DOI: 10.1074/jbc.M111.330100 Code: 4A94 GP4, PL3

Fonte Biológica

›Inibidor de Carboxipeptidases de caracol marinho - espécie Nerita versicolor

›Carboxipeptidase – origem humana, homo sapiens

Metalocarboxipeptidase - MCP

EC: 3.4.17

› 3. Hidrolase

› 3. 4. Peptidase

› 3.4.17. Metalocarboxipeptidase

CPA 3 – Digestão das proteínas pelos mastócitos CPA 4 - Envolvido na progressão tumoral CPA 5 – Não é bem estudada CPA 6 – Presente na matriz extracelular onde é ativa

human carboxypeptidase A4 – hCPA4

Atividade

Exopeptidase: quebra as ligações peptídicas entre

os aminoácidos na região C-terminal.

Envolvida em processos como:

›Digestão

›Coagulação/Fibrinólise do sangue

›Inflamação

›Processamento de prohormonas e neuropéptidos

›Progresso de alguns cancros

Inibição

Localização biológica:

Inibidores já estudados:

› PCI – potato carboxypeptidase inhibitor de Solanum tuberosum › LCI – leech carboxypeptidase inhibitor de Hirudo medicinalis › TCI – tick carboxypeptidase inhibitor de Rhipicephalus bursa › ACI – Ascaris carboxypeptidase inhibitior de Ascaris suum

Pequeno tamanho

(39-75 resíduos)

Estabilização por pontes de

dissulfito

Nerita Versicolor carpoxypeptidase inhibitor - NvCI

› 53 resíduos de aminoácidos

› Composto por 2 folhas b anti-paralelas, ligadas por 3 loops

› Cauda C-terminal inibitória

› Estabilização por 3 pontes de dissulfito.

› Liga-se fortemente a M14A – subfamília das carboxipeptidases

bCPA1 – bovine carboxypeptidase A1

CPA1 – human carboxypeptidase A1

hCPA4 – human carboxypeptidase A4

Inibição bastante eficiente relativamente a outros inibidores

exógenos

Objetivo:

Caraterizar estruturalmente o NvCI e o complexo formado quando se liga à hCPA4

Estudar o seu modo de atuação numa subfamília de carboxipeptidases

Comparar atividade com outros inibidores já estudados

Procedimento Experimental

1. Expressão e Purificação de NvCI recombinante

2. Expressão e Purificação de hCPA4 recombinante

3. Formação e Purificação do complexo NvCi – hCPA4

4. Cristalização e Organização dos dados

5. Determinação da estrutura e Refinamento

6. Determinação das constantes de inibição

Produção de NvCI recombinante

Sequência de aminoácidos

Degradação de Edman e

MALDI-TOF-MS

Concentração da proteína no

sobrenadante

Método BCA e atividade

inibitória contra bCPA1

O resíduo N-terminal é marcado e clivado, deixando intactas todas as outras ligações peptídicas

Técnica de ionização usada em espetrometria de massa, permitindo a análise de biomoléculas que se fragmentam quando ionizadas por métodos convencionais.

Semelhante ao método de Lowry no entanto o reagente – ácido bicinchonínico - é mais estável em condições alcalinas.

Purificação do NvCI recombinante

Combinação de dois processos de cromatografia de troca iónica:

Pureza do NvCI recombinante determinada pela sua massa molecular, obtida por:

›MALDI-TOF-MS

›Tris/Tricina/SDS-PAGE

›Atividade funcional contra bCPA1

As proteínas movem-se através da coluna a velocidades determinadas pela sua carga efetiva e pelo pH a ser usado

Sistema de electroforese de preferência para a resolução de proteínas mais pequenas do que 30 kDa

1. Troca catiónica fraca

20 mM Tris-HCl

pH 7.0

Gradiente de força iónica (até

1 M NaCl)

2. Troca aniónica

Gradiente linear de 0-100% de 20

mM Tris-HCl contendo 1 M

NaCl

Produção e purificação de hCPA4 recombinante

› Produção: feita da mesma forma que o descrito para NvCI.

› Purificação: combinação de cromatografia de interação hidrofóbica e cromatrografia de fraca troca aniónica.

› Pureza: determinada por SDS-PAGE.

› Atividade enzimática funcional: hidrólise de um substrato sintético, N-(4-methoxiphenylazoformyl)phenylalanine.

Baseia-se em interacções hidrofóbicas entre as proteínas e os ligandos na fase estacionária.

Formação e purificação do complexo NvCI-HCPA4

Incubação de ambos

(razão molar de 1:2 enzima/inibidor)

30 min

50 mM de Tris-HCl

pH 8.5

150 mM de NaCl

37 ºC

16 mg de rhCPA4

5.5 mg de rNvCi

Volume reacional: 70

ml

Cromatografia de exclusão por tamanho

(filtração em gel)

Ultracentrifugação

Complexo concentrado a 17.6

mg/ml

Separa as moléculas dissolvidas com base no seu tamanho, bombeando-as por colunas especializadas que contêm material de preenchimento de tamanhos diferentes Complexo purificado

Cristalização

0.04 M NH4NO3

25 % (m/v) PEG 3350

T = 18ºC

4 dias… Crio-conservação

em azoto líquido e 12%

glicerol

› A estrutura do complexo foi determinada por difração

de raio-X a 1.7 , usando hCPA4 como modelo, através

do código 2 PCU do Protein Data Bank.

› Refinamento: CNS e PHENIX.

Bom modelo

A maioria dos resíduos encontram-se nas regiões

preferenciais do Gráfico de Ramachandran

Determinação das constantes de inibição

› Variação da concentração de inibidor

› Variação do tempo de incubação

› Concentração fixa de enzima

› Concentração fixa de substrato (0.1 mM N-(4-

methoxiphenylazoformyl)phenylalanine)

pH = 7.5 T = 37 ºC

• 8 alfa-hélices

• 8 folhas beta

Resultados experimentais: Estrutura da hCPA4

Motivo a/b

Centro catalítico:

Zn2+ coordenado a H2O, His-69, His-196, Glu-72

Resultados experimentais: Estrutura do NvCI

› Duas folhas b antiparalelas ligadas por 3

major loops e duas caudas (N e C

terminal)

› 3 pontes dissulfito (Cys 9 e 23, Cys 15 e 51

e Cys 27 e 38)

› Centro hidrofóbico perto do C

terminal da proteína

– Resíduos hidrofóbicos expostos ao

solvente – redução da solubilidade

– Interações apolares com a cadeia

lateral do Trp-42

– 2 pontes dissulfito do inibidor

Cauda C-terminal: ligação aos resíduos do centro ativo e também ao Zn2+

– Tyr- 52

– Ala- 53

Resultados experimentais: Estrutura do NvCI

Dímero: dois complexos idênticos

Cada monómero:

estrutura binária hCPA4 + NvCI

Resultados experimentais: Estrutura do complexo hCPA4 - NvCI

› Ligando H2O substituído por grupo carboxilato do C-terminal do inibidor (coordenação bidentada) na ligação ao Zn2+

› Mudança: movimento da cadeia lateral da Tyr-248 em 180º para acomodar a cadeia C-terminal do inibidor

Resultados experimentais: Estrutura do complexo hCPA4 - NvCI

Mais pequeno que os outros inibidores (2 resíduos da cauda C-terminal – P1 e P2) e 53 resíduos no total.

Resultados experimentais: Porquê o NvCI?

NvCI Outros inibidores

P1’- Presença de Nitrato P1’ – aminoácido aleatório

Interage muito mais fortemente com os resíduos do centro ativo da proteína

onde se liga o substrato

P1 - resíduos alifáticos (Ala)

P2 – resíduos geralmente aromáticos (Tyr)

Resultados experimentais: Porquê o NvCI ? – química do C-terminal

Estabilização da Tyr-248

Forte inibição do NvCI

› Ala-53 – Liga-se pelo seu grupo carboxilato de forma bidentada ao zinco

– O seu grupo amino estabelece pontes de H com o O da Tyr-248

Proteína Ki/ pM

bCPA1 5,8

hCPA1 1,2

hCPA4 4,9

Resultados experimentais: Determinação das constantes de inibição (Ki)

› NvCI apresenta as mais fortes constantes de inibição (grandeza picomolar), ao contrário dos outros inibidores estudados, que geralmente apresentam Ki de grandeza nanomolar.

Menor Ki Inibição mais forte

Resultados experimentais: NvCI e outros inibidores – um exemplo de

evolução convergente

C-terminal

mimetiza a ligação

do substrato

Interação do C-

terminal do NvCI

semelhante à de

outros inibidores

exógenos

Resíduos P1 e P2 da C-terminal

conservados

Mecanismo de inibição semelhante

Conformação e estrutura

da C-terminal parecidas

Origem de organismos diferentes

Resíduo P3 (Gly-51) – diferença estrutural curiosa

NvCI – a exceção

Formaçao de 2 pontes de H extra com Glu-163 da hCPA4

Inibição mais forte do NvCI, redução de Ki

Estabilização da formação do complexo NvCI – hCPA4

Interação Secundária Contactos entre

resíduos das folhas B de NvCI com resíduos distantes do centro ativo da hCPA4

Interações Van der Walls

Aumento do caráter

inibitório de NvCI

Pontes de H:

Gln39-Asn123

Glu37-Arg130 (CPK)

Arg7-Asn159

Cauda C-terminal mais pequena em NvCI – não há clivagem

Estruturas diferentes, cauda C-terminal semelhante

Afinidade entre inibidor-carboxipeptidase maior em NvCI –

interação Glu163-Cys51

Biotecnologia e Biomédica:

- Formas de atuação na Natureza com a evolução

- Descobrir mecanismo geral de inibição

Discussão de Resultados/ Perspetivas Futuras