben. Az adatok

darabszm/5 perc SEM-ben kifejezve (*p

41

0

2

4

6

8

10

12

Dara

bszm

/5perc

l-mttt

vehikulum

0 min

30 min

**

15.bra Az i.c.v. 100g/patkny L-2286 hatsa a fejbettel nyitott karba paramterre.

Az adatok darabszm/5 perc SEM-ben kifejezve (*p

42

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Id (m

p)

l-mttt

vehikulum

0 min

30 min

****

17.bra Az i.c.v. 100g/patkny L-2286 hatsa a nyitott karban tlttt idre. Az adatok

mp SEM-ben kifejezve (*p

43

kvetkeztben krosodott motoros teljestmnyt (beam-balance teszt), s

nagymrtkben cskkenteni a trauma utn kialakul szorongs szintjt (emelt

keresztpall teszt), vagyis javtja a funkcionlis kimenetelt.

E vizsglatok nem nyjtottak arra vlaszt, hogy a PARP inhibitor pozitv hatst

kizrlag a DAI gtlsa rvn okozza, vagy esetleg szerepet jtszhat a Marmarou-fle

koponyatrauma modellben igazolt diffz neurlis krosods kivdse is.

44

6. TRANZIENS FOKLIS AGYI ISZKMIA OKOZTA STT

IDEGSEJTEK SORSA NEM-NEKROTIKUS ES NEM EXCITOTOXIKUS

SZVETI KRNYEZETBEN: NEUROBIOLGIAI KVETKEZTETSEK

A fejezet alapjul szolgl publikci:

Kvesdi E., Pl J., Gallyas F.: The fate of dark neurons produced by transient focal

cerebral ischemia in a non-necrotic and non-excitotoxic environment: neurobiological

aspects. Brain Res. 2007 May 25;1147:272-83.

45

6.1. Bevezets

Tbb mint egy vszzada Flesh [52] mutatott r arra, hogy klnbz

neurolgiai betegsgek kvetkeztben meghaltak agyban drmai mrtkben (>50%)

zsugorodott s hiperkromatikus idegsejtek tallhatk, klnfle lokalizciban s

klnfle arnyban. Ezen - tradicionlisan stt-nek nevezett - idegsejtek

patogenezise vitatott trgy a neuropatolgiban [4], amely ezeket ngy morfolgiai

tpusba sorolja [67]: Huntington tpusuak (Huntington-krban), artefakt tpusuak (post

mortem kpzdnek klnbz mechanikai hatsokra), reverzibilis tpusuak

(hipoglikmia, epilepszia vagy iszkmia korai stdiumban), valamint irreverzibilis

tpusak (hipoglikmia, epilepszia vagy iszkmia ksi stdiumban tallhatk meg).

Az utbbi nhny vben egyes kutatk j eredmnyeket mutattak be

koponyatrauma, elektromos sokk, vagy hipoglikmia hatsra - viszonylag p szveti

krnyezetben kpzd - stt idegsejtek kpzdsi mechanizmusra, regenercis

kpessgre illetve pusztulsnak mdjra vonatkozan [35, 56, 57, 160]. Ezekbl arra

lehet kvetkeztetni, hogy a stt idegsejteknek egyetlen sejtbiolgiai tpusa van, a

fenti ngy morfolgiai tpust a kros krnyezet erszakolja rjuk [60].

Jelen ksrlet sorn az arteria cerebri media - intraluminrisan bevezetett

vkony filamentel val [82]egy-rs elzrsnak hatsra p szveti krnyezetben -

kpzd stt idegsejtek morfolgiai vltozsait kvettk nyomon a tllsi id

fggvnyben, abbl a clbl, hogy iszkmia esetben is igazak-e a fenti hrom esetben

talltakbl levont neurobiolgiai kvetkeztetsek.

6.2. Anyagok s mdszerek

6.2.1. Ksrleti llatok

A ksrleteket 200-220 g-os hm Wistar patknyokon vgeztk, amelyeket a

Pcsi Idegsebszeti Klinika kutatlaboratriumnak llathzban standard krlmnyek

kztt tartottuk, tellel s vzzel ad libitum elltva. Az llatok tartst s kezelst az

llatksrletek vgzsrl szl 243/1998. szm kormnyrendelet elrsainak

megfelelen vgeztk.

6.2.2. Patkny tranziens foklis agyi iszkmia modell

A mttek alatt az llatokat altatgp segtsgvel (SurgiVet respirator,

Waukesha, WI, USA) llegeztettk 2,5% isoflurane, 30% oxign s 67,5% dinitrogn-

oxid keverkvel. 24 patkny esetben a jobb oldali arteria cerebri media-t a Koizumi

s mtsai. ltal lert mtti eljrs szerint [82]1 rra lezrtuk. A mtt sorn a nyakon a

46

jobb oldali arteria carotis terlett feltrtuk, majd az arteria carotis f s

pterigopalatinus gt elktttk. A arteria carotis kls gn keresztl egy lekerektett

vg 4-0-s manyag sebszeti fonalat vezettnk fel az arteria cerebri media-hoz, majd

1 rn keresztl ott tartottuk. Vgl a fonalat eltvoltotuk s a keringst

helyrelltottuk.

Kzvetlenl ezutn 3 darab patknyt szven keresztl perfundltunk 500 ml

glutraldehides fixlval. A tbbi llat esetben klnbz tllsi idket alkalmaztunk,

ezen idpontokban a perfzi eltt az llatokat intraperitonilisan 25 mg/ml thiopental

s 5 mg/ml diazepam 1:1 arny keverkvel 2 ml-t beadva testsly-kilogrammonknt

tlaltattuk. Glutraldehides fixls esetben a tllsi idk a kvetkezk voltak: 1 ra, 4

ra, 1 nap, 2 nap s 1 ht (vizsglati idpontonknt 3 darab llat), mg a formaldehides

fixls esetben: 1 ra, 1 nap s 2 nap (vizsglati idpontonknt 2 darab llat).

Tovbbi 9 llat a fent ismertetett mtti eljrson keresztl esett t (l-mttt,

tovbbiakban kontroll llatok), de ezeknl a fonalat kzvetlenl a behelyezs utn

eltvoltottuk. Ezen kontroll patknyok kzl hrmat kzvetlenl a mtt utn, majd a

maradk 3-3 patknyt 1 rval illetve 24 ra elteltvel szven keresztl perfundltuk.

6.2.3. Szvettani feldolgozs

A szven keresztli perfzi utn 1 nappal az agyakat eltvoltottuk a

koponybl [29]. A glutraldehiddel fixlt agyak kzps 2/3-rszbl 150 m

vastagsg metszeteket ksztettnk frontlis skban metszve vibratom segtsgvel.

Minden tdik metszetet egy specilis ezstzsi eljrssal festettnk meg, amely

specifikus a stt idegsejtekre [59] s reproduklhat eredmnyt kpes nyjtani [103].

A mdszer alapjn a metszeteket felszll alkohol-sorban (1-propanol) vztelentettk,

majd 16 h-n t 56 C fokon 0,8 % knsavat s 2 % vizet tartalmaz l-propanol oldatban

inkubltuk (szterifikci). Ezutn a metszeteket rehidrltuk leszll alkohol sorban (1-

propanol), 10 percig 1 %-os ecetsavba helyeztk, majd egy specilis fizikai elhv

oldatba mertettk, amg vilgos barnv vltak.

Az elektronmikroszkpos szvettani feldolgozshoz 2x2 mm2-es darabokat

vgtunk ki a caudo putamen s temporlis cortex azon terleteirl, ahol az ezstzs

utn kompaktldott idegsejteket vagy axonokat tartalmaztak az elbb ismertetett

eljrssal megfestett metszetek. Ezeket a darabokat egy rn keresztl,

szobahmrskleten utfixltuk 2 %-os ozmium tetroxid s 3 %-os klium ferrocianid

47

1:1 arny keverkvel, ezutn Durcupan ACM-be gyaztuk, majd 1 m vastagsg

flvkony metszeteket ksztettnk. Ezeket a metszeteket 0,05 % toluidin kket, 0,05 %

ntrium-tetrabortot s 0,1 % szacharzt (pH 9,5) tartalmaz oldatba helyeztk 1 percre,

90 Celsius fokon. A metszetek toluidin-kkkel val festsvel azonostottuk a vizsglni

kvnt terleteket. Ezutn vkony (50 nm) vastagsg metszeteket ksztettnk,

amelyeket gridekre hztunk, majd 5%-os uranil-acetttal 2 percig s 0,5 %-os lom-

citrttal 1 percig kezeltk a metszetek kontrasztostsnak cljbl. Az ultrastrukturlis

vizsglatokat JEOL JEM 1200EX tpus transzmisszis elektronmikroszkppal

hajtottuk vgre.

A formaldehiddel fixlt agyak kzps 2/3-t paraffinba gyaztuk, majd 10 m

vastagsg szeltekre metszettk sznkamikrotm segtsgvel. Minden tizedik metszetet

0,1 %-os krezil ibolyval (oldszer: 0,01%-os ecetsav) vagy 1%-os savany fukszin

(oldszer: 0,01%-os ecetsav) oldattal festettk. Ezekbl a metszetekbl olyan

terleteket vlasztottunk ki az apoptzis vizsglathoz, amelyek az elbb emltett festsi

eljrsok sorn krosodott idegsejteket tartalmaztak. Az gy kivlasztott darabokat in

situ sejthall detektl (TUNEL) kereskedelmi forgalomban kaphat kit-el (Roche, Cat.

No. 11684817910) a termk hasznlati utastsa szerint feldolgoztuk s

fnymikroszkppal rtkeltk.

6.3. Eredmnyek

6.3.1. Fnymikroszkpos megfigyelsek

A filament eltvoltsa utn azonnal fixlt patknyokban a jobb oldali caudo

putamen nhny idegsejtjnek szma-dendrit domnje homognen ezstzdtt (18.

bra a). Ez volt megfigyelhet nhny piramis sejtnl is a jobb oldali temporlis cortex

terletn (19. bra a). Az 1, vagy tbb rt tllt llatoknl a natv, festetlen metszeten

megfigyelhet volt a krosodott (nekrotikus, excitotoxikus) terlet elhelyezkedse fzis-

kontraszt vizsglat alapjn (20. bra e). Az 1 napig tlltetett llatoknl ezen a terleten

a temporlis cortex szmos megduzzadt dendritet s asztrocita nylvnyt, tovbb

norml kinzet idegsejtet, oligodendroglit, pericitt s endothel sejtet tartalmaztak,

tovbb nhny stt idegsejtet. Egy, 4 s 24 ra tlls utn a krosodott

idegsejtek szmjban s dendritjei mentn mitokondrium mret ezst-gbk voltak

megfigyelhetk (18. bra b s 19. bra c), ami a regenerld stt idegsejtekre

jellemz tulajdonsg [35]. Egy ra tlls utn a nekrotikus terleten ill. 1 s 4 ra

tlls utn a temporlis cortex excitotoxikus terletn szmos olyan homognen-

48

ezstzdtt idegsejt figyelhet meg, amelyek szma-dendrit domnjeit nem lehetett

kln-kln megfigyelni (18. bra d; 19. bra b).

Egy ill. 2 nap tlls utn nhny stelltum illetve piramis idegsejtnl

megfigyelhet volt a szma homogn ezstzse, mg a dendritekben a

mitokondriumoknl nagyobb mret ezst-gbk lltak (18. bra c; 19. bra d), ami a

pusztul "stt" idegsejtek jellegzetes tulajdonsga [35]. Egy nap tlls utn a

krosodott terlet szli terletn (penumbra zna) ezstzd neuronlis elemek

tmr halmaza volt megfigyelhet (18. bra e). Ezeknl az llatoknl az ezstzs

utn mind pusztul, mind regenerld stt idegsejtek voltak thatk, klnsen az

excitotoxikus terlet perifrijn (19. bra e). Hat nap tlls utn csak nhny

fagocitl sejt jelenlte jelezte a mr elpusztult stt idegsejtek helyt (20. bra d).

Toluidin-kkkel homognen festdtek a frissen-kpzdtt stt idegsejtek magja,

citoplazmja s f dendritjei mind a temporlis cortex, mind a caudo putmen terletn

(21. bra a). Egy nappal ksbb a "stt" idegsejtek festdsnek intenzitsa megntt

(20. bra b). Kt napot tllt llatoknl viszont mr fragmentldsuk (20. bra c), mg

6 nap tlls utn pusztulsukat bizonyt fagocitk voltak megfigyelhetk (20. bra d).

TUNEL-pozitv sejtmagok a csak a nekrotikus terletek szli rszein voltak

megfigyelhetek, fleg az egynapos tlls utn (20. bra f).

49

18.bra: Ezstzdtt stt idegsejtek fnymikroszkpos kpei a caudo putamen

terletn az arteria cerebri media 1 rs elzrsa utn. Egy rs arteria cerebri media

elzrs utn azonnal perfundlt (a), 1 rt (b and d) vagy 1 napot (c s e) tllt llatok

szvettani kpei.

50

19.bra Ezstzdtt stt piramidlis idegsejtek a temporlis cortex terletn az

arteria cerebri media 1 rs elzrsa utn. Egy rs arteria cerebri media elzrs utn

azonnal perfundlt (a), 1 rt (b s c),1 napot (d) vagy 2 napot (e) tllt llatok

fnymikroszkpos szvettani kpei. A rmai szmok az rintett krgi rteget jelenti.

20.bra Toluidin-kkkel jellt stt piramidlis idegsejtek a temporlis kreg

terletn (ad), emelkedett fzis-kontraszt a caudo putamen nekrotikus terletein (e),

TUNEL-jellt sejtmagok a nekrotikus terlet szli terletn (f). Egy rs arteria

cerebri media elzrs utn azonnal perfundlt (a), 1 rt (b s e), 1 napot (c s f)

valamint 6 napot (d) tllt llatok fnymikroszkpos kpei.

51

6.3.2. Elektronmikroszkpos megfigyelsek

A filament eltvoltsa utn azonnal perfundlt llatoknl nhny

kompaktldott idegsejt volt megfigyelhet (20. bra a). Ezekben az ultrastrukturlis

elemek kztti tvolsgok drmai mrtkben lecskkentek, az ER ciszterni

sszeszkltek, mg a Golgi-appartus ciszterni kitgultak, a mitokondriumok mrete

vltozatlan maradt, az ER-ciszternkhoz nem-ktdtt riboszmk egymshoz-

kapcsoldott formban (poliriboszma) voltak jelen. A sejtmag szmos kismret

kromatin-gbt tartalmazott. Egy rs tlls esetben sok kompaktldott idegsejt volt

megfigyelhet. Ellenttben az azonnal perfundlt llatokkal, a riboszmk egymshoz

nem-ktdtt (sequestered) formban voltak jelen, s tbb, feltnen nagy

mitokondriumot tartalmaztak (21. bra b) a megnvekedett fzis-kontraszt terlet

kzelben.

Egyill. 4 ra tlls utn a kompaktldott idegsejtekben az ER ciszterni mr

normlis mretv alakultak vissza (22. bra a). Egy- ill. 2-napos tlls utn szmos

normlis kinzet idegsejt szmja s dendritjei mitokondrium-mret membrn-

rvnyt (whorl) tartalmazott (22. bra b,d,e). Ezek kzl nhny a szmt vagy a

dendritet ppen elhagyni ltszott (22. bra c,f). Ugyanezen a terleten nhny "stt"

idegsejt olyannyira kompaktldott, hogy a klnbz ultrastruktrs elemeket tbb

nem lehetett elklnteni egymstl s emellett sok, klnbz mret

membrnkitremkedst is tartalmazott. Mellettk glikognszemcsket tartalmaz,

duzzadt asztrocitk voltak megfigyelhetk. Kt napos tlls esetn a korbbi

membrnkitremkedsek membrnba csomagolt, kompakt s homogn

fragmentumokk alakultak t (23. bra a), amelyeket a 6-napot tllt llatokban

asztrocitk, vagy mikroglia sejtek rszben, vagy egszben fagocitltak (23. bra b,c). Az

1 napot tllt latokban a nekrotikus vagy excitotoxikus terleteken nhny "stt"

idegsejt mg kompaktabb s elektrondenzebb vlt, mg msok megduzzadtak, st -

rszben, vagy egszben sztzilldtak (24. bra ad). Ezen utbbi sejtek duzzadt

dendritekkel s glikognszemcsket nem tartalmaz asztrocitkkal voltak krlvve

(24. bra a, d). Kt ill. 6 nap elteltvel a "stt" idegsejtek a nekrotikushoz-hasonl

feldaraboldson mentek keresztl (24. bra e, f). A nekrotikus terletek szln lv,

kompaktldott-ultrastruktrj sejtekben - az 1-napot tllt llattoknl - a sejtmagok

nhny kerekded (apoptotikus) kromatin-gbt tartalmaztak (25. bra a, b). A 2 vagy

tbb napot tllt patknyokban az ilyen sejtek kzl nhny a nekrotikushoz-hasonl

fragmentldson mentek keresztl (25. bra c), mg msok membrnnal burkolt,

52

kompakt s homogn fragmentumokk estek szt, amelyeket glikogn-tartalm

asztrocita nylvnyok vettek krl. Ezeket mikroglia- vagy asztrocita-sejtek

fagocitltk (25. bra d, e).

21.bra: jonnan kpdtt kompaktlodott stt s nem kompaktldott idegsejtek

elektronmikroszkpos kpei a caudo putamen-ben azonnali perfzi (a) illetve 1 rs

tlls utn az arteria cerebri media elzrsa utn.

53

22.bra: Regenerld stt idegsejtek szmja s dendritjei a temporlis cortex-ben

(a, b s f) valamint a caudo putamen-ben (ce) 1rs (a), 1 napos (b, d s e) illetve 2

napos (c s f) tlls esetben.

23.bra A klnbz apoptotikus ton valeltvoltds p szveti krnyezetben a

caudo putamen (a s b) valamint a neocortex (c) terletn 2 napos (a) illetve 6 napos (b

and c) tlls esetben.

54

24.bra A temporlis cortex terletn lv stt idegsejtek nekrotikushoz hasonl

eltvolitdsnak klnbz fzisai excitotoxikus szveti krnyezetben. Egy rs (a), 1

napos (bd) illetve 2 napos(e s f) tlls esetben.

55

25.bra jonnan kpzdtt apoptotikus idegsejt (a s b), apoptotikus idegsejt

nekrotikushoz hasonli eltvoltdsa a caudo putamen nekrotikus szveti krnyezetben

(c), illetve apoptotikushoz hasonl eltvoltdsa a nekrotikus terlet szli rszn (d s

e). Egy napos tlls (a s b), illetve 2 napos tlls (ce) esetben.

6.4. Megbeszls, kvetkeztetsek

Az iszkmia a kerings elzrdst jelenti. Ez az ltalunk alkalmazott foklis

tranziens iszkmia esetben csak rszben valsul meg, mert a caudo putamenben a

nekrotikus terlet centrlis illetve perifris rszn, valamint a temporlis cortex

citotoxikus illetve viszonylag p szomszdos rszn ms-ms mrtkben cskken az

raml vr mennyisge [89]. Ezrt az a biokmiai kaszkd, amely az ultrastrukturlis

kompakcit elidzi, nagyban klnbzhet ezeken a terleteken. Ennek ellenre az

alapvet morfolgiai tulajdonsgok minden jonnan-kpzdtt stt" idegsejtben - gy

a caudo putamen stellatum sejtjeiben, mind a temporlis cortex piramis sejtjeiben -

megegyeztek. Megegyeztek tovbb az egyb noxk (mechanikus, elektromos,

hipoglikmis) ltal okozott stt idegsejtek morfolgiai kpvel. Mindebbl arra

kvetkeztethetnk, hogy a stt idegsejtek kpzdse egy inicil s egy vgrehajt

fzisbl ll. Az inicici mechanizmusa sokfle lehet, mg a vgrehajts mechanizmusa

fggetlen az inicil noxa milyensgtl, tovbb az rintett idegsejtek feno- ill. kemo-

56

tipustl. Ez a tny megersti a stt idegsejtek kpzdsi mechanizmusval

kapcsolatos korbbi elkpzelsnket.

A koponyatrauma s az elektromos sokk [35], tovbb a hipoglikmia [56]

hatsra kompaktldott (stt) idegsejtek egy hnyada regenerldik. Ennek

fnymikroszkpos jele az ezstzds szemcsss vlsa, majd eltnse; kezdeti

fzisnak elektronmikroszkpos jele az, hogy az ER ciszternk visszanyerik eredeti

trfogatukat, majd az egyb ultrastrukturlis elemek kztti tvolsg fokozatosan

normalizldik, kzben pusztul mitokondriumokbl membrn-rvnyek keletkeznek,

amelyek egy-kt nap mlva elhagyjk az idegsejteket. A klnflekppen elidzett

stt idegsejtek sejtbiolgiai azonossgra vonatkoz elkpzelsnket altmasztja az

a tny, hogy esetnkben ugyanezeket a regenercira-utal morfolgiai elvltozsokat

tapasztaltuk.

A koponyatrauma s az elektromos sokk tovbb a hipoglikmia hatsra

kompaktldott (stt) idegsejtek egy msik hnyada elpusztul. A nem-nekrotikus,

nem-excitotoxikus illetve nem-kontzis agyi terleteken ezen noxk hatsra

kompaktldott idegsejtek pusztul hnyada az apoptotikus sejtekhez hasonl mdon

(homogenizci, felszin-konvolci, fragmentci majd fagocitzis) tvoltdik el az

agyszvetbl, amint ezt esetnkben is tapasztaltuk. Ebbl arra kvetkeztethetnk, hogy

a stt idegsejtek nem nekrzis tjn pusztulnak el, amint ezt korbban gondoltk

azon az alapon, hogy a nekrotikus, a citotoxikus illetve a kontzis agyi terleteken a

stt idegsejtek a nekrotikus idegsejtekhez hasonl mdon (duzzads, diszintegrci,

diszperzi) tvoltdnak el az agyszvetbl. Minthogy az emltett fizikai noxk esetn

az ultrastrukturlis kompakci pillanatszer, az apoptotikus pusztulsi md is

elkpzelhetetlen. gy a stt idegsejteknek sajt pusztulsi mechanizmussal kell

rendelkeznik.

Esetnkben a nekrotikus krnyezetbe kerlt apoptotikus idegsejtek is a

nekrotikushoz hasonl mdon tvoltdtak el az agyszvetbl; apoptotikus eredetkre

csak a visszamaradt nagy kromatin-gbk utaltak. Azaz a nekrotikus krnyezet

rknyszertett egy nekrotikus eltvoltsi mechanizmust az apoptotikusan elpusztult

idegsejtekre. Ennek analgijra felttelezzk, hogy a nekrotikus krnyezet a nem-

apoptotikus s nem-nekrotikus (sajt) mechanizmussal pusztul stt idegsejtekre is

rknyszert egy nekrotikus eltvoltsi mechanizmust.

57

7. J EREDMNYEK SSZEFOGLALSA

7.1.

A kzpslyos centrlis folyadk perkusszis (CFP) modellel vgzett

ksrleteinkkel bizonytottuk, hogy a CFP utn 30 perccel i.c.v.-beadott 100 g PACAP

szignifiknsan cskkenti mind az APP, mind az RMO-14 immunopozitv axonok

denztst, azaz a PACAP-nak neuroporotektv hatsa van a TAI mindkt megjelensi

formja, az axonduzzads/ballonkpzds s az ultrastrukturlis kompakci esetben.

A PACAP neuroprotektv hatsa nem volt szignifikns a medilis hosszanti

ktegben. Magyarzatul szolglhat az, hogy ezen idegplya terletn az p axonok

tmrje s lefutsa ms, mint a kortikospinlis plya terletn, ahol a protektv hats

szignifiknsnak bizonyult.

Eredmnyeink altmasztjk a TAI impakt acceleris modellje esetben

tapasztaltakat, miszerint a PACAP hatkonyan cskkenti a maradandan krosodott

axonok szmt a koponyatrauma kvetkeztben kialakul intraaxonlis transzportzavar

s a neurofilament kompakci esetben.

7.2.

A Marmarou-fle impakt accelercis modellel vgzett ksrleteinkkel

bizonytottuk, hogy a koponyatrauma utn azonnal, vagy 30 perccel ksbb i.c.v.-

beadott 100 g L-2286 (egy jonnan kifejlesztett PARP-gtl) szignifiknsan cskkenti

mind az APP, mind az RMO-14 immunpozitiv axonok denzitst, mind a CSpT-ben

mind pedig az MLF-ben; azaz az L-2286-nak neuroporotektv hatsa van a TAI mindkt

megjelensi formja, az axonduzzads/ballonkpzds s az ultrastrukturlis kompakci

esetben.

Az APP-immunopozitv s RMO-14-immunopozitv axonok denzitsnak az

i.c.v.-beadott 100 g L-2286 hatsra val cskkense eltr mrtk volt. Ez a tny

arra utal, hogy a szban-forg axon-krosodsok heterogn jelensgek, klnbz

tengely-fonatokban klnbz valsznsggel aktivldnak.

Az i.c.v.-beadott 100g L-2286 neuroprotektv hatsa a magatartsvizsglatok

sorn is bizonytst nyert. Nevezetesen: a beam-balance teszt esetben szignifiknsan

javtotta a krosodott motoros funkcikat, valamint az emelt-kersztpall tesztben

szignifiknsan cskkentette a trauma utn gyakran fellp szorongs mrtkt.

58

7.3.

Az ltalunk alkalmazott foklis tranziens iszkmia esetben a stt idegsejtek

kpzdsre s morphologiai sajtossgaira vonatkoz j megfigyelsket tettnk.

Mindkt vizsglt agyterleten (caudo putamen centrlis illetve perifris rsze,

valamint a temporlis cortex citotoxikus illetve viszonylag p szomszdos rsze) a ms-

ms mrtkben cskken vrtramls ellenre az alapvet morfolgiai tulajdonsgok

minden jonnan kpzdtt stt" idegsejtben azonosak voltak. Megegyeztek tovbb

az egyb kros behatsok (mechanikus, elektromos, hipoglikmis noxa) ltal okozott

stt idegsejtek morfolgiai kpvel.

Mindebbl arra kvetkeztethetnk, hogy a stt idegsejtek kpzdse egy

inicil s egy vgrehajt fzisbl ll. Az inicici mechanizmusa sokfle lehet, mg a

vgrehajts mechanizmusa fggetlen az inicil noxa milyensgtl, tovbb az rintett

idegsejtek feno- ill. kemo-tipustl. Ez a tny megersti a stt idegsejtek kpzdsi

mechanizmusval kapcsolatos korbbi elkpzelsnket.

59

8. AZ RTEKEZS ALAPJT KPZ PUBLIKCIK

1. Kvesdi, E.; Tams, A.; Regldi, D.; Farkas, O.; Pl, J.; Bukovics, P.; Dczi, T.;

Bki, A. Posttraumatic administration of pituitary adenylate cyclase-activating

polypeptide in central fluid percussion injury in rats. Neurotox. Res.

2008,Apr;13(2):71-8 If.: 2,828

2. Kvesdi, E.; Bukovics, P.; Besson, V.C.; Pl, J.; Nyirdi, J.; Lckl, J.; Smegi, B.;

Dczi, T.;Herndi, I. and Bki, A. A Novel PARP Inhibitor L-2286 in a Rat Model of

Impact Acceleration Head Injury: An Immunohistochemical and Behavioral Study. Int J

Mol Sci. 2010 Mar 26;11(4):1253-68.If.: 1,387

3. Kvesdi E., Pl J., Gallyas F. The fate of dark neurons produced by transient focal

cerebral ischemia in a non-necrotic and non-excitotoxic environment: neurobiological

aspects. Brain Res. 2007 May 25;1147:272-83. If.: 2,296

sszestett impakt faktor: 6,511

60

9. EGYB EREDETI KZLEMNYEK

1. Lckl J, Farkas O, Pl J, Kvesdi E, Czeiter E, Szellr D, Dczi T, Komol