Histološka i histohemijska bojenja

doc. dr Mirela UkropinaKatedra za biologiju ćelija i tkiva

Šta nas čeka...

� Priprema tkiva u histologiji� Histohemija i citohemija

� Hemijski sastav histoloških preparataHemijska osnova bojenja� Hemijska osnova bojenja� Bazne i kisele boje� Aldehidne grupe i Šifov reagens

� Enzimska digestija; enzimska histohemija� Imunohistohemija – IHC� Autoradiografija; historadiografija

Histologija

� Nauka o tkivima� Struktura – funkcija

� Organi, tkiva, ćelije – korelisati strukturu sa funkcijom� SM, TEM� 2D – 3D

Priprema tkiva

� Paradoks – živo vs. mrtvo� Rutinski pripremljeni preparati bojeni H&E

� Fiksacija - metabolizam, struktura (formalin)� Ispiranje� Ispiranje� Dehidratacija – izvlačenje vode (alkoholi, 30-100%)� Ksilol – uklanjanje alkohola� Kalupljenje, parafin (tečan-čvrst)� Sečenje – mikroskopski preseci� (Bojenje)

Bukalna sluzokoža

Priprema tkiva (cont.)

� Parafinski preseci su bezbojni� Izvlačenje parafina (ksilol)� Rehidratacija (alkoholi,100-70%), voda� Hematoksilin – rastvoren u vodiHematoksilin – rastvoren u vodi� Eozin (rastvoren u alkoholu ili vodi)� Alkoholi, ksilol, montiranje DPX – trajni preparat

� Montiranje u nevodenom medijumu da bi se sprečio gubitak boje

Hematoksilin Eozin H&E

Drugi fiksativi, metode bojenja

� H&E – opšta histološka graña, ali ne hemijski sastav ćelija

� Mnoge komponente izgubljene tokom pripreme � Mnoge komponente izgubljene tokom pripreme preparata (alkoholi i ksiloli uklanjaju neutralne lipide→)

Lipidi

Oil Red Osmium tetroxide

H&E

Elastična vlakna

� Resorcin-fuksin

Retikularna vlakna

� impregnacija srebrom aksoni

limfni čvor periferni nerv

Hemijska osnova za mnoge metode bojenja nije poznata! Ali one rade!!

Histohemija i citohemija

� Specifične hemijske procedure daju informacije o funkciji ćelija i vanćelijskih komponenti tkiva

� Procedure zasnovane na� Procedure zasnovane na� Specifičnom vezivanju boje� Inherentna enzimska aktivnost ćelijske komponente� Upotrebi (fluorescentno) obeleženih antitela

� Još i: autoradiografija i historadiografija

Hemijski sastav histoloških preparata

� Razlikuje se od živog tkiva� Posle fiksacije preostaju mahom veliki molekuli

koji se nerado rastvaraju, naročito u koracima koji se nerado rastvaraju, naročito u koracima koji slede nakon fiksativa

� Oni čine strukturu ćelija i tkiva, organizaciju vidljivu mikroskopom

Hemijski sastav histoloških preparata

� Nukleoproteini (nukl. kis. vezane za proteine)� Unutarćelijski citoskeletni proteini, kompleksovani

sa drugim proteinima� Vanćelijski proteini u velikim nerastvorljivim � Vanćelijski proteini u velikim nerastvorljivim

agregatima, unakrsno povezani sa susednim sličnim molekulima, kolagena vlakna

� Membranski fosfolipid-protein (ili ugljenohidratni)

kompleksi

� Struktura – funkcija� Proteini – vidljivi kontraktilni filamenti mišićne ćelije –

učestvuju u kontrakciji� RNK u citoplazmi motoneurona – Nislova tela –

sinteza proteinasinteza proteina

� Gube se tokom rutinske pripreme preparata� Mali proteini, male nukleinske kiselina (tRNK)� Veliki molekuli – glikogen (unutar), proteoglikani i

GAG (van)GAG (van)� Rastvorljive komponente, joni, mali molekuli

(intermedijarni metaboliti, glukoza, Na, Cl..) –učestvuju u ćelijskom metabolizmu – ne čine formirane elemente tkiva

Hemijska osnova bojenja

� Kisele i bazne boje� Kisele boje - negativno naelektrisan obojeni

deo [Na+boja-] (eozin) � Bazne boje - pozitivno naelektrisan obojeni deo � Bazne boje - pozitivno naelektrisan obojeni deo

[boja+Cl-] (hematoksilin striktno govoreći nije bazna boja, ali ima osobine koje podsećaju na baznu boju)

� Bazne boje� Metil zeleno (zeleno)� Metilensko plavo (plavo)� Pironin G (crveno)� Toluidin plavo (plavo)

� Kisele boje� Kiseli fuksin (crveno)� Anilin plavo (plavo)� Eozin (crveno)� Oranž G (narandžasto)

Bazne boje (+)

� Reaguju sa anjonskim komponentama ćelija i tkiva (-)

� Fosfatne grupe nukleinskih kiselina� Sulfatne grupe GAG

Karboksilne grupe proteina� Karboksilne grupe proteina

� Bazofilija – sposobnost anjonskih grupa iz tkiva da reaguju sa baznim bojama; strukture koje se boje baznim bojama su bazofilne

� Mali broj tkivnih struktura pokazuje bazofiliju� Heterohromatin i nukleolus, citoplazma bogata ribozomima,

vanćelijski ugljeni hidrati

Bazne boje (+)

� Reakcija anjonskih grupa zavisna je od pH� pH 10: sve tri grupe jonizovane i interaguju sa baznim

bojama� pH 5-7: sulfatne i fosfatne grupepH 5-7: sulfatne i fosfatne grupe� pH <4: samo sulfatne grupe

� Bojenje na specifičnom pH vizualizuje odreñene anjonske grupe, karakteristične za odreñene makromolekule

Hematoksilin

� Nije bazna boja, striktno gledajući� Hematoksilin→Hematein� Koristi se sa mordantom (štavilom) –

intermedijarni link izmeñu tkiva i boje, i on čini intermedijarni link izmeñu tkiva i boje, i on čini da hematoksilin podseća na baznu boju (Al, Fe)

� Harisov, Majerov..

Metahromazija

� Neke bazne boje reaguju sa komponentama tkiva koje menjaju njihovu normalnu plavu obojenost u crveno/ljubičasto

� Toluidin plavo� Toluidin plavo

Metahromazija

� Zbog prisustva polianjona u tkivima, molekuli boje formiraju polimerne agregate – različita apsorpciona svojstva od monomera boje

� Jonizovane sulfatne i fosfatne grupe u tkivima � Jonizovane sulfatne i fosfatne grupe u tkivima (granule mastocita-heparin, osnovna supstanca hrskavičavog tkiva)

Kisele boje (-)

� Reaguju sa katjonskim komponentama ćelija i tkiva (+)

� Jonizovane amino grupe proteina

� Acidofilija – sposobnost katjonskih grupa iz tkiva � Acidofilija – sposobnost katjonskih grupa iz tkiva da reaguju sa kiselim bojama;strukture koje se boje kiselim bojama su acidofilne

� Bojenje kiselim bojama je manje specifično i precizno nego bojenje baznim bojama

� Citoplazmatski filamenti, citoplazma, većina vanćelijskih vlakna (amino grupe) – više tkivnih komponenti pokazuje acidofiliju

Trihromno bojenje

� Tri kisele boje – metod za vezivno tkivo� Kiseli fuksin (Mallory)/azokarmin (Heidenhain's AZAN)

(citoplazma) � Anilin plavo (kolagen, ali i hrskavica, mukus)� Orange G (eritrociti)

� Veličina molekula boje, permeabilnost/kompaktnost tkiva

Aldehidne grupe i Šifov reagens

� Izbeljeni bazni fuksin (Šifov reagens) reaguje sa aldehidnim grupama dajući specifično crveno/magenta obojenje

� PAS (Periodic Acid Schiff) metod – ugljeni � PAS (Periodic Acid Schiff) metod – ugljeni hidrati i makromolekuli bogati njima

� Glikogen, mukus, podepitelske lamine

Bazalna membrana – PAS

H&E PAS

AB-PAS Neutralan vs. kiseli mukus

BPB Proteini

� Pedomorfan Lissotriton vulgaris, 40x

Enzimska digestija

� Dva uzastopna tkivna preseka� Pretretman diastazom ili amilazom, PAS – ne boji se glikogen� PAS

Enzimska histohemija

� Za lokalizaciju enzima u tkivnim presecima� Vizualizuje se produkt enzimske aktivnosti, a ne sâm

enzim� Boja ili teški metal vezuje produkt reakcije enzima –

precipitacijaprecipitacija� Lizozomi – olovo fosfat nastaje dejstvom kisele fosfataze –

SM i EM� ATPaza, Na/K ATPaza..

Imunohistohemija - IHC

� Antigen – antitelo afinitet, specifična reakcija

� Vertebrati mogu da se brane od makromolekula poreklom iz drugih organizama, antigenaporeklom iz drugih organizama, antigena

� Limfni čvorovi: B limfociti, plazmociti, antitela� Antigen-antitelo kompleks, nekovalentne interakcije� Deo antigenog molekula koji ga spaja sa antitelom –

antigena determinanta, epitop� Unakrsna reaktivnost (cross-reactivity) – slični proteini

mogu imati isti epitop

Imunohistohemija - IHC

� Antitela – imunoglobulini

� Dva mesta vezivanja za antigenu determinantu – Fabantigenu determinantu – Fab� Fc fragment – identičan za sva antitela jedne živ. vrste� Ig su makromolekuli, ponašaju se kao antigeni kada se injektiraju u životinju druge vrste

Struktura IgG molekula

Imunohistohemija - IHC

� Bočni lanci aminokiselina antitela mogu sekonjugovati sa drugim komponentama� Fluorescentna supstanca, fluorohrom → imunofluorescenca� Enzimi → imunoenzimološko bojenje / enzimska IHC� Enzimi → imunoenzimološko bojenje / enzimska IHC� Koloidno zlato → imunocitohemija, EM

Enzimska IHC � Antitela konjugovana sa enzimima

� peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza (AP)

� Supstrat� DAB (diaminobenzidin, braon), AEC (3-amino-9-ethyl-

carbazole, crveni precipitat) ...carbazole, crveni precipitat) ...

Enzimska IHC � U zavisnosti od tipa procedure

� Direktno bojenje� Indirektno bojenje

� Biotin (organski obelež.), detektuje se avidinom (glikoprotein) koji je obeležen enzimima (ili fluorohromama)koji je obeležen enzimima (ili fluorohromama)

Insulin Ki67

LSAB IHC metod

Propidijum jodid - apoptoza

� Tkiva bojena ne-jonskim bojama montiraju se vodenim medijumom

Autoradiografija

� Mali molekuli, prekursori većih – aminokiseline, nukleotidi – mogu se obeležiti radioaktivnim atomima (inkorporiraju se)

� Injektiraju se u životinju ili unesu u kulturu ćelija, uključuju se u sintezu proteina, nukleinskih uključuju se u sintezu proteina, nukleinskih kiselina...sekrecija, deoba

� Preseci tkiva uranjaju se u fotografsku emulziju, razvijaju standardnim fotografskim tehnikama, mogu se i obojiti, montiranje

� Partikule srebra u emulziji iznad radioaktivno obeleženih molekula – crne granule

� [3H] timidin – sinteza DNK

limfni čvor

Historadiografija

� Mineralizovano tkivo� Brušena kost, fotografska emulzija na mikroskopskoj

pločici, x-zraci� Fotografska emulzija se razvije i gleda pod mikroskopom

mineralizovano tkivo

meko tkivo

Summa summarum

� Bojenje – vizuelno obeležavanje nekog entiteta vezivanjem, ili taloženjem u njegovoj blizini, markera karakteristične boje ili oblika

� Cilj – dati tkivu bojeni kontrast� Cilj – dati tkivu bojeni kontrast� Boja – obojena supstanca, marker, ili reagens

korišćen da bi se stvorio marker

� Bojenje bojama� Prirodne ili veštačke (sintetičke, anilinske – benzenov

prsten)� Jedarne ili citoplazmatske

Direktno ili indirektno (štavilo – obojenost tkiva

Glavne procedure bojenja u histologiji

� Direktno ili indirektno (štavilo – obojenost tkiva stabilnija, boja jače vezana za tkivne komponente)

� Fizički, hemijski mehanizmi ili kombinacija� Boja-tkivo interakcije

� Elektrostatičke veze, Van der Valsove sile, vodonične veze, kovalentne veze� Prosta rastvorljivost (lipidna tela obojena bojama rastvorljivim u mastima)

� Boja-boja interakcije� Molekuli boje se privlače – agregati; metahromazija

� Produkcija obojenog hemijskog jedinjenja� Bezbojan rastvor reaguje sa komponentama tkiva i

produkuje obojenu supstancu� Prava boja (Šifov reagens)

Glavne procedure bojenja u histologiji

� Obojeni produkt koji nije boja (imunohistohemijske metode)

� Impregnacija metalima � retikularna vlakna

� Vitalno bojenje

Glavne procedure bojenja u histologiji

India ink & H&E Trypan Blue & Safranin & Orange G