10
Journal of Cellular Biochemistry Supplement 37:110±119 2001) Genomics Approaches to Drug Discovery John F. Reidhaar-Olson,* Brian K. Rhees, and Juergen Hammer Department of Genomic and Information Sciences, Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, New Jersey Abstract New approaches to drug discovery have come about in recent years as a result of important advances in genomics and bioinformatics. The availability of genome-scale sequence data, the development of new tools for high- throughput gene expression monitoring, and improvements in the ability to analyze large data sets have revolutionized the ®eld. In this article, we discuss three applications of genomics data in the drug discovery process: target discovery, prodrug strategies, and vaccine development. J. Cell. Biochem. Suppl 37: 110±119, 2001. ß 2002 Wiley-Liss, Inc. Key words: genomics; bioinformatics; gene expression; target identi®cation; epitope Recent advances in genomics and bioinfor- matics have transformed biology from a science of small-scale experiments to one of high- throughput processes, large data sets and sophisticated analytical methods. As a conse- quence, new possibilities have arisen for the identi®cation of therapeutic targets and the development of small molecule drugs. These changes have been driven largely by genome sequencing projects and new technologies for high-throughput measurements of gene expres- sion. The sequencing projects, particularly the Human Genome Project [International Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Venter, 2001], have put into the hands of researchers the complete sequences of tens of thousands of genes, along with the challenge of sorting out which represent opportunities for therapeutic intervention. To help meet this challenge, gene expression technologies, such as those based on microarrays [Lockhart et al., 1996; Brown and Botstein, 1999], have provided a powerful means of using genome sequence data for the identi®cation of disease-associated genes. The power of array-based methods lies in their ability to rapidly dissect the transcrip- tional differences between normal and diseased cells. This capability has important implica- tions throughout the drug discovery process. At the early stages, expression pro®ling of normal and diseased tissues contributes to target identi®cation. At later stages, expression data can be used to optimize lead compounds and to evaluate toxic effects [Gore et al., 2000]. In addition, expression pro®ling can lead to the discovery of diagnostic, prognostic, and surro- gate markers [Golub et al., 1999]. In this article, we will provide an overview of the genomic and bioinformatic processes involved in large-scale gene expression studies, and focus on three speci®c applications of these methods, each with a different approach to the development of novel therapeutic treatments Table I). Genomics Process Successful use of expression pro®ling in drug discovery depends on the incorporation of a set of wet-lab and analytical steps into an inte- grated process, such as the one outlined in Figure 1. The process starts with the disease of interest and collection of relevant tissues. The number of tissues required for such a study can range from several dozen to several hundred, and must include a suf®cient number of each tissue type to allow for meaningful compari- sons. In many cases, the situation will be more complex than a simple division of tissues into normal and diseased categories. For example, in a study of diabetes, tissues may be collected from normal, insulin-resistant, and diabetic individuals, with samples collected from each individual under multiple experimental condi- tions, such as before and after insulin treat- ment. Moreover, in addition to these tissues, ß 2002 Wiley-Liss, Inc. DOI 10.1002/jcb.10072 *Correspondence to: John F. Reidhaar-Olson, Department of Genomic and Information Sciences, Hoffmann-La Roche Inc., 340 Kingsland St. Nutley, NJ 07110-1199. E-mail: [email protected] Received 28 September 2001; Accepted 4 October 2001

Genomics approaches to drug discovery

Embed Size (px)

Citation preview

������� �� ������ ��� ������� �������� ���������� ������

����� � ����� �� �� !��" !�� �#��

���� $% &�'����()����*+ ����� ,% &��* ��' ���"� -����

���������� ����� ��� �������� � ��� ��� �������� � �� �� �� ������� ��� ������

.���� � ��� ����� ��� � ���� ��� ��� �� � �� �!�� �� �� ��� ����� �� � ������ �������� �� �� �� ������� � ��� !�������� �� "�� � ����!����� ������� ��� ��#��� � ����� ��� �� ������� ��� ��� � �������������� ���� �$������� ��������� ��� ���� ������ �� ��� �!����� � �����%� ����� ���� ���� �� � �� ������%����� &���� �� ���� ���� ��� �� ��� ��� ����� ����� ����� ����� � ���� �� ��� ���� ��� ��� �� ���' ������ ��� ���������� ����������� ��� � ��� �� �������� �� (���� )� ���� ����� *+' ,,-.,,/� 0--,� � 0--0 1���������� �� �

,� /��'�� ����� �2 !�������� �2 ���� �$�������2 ������ ������& ����2 ������

������ ������� � ���� � ��� ������� ��� ���� ������� �� ������ ��� � ������� �������� ����� ��� �� ��� �� �������������� ������� ����� ���� �� ������������ ��������� ������ � � ������������ ��� ������ ���� ���� ������ ���������� �� ���������� ������ ������ ������� ��� �� ��� ������� ����� ���������� ���� ���� ����� ������� �� ���� ��������� ������� ��� ��� ���������� ����������������� ����� ��� �� ���� ��������� ��� �������� �������� ����������� ��� � �� !��� � "������ #$����������� � ��!��� � %�������� &������ � '(()* +������'((),� ���� ��� ��� ��� ���� �� ������������ �� ����� ������� �� ��� �� ������� ������� ����� ��� ��� ��������� �� ����� ������� �������� ���������� ��� ��������������������� �� ���� ��� �� ���������� ����������� ����������� ��� � ���� ���� �� �������� #-��.���� �� ���� )//0* 1���� ���1������ )///,� ���� ������� � �������� ��� �� ��� ���� � ������� ���� ��� ������������� �� ������������ �������� ����� �� ���������� ����� �� �

���� ����� �� ������ ���� ��� ������������� ��������� ������� ��� �� ��� ���������� �� �������� �� ������� �������� ���������� ��� ���� ������� ������

�� ��� ����� ����� ������� ������� ����� �� ��� ����� ��� ��������� �������� ����������� �� ����� ����� ����������� ��� �� ��� �� ��� 2� ���� �� �������� �� �������� ���� ������ #!��� �� ���� '(((,�$� ������� ������� ������� ��� ���� �� ���������� �� �������� ��������� ��� ��������� ��.�� #!���� �� ���� )///,� $� �� ��������� ��� ������ �� ������� �� ��� ���� � ��������� ��� ������ ������� � �������������� ������� ����� ��� ���� �� ������������������� �� ���� ������ �������� �������� �������� �� ��� ������� ��� �� ��������������� ����� ��� 3����� $4�

����� � 0�� ��

%������� �� �� ������� ������� � ����������� ������ �� ��� ����������� �� � ���� ������� ��� ��������� ��� ��� �� ���������� ������ ��� � ��� ��� ������� �5���� )� ��� ����� ���� ��� ��� ���� �������� ��� ��������� �� �������� ���� ����� ��� �� ��� ������� ��� ��� � ���� �������� ��� ������ ��2�� �� ������ ����������� �� ������ � ������� �� ��� �� ������� ���� �� ����� ��� �������� �� ������� $� ��� ���� ��� ������ ��� �� ����� ���� ���� � ��� ���� �� ��� ������ �� �������� ��������� 5�� ��� ���� �� ���� �� ������� ��� �� �� ������������ ��� ��� ������������ ��� �������������� ��� � ��� ��������� ��� ����������� ����� ������ ����� ����� ��������� ��� � ������ ��� ����� ���� ������ ���� 6�������� � ������ �� ���� ����

� ���� 1���(2���* 3� %!)3 ��%����45 .%�����

7&������������ ��8 9��� 5� ��������:���� ;����� ����� !��� � ��� $���� ���� %������ ��� ����-� �����$���� <=( >������ %�� ?������ ?9 (@))(�))//�A� ��8 �����������������B��������

������� 'C %���� ��� '(()* �������� = :������ '(()

����� ��� �� �� ���� �� � ��� ����� ��� ��� ��� ����� ������ � ����� �� ����� ������� ��� �������� �� ������� ������� �� ������� 5�� ��� ��� � ��� ����������� ������ ���� ���� �� �� ������������ ����� � � ��� ������� ��� ����� ������ ��� ������� ����� � ����� ������$� ��� ���� ���� ��� � ��� ��� ��������

�� ������� ������� ��� ��������� D��������� ������� ����� ��� ������������������ �� ������ �;?� ������ �� ��� ��������� ������� ���� ��� �� �� ��� ���� ���� �� �� ���� �� ����� �� �� ����� ����� ��������� �� �� ������� ��� ������������� 35�� '4� ���� �� � ���� ���� �� �������������� ����� D��� �������������� �� ��� �� ��� ���� ���� ���������������� ������� #A�� �� ���� )//C, ��� �������� �� ����� ��� � ��� ���� �� ����

���� ������� �������� $� ��� ���� ���� ��� � ������ ������ ������� ��� ��� �� ������ ������� �� ��� ��������� � :����� �� �������� ����� ���� ��� � �������������� �� �� ��� �� ���� �� ��� ����� ���� � ���� ����� ����� ��� �� ������� ��� ����� �� ������� ������� ���� ������ �� �� ���� ��� ��� ��������������� �� ���� ���� ��� ��� ������������� �� ��� �� �� ������$� �� ���� ����� �� ������� ����

�� �� �������� �� ��� �������� ���� ����������� ����� ����� ���� ��� ����� ������ ��� �� ����� ����� ���� ������� ���������� ���"&� # �� �� ���� )//0,��� �������� �� ��� ��������� ���� � ��� �������� ������ ��� ���� �� ��� ������ �� ������ ��� ��� �� � ��� ������� ����� ����� ��� ��� ����� �� ������ ���� ��

����� �� ��� ����������� �� ��������� ������� �� ���� ��������

��������� 1�� ��� ��� �� �������� &���������� �� ������� ���� ������

������ ���������� 6��� �� ������� ���� ��� ������ ���� ������� ���������� �� ��������� ���� ������

&������ ���� � ���� 3���������� �������4

"������ ������� ����� �� ������� ���� �� ������ ��2� ��������� ��������� ������� ��� ����� ����

%������� ������� � ���� 3A����������������4

+����� ������� ��� E� �� ������� ���� ��� ������ ������������� �� ������ ���������� ������ ������

%������� ������� � ���� 3?� ��������������� ���4

$�"% �% 1�34� � ���� ��� ��� ��5� �� !���� � ���� �$������� ��&����� "���� ��� �& ����� ����� �$������� ���� ��� ����' 6 7 ������ ������& ����2 6�7 ������& ���� ��%���� ������� �� ������2 ��� 67 ������& ���� "� ��� ������� � � ��� �� �������� ��� ��$� � ��������

����� � ����� �� �� !��" !�� �#�� ���

����� �� � ����������� ������� �������3%�A"4� ��� ���� ���� � � ����� ���� ������ ��� ����� ����� ��� ��� ������ ��� ���������� �������� �� �������� �� ���� ����� ������ ��� ��� �� ��� ��������� ������ ����� ��� �������� �� ��� �������� ��� ����� ��� ��� ��� ������� ��������� ��� ��������� �����

�� �� ���� � ��� ������ �������� ��������� �� ������ �������� �� ��� ����� D� ������� ���� �� ����� ��� � ���� � �� �������������� ���� ��� �� ��� �� ������������ ����������� $� ��� ��� ���������� ������� ���������� �� ��� ������ ������ ���������� ���� � ����� $� ��� ������ ����������� ������� �� ��2� ��� ������

$�"% �% �������� �� ����� ���� �� ��� �������� ���� �$������� �����

$�"% �% 8� ��� � �������� ���� �$������� ����� ������ ��� ��� �������� 6�� ����� �7 ������� ���� � �� � ����� "�� ����� ���� ���� ���� � ���������� ��������� � ����� "�� ������ ��� ������� �$������2 ����� ���� ��� ���� �� �������� �� !� ��!���������

��� &�'����()���� � ��%

��������� ������� � ����� ��� ���� ������� � ��� �� ��� ������� ������� ���� ������� ��������� ������ ������ ���������������� � ����� ���� ��� �� ������.���� ������� ��� ��� �� ������ ����������� � ��� ������� � � ��� ������ ������������� ����

6��"� 3'���7 �����

��� ���������� ��������� �������� ������������� �� �������� ���� ������ �������� ��� ������ �� ��� ���� ��� ��� ��������� $� ��� ���� ���� ������� ���� ��� ��� �� �������� � ����� ��� �� ������� 3���� ���� �������� ����4� ������� ���������� �� �������� ������ ����� ����� $� ��� � ���� ��� ����� ��� ����������� �������������� ������� � �� ����

�� �� ��� �� �� ����� ��� ��� ������ �� � ��� �� ������ ���� ���� ���������� ��������� � ������� �����3���� ����� � ����� �� ����� ����� ��� ����� ���� ������ �� �D������F ��������. ���������� ���� �����* �� 5�� <4� $� ������ ��� � ������ �� �� ���� ���� ��� ������������ � ����� ���� ��� ���� �������� ��� ������ ��� ���� ���� �� ������ ��������� �� ��� ����������� �������$� ����� ���� �������� ��� ����� ��� ��

���������� ��� �� �������� ������� ����� �� ��� ��������� ������� ��������� � ����� �� ������� 3�?:+�4 ��� ������ �� ��������� 3�?&:+�4� �� ���������������� ������� � ���� � ������� ���� ������ ������ � ������ ���� ������ ����� ��� �� �� ���� �� ������� ;�����

$�"% 8% (�������� �$������� ���� ���� ���� �� �����������"�� �$������� �� ��� ������������� ,9 �� �3������ ��� ��������� 6 7 !��� ��� 6�7 ���� ������� ��������� ���� ����������� ����� :������$ ����(���� ������� : ���� ��������6��-�--,7 �� !��� �� !������ ��� �� ������� ����;���� !������ 6���;�)<7 6��� �����72 ��� ��� ���� � ������ � ������� �� ���� �� ��� ��������� ����������� ��� ���;�)< �� � �� � ����� �����& ��� 6��-�0=7� �� ���� ���� ���

��� �����& �� � ��� �� � ������ &��� � ������� ��������� ��� 6��"�� �����7� �� !�� ����� �$������� ���� ���������%�� !� :�(>?: !� &����� � ���� ���� �� ����� ���;�)<� ������� ���������� ��� ����� ������ ���� �� &$�� �� ���"�� ��� �������� ��� �� ����� ������� ���� ��$� ����� ���� !������ ����$� ��� ��� !�� ��� ����������� ����� ��� ������ ������� ��� �� &$�� �� �� � �������� �� ����������� <���� ����&� ����� �:� �� ����� ��< @�:� ���������� ,/==A�

����� � ����� �� �� !��" !�� �#�� ���

���� ������� ���� ����� ����� ����������� � �������� ����* ������� � ������ ��� ���� �������� �� ��� �������� ��������� ��� ��������� �� ������ � ���� �������� �� ������ � ��� �� ���� ������������� �� ������� �� ����� ��� ��� ������ ����� ��� �� ������� � ��� ���� ��� �����2�� ��������� 5�� ��� ���� 5���� =��� ��� ����� �� �� ������� ����������� �� ���� ������ �� ��� .������ ������� ������� ������� ������ ������ ���� ������ ���������� ��� ������ ��� ��� �� �� ����������� �� ������� %� ������� ������� ��� ���� ������� ���� ��������� ����� ���� ����� ��� ��� � ������� �G���������� � ��� �� ��� ����� �� ��� ������� ��� ����� �� � ��� ������ �������� ������ ���� ����� ������� ����������������� ������� ����� ��� ������ ��������� ������� ��� ���� ���� � 3!;�G-164� �������� ���� ��H��� ���� ������� $� ����� ���� �� ��� ��� ����� ��� ������������� )5� � ���� ���� ����� �.��� ���� ��������� �������� ����� ��� ��� ����� ���

� ��� � ������ ������� ���������� �������!;�G-16 ��� ������� ������ ������� �������� ��� �� ������ ��������� ����������� ������� � ������ ��� �� ����������� ���� ��� ��.�� ��� �������� � ����� ��� ���� ������ ��� �� �� �������� �������������� �� ������� � ������ ���� % �������� ������ ����� ���� ���������� ����� ������� ������� 3����� $$4� �����2�� ������� ��� ��� ��� �������� ������ ���� �������� �� � ��� �������� �� �� ������������� �����E�� ������ ��� ���� �� ������ ����������

� �� �� ���� ���� ��� ��� ��� ������� ������ ���� ��� ���� ���� � ������� �����&����������� ��������� ���� ���� �� ������� ������� $� � � ���� ����� �� ��������� ��������� ��������� ��� � ���� �������� ���� �� ������� ��������� ���� ������������� ������� � ��� ���� ��� �������� �� � ���� ��� �� ��.����� �� � ���� � ������� ������ ���������� $� ���� ������� ������� �� ����� ����� ��� ��������� ���� ����� ������� 1����� ��� ����� �� ��� ����

����� ��� ��� ��� ���������� !��������� �� �"����� �� #����$�

A����� ���� ���� $; &��� �� � !��� %� ��� ���� ����� $;

%�� <==@@I�� J�)) E�J E�������� ������������������������ ������ ����

?6I((@)'K

<@KC<I�� J�)) %6&J %6& 3 ���4 �� ���� ?6I((=0K<<C<KKI�� J�)) ;1J ;A�;G 3���!���������G 4

��� ����������?6I((=00(

=)')=I�� J�))�< �"%=J ���� �� ������ %=� J���.�� ?6I(()((C<=C='I�� )K�)' %?�"? % ��� ������� ���������������

����������?6I((<(/@

<C==0I�� L ?�)$< ?������ �������� ���� �� )������ $� � ��� <

?6I((K)''

=K<'=I�� L ?�)$< ?������ �������� ���� �� )������ $� � ��� <

?6I((K)''

=@/=(I�� )0�)< 6�)A 6������������ )A 3���������4

��� <)0''I�I�� )0�)< 6�)5 6������������ )5 3���������4<)@/)I�� <�'@��'/ �"0< �� �� ������ 0< .;� ?6I((<@''<)@/=I�� )(�����'0�)) ?�K1 K������������ 3�����4�

������� ����?6I()'''/

<@K/'I�� K�)<�< &>6�' &������ .���� ���������� ' ?6I(()C'K<=C))I�� ��"K!< ��" ������ ?6I(()0C/<@('@I�� ))�)'��)< � ?�> � ?�> ������������

3�� ���.�4

A������ <==//I�� ))�)<��)= �&�?< ������ ����� < ?6I(())(=<0@<0I�I�� @�')��)K "%" "��������� ��������� ?6I((=K@@<@'(CI�� @�))�' "%" - "��������� �����������.� ?6I((<C<'<@'(/I�I�� @�))�' "%" - "��������� �����������.� ?6I((<C<'<0KC@I�� )/������)' AA5' A�.������ ���������

��������� ������ '?6I(()/0)

<0K/KII�� )K�))�' !��6 !����� � ������������ ?6I(()=C'<CC<<I��)@'CI�� )(�)< 16$) 6���� ���.� � ���� 3� �)4

�������� �� ����?6I((K)C(

0@=I�I�� )=�'= 6� 5;) 6������������������������������������

?6I((K/K0

=KK=0I�� �<<@'/I) ���������� ������ �<<@'/I)KK(''I�� %A%' %���� ' ?6I(<)=K/

��8 &�'����()���� � ��%

������� ������ ���� �� �������� � ������ � � ��������� ���� ��� �������� �����2������ "������������ ��������� ����� ������������ ����� #E��2 �� ���� '(((, �������.���� ���� ��� ��������� ����������� ���� �� �������������� ���� ��

������ ������ ��������� ������ �� �������������6��� �� ���� ���� �� ����� ��� ���� ������ �� ���� ���� ����� ��� ��� ����� ���������� ������ �� � �� ��� �� ������2�� �������� ������ �����

0��'��" !#������

������� ��������� �� ������� ���� ���������� �� ��2� ��� ������ ���� ��������������� � ����� ��� ��� ���� ��� ���������� ��� �������� �� ������� ��������� ������ ������� ������� ����� ��� ��������� � ����� �� ��� �� .���� ���� ����������� ������� � ��� ����� ����� < ���������� ��2� � ����� ��� ������ �������� �� )=K .���� ���� ������� � � ����������� ��� ������� ���� �������� � ���� ��

����� ���� %���� ��� ������ �� !��� !����

"������ A�2� � ���� "����� �������

)@ ;�����������G����������� C >��� <' :��������� ��������)K "����� ��������G���������� = 6������������� '/ A������������ ����)= ������������ ��������� ' "�������� )0 $������� � ����� ������)) $ ����G�H� ���� < %���� ������� )= ���������� ������)( "������������G��������������� ' E����� ���� @ &���.������0 &��� ����� ' &�������� ���� �������� 0 ������= ;?� ��������� )< :���� ��2� � 3) ����4 K "�������� � �����= ������ 0 ?����������� .���= %������� ��� ������.�� = !����� ������< -�� �������� = 6�������������< 6�� ��� �� = ;?� �����G ��������< D���� ������ < %���� �������)= :���� ������� 3� < ����4 < "������ ������

< &�� �.��G����.��< !������� �������)@ :���� ������� 3� < ����4

$�"% 9% B�%����� � ����� C���� � � �� � 6 ���$� 7��� ��� �� � 6����$� 7 ����!������ <��� ����� ��� ������ ��� ��������� ����������� � �� ��� ��� �� �� ��� ���������������� ������������ � �� ���2 ���� �!����������� � ������ � ��������� D�9E �� ���� ������ ���� ������� �������

$�"% :% B����� ����� ��� ����� �� ��� � �� � &��������� � ����� ����������� �& �������� ������ ����!�����"��� � ���� ���� �� �� � � ���� �� !� ������� ����� � �����& ����� ��� ��%� ��� ������� ��������� � !� ������� "� ��� �� ������� ���� �� ��� �� �������� ���� � � �������� ��!����� ��3 ������� � � ��� ������ ��� ������� ����

����� � ����� �� �� !��" !�� �#�� ��9

� ������� ������� ��� �������� ��� ���� ����� ��� �� ������ ��2� � ��� ����������������� �� ��� ��� �� ��� � ������� ���������� 3L������4� ��������� ��� � ������ ��� �� ������� ����� ��� ���������� ������#1�� � '((),� &��������� ���� ������*�������� ��2� ��� �������� ����� � ������ ���� �� K�H���������� �� ����� ������������� 35�� K4� ��� ��2� � ���� ������2� ���

���� ��� � ��� �������� �� ��� ����� ��� ���� ��� ������������ ��������� �������� � �� �� ���� ���� � ��� �� ����� $�������� ��������� ��� ����������������� ������� K�H��������� �� �� ������ ��������� �� ����� � ��� �� ��#$�.��� �� ���� )//C,� ��� ��� ������� ������������� �������� � �� �� ���� �������� ������� ������ �� ������� ��� ����� �������

$�"% �% "�� #��������� � �����$�!���� ������ ����� ����� ���� "�� 4� ���� ����������� ��� !��� ����� ��#����� � ����� 6���7 ��� �����%� 6�����7 #��������� � ����� �� � ������������ ����� ���� �������� �� ��� �$���������� ����������� ��� ���� � �� ���� ���� �� �� �� ��� ������� ������� ��:��� !������ ��������� ��� ��������� �� � � �� ���� ��������� �� � ������� ���� 6897 ������� �� ��� �����%�� ��������#��� �� "��� � �� �� ���� ������ � ��� � �� ������!�����

�� ������ � �� � �����$� ��� ��� 89 ������� �� ������������� � ������� ������� ��#��� � ����!���� � ��� � �� ��� �����%�� 89 �� �#��� � � ������ ���� ��� � �� �����!������� � ��� ��� ������ �������� ���� ��������� ���� ��� !���� ���� 6,F �� ���� �������7� ��� ����� ��� �������� �� �������� ��� �������� �������� �� � 89 �� �������� ��:�����������

��: &�'����()���� � ��%

������� 1� �����2�� ������� ������� ������� ��� ��������� � ��� ����� ���������������� ��� �� ���������

;� �� !#������

��� ���� ��������� �� ������� ���� ������� ���������� �� �������� ������ ����������� ��� �� ��� � ��� ������� ��� �� ����������� ������� ��� ��������� �� ���� ������ ������� ���� ����� ������� ��� ����� ����� ������� ������� ����� ����� ������� ������� ��� �� ��� �� ��������������� ������� 1����� �� ��� ���� ��������� ���� �������� ����� ����� ���������� �� �������� ������ ������ �������� ������� ��� � ��� ����� ��� ����� ���������� ������ ��� ������ �� �����

��� ��� ������� ������� �� ����� ����������� �� ������ ��� �������� ��� ��������� ����� �� ������ ���������� ��� ����� �� � 2� ��� �� ��� ������� ��������� D�� � ������� ������� �� ��� ������� ���� � ��� ��� ������ ��� ��������� ������ ������ ����� 35�� 04�������� � ����������� ������ ������

����� �� ��� �������� ����� ���� �������������� ������� ��� �� �� ����� ���� ������� ���������������� ������ # � �������� )//@,��������� � � �� ��� �������� ����� �������� ���������� ��� ���������� �������� �� �� ����� ��� ������ �������� ����������� ��� � ��� ��������� �� ������ ����� ��� ��� -� ����� ���� ���� ����������2�� ����������� � � ����������� �� �� ���

$�"% <% 8���� �� � ���� ��:��� ������ ����� ��� ' "�� !������ �������� ������� ���� ��� �������������� ��#��� �� ��� �$������������ ������� � �������� ���������� ��:��� !������ ��� ���!������ ���������:������� !� ��� �����$�!���� ����� ��� ���� ���� �������������� ����� �� ��������� �������� �� ���� ��� ��� !�������������� ���� ������ ����� ��� �� ��:��� ������� 6!�� 3 !���7������ ��� � �� ��� ������ ��� ���!������ 6����� !���7 �������� ���� "�� ���� � �� ��:��� ������� ��� ����� �' �� �����$������ �� ������� ���� ���� � ������� ���� ����� ����� ������������ �� ������ ������� ���� �� �� �� �� �� ���������"�� ������� ���!�� ������ ��#��� �� � !� � ������ �

������ ������& ���� ��� ���� ���� �� �� �,/�--- 6���!�� ���� ��#��� �� ��� ����� ����������� � ��� ��:�� ������� ���� � ���� ��������7 � *G ���� ���� �� ��������������� �� �� ����� D-F ��� ������� �� �� �� ������������%�� 6������ !��7� :������� ���� ��� ������ ��#��� ������� ��� ��:��� ������ �����$�!���� �������� "B8�">8B������&�� ,*- ����� ��� �������� " ��� ������ ��#��� ��6!��� !��7� ��� � ��������� � �������!�� ����� ���� ���!��#���� ��!����� �������� "�� �� ��� ������ !��� ����������� ��� �� �������� ��� ���!�� �������� ���������� � ��� ����;������ ��#��� �� �����%���

����� � ����� �� �� !��" !�� �#�� ���

��������� �������� ������ �������� ������� ���� �� -� ������ ����� ����� �������� ���� �������� �� ��� ������������� -� ������ ����� � ���� ���������.� ��� ������� �� ������� � ������� �� �������� ���� �� ������ ������� ���. ���������� �� ������� ��� -� ��������%������ ��������� ���� ���� ��������� ���

-������ ������ ��������� ��H����� ������� �������� ����������� �� ������ ������������� -��$ ��� -��$$� ��� ��� ���������������� ��� ��������� ���� ���� ������ ���� � �������� ���� ��� ��� ������#�����22�� ��� � ��� '(((,� �� �������� -��$$ ������ �������� ���� �A"$�:"A����� ���� �� �������� ���������� ������ #%������� �� ���� )///, 35�� @4� M��������� ����� ������ ���� ������� ���� � ������� ���������� �� ����� �� ���� � �� ��� ������ ����� ���� � ����� ���� �� � ������ ��������� ��� ����������� � �� �������� ��H��� ��� ��������� �������� ��

-� ������� ��������� ��������� � NN����������FF �� -� ����� �� ��� M��������� ��������� �������� ��� ��� ����� ���� ���� ��� ��� �� ��� ��� ��� ��������� � � ����� ���� ��� ���� ����� �������6��������� �������� ���� ���� ����

�������� ��� -��$$ � ������ ��������������� 35�� C�4� 5������ ���� ���� ���� ������������� ������ �� ������ ������ ������ ���� ������� �� ��������� �������� ��� ���� � ��� ���� #!�� �� ���� )//C* �� -���� �� ����)///*6��� �� ���� )///*&������� �� ���� '(((*%���� �� ���� '((),� 1� ������ ��� ��������� ���� ������ ���� ����� ���� � ������������ ��� �� ��� �� ����� �� �� ������ ����� ������� �� � ��������� �� ��� ���� ����� ����� �� ����� ������� ����� � ���� �� ��� �� ������ ������� ��� ������ 35�� C1��� /4�� ���� ��� ��� ��������� ����� ��� ���

��� �������� ��� ��� ���������� ����������� ���� � ��� ���� ������� ������

$�"% �% ������& ���� "� ��� ������� !� �$������� ��&���� �!���� ���� ����� �� � ���������� ' B$������� ��&���� ����� :������$ ����(��� ������ ���� ���� ���$������� ��� �� ��� �������� ��� �� �� ����������� �' "�� ������ � ������ �� ����� �� ������� ����� ��� �� �� �$������ "����: !������ �&������ �������� �� � ������� ����� ���� ��� ������ ��� ������ ��#��� � �������� ��� ����� � ������ �����$�!���� ���������

��< &�'����()���� � ��%

���� ��� ��������� �� ���� ������� ������ � ����� ������ ��� �������� ������ ������ ������ �������� ��� ��������������������� ������� ���� ���� ������� ������� �� ��� ���� ��������� �� ������ ������� �� ���� �������� ��������� ���� ������� �� ������� ��� ���� �� ������� ������������� ��� ����� ���� � ��� ���� �� �������� ������� ����� ������� �� ��� �������� ���� � ��������� ��� ����� ��������� ��� ��������� �������������� ���������� ���� � ����� ��� ���� �������� ��������� ���� � ���������� ���������� ��� ������� �� ������� ��� ���� �������� ����� �� �� ������ ��� ����� �������� ���� ��� ������� �� �������������� �� ������ ��������

&=$=&=>=�

1�� 9-� '(()� ��� ���� �� ����������� �� ����� ��2�� ������� �������� H������� ���� � ��� ����� ����� ������� ����� ������� ��� :������� 08K0O0=�

1���� ":� 1����� ;� )///� A������� ��� ��� ������� ��� ���� � ��� ;?� ��������� ?�� !����')3%���� )48<<O<@�

&������� 1� %����6� &��� :� �����22�� -� � ��9� 6������ $� P����� 6� '(((� $� ���� ��� � ���������� �� � �� ���� ������ ������ ������ �� ��� ����� ��������� ����������� )(( ������ ��������� ��� �A"$�:"A ������ � 9 $ ���� )0K8=@<)O=@=)�

�� -���� &� %������� �� �����22�� -� � �� 9� %��� ��%������ 5� "�����1������� "� )///� &����� ����8$���������� �� ����� � ���� ������ � -�� �K� ���� ��������� ��������� 9 $ ���� )0<8)@'KO)@'/�

A�� 61� %���� �� "�� 1���� ":� 1����� ;� )//C�&����� ����� ��� ����� �� ���� ����� ��������������� "��� ?��� ���� %� E%� /K8)=C0<O)=C0C�

!���� ��� %��� ;>� �� ��� "� ���� &� !�������. 6�6���� 9"� &����� � -��6-� ;����� 9�� &����� 6��1��� ���� &;� -����� A%� )///� 6�������� ����������� ������8 &�� ������� ��� ��� �������� �� ����������� �������� %����� 'C08K<)OK<@�

!��� 6�� 6����� 66� ��������:��� 95� '(((� !���������� ������ ������� ��� ����������������� ��� �;?� ������ 5���� $����� !��� �)8))=O )'0�

!�� ;6� 5�������� �� �����-�� ���6� A���� &� $�� >�?��� P�� 5��� 9�� %����� �&� ���� 1�� )//C� $����������� �� -5��) � � �������� ���������� � ������ ���������� -� � ������� %����� 'C)8@(<O@(0�

� �� 9� %������� �� %������ 5� )//@� -� ��� $$������ ����� ������� ��� ���� ����� ���$ ���� 0080@O)((�

�� &�� %����� 9� -��. >9� D��� "6� )//0� ����� � ���������� "&�� !��� � �� 08/C0O//=�

$����������� � �� !��� � %�������� &������ �'(()� $���� �������� ��� ����� �� ��� �� ������ �� ?����� =(/8C0(O/')�

$�.��� �� %�.���� 5� 5�.�� J� %����� ?� $���.� � )//C� "���� ���������� ������� ��� ������� ������������ ��� ���H����� ��� ��� ���� �� ��� �������������� �� ��������� ��� ������������������ � �� �� � �� �� ������ ���������� &������� KC80CKO0/(�

-��.���� ;9� ;��� � 1���� 6&� 5������� 6�� !���� 6+�&��� 6%� 6�� ��� 6� D��� &� >������ 6� ����� � 1���� A-� )//0� A������ ������� �� �����2����� �� ��������� ������������� ������ ?�� 1��������� )=8)0@KO)0C(�

6��� %� %������� �� $ �� 6�� � �� 9� %������ 5�?����� &� %������ !� 6�22 1� 1������ 6� ;�������� "�"���� 6"� )///� 6����� � ���� ������ � 6�!A�<������ �� &;=3�4 �������� � ���� � ������� �������� ������� ���.����� ������ ;�))� 9 A�� 6��)C/8C@)OC@0�

�����22�� -� � �� 9� '(((� A����� ������ ��������� ��������� ������� � 1��� 1����� ���)8)@/O)C/�

%�% $������� )/CC� %�%G%��� E��F !���� +���� 0�A�� =� &���� ?&8 %�% $�������

%���� 69� �����22�� -� � �� 9� P����� 6� '(()��������� ����������� �� 6 & ��� $$������ �������� ��� ����� ���� ������ ��������� ������ ��!A�)�$ ��������� '(<8@=<O@KK�

%������� �� 1��� A� ;�� 9� �����22�� -� ������ :�%��� E� 1����������� 6� !����22 5� "���� 6"�%������ 5� � �� 9� )///� !�������� �� ��������� ��� ��� ���� -� ����� ������� ���;?� �������� ��� ������ -� ��� $$ ������ ?��1����� )@8KKKOK0)�

E��2 "� !�� -� &�����!�6������ ��� 9���� �%� >����9�� -��.��� ;� ?������ +� %������ 6� "������ "�M�����A � �� - J� !���� 1� &������ ;� >���H����� +������ ���� !� J��� 6� 9������ 6� 5��� %��������� 96� '(((� � �� �������� ����� �� �������O������ ��������� � ����������� ��� � ��?����� =(<80'<O0'@�

+����� 9&� �� ��� '(()� ��� ������� �� ��� �� �� ���� ��%����� '/)8)�

����� � ����� �� �� !��" !�� �#�� ���