1

Hemaglutinacija za određivanje krvnih grupa

2

Bakterijska aglutinacija

Koliki je titar protutijela

za analizirane serume?

3

4

Pasivna aglutinacija

•aglutinacija prilagođena za detekciju topivih antigena

•na površinu eritrocita se adsorbira inače topivi antigen

•puno osjetljivija od reakcije precipitacije

•umjesto eritrocita – sintetske kuglice (npr. lateks) – brzo očitavanje (3-5 min), lako vežu

antigene, same su neantigenične

Pasivna aglutinacija na stakalcu – test za dokazivanje reumatoidni faktora (protutijela na

vlastite IgG molekule) u serumu bolesnika s reumatoidnim artritisom

IgG molekule (antigen) vezane na čestice lateksa

normalni serum aglutinacija – serum bolesnika

5

Coombsov test

hemolitička bolest novorođenčadi

6

Inhibicija aglutinacije – dijagnostika gripe

• testira se protutijelo (u serumu pacijenta)

• dijagnostika gripe

7

Inhibicija aglutinacije

Kako može doći do lažno pozitivne reakcije?

• testira se antigen (u urinu ili uzorku krvi)

• detekcija upotrebe nedopuštenih tvari (npr.

kokain, heroin ...)

Što je antigen (vezan na čestice)?

8

Inhibicija aglutinacije - test za rano otkrivanje trudnoće

• testira se antigen (humani korionski

gonadotropin u urinu žene)

9

10

Radio-imuno test (na čvrstoj fazi)

• razvijen 1960. – određivanje konc. inzulina u plazmi

• endokrinolozi Berson i Yalow

• Nobelova nagrada 1977.

• princip RIA – kompetitivno vezanje radioaktivno-označenog

antigena i neoznačenog antigena (koji se testira)

na protutijelo visokog afiniteta

Detekcija hepatitis B virusa u uzorcima krvi

koncentracija neoznačenog antigena

% o

znač

enog

ant

igen

a ve

zano

g za

ant

i-HBs

Ag

Imunotestovi

• molekule protutijela su visoko-specifične za odgovarajuće antigene –

mogu detektirati 1 molekulu proteinskog antigena između 100.000.000

sličnih molekula

• razvijen je čitav niz senzitivnih i visoko specifičnih tehnika kojima se mjeri

njihovo prisustvo

12

ELISA – enzimski imunotest na čvrstoj fazi

(enzyme-linked immunosorbent assay)

• Jeli se određuje antigen ili protutijelo?

• Jeli je kvalitativna ili kvantitativna metoda?

13

ELISA

• Kvalitativna ELISA: pozitivni / negativni rezultat (unaprijed određena granica)

• Kvantitativna ELISA: standardna krivulja apsorbancije serijskih razrijeđenja testirane molekule poznatih razrijeđenja

Omogućava brzo testiranje prisustva i kvantifikaciju specifičnih molekula (antigena ili

protutijela) u uzorku

Upotreba:

• detekcija prisutnosti različitih infektivnih bolesti (npr. u ljudi Salmonella, E. Coli,

ospice, gripa, HIV; u životinja: Trichinella u svinja i bruceloza u goveda)

• Testovi na trudnoću

• Testiranje na prisutnost određenih droga, lijekova

• Testiranje alergena

ELISA

15

Mikrotitarske pločice za enzimski imunotest na čvrstoj fazi • razne plastike (polivinil, polistiren) imaju svojstvo da na svojoj površini adsorbiraju

monomolekulske slojeve proteina

16

Osnovni princip ELISA - direktna ELISA

antigen protutijelo s vezanim enzimom

bezbojni supstrat

obojeni produkt

označeno protutijelo vezano za antigen

17

ELISA

ENZIMI – konjugirani s protutijelom

– alkalna fosfataza – peroksidaza hrena – β – galaktozidaza

SUPSTRATI

– kromogeni - spektrofotometar – luksogeni (ELISA s kemiluminiscencijom) – luminometar

• količina obojenog produkta koji nastaje mjeri se pomoću specijalnih

spektrofotometrijskih čitača pločica koji mjere apsorbanciju svih bazenčića u vrlo

kratkom roku (nekoliko sekundi)

18 Lehninger, str. 181

Indirektna ELISA – koristi se češće od direktne

Detekcija prisustva antigena

? npr. kazein iz mlijeka, goveđi albumin

19 Lehninger, str. 181

Indirektna ELISA – koristi se češće od direktne

Detekcija prisustva serumskih protutijela protiv HIV-a ---- ŠTO JE TADA ANTIGEN?

20

ELISA

21

Sandwich ELISA – za detektiranje antigena

Indirektna ELISA Indirektna sandwich ELISA

Imobilizacija antigena (vezanje za površinu bazenčića) – nespecifično u indirektnoj ELISA-i

I – plastična površina

Ag - antigen

Ab – protutijelo specifično za antigen

anti-Ab – protutijelo dobiveno u drugoj vrsti specifično za protutijelo Ab

AB – protutijelo dobiveno u drugoj životinjskoj vrsti specifično za isti antigen (ali različite epitope)

anti-AB – protutijelo dobivenoj u drugoj vrsti specifično za protutijelo Ab ili AB

W – ispiranje E – enzim S – kromogeni supstrat

Praktikum !!