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1
Dia do INSAA Referência: Função essencial do INSA
Hemoglobinopatias:
contributo da Genética Molecular
João GonçalvesUnidade de Genética Molecular – Lisboa
Departamento de Gené[email protected]
UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
Unidade de
Citogenética
Unidade de Genética Médica
Unidade de Genética Molecular
Unidade de Rastreio Neonatal
Unidade de Investigação e
Desenvolvimento
Núcleo de Apoio
Unidade de Bioquímica
Genética
Unidade de Tecnologia e
Inovação
UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)
Lab.Lisboa
João Gonçalves
Lab. Porto
Rosário Santos
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
2
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
Departamento de Promoção da Saúde e Doenças Crónicas
> HemoglobinopatiasUnid. Lab. de Referência
Departamento de Genética
� UnidUnid de Gende Genéética Molecular tica Molecular LisbLisb..� …� Hemoglobinopatias
(Genética Molecular)� …
> Médico Solicita Análise <Hospital – Serviço Hematologia
Serviço Genética
Centro DPNLab. Análises Clínicas
Cons. Privado
? Identif. Molecular HB variante? Identif. Molecular Talassémia
> Portador <> Doente <
> Casal em Risco, DPN <>>> Avaliação Hematol. e Bioq.<<<
Cooperaç
ão/
partilh
a de r
esulta
dos e
de co
nhecim
ento
s
Cooperação/
partilha de resultados e
de conhecimentos
Cooperação/partilha de resultados e
de conhecimentos
Cooperação/
partilha de resultados e
de conhecimentos
Cooperaç
ão/
partil
ha de r
esulta
dos e
de co
nhecim
ento
s
Departamento de Genética
Unidade de Investigação e Desenvolv.
> Grupo de Investigação em hemoglobinopatias e metab.
Ferro
Contributo da Genética Molecular integra-se no
Programa Nacional de Controlo das hemoglobinopatias
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Prevalência de portadores de beta-talassémia na pop. Portuguesa
Prevalência de portadores de hemoglobina S na pop. Portuguesa
Martins MC et al (1993) Hereditary anaemias inPortugal: epidemiology, public health
significance, and control. J Med Genet 30:235-239.
(15208 indivíduos ♂: ββββtal:0,45%; HbS: 0,32%)
Base Científica
para o Programa Nacional de Controlo
das Hemoglobinopatias, 1986 (PNCH)⇒ Cooperação com a OMS⇒ Coordenação do INSA
DGS: Circ Norm Nº 18/DSMIA de 07/09/2004
Objectivos:- Prevenção
> Diagnóstico > Idef. Casais em risco> Aconselhamento Genético
> DPN molecular
- Tratamento
- Investigação
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Prevalência de portadores de hemoglobinopatia β em Portugal
HbS
β-Talassémia
Inez et al, Arq INSA 1993, 19:27
“Bolsas” de alta prevalência:
5-10%
População (2006): 10,9 x 106
Nascimentos (2007): 102 x 103
Prevalência (global)
de portadores: 1-2%
Incidência:
5-10 casos/ano
SS,
Sβ-Tal,
β-Talβ-Tal
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183388956Total
30(16.4%)
9147Talassémia
15(8.2%)
177Tal-Drepanocitose
138 (75,4%)
286842Drepanocitose
TotalAfectadoPortadorNormalDoença
DPN de Hemoglobinopatias de 1990 a Set2009
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εεεε Gγγγγ Aγγγγ ϕϕϕϕβ β3’
δ5’
Agrupamento génico da β β β β globina (11p15.5)
Gene: HBB5’ 1
pb 93 222 126
3’2 3130 850
Cd 1 30 31 104 105 146
CD 6: GAG>GTG
(c.20A>T)
p.Glu6Val ⇒⇒⇒⇒ Hb S
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Diagnóstico molecular de Drepanocitose - Metodologias
2. BI-PASA (PCR bidireccional específica de alelo)
M
N
Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val)
AA AA SS AS AA
800 pb
N
C
500 pb300 pb
C
M
1. PCR e Restrição Enzimática(Bsu 36 I)
controlos
AS SS AS SS AS AA
Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val)
390 pbDig. Bsu 36 I:
Mutação : 390 pbAlelo Normal: 213 e 177 pb
M
N
f m f
Análise Molecular: - Amostras de DNA dos pais (SE; casal PNCH)- DNA fetal analisado em duplicado (LA; VC)- Dois métodos de análise molecular (independentes). - Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio
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Sequenciação automática
de fragmentos de DNA obtidos por PCR
(c.20A>T)
p.Glu6Val ⇒⇒⇒⇒ Hb S
GAG>GTG
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DPN de Drepanocitose
pai mãe feto feto C. Neg MPM
Pesquisa de contaminação materna no DNA fetal: VNTR (DXS52)
Portador de Hb S Portadora de Hb SMutação: c. [20A>NT] + [=]
(p.Glu6Val)
Mutação: c.20A>T (p.Glu6Val)
c.[20A>T] + [20A>T]
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Feto não possui alelo c materno
abc
Mutação: c. [20A>NT] + [=]
(p.Glu6Val)
UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)
Análise Molecular: - Amostras de DNA dos pais (SE; casal PNCH)- DNA fetal analisado em duplicado (LA; VC)- Dois métodos de análise molecular (independentes). - Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio
6
Natural de S. Tomé e PríncipeC/ Anemia (Hb A2:3,6%; Hb S: 35%)Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatiaSangue materno (enviado para Lab Hematologia (PNCH))
Não foi possível fazer o estudo do marido desconhecendo-se se tem anemia.
Pai inacessível.
LA; Gestação de 16 semanas
?
?
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DPN de Drepanocitose
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Análise Molecular: - Amostras de DNA dos pais (SE; casal PNCH)- DNA fetal analisado em duplicado (LA; VC)- Dois métodos de análise molecular (independentes). - Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio
Feto: Heterozigótico composto para as mutações
HBB:c.19G>A (HbC); p.Glu6Lys e HBB:c.20A>T (HbS); p.Glu6Val
HbC
HbS
Natural de S. Tomé e Príncipe(Hemog: 11,3 g/dL; VGM: 86,0 fL; HGM: 28,9 pg)Hb F: 2,0%; Hb C:38,0%)Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatia
Não foi possível fazer o estudo do marido desconhecendo-se se tem anemia.
Inacessível
LA; Gestação de 16 semanas: Afectado – Hb SC
?
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UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)
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Confirmação hematológica e bioquímicaPortador de Hb S
Confirmação hematológica e bioquímicaPortadora de Hb S
Despiste de contaminação materna do DNA fetal
(VNTR)
f P M f CN MP
DPN Análise Molecular: - Amostras de DNA dos pais. - DNA fetal em duplicado.- Dois métodos de análise molecular (independentes).- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)- Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
Mutação: c. [20A>NT] + [=]
?
p1
p2
m
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feto
Pai
mãe
Feto: 6/9 alelos não se encontram no (pai)
STR
D3S13
58AMG
X
AMG
Y
D5S81
8
vWA12
p12
D21S11
D13S317
FGA 4
q28
D7S82
0
D18S51
D8S11
79
UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)
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Confirmação hematológica e bioquímicaPortador de Hb S
Confirmação hematológica e bioquímicaPortadora de Hb S
Despiste de contaminação materna do DNA fetal
(VNTR)
f P M f CN MP
DPN
Análise Molecular: - Amostras de DNA dos pais. - DNA fetal em duplicado.- Dois métodos de análise molecular (independentes).- Pesquisa de contaminação materna do DNA fetal (VNTRs)
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
Mutação: c. [20A>NT] + [=]
?
p1
p2
m
UMOL_2009.09.29 _ Dia do INSA (J.G.)
??
Sequenciação completa
do gene HBB
Portador de Hb S Portadora de Hb S
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
?
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Diagnóstico e prevenção de hemoglobinopatia
Portador População Caso-índice
História familiarRastreio
(doentes e portadores)
STOPRastrear parceiro
Portador?
NS
STOP N AconselhamentoS
DPN? STOPNSAmniocentese ou
biópsia do córion
Afectado?STOP N SIVG?
S
STOP
N
IVG
DPN-LAB
LAB
LAB
LABLAB
Doente?
Portador?
H em oglobinopatias : contributo da G enética M olecular
Lab./Unidade Genética Molecular - Qualidade/ReferênciaDPN de Hemoglobinopatia
- Recepção de produtos Biológico (colheitas)
> Registos
- Extracção de DNA (diferentes métodos)
> Dif. produtos biológ. (SP; LA; Vil.)
- Diferentes métodos de análise
> PCR - Dig. enzimática
> BI-PASA
> ARMS
> Sequenciação
- Leitura e Interpretação dos resultados por TDT e TSS
- Registo de resultados
- Validação final/global dos resultados
- Elaboração de relatórios directivas internacionais
- Participa em ensaios de avaliação externa da qualidade
Validação
interna dos
resultados
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Lab.
Referência
?
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- Experiência e o conhecimento acumulado ao longo dos anos necessário à função referência
- Frequência regular de cursos/acções de formação específicas patologia no âmbito da AEQ
- AcreditaAcreditaçção do Laboratão do Laboratóório/ensaios especrio/ensaios especííficos de determinado teste genficos de determinado teste genéética moleculartica molecular
- Utilização de métodos/ensaios validados; Validação interna de resultados
- Participação em reuniões internacionais de AEQ onde se estabelecem as directivas/recomendações UE
- Participação em exercícios de avaliação externa da qualidade (UK NEQAS; 2002)
- Formação no âmbito das actividades de prestação de serviços a profissionais de saúde e ensino Sec. Sup.
- Colaboração próxima com laboratório de nível 2 que permite resolver casos complexos
- Actuação como consultor/licenciamento Lab. para a validação de testes genéticos > Lab nível 2
- Colabora em investigação no âmbito do diagnóstico molecular em causa > Lab nível 2
- Organiza cursos/congressos AEQ/acções de formação de boas práticas laboratoriais a nível nacional >Ln2
H em oglobinopatiasH em oglobinopatiasH em oglobinopatiasH em oglobinopatias :Contributo da G en:Contributo da G en:Contributo da G en:Contributo da G en éééética M oleculartica M oleculartica M oleculartica M olecular - Função Referência
AcreditaAcreditaçção do Laboratão do Laboratóório/ensaios especrio/ensaios especííficos de determinado teste genficos de determinado teste genéética moleculartica molecular
> Estabiliza> Estabilizaçção das equipas; solucionar necessidades de pessoalão das equipas; solucionar necessidades de pessoal
> Reorganiza> Reorganizaçção de espaão de espaçços/obras (cumprir directivas internacionais)os/obras (cumprir directivas internacionais)
> Repara> Reparaçção de equipamento/substituião de equipamento/substituiçção equipamento obsoletoão equipamento obsoleto
> Actualiza> Actualizaçção dos procedimentos; Impressos e Instruão dos procedimentos; Impressos e Instruçções trabalho ões trabalho
> Operacionalidade do Programa Inform> Operacionalidade do Programa Informáático tico
> Aquisi> Aquisiçções de consumões de consumííveisveis
Prioridade