Genová exprese

Regulace

genové exprese

28 000 genů

6 000 -

12 000 genů

Ústřední dogma molekulární

biologie

„Svět RNA“

Prokaryotická a eukaryotická mRNA

Úrovně regulace genové exprese eukaryot

Chemická struktura RNA

Ribosa (2’-OH skupina)

Uracil místo thyminu (absence methylu v

poloze 5)

Důsledky: Většinou jednořetězcová šroubovice s kratšími dvouřetězcovými úseky Variabilita prostorové organizace druhého a dalších řádů Komplexní trojrozměrná struktura RNA může mít i strukturní a katalytickou funkci

Rozdílymezi RNA a DNA:

Funkční domény 23S rRNA

Katalyzované reakce – substrátem většinou RNA

nejčastěji místně specifická hydrolýza fosfodiesterových vazeb

endonukleasa

obrácený směr – syntéza fosfodiesterových vazeb

RNA ligasa, RNA polymerasa

transesterifikace

sestřih

Katalytická RNA - ribozymy

Substrátem není RNA !

hydrolýza aminoacylesterových vazeb

syntéza peptidové vazby

28S rRNA

Typy RNA v buňce

Dvě základní regulační úrovně:1. Struktura chromatinu

2. Aktivita RNA polymerasy a s ní kooperujících bílkovin

Transkripce

Dvě základní regulační úrovně:1. Struktura chromatinu

2. Aktivita RNA polymerasy a s ní kooperujících bílkovin

heterogenní jaderná RNA = primární transkript

= pre-mRNA = hnRNA

Polyadenylace

m7G

m7G

AAAAAm7G

Zrání pre-mRNA - posttranskripční modifikace

mediátorová RNA = mRNA

Sestřih

Syntéza čepičky

exon intron

čepička

poly(A) řetězec

CTD platforma

C-terminální doména RNA polymerasy II

Regulace aktivity RNAP II

Platforma pro asociaci RNP komplexů

posttranskripčních modifikací primárního

transkriptu

Vytvoření čepičky, sestřih, rozštěpení, polyadenylace

RNA a RNP

hnRNP/mRNP – komplexní a dynamická struktura velká množina bílkovin vážících se k transkriptu po celou dobu jeho existence obecné a specifické bílkoviny bílkovinné složení se průběžně mění

RNP – ribonukleoproteinová částice

Základní struktura čepičky: m7GpppN(m)pN(m)p

Čepička

1974: mRNA několika eukaryotických virů

na 5’-konci není trifosfát, ale čepičkaDnes: Čepička u téměř všech eukaryotických mRNA

Úprava 3’-konce pre-mRNA - polyadenylace

Význam čepičky a poly(A) řetězce

Účast při sestřihu

Export mRNA z jádra

Stabilizace mRNA v cytoplasmě

Regulace degradace mRNA

Komunikace obou konců mRNA

Translace

Výjimka – histonové mRNA

Metabolismus histonové mRNA

Replikace DNA S-fáze buněčného cyklu: syntéza DNA koordinovaná syntéza množství histonů

Histonová mRNA –– 70 typů H mRNA (savci) neobsahuje introny, není polyadenylovaná synchronizovaná regulace exprese všech H

genů

S-fáze 35 x nárůst abundance H mRNA

aktivace transkripce

zvýšení stability (T1/2 = 45-60 min)

konec S-fáze úbytek H mRNA

represe transkripce

destabilizace mRNA (T1/2 = 10 min)

M

E

C

H

A

N

I

S

M

U

S

Lidský gen pro dystrofin78 intronů: 99.4 % délky genuPre-mRNA: 2 500 000 nt / 79 exonůmRNA: 14 000 nt

Sestřih (splicing)Vystřižení intervenujících

sekvencí (intronů) následované spojením

odpovídajících částí kódující oblasti (exonů)

Obratlovci a rostliny

Introny v 80 - 85 % všech genů

Kvasinky

Introny v 235 z 6000 genů

snRNP, spliceosom

Katalytické jádro spliceosomu

Fosfát vážící Mg++

Formování terciálních interakcí mezi U6 a U2 snRNA (pseudoknot)

Místo 2’,3’,5’-fosfotriesterové vazbys A v místě větvení

Párování k 5’-SS

Párování k místu větvení

velice pravděpodobně ribozym

Alternativní sestřih

Sestřih pre-mRNA• Nezbytná součást genové exprese• Významný regulační krok

Variabilní užití potenciálních míst setřihu

Komplexní transkripční jednotka• Jedna pre-mRNA může dát vzniknout mnoha zralým mRNA• Mnoho bílkovin může být kódovanáno jedním genem

Člověk - 40 % genů( podle 5 000 000 EST / 33 000 genů )

Arabidopsis - zatím asi 5 % genů( podle 179 000 EST / 27 000 genů )

Drosophila gen pro Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM): teoreticky až 38 016 isoforem

ORF

Součástkatalytickéha

jádra

ribozym

nukleofil

Samosestřih - ribozymy

Mobilní genetické elementy

Mechanismus sestřihu stejný jako u spliceosomů• snad jejich evoluční předchůdci• teorie vzniku snRNA rozpadem intronů II. typu

Samosestřih – introny II. typu

Úrovně regulace genové exprese eukaryot

Komplex jaderného póru

1 000 – 10 000 jaderných pórů na jednom jádře

Obratlovci (Xenopus) – 125 MDa (30 x velikost ribosomu);odhad: původně 50-100 bílkovin, dnes cca 30-40

Celý komplex průměr 120 nm

Průměr kanálu 9 nm v klidu 26 nm v aktivním stavu

Komplex jaderného póru

Hustota pórů na povrchu

jádra oocytu Xenopus laevis

Export mRNP z jádra

Slinné žlázy larev Chironomus tentans

Obrovská mRNA

~ 75 kb > 10 MDa

Ø 50 nm

Úrovně regulace genové exprese eukaryot

Stabilita, lokalizace a translatovatelnost mRNA

Cis-elementyPrimární sekvence mRNA

Strukturní elementyČepička (5’-5’ trifosfátová vazba)

Poly(A) řetězec

Trans-faktoryRibosomy

RNA-vazebné bílkoviny

Ribonukleasy

Antisense RNA

Komplexní soubor vztahů – dynamické složení mRNP

lokalizace x stabilita x translační aktivace/inhibice

Stabilita, lokalizace a translatovatelnost mRNA

Abundance mRNA – aktuální poměr rychlosti syntézy a degradace

TranskriptyExtrémně stabilní - skladované mRNA

Stabilní - konstitutivní geny

Nestabilní – regulační bílkoviny transkripční faktory, geny buněčného cyklu, geny stresové odpovědi regulace stability mRNA – změna poločasu života dané mRNA až 10x

fyziologická – vývojové stadium, rychlost růstu, diferenciace podněty okolí – stres, výživa, hormony

Iron-responsive element

IRE (iron-responsive element)

vlásenka (23-27 nt) smyčka (6 nt)

Transferrin receptorexprese při nedostatku Fe

IRP (IRE-binding protein)

volný – enzym akonitasa vazba k IRE stabilizuje TR mRNA regulace železem

Vztah stability a translatability mRNA

Ferritinexprese při nadbytku Fe

Naprosto opačný efekt stejného elementu v závislosti na jeho poloze v

mRNA

Lokalizační cis-elementy

ash1 mRNA

Drosophila melanogast

er

Embryo

Lokalizace některých

mRNA

Protismyslná RNA

RNA komplementární k cílové RNA, reguluje její funkci ovlivnění stability cílové RNA inhibice nebo zesílení exprese chemická modifikace cílové

RNA/DNA

Umělé protismyslné molekuly – antisense DNA oligonukleotidy

terapeutické užití

štěpeny RNasou H (štěpí DNA/RNA hybrid)

Délka 22 nt až >10 kb

Umlčování genů / gene silencing

Petunia (1990): změny barev květů po transformaci genem pro chalcon synthasu za 35S promotorem

Obranná strategie – kontrola virové infekce umlčování cizorodých genů

Úrovně regulace genové exprese eukaryot

Translace

Syntéza bílkovin na základě matrice mRNA

Ribosom – největší RNP částice

4,2 MDa = 2,8 + 1,4 MDa

Peptidyl transferasa - ribozym

Ribosom a translace

Translace video

Zrání ribosomální RNA

Rozštěpení polycistronického 45S transkriptu

endonukleasy, exonukleasy

Samosestřih pre-rRNA

ribozym

Modifikace nukleotidů pre-rRNA

účast snoRNP

Posttranskripční modifikace tRNA

Úprava 5’-konce tRNA RNasa P, RNP ribozym RNA + 1 či více bílkovin

Modifikace nukleotidů

3’-terminální sekvence CCAATP(CTP):tRNA nukleotidyltransferasa enzymatická syntéza bez templátu

Sestřih (introny IV. typu) introny v antikodonové smyčce enzymatický – endonukleasa, ligasa

Modifikacenukleotidů v tRNA

80 popsaných (2001) nukleotidových derivátů

Specificita aminoacylace

Rozpoznání kodónu

3D struktura molekuly

Zvýšení povrchu tRNA(dostupnost pro bílkoviny)

Význam:

Úrovně regulace genové exprese eukaryot

Závěry

Množství úrovní regulace genové exprese

Komplikovanost a vzájemné propojení regulačních mechanismů

Obrovská variabilita „světa RNA“ v současné eukaryotické buňce

Řada reakcí katalyzovaných ribozymy

Dynamika formování a přeskupování ribonukleoproteinových komplexů

Kontinuum světa RNA a bílkovin v eukaryotické buňce

Kontakt:David Honys

ÚEB AV ČR

http://www.ueb.cas.cz/laboratory_of_pollen_biology/default.htm