Genoma Peces.unlocked

Sector agroalimentario

Genmica de especies pisccolasInforme de Vigilancia Tecnolgica

Genmica de especies pisccolasInforme de Vigilancia Tecnolgica

GENMICA DE ESPECIES PISCCOLAS

El presente informe de Vigilancia Tecnolgica ha sido realizado en el marco del convenio de colaboracin conjunta entre Genoma Espaa y la Fundacin General de la Universidad Autnoma de Madrid (FGUAM), entidad que gestiona el Crculo de Innovacin en Biotecnologa (CIBT), perteneciente al Sistema de Promocin Regional de la Innovacin MADRID+D. Los autores de este informe agradecen la colaboracin ofrecida por toda la comunidad cientfica y empresarial para la realizacin de este informe, en especial a: - D. Mar Ajubita, D. Isabel Cano, D. David Muoz y D. Carlos Buergo (Phyllum). - Dra. Carmen Amaro (Univ. de Valencia). - Dr. Julio Coll (INIA). - Dra. Mara Amparo Estepa (Univ. Miguel Hernndez). - Dra. Rosa Flos (Centro de Referencia en Acuicultura de la Generalitat de Catalunya). - Dra. Alicia Gibello (Univ. Complutense de Madrid). - Dr. Miguel Jover (Univ. Politcnica de Valencia). - Dr. Victoriano Mulero (Univ. Murcia). - Dr. Lluis Tort (Univ. Autnoma de Barcelona). - Dr. Alberto Villena (Univ. de Len). - Dr. Jos Antonio Snchez (Univ. de Oviedo). - Dra. Sara Isabel Prez (CIB-CSIC). La reproduccin parcial de este informe est autorizada bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando: Genmica de Especies Pisccolas. GENOMA ESPAA/ CIBT-FGUAM. Genoma Espaa no se hace responsable del uso que se realice de la informacin contenida en esta publicacin. Las opiniones que aparecen en este informe corresponden a los expertos consultados y a los autores del mismo.

Copyright: Fundacin Espaola para el Desarrollo de la Investigacin en Genmica y Protemica/ Fundacin General de la Universidad Autnoma de Madrid Autores: Marta Lpez (CIBT) Paloma Mallorqun (CIBT) Miguel Vega (Genoma Espaa) Edicin: Silvia Enrquez (Genoma Espaa) Referencia: GEN-ES03003 Fecha: Noviembre 2003 Depsito Legal: M-54061-2003 ISBN: 84-607-9254-4 Diseo y realizacin: Spainfo, S.A.

4


ndice de contenido

RESUMEN EJECUTIVO

7

1.

INTRODUCCIN A LA GENMICA Y PROTEMICA

8

2.

INTRODUCCIN A LA ACUICULTURA 2.1. Definicin de acuicultura. 2.2. El estado mundial de la acuicultura.

9 9 10

3.

ESPECIES PISCCOLAS CULTIVADAS EN ESPAA 3.1. Produccin de las especies pisccolas cultivadas en Espaa. 3.2. Distribucin geogrfica de las actividades de acuicultura en Espaa. 3.3. Actividades de I+D en acuicultura en Espaa.

13 14 17 18

4.

APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGA EN LA ACUICULTURA DE ESPECIES PISCCOLAS 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8. 4.9. Secuenciacin. Genmica funcional. Vacunas. Seleccin Asistida por Marcadores. Transgnesis. Embriognesis y Clulas madre. Clonacin reproductiva de peces. Produccin de protenas. Tecnologa de la PCR. 20 20 24 25 33 36 48 49 50 52 55 56

4.10. Tcnicas de control del sexo. 4.11. Probiticos.

5.

ESPECIES PISCCOLAS CULTIVADAS EN TERRITORIO ESPAOL 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8. 5.9. Dorada. Lubina y besugo. Salmn. Rodaballo. Atn rojo. Lenguado. Trucha. Anguila. Esturin.

57 57 57 58 58 59 59 60 61 61 62 62 63

5.10. Tenca. 5.11. Tilapia. 5.12. Otras especies pisccolas de posible inters para la acuicultura espaola.

5

6.

EL SECTOR EMPRESARIAL EN LA ACUICULTURA ESPAOLA 6.1. Estructura organizativa del sector de la acuicultura en Espaa. 6.2. Condicionantes de la acuicultura espaola.

66 68 69

7.

LEGISLACIN RELACIONADA CON LA ACUICULTURA

72

8.

EVALUACIN DE LAS CAPACIDADES TECNOLGICAS ESPAOLAS

75

9.

EJEMPLOS DE GRUPOS DE INVESTIGACIN ESPAOLES EN GENMICA DE ESPECIES PISCCOLAS

76

10. CONCLUSIONES

83

11. ANEXOS Anexo I: Proyectos de investigacin en Espaa sobre biotecnologa aplicada al cultivo de especies pisccolas. Anexo II: Patentes publicadas o solicitadas en Espaa sobre biotecnologa aplicada al cultivo de especies pisccolas. Anexo III: Clasificacin de empresas de acuicultura en Espaa por especie cultivada.

85

85 95 96

12. REFERENCIAS

100

GLOSARIO

104

6


Resumen ejecutivo

La importancia de la acuicultura crece cada ao debido a la disminucin de las reservas de pesca mundiales y al incremento de la demanda de los productos del mar. Espaa posee una amplia extensin litoral y fluvial que le han permitido, en las dos ltimas dcadas, lograr un puesto competitivo en la acuicultura mundial, si bien ciertas amenazas se divisan sobre el horizonte. Las especies pisccolas con mayor produccin en Espaa son la trucha arcoiris, la dorada, la lubina, y el rodaballo. No cabe duda que las tcnicas genmicas y protemicas suponen uno de los determinantes para el desarrollo de esta industria. Algunas de las aplicaciones mas claras son: el diseo de vacunas ms efectivas que disminuyan la mortalidad de los peces por enfermedades infecciosas y eviten la administracin de medicamentos costosos y poco efectivos; la caracterizacin de marcadores genticos asociados a caractersticas de inters comercial, que permita la seleccin de reproductores que tuvieran en su ADN las caractersticas deseadas; las tcnicas de transgnesis que han demostrado sus aplicaciones en el diseo de peces resistentes a enfermedades y a condiciones ambientales adversas, o cuyo crecimiento y maduracin han sido modificados con el fin de conseguir ejemplares mayores en menor tiempo; y por ltimo la identificacin de especies y la deteccin temprana de patologas. El rodaballo es actualmente la especie con mayor produccin acucola en Espaa, mientras que la produccin de lubina y la dorada han sufrido un duro revs debido a la competitividad procedente de otros pases europeos. La especie de mayor inters para la acuicultura espaola es el lenguado, que posee grandes expectativas de mercado si se consigue solventar algunos de los problemas que en estos momentos dificultan su cultivo.

Como parte de la elaboracin del presente informe, se ha realizado un anlisis de la produccin cientfica y tecnolgica espaola en el campo de la biotecnologa aplicada a especies pisccolas. El resultado de dicho anlisis pone de manifiesto que el importante esfuerzo pblico realizado (en trminos de financiacin) en los ltimos aos no ha producido retornos apreciables a la industria ni ha mejorado nuestra posicin cientfica. Algunas de las causas de esta situacin se encuentran en la falta de coordinacin entre los grupos de investigacin, la realizacin de proyectos en especies o con objetivos que carecen de inters para nuestra industria y la escasa financiacin privada para acometer investigacin en genmica de peces. A la vista de las importantes inversiones que estn realizando pases competidores como Chile o Noruega, no es atrevido vaticinar que Espaa podra seguir perdiendo capacidad competitiva en este sector. La nica forma de lograr competir con xito radica en incrementar el valor de nuestra produccin final, objetivo que puede lograrse por, entre otras, la aplicacin de nuevas tecnologas como la genmica. Bajo esta creencia, Genoma Espaa junto con grupos cientficos, empresas privadas espaolas, administraciones y socios internacionales, como Genoma Canad, ha puesto en marcha uno de los proyectos ms estratgicos, y ms ambiciosos, nunca establecido en nuestro pas, sobre genmica de peces.

7

1. Introduccin y objetivos del informeLa Genmica y la Protemica son dos de las tecnologas que ms inters estn despertando en los ltimos aos. Sin embargo, todava existe cierta confusin respecto a los mbitos de accin de ambas tecnologas. Mientras que la Genmica trata el estudio del genoma en su conjunto, la Protemica se basa especficamente en el anlisis de las protenas codificadas por el genoma. El objetivo de este informe es revisar las tecnologas biolgicas en general, y la genmica y protemica en particular que permiten una mejora en el cultivo de especies pisccolas marinas o de agua dulce. Por este motivo, y aunque en el texto se haga referencia a esta prctica como acuicultura en general, nos centraremos tan solo en el cultivo de peces o piscicultura.

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2. Introduccin a la acuicultura2.1. Definicin de acuiculturaEl trmino acuicultura engloba todas las actividades que tienen por objeto la produccin, desarrollo y comercializacin de organismos acuticos, animales o vegetales, de aguas dulces o saladas1. Esto implica el control de las diferentes etapas de su desarrollo, proporcionando a los organismos los medios adecuados para su reproduccin, crecimiento, desarrollo y engorde. Existe una gran variedad de trminos que se aplican indistintamente para referirse al desarrollo de prcticas de acuicultura. Sin embargo, existe una divisin de dichas actividades que se corresponden con la fragmentacin del mercado de los productos cultivados. De esta forma, podemos hablar de Marcultura o Maricultura para referirnos cultivos en agua marina, mientras que la Acuicultura continental se trata de una acuicultura de agua dulce.

DEFINICIN DE ACUICULTURA SEGN LA FAO2La acuicultura es la cra y cultivo de los organismos acuticos, ya sean peces, moluscos, crustceos o plantas acuticas. El cultivo implica algn tipo de intervencin en el proceso para incrementar la produccin, por ejemplo el almacenamiento regular, la alimentacin, la proteccin contra los depredadores, etc. El cultivo implica tambin la propiedad individual o colectiva del stock explotado. Con fines estadsticos, los organismos acuticos que son recolectados por un individuo o un colectivo que los ha tenido durante el periodo de cultivo contribuyen a la acuicultura, mientras que los organismos acuticos que son explotables por todos como recurso de propiedad pblica, con o sin licencia apropiada, constituyen la cosecha de las pesqueras. (FAO, 1997).

1 2

Barnabe, G. (1990). Aquaculture. Ellis Horwood Books in Aquaculture and Fisheries Support. Ellis Horwood Ltd. FAO (1999). Desarrollo de la Acuicultura. FAO Orientaciones Tcnicas para la Pesca Responsable 5.

9

2.2. El estado mundial de la acuiculturaDurante el ao 2000, la produccin total en acuicultura, incluyendo plantas acuticas, fue de 46 millones de toneladas en peso y de un valor de 56.500 millones dlares. Cabe destacar que China fue responsable del 71% de la produccin, y del 50% del valor total. Excluyendo a las plantas acuticas, China como principal pas productor en acuicultura obtuvo un volumen de produccin de 24,6 millones de toneladas durante el ao 2000, mientras que en el resto del mundo esta cifra se reduce a 11 millones de toneladas. Segn datos proporcionados por la FAO, en el ao 2000 ms de la mitad de la produccin acucola mundial proceda de aguas marinas y salobres. No obstante, se ha registrado un mayor crecimiento en los ltimos 30 aos en la produccin acucola de agua dulce3.

PRODUCCIN ACUCOLA MUNDIALAguas continentalesMillones de toneladas 16 16

Aguas marinasMillones de toneladas

12 China

12 China

8

8

4 Mundial, con exclusin de China 0 1970 1980 1990 2000

4

Mundial, con exclusin de China

0 1970 1980 1990 2000

Fig. 1. Produccin acucola mundial en aguas marinas y continentales. Fuente: El estado mundial de la pesca y la acuicultura. 2002. FAO (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm).

A diferencia de la pesca de captura, el ritmo de crecimiento de la acuicultura a nivel mundial se ha valorado en un 7,2%4 en los ltimos 30 aos, siendo China el pas con mayor crecimiento de produccin, en torno al 11%5. Segn estos datos, la acuicultura crece con mayor rapidez que todos los dems sectores de produccin de alimentos de origen animal. El aumento de la produccin en acuicultura es en parte debido a la gran diversidad de especies acuticas que pueden adaptarse fcilmente a diversas condiciones de produccin en distintas regiones del mundo.

Adems, si tenemos en cuenta que la poblacin mundial experimenta una expansin continua, que segn Naciones Unidas alcanzar los 8 mil millones en el ao 2025, y que las reservas de pesca se aproximan a su vez a su lmite biolgico, umbral que se estima se alcanzar en el ao 20406, la acuicultura representa una ms que interesante oportunidad de negocio.

3 4

5 6

El estado mundial de la pesca y la acuicultura (2002). FAO. (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm). Gonzlez Laxe, F. (2001). Avances en el desarrollo de la acuicultura marina. Instituto de Estudios Econmicos Fundacin Pedro Barri de la Maza. El estado mundial de la pesca y la acuicultura (2002). FAO. (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm). Igor I. Solar. Biotecnologa Aplicada a la Acuicultura. Aquanoticias, 6-10. Dic. 2001-Ene. 2002.

10


La consideracin de series estadsticas desde el ao 1996 sobre produccin y consumo de pescado a nivel mundial, arroja un importante aumento tanto de las producciones acucolas como del consumo de pescado por persona y da, as como estancamiento de las capturas marinas.

PRODUCCIN PESQUERA MUNDIAL Y SU UTILIZACIN1996 1997 1998 1999 2000 2001*

(millones de toneladas) PRODUCCIN CONTINENTAL Captura Acuicultura Continental total MARINA Captura Acuicultura Marina total Captura total Acuicultura total Total de la pesca mundial UTILIZACIN Consumo humano Usos no alimentarios Poblacin (miles de millones) Suministro de pescado como alimento por persona (kg) 88,0 32,2 5,7 90,8 31,7 5,8 92,7 25,1 5,9 94,4 32,2 6,0 96,7 33,7 6,1 99,4 29,4 6,1 86,1 10,8 96,9 93,5 26,7 120,2 86,4 11,1 97,5 93,9 28,6 122,5 79,3 12,0 91,3 87,3 30,5 117,8 84,7 13,3 98,0 93,2 33,4 126,6 86,0 14,2 100,2 94,8 35,6 130,4 82,5 15,1 97,6 91,3 37,5 128,8 7,4 15,9 23,3 7,5 17,5 25,0 8,0 18,5 26,5 8,5 20,1 28,6 8,8 21,4 30,2 8,8 22,4 31,2

15,3

15,6

15,7

15,8

16,0

16,2

Con exclusin de las plantas acuticas. * Estimacin preliminar.Tabla 1. Produccin pesquera mundial y su utilizacin (Fuente: El estado mundial de la pesca y la acuicultura. 2002. FAO) (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm).

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Los datos relativos a la produccin de Acuicultura procedentes de los Estados miembros de la Unin Europea durante el ao 2000 indican una aportacin de tan solo el 1,1% en acuicultura continental, y un 7,24% en acuicultura marina. Otro dato relevante es la disminucin en la produccin de acuicultura continental y pesca en comparacin con los datos referentes al ao 1996.

PRODUCCIN PESQUERA DE LA UNIN EUROPEA, BALANCE DE ALIMENTOS Y COMERCIO1988 Produccin de la acuicultura Continental (miles de Tm) Porcentaje del total mundial Marina (miles de Tm) Porcentaje del total mundial 195 2,7 714 15,7 Produccin de la pesca Continental (miles de Tm) Porcentaje del total mundial Marina (miles de Tm) Porcentaje del total mundial 97 1,6 7.037 8,5 Produccin de la pesca y la acuicultura Suma total (miles de Tm) Porcentaje del total mundial 8.043 8,0 Balance de alimentos Suministro alimentario total (millones de Tm) Suministro per cpita (kg) Proporcin del pescado en las protenas animales (%) 7.795 21,5 9,3 8.358 22,7 9,9 8.805 23,5 10,3 7.578 7,5 7.750 6,4 7.236 5,5 96 1,5 6.570 8,3 104 1,4 6.507 7,6 86 1,0 5.861 6,8 226 2,4 686 11,2 250 1,6 889 8,2 240 1,1 1 049 7,4 1992 1996 2000

Comercio de productos pesqueros Importaciones totales (millones $) Porcentaje del total mundial Exportaciones totales (millones $) Porcentaje del total mundial 12.261 38,7 6.400 20,2 17.270 43,0 8.580 21,4 19.352 36,7 11.000 20,9 19.609 35,5 11.398 20,6

Tabla 2. Produccin pesquera de la Unin europea, balance de alimentos y comercio (Fuente: El estado mundial de la pesca y la acuicultura. 2002. FAO) (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm).

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3. Especies pisccolas cultivadas en EspaaEspaa es uno de los pases con mayor consumo de pescado en el mundo, segn datos pertenecientes al ao 1995 Espaa importaba una media de un milln de toneladas de pescado por ao. La produccin acucola nacional se encuentra en el orden de 0,25-0,3 millones de toneladas anuales7. El mejilln, la trucha arcoiris, la dorada, la lubina y el rodaballo, son las especies de mayor produccin en Espaa. Las caractersticas geogrficas de Espaa, con gran extensin de litoral aunque con un limitado nmero de bahas, e importantes ncleos urbanos y tursticos en la costa, obligan a realizar la mayor parte de las actividades de acuicultura en mar abierto8.

PRINCIPALES ASPECTOS QUE FAVORECEN LAS EXPECTATIVAS DE CRECIMIENTO DE LA ACUICULTURA MARINA PISCCOLA EN ESPAA

Disminucin de capturas. Dimensin del mercado espaol. Cambio de hbitos alimenticios. Tendencia a mayor elaboracin de los productos. La costa y su climatologa. Mejora en la eficacia del sistema de transportes. Apoyo IFOP9. Nmero suficiente de empresas con tamao y tecnologa adecuada, la calidad de sus productos y su conocimiento sobre los mercados locales.

(Fuente: Acuicultura [1999] Documentos COTEC sobre necesidades tecnolgicas).

7 8 9

Coll Morales, J. (2002). Development of Aquaculture in Spain. Aquaculture Europe 33, 3-8. 11 Acuicultura (1999). Documentos COTEC sobre necesidades tecnolgicas. IFOP: Instrumento Financiero de Orientacin de la Pesca http://europa.eu.int/scadplus/leg/es/lvb/l60017.htm

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3.1. Produccin de las especies pisccolas cultivadas en EspaaLas especies con produccin de al menos 10.000 toneladas por ao son el mejilln, la trucha arcoiris, la dorada, el rodaballo y la lubina. Esta produccin significa ms del 18% de la pesca espaola, el 25% de la acuicultura de Europa y el 3% de la acuicultura del mundo. Espaa contina siendo el mayor productor de mejilln con un porcentaje del 32,7% del total mundial, y uno de

los principales en el cultivo de la trucha, con un 7,1% del total. La siguiente tabla contiene una relacin de las especies pisccolas que han sido cultivadas en territorio espaol, y su estado comercial y de desarrollo. Estos datos provienen de Fishbase10, base de datos desarrollada por el WorldFish Center en colaboracin con la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO)11, con el apoyo de la Comisin Europea.

PECES CULTIVADOS EN ESPAANombre cientfico Acipenser naccarii Anguilla anguilla Dentex dentex Dicentrarchus labrax Lampetra planeri Oncorhynchus mykiss Oreochromis ssp. Salmo salar Scophthalmus maximus Seriola dumerili Solea solea / Senegalensis Sparus auratus Thunnus thynnus Tinca tinca Nombre local Esturin del Adritico Anguila Dentn Lubina Lamprea de arroyo Trucha arcoiris Tilapia roja Salmn del Atlntico Rodaballo Seriola Lenguado Dorada Atn Tenca Uso experimental comercial comercial comercial experimental comercial comercial comercial comercial experimental comercial comercial comercial comercial Origen cuestionable nativo nativo nativo cuestionable introducido introducido nativo nativo nativo nativo nativo nativo nativo

PECES POTENCIALMENTE CULTIVABLES EN ESPAAAcipenser baerii Acipenser sturio Alburnus alburnus Ameiurus melas Ameiurus nebulosus10 11

Esturin siberiano Esturin comn Albur Pez gato Pez gato

introducido nativo introducido introducido introducido

FishBase (http://www.fishbase.org). Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin http://www.fao.org

14


PECES POTENCIALMENTE CULTIVABLES EN ESPAA (Continuacin)Carassius auratus Carassius carassius Coryphaena hippurus Cyprinus carpio Diplodus sargus Esox lucius Hucho hucho Ictalurus punctatus Liza aurata Liza ramada Liza saliens Megalops atlanticus Micropterus salmoides Mugil cephalus Pagrus pagrus Perca fluviatilis Pleuronectes platessa Pomatomus saltatrix Pseudocaranx dentex Rutilus rutilus Salmo trutta Salvelinus alpinus Salvelinus fontinalis Sander lucioperca Scardinius erythrophthalmus Scomber japonicus Silurus glanis Solea impar Trachinotus ovatus Pez rojo Carpin Dorado Carpa Sargo Lucio Salmn del Danubio Pez gato Galupe Capitn Gala blanca Pez lagarto Black-bass Albur Pargo Perca europea Solla Anchoa de banco Jurel dorado Rutilo Trucha comn Salvelino Salvelino Lucioperca Escardino Caballa Siluro Lenguado Palometa blanca introducido nativo nativo introducido nativo introducido introducido introducido nativo nativo nativo nativo introducido nativo nativo introducido nativo nativo nativo introducido nativo nativo introducido introducido introducido nativo introducido nativo nativo

Tabla 3. Peces cultivados en Espaa y potencialmente cultivables en Espaa (Fuente: Froese, R. and D. Pauly. Editors. 2003; FishBase. World Wide Web electronic publication. http://www.fishbase.org version 10 Septiembre-June 2003).

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Segn datos procedentes de la Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos (JACUMAR)12, la produccin en acuicultura espaola en el 2001 fue superior a las 313.000 toneladas, de las que casi 257.000 corresponden a produccin de moluscos, 56.000 toneladas a peces y el resto a crustceos. En el siguiente grfico se puede observar la predominancia del cultivo de la trucha arcoiris en Espaa, con un 11% de la produccin total acucola, seguida de lejos por la dorada, con un 3%, y en menos medida por tnidos, rodaballo y lubina.

80% Mejilln Trucha Arcoiris Dorada 11% 3% Tnido Ostras Almeja Rodaballo Lubina Berberecho Otros

Fig. 2. Produccin en Espaa en el 2001 por especie (Tm). Fuente: JACUMAR, http://www.mapya.es/jacumar

El desarrollo de la acuicultura en Espaa ha sido sobrepasado en los ltimos aos por varios pases que han sufrido un rpido progreso. Este es el caso de Noruega y Chile, mientras que otros pases con menor produccin total son importantes competidores en el cultivo de determinadas especies, como por ejemplo Grecia. En 1997 Espaa alcanz el 1% de la produccin mundial en volumen y el 20% de la produccin de la Unin Europea. Al ao siguiente, la acuicultura espaola ocupaba el primer puesto en produccin dentro del Unin Europea13. En 1999 Noruega se colocaba por delante, mientras que Francia estaba

situada en un puesto inferior a poca distancia de Espaa. En este ao Espaa se situ en el puesto 11 del ranking mundial de productores. Pese a que la produccin total espaola en acuicultura ha aumentado en los ltimos aos, se observa una prdida de competitividad con respecto al ao 1997. La capacidad mxima de produccin de especies pisccolas en Espaa se estima en 600.000 toneladas. La mitad de las Comunidades Autnomas todava no han explorado sus posibilidades en la acuicultura, por lo que todava existe un amplio margen de crecimiento14.

PRODUCCIN ACUCOLA EN TONELADASToneladas 500.000 450.000 400.000 350.000 300.000 250.000 200.000 150.000 100.000 50.000 0 GRECIA ESPAA CHILE NORUEGA 1988 1996 2000

Fig. 3. Produccin en acuicultura de Grecia, Espaa, Chile y Noruega. Fuente: JACUMAR, http://www.mapya.es/jacumar

12 13 14

Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos, JACUMAR (http://www.mapya.es/jacumar). Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos, JACUMAR (http://www.mapya.es/jacumar), segn datos de la FAO. Arnal, J. I. (1980). Posibilidades de la Acuicultura en el litoral espaol. Beca Rumasa de Investigacin. Anlisis Econmicos S.A. 1:1-337.

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3.2. Distribucin geogrfica de las actividades de acuicultura en EspaaSegn las caractersticas de cada zona geogrfica, se ha apostado por el cultivo de especies que se adapten mejor a las condiciones de determinadas zonas. Del mismo modo, el desarrollo de los sistemas de cultivo ha sido diferente en funcin de las necesidades de cultivo de dichas especies y las caractersticas biogeogrficas de la zona. Catalua y Andaluca lideran la produccin de acuicultura de especies pisccolas en la regin mediterrnea y sur-atlntica, principalmente mediante el cultivo de lubina y dorada. En la zona cantbrica y del norte del atlntico, en especial Galicia, predomina el cultivo del rodaballo como principal especie acucola. En la ltima dcada, la acuicultura marina espaola ha sufrido un crecimiento significativo.

DISTRIBUCIN GEOGRFICA DE LA ACUICULTURA MARINA EN ESPAARegin o zona Especies Moluscos (mejilln, ostra, almeja, berberecho). Rodaballo. Cantbrico y Galicia Salmn. En regresin (no compite con industrias ms maduras del norte europeo). Cultivos experimentales. Jaulas flotantes o estanques de cultivo (antiguas explotaciones salineras de la regin sur-atlntica). Comentarios

Bateas, parques de cultivo.

Instalaciones en tierra.

Pulpo, besugo.

Lubina y dorada.

rea mediterrneo y Sur-atlntica

Ostras, almejas, mejilln (langostino en menor medida). Atn rojo, pulpo, dentn y lenguado.

Mar abierto.

En un futuro.

Canaria y Balear

Lubina y dorada.

Jaulas flotantes. Produccin limitada, satisface la demanda nacional. Engorde de animales capturados vivos. Produccin limitada, sin gran xito empresarial. Nuevas tecnologas. Inters por su produccin.

Valencia y zona sur

Anguila.

Atn.

Langostino. Sin zona especfica Besugo, dentn, pulpo. Almeja y moluscos pectnidos.

Tabla 4. Distribucin geogrfica de la acuicultura marina espaola (Fuente: JACUMAR; http://www.mapya.es/jacumar; Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001).

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Por lo que respecta al cultivo de especies continentales, la primera especie es la trucha arcoiris, cultivada en tanques de cultivo, cuya cra se centra principalmente en Galicia, y en un segundo nivel, en Castilla-La Mancha, Castilla y Len, Navarra, Asturias, Catalua, Andaluca y La Rioja.

DISTRIBUCIN GEOGRFICA DE LA ACUICULTURA CONTINENTAL EN ESPAARegin o zona Especies Comentarios

Tramos altos de ros con caudales elevados, constantes, y con pequeas fluctuaciones de temperatura, y cierta alcalinidad. Fuentes de agua oxigenadas y aprovechadas mediante recirculacin.

Trucha arcoiris

Tanques de cultivo.

Lagos y embalses de Extremadura, y Castilla y Len en menor medida. Baleares. Cuenca del Guadalquivir.

Tenca Carpa Esturin

Consumo local. Pequea produccin. Intento de cultivo. Intento de freno mediante la introduccin del cangrejo seal.

Casi todos los ros de la pennsula.

Cangrejo rojo

Tabla 5. Distribucin geogrfica de la acuicultura continental espaola (Fuente: JACUMAR; http://www.mapya.es/jacumar; Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001).

3.3. Actividades de I+D en acuicultura en EspaaEspaa ha invertido desde sus primeros planes en acuicultura en 1982 alrededor de 70 millones de euros en el desarrollo de tecnologa propia con aplicaciones en acuicultura. Ms de 20 especies

distintas se encuentran actualmente en distintas fases de desarrollo15. Desde 1982, fecha en la cual se puso en marcha el primer programa de I+D en acuicultura en Espaa, se han desarrollado diversos programas hasta la actualidad.

PROGRAMAS NACIONALES ESPAOLES EN ACUICULTURAPerodo 1982-1988 1988 1988-1991 1992-1999 1996-1999 1988-1999 Programa 1.er Programa de I+D en acuicultura. Plan de Cultivos Marinos. Programa Nacional de Recursos Marinos y Acuicultura. Programa Nacional de Ciencias Agrarias (Subprograma de Ganaderas y Acuicultura). Programa Nacional de Ciencia y Tecnologa Marinas. Programas en transferencia de resultados de investigacin y dotacin de infraestructuras.

Tabla 6. Programas Nacionales espaoles en acuicultura (Fuente: Coll Morales, J. (2002). Development of Aquaculture in Spain. Aquaculture Europe 33, 3-8, tomado de: Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001).

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Coll Morales, J. (2002). I Reunin de la Red Nacional sobre Biologa Molecular de Peces. INIA Investigacin y Desarrollo n2, 12-15, tomado de: Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001.

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Los proyectos de investigacin que se desarrollaron durante estos periodos tuvieron lugar principalmente en varios centros pertenecientes al CSIC, el Instituto Espaol Oceanogrfico (IEO), el Instituto de Investigaciones Agrarias y Alimentarias (INIA), y distintas universidades y empresas16. En el ao 2001 tuvo lugar la primera reunin de la Red Nacional sobre Biologa Molecular de Peces entre un grupo de laboratorios espaoles participantes en la red17. En esta reunin se elabor un listado de aquellas herramientas o tecnologas clave en el desarrollo de la I+D en la acuicultura espaola: Estudio y caracterizacin de la regulacin de la transcripcin en las especies seleccionadas (identificacin de factores de transcripcin, promotores, amplificadores). Obtencin de libreras genmicas y cDNA de especies seleccionadas mediante diversas tecnologas de genmica y protemica (microarrays de ADN y protenas, mapeo de genes, etc.). Desarrollo de mtodos de transfeccin de zigotos e identificacin de marcadores moleculares de los transgenes insertados. Mejora en la integracin controlada del ADN en los genomas de especies seleccionadas. Desarrollo de un banco de clulas (lneas celulares, clulas madre).

En diciembre del ao 2002 tuvo lugar una sesin preparatoria para la elaboracin de un proyecto de tres aos de duracin sobre biotecnologa aplicada a genmica de peces, dirigida por Genoma Espaa18 en colaboracin con Genome Canad19, su homloga canadiense. Los representantes del sector empresarial expusieron sus necesidades en el sector de la acuicultura, mientras que los investigadores explicaron qu posibles soluciones podan ofrecer desde su experiencia investigadora. Como consecuencia de esta reunin se lleg a una serie de preacuerdos con distintas empresas y grupos de investigacin, quienes consideraron prioritaria la investigacin en peces planos, es decir, rodaballo y lenguado. Los proyectos presentados se centran en la identificacin de ETS o Expressed Sequence Tags, con aplicaciones en embriologa, inmunologa y crecimiento. Asimismo, dejaron constancia de la importancia del estudio de peces modelo, como son el pez cebra y el pez fugo. Es interesante sealar la falta de inters por parte de las empresas en especies antes consideradas en auge, en concreto la dorada y la lubina, ya que la baja superviviencia de alevines y la competencia procedente de otros pases mediterrneos ha obligado a buscar otras opciones ms rentables. En el ANEXO I del presente informe se recogen los centros de investigacin espaoles que actualmente tienen en marcha proyectos de investigacin financiados con fondos pblicos, relacionados con las tcnicas de genmica y protemica aplicadas a la acuicultura de especies pisccolas.

16 17

18 19

Coll Morales, J. Desarrollo futuro de la acuicultura en Espaa. Noticia: El Correo Agrario 09/06/01. Coll Morales, J. (2002). I Reunin de la Red Nacional sobre Biologa Molecular de Peces. INIA Investigacin y Desarrollo n2, 12-15, tomado de: Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001). Genoma Espaa http://www.gen-es.org Genome Canad http://www.genomecanada.ca

19

4. Aplicaciones de la biotecnologa en la acuicultura de especies pisccolasUna especie modelo para ser cultivada sera aquella que obtenga un alto precio en un mercado establecido, elevada tasa de crecimiento, resistencia a enfermedades, requerimientos biolgicos o ambientales no demasiado estrictos, y que sus primeros estados de vida sean fciles de obtener, tanto a partir de animales capturados en el medio natural como a travs de la cria en cautividad. El presente informe pretende realizar un anlisis nicamente de las tcnicas que la genmica y protemica proporcionan como herramientas para el desarrollo de la acuicultura. Por este motivo, el resto de tcnicas de mejora gentica, como son la manipulacin cromosmica y los sucesivos cruzamientos entre miembros de la misma o diferente especie, tan solo sern tratadas en la introduccin como tcnicas complementarias.

4.1. SecuenciacinEl genotipado sistemtico y la secuenciacin del genoma proporcionan el acceso a todos los genes de una determinada especie, lo que permite la seleccin de especies pisccolas en funcin de sus caractersticas genticas (seleccin en base al genotipo), y no slo en funcin de su aspecto o circunstancias particulares (seleccin en base al fenotipo) tal y como se vena realizando hasta la fecha. La seleccin en base al genotipo tiene entre sus principales ventajas la rapidez y la eficacia, permitiendo la obtencin del producto en un tiempo considerablemente menor (ej. progenie de peces). Hasta la fecha, la seleccin en base al genotipo es marginal puesto que se trata de una tcnica nueva y adems requiere del desarrollo previo de nuevos conocimientos. No obstante, la gran mayora de pases competidores con Espaa en el sector de la acuicultura ya han introducido la seleccin en base al genotipo en sus programas de mejora y/o de introduccin de nuevas especies. Las estrategias seguidas por el principal consorcio de Secuenciacin del Genoma de Pez cebra son la Secuenciacin de libreras genmicas aleatorias y la secuenciacin clon por clon.

SECUENCIACIN DE LIBRERAS GENMICAS ALEATORIAS El genoma completo es multiplicado y fragmentado muchas veces al azar en millones de pedazos del ADN no mayores a 500 bases cada uno. La secuencia de bases que forma cada fragmento es determinada mediante un proceso conocido como secuenciacin. Mediante un programa informtico se comparan las secuencias de millones de fragmentos, identificando los segmentos superpuestos. Los segmentos superpuestos forman segmentos de mayor tamao que son ensamblados para dar lugar a la secuencia del genoma completo.

SECUENCIACIN CLON POR CLON Determinacin de las secuencias del ADN de los genes expresados (ESTs20). Estos marcadores son utilizados para dividir cada cromosoma en pequeas regiones (mapeado). Cada segmento localizado entre dos marcadores es multiplicado y fragmentado al azar. La secuencia es determinada mediante regiones superpuestas, como ocurra en el mtodo anterior.

20

EST: Expressed Sequence Tag o identificador de una secuencia expresada (consultar el siguiente cuadro para obtener ms informacin).

20


Realmente ninguna de estas estrategias por separado puede dar paso a una secuencia consenso convincente del genoma del pez de inters, por lo que en ltimos aos los proyectos de secuenciacin de organismos superiores han empleado las dos estrategias para llegar a la completa secuenciacin de los genomas. Los proyectos de secuenciacin necesitan el apoyo de iniciativas que permitan el acceso pblico a los resultados, tales como las secuencias de genes que se recopilan en GenBank21, o en bases de datos ESTs.

EST (Expressed Sequence Tag)Los genes presentes en el ADN son expresados en ARN mensajero (ARNm) a travs del proceso de transcripcin. El ARNm es luego traducido en protenas a travs del proceso de traduccin. La construccin de ESTs de realiza mediante la copia de ARNm en fragmentos de ADN complementario (cADN) por la enzima transcriptasa inversa. Los ESTs son por tanto una representacin de los genes que se estn transcribiendo en un tejido en un momento determinado y en una especie concreta. Aplicaciones de las bases de datos de ESTs: Identificacin de genes que se transcriben en un determinado momento. Deteccin de genes que se transcriben en un tejido. Identificacin de posibles genes. Caracterizacin de los lmites de un gen e intrones. Secuenciacin de genes en especies donde no se dispone del genoma completo secuenciado.

21

GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html

21

SECUENCIACIN aleatorias ADN DEL PEZFragmentacin en segmentos de pequeo tamao al azar

SECUENCIACIN clon por clon ADN DEL PEZFragmentacin en segmentos ordenados mediante enzimas de restriccin

1 1 6 4 5 3 2 7

2

3

4

5

6

Fragmentacin de cada segmento en secuencias de pequeo tamao

1 6 4 5 3

2 7

Secuenciacin de cada fragmento de ADN

Secuenciacin de cada fragmento de ADN Ensamblaje de los fragmentos superpuestos

Secuenciador de ADN Ensamblaje de los fragmentos segn orden conocido

2 1 3

4 5

6 7

1

2

3

4

5

6

7

SECUENCIA DE ADN DEL PEZ

SECUENCIA DE ADN DEL PEZ

Fig. 4. Mtodos de secuenciacin del genoma (Fuente: adaptado de, Genoma Humano: el Negocio de la Vida. Instituto Panamericano de Alta Direccin de Empresa. Tecnologas que rompen esquemas. Qu est pasando? Poltica de empresa, Continuidad 2000-2001).

Las especies cultivadas en acuicultura pertenecen en su mayora a especies prximas entre s, como es el caso de la dorada, lubina y besugo. Este es el motivo por el cual se elige generalmente una especie para realizar un anlisis de su genoma, y posteriormente trasladar la informacin al resto de especies relacionadas. El estudio de sus genes es sin embargo necesario a nivel de especie, ya que los genes de inters no suelen encontrarse en las zonas conservadas de estas especies. Actualmente se dispone del genoma completo secuenciado del pez fugo (Fugu rubripes), y existen numerosas iniciativas de secuenciacin de diferentes especies pisccolas en distintos pases . Tanto al pez fugo como al pez cebra (Danio rerio) se les considera peces modelo, puesto que los resultados obtenidos22

en la secuenciacin de su genoma podran explicar muchos procesos biolgicos caractersticos de las especies pisccolas, tales como la reproduccin, el crecimiento o la supervivencia a enfermedades o condiciones climticas entre otros. Adems, estos resultados son altamente extrapolables a otras especies de inters comercial, sirviendo as a mejorar la produccin y/o la productividad de las granjas pisccolas. A partir de estas secuencias completas se pretende la caracterizacin de secuencias gnicas, la identificacin de marcadores genticos de inters en acuicultura y la bsqueda de nuevas dianas teraputicas para el desarrollo de nuevos frmacos veterinarios.

22

The Zebrafish Information Network , ZFIN (http://zfin.org). Fugu Genome Project http://www.fugu-sg.org

22


PROYECTOS DE SECUENCIACIN DEL GENOMA DE ESPECIES PISCCOLASOrganismo Institucin Financiacin Base de datos NCBI24 Washington University25 26 University of Oregon 27 Fishman-MGH Carnegie Institute of Washington Stanford University28 Sanger Institute29 Estatus

Danio rerio (pez cebra)

Washington Univ Sanger Institute

NHI23

Incompleta

Oreochromis niloticus (tilapia)

Univ. of New Hampshire Genome BC Genome Canada Roslin Institute

Roslin Institute30

Incompleta

Salmo salar (Salmn Atlntico)

Genome British Columbia

Genome BC/Genome Canada31 Roslin Institute32

Incompleta

Takifugu rubripes (pez fugo)

International Collaboration33

MRC34 DOE35

HGMP-RC36 Joint Genome Institute37 Sanger Institute38 Institute of Molecular and Cell Biology39

Completa

Tetraodon nigroviridis (Pez globo verde)

Genoscope Whitehead Institute

NHGRI40

Genoscope41 Whitehead Institute42

Incompleta

Oryzias latipes (medaka)

Medaka Genome Initiative

Japanese government

Medaka fish43 Medaka Genome Initiative44

Incompleta

Tabla 7. Proyectos de secuenciacin del genoma de especies pisccolas. Fuente: elaboracin propia, tomado de: GOLDTM Genomes OnLine Database, http://wit.integratedgenomics.com/GOLD

23 24

25 26 27 28 29

30 31 32 33

34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

National Institutes of Health, US Department of Health and Human Services (http://www.nih.gov). National Center for Biotechnology Information,USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Zebrafish Genome resources (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish/index.html). WashU-Zebrafish Genome Resources Project (http://zfish.wustl.edu). ZFIN: Zebrafish information network (http://zfin.org). MGH / CVRC Zebrafish Server (http://zebrafish.mgh.harvard.edu). Stanford Genome Evolution Center (http://cegs.stanford.edu/index.jsp). ZFIN: Zebrafish information network (http://zfin.org). Zebrafish Genome resources (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish/index.html). Tilapia mapping database (http://www.thearkdb.org/browser?species=tilapia). GRASP, Genomic Research on Atlantic Salmon Project, Genome BC/Genome Canada (http://web.uvic.ca/cbr/grasp). Salmon mapping database (http://www.thearkdb.org/browser?species=salmon). International Fugu Genome Consortium: Institute of Molecular and Cell Biology (Singapore), Joint Genome Institute (U.S. Department of Energy), Human Genome Mapping Project (UK), Institute for Systems Biology (USA) (http://www.fugu-sg.org/project/info.html). MRC, Medical Reseach Council, UK (http://www.mrc.ac.uk). DOE, US Department of Energy (http://www.doe.gov) of California for The US Department of Energy. HGMP-RC, The Fugu Genomics Project, Medical Reseach Conuncil, UK (http://fugu.hgmp.mrc.ac.uk). Puffer fish project, EEUU, Joint Genome Institute, DOE (http://www.jgi.doe.gov/fugu). Fugu rubripes Sequencing Project (http://www.sanger.ac.uk/Projects/F_rubripes). Fugu genome project, Institute of Molecular and Cell Biology, Singapur (http://www.fugu-sg.org). NHGRI, National Human Genome Research Institute , USA (http://www.genome.gov). Tetraodon nigroviridis Genome Anlisis, Francia (http://www.genoscope.cns.fr/externe/tetraodon). Tetraodon nigroviridis genome at Whitehead, EEUU (http://www-genome.wi.mit.edu/annotation/tetraodon). Medaka fish, Japn (http://biol1.bio.nagoya-u.ac.jp:8000). Medaka Genome Initiative (http://medaka.dsp.jst.go.jp/MGI).

23

4.2. Genmica funcional45La informacin procedente de la secuenciacin de genomas de peces, como el pez cebra, medaka y pez fugo, proporciona la identificacin de genes que potencialmente posean caractersticas ventajosas o deseables comercialmente. El paso siguiente a esta identificacin de secuencias gnicas es lo que comnmente se conoce por anlisis de la expresin y regulacin de los genes. Dicho anlisis nos acerca al conocimiento de la funcin de los genes de inters y de cmo estos se activan o se inhiben.

PRINCIPALES OBJETIVOS DEL ANLISIS DE LA EXPRESIN GNICA EN PECES

Identificacin de marcadores genticos. Diseo de vacunas ms efectivas. Desarrollo de peces transgnicos.

Generalmente el anlisis de la expresin gnica se realiza mediante separacin de protenas por medio de electroforesis en geles bidimensionales, seguida de la secuenciacin de las protenas por espectrometra de masas46. Mediante estas herramientas se elaboran mapas de protenas y fragmentos peptdicos, los cuales se emplean para detectar la presencia y analizar la expresin de protenas implicadas en la regulacin de diversos procesos, tales como el desarrollo del pez y la resistencia a las enfermedades ms comunes. Sin embargo, existen otras tcnicas como los microarrays o chips de ADN, que permiten el anlisis de la expresin gnica de miles de genes simultneamente mediante la evaluacin de los niveles de ARNm . En la actualidad, tan solo se estn realizando este tipo de estudios por medio47

de microarrays de ADN en pez cebra, especie para la que se conocen un gran nmero de ESTs48. Debido al incremento de ESTs identificados en los ltimos aos (ver seccion anterior), en un futuro cercano ser posible realizar el anlisis de la expresin gnica de otras especies de inters en acuicultura. El lenguado49, carpa, tilapia, y trucha son algunas de las especies pisccolas de las que se dispone actualmente de un mayor nmero de secuencias expresadas50. Sin embargo, es necesaria la puesta en marcha de proyectos de investigacin espaoles que permitan identificar un gran nmero de ESTs en peces. Como consecuencia directa se obtendra una informacin muy valiosa que sera empleada en la mejora del crecimiento, engorde, y reproduccin de las especies con mayor potencial en acuicultura.

45

46

47

48

49 50

Genmica funcional: comprende la utilizacin de los conocimientos resultantes del estudio del genoma para obtener cantidades masivas de datos sobre la regulacin y la expresin en sistemas celulares completos. Para ms informacin consultar las fichas tecnolgicas del I Informe de Prospectiva Tecnolgica sobre el Impacto de la Biotecnologa en el Sector Sanitario, realizado por Genoma Espaa y el OPTI, y que puede obtenerse gratuitamente en la pgina web: http://www.gen-es.org Lpez, M.; Mallorqun, P.; Vega, M. (2002). Informe de Vigilancia Tecnolgica: Microarrays y biochips de ADN. CIBT-FGUAM/Genoma Espaa. EST (Expressed Sequence Tag): secuencia parcial de un cDNA clonado. Expressed Sequence Tags database, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST). En Japn se est desarrollando un chip de cDNA para el lenguado japons. Melamed, M., et al. (2002). The potential impact of modern biotechnology on fish aquaculture. Aquaculture 204, 255-269.

24


4.3. VacunasLas enfermedades infecciosas son la causa mayoritaria de las prdidas econmicas en Acuicultura. La prdida se estima en un 10% de los peces cultivados que mueren al ao, causando algunas de estas enfermedades mortalidades superiores al 90%51. La primera vacuna comercializada contra una enfermedad propia de peces cultivados sali al mercado en 1976 en Estados Unidos52, por lo que el desarrollo de vacunas para peces todava es una ciencia joven. Desde entonces, se han conseguido grandes avances que adems han sido introducidos en la industria de la acuicultura con xito. Actualmente, gran parte de las investigaciones en vacunas pisccolas se llevan a cabo por grupos de investigacin de la Universidad con departamentos de I+D de empresas comerciales que quieren aumentar la eficacia de la vacunacin.

Durante los ltimos 20 aos la vacunacin ha sido uno de los mtodos preventivos ms efectivos en el control de enfermedades infecciosas en los peces cultivados, principalmente en el salmn. Las ventajas principales del uso de vacunas son la reduccin en la mortalidad debido a enfermedades infecciosas, y la reduccin en el empleo de antibiticos53 ya que disminuye la aparicin de resistencias y efectos secundarios54. Para desarrollar una vacuna pisccola es imprescindible establecer e identificar los factores de virulencia o agente patgeno, y los mecanismos de respuesta del pez a nivel celular y humoral. Adems, la induccin del sistema inmune debe ser optimizada de tal forma que los peces vacunados sean capaces de desarrollar mecanismos de proteccin inmune contra el agente patgeno.

LA RESPUESTA INMUNE DE LOS PECES

El sistema inmune innato es el primer mecanismo de defensa de los peces, el cual incluye barreras fsicas como las mucosas y piel, leucocitos, y sustancias que inhiben inespecficamente el crecimiento de microorganismos infecciosos. El sistema inmune adaptativo posee dos estrategias de defensa, la respuesta humoral (reconocimiento y unin de antgenos55 solubles con clulas B, quienes secretan anticuerpos contra estos antgenos) y la respuesta celular (reconocimiento de antgenos de superficie celular por clulas T), por la cual se eliminan las clulas infectadas.

51 52 53 54

55

Fernndez-Alonso, M.; Estepa, A.; Coll, JM. Vacunas DNA en Acuicultura. Revista AquaTIC, n 4, Septiembre 1998. Vacuna contra la ERM (enteric mouth disease), causada por la bacteria Yersinia ruckeri. Vinitnantharat, S.; Gravningen, K.; Greger, E. (1999). Fish Vaccines. Advances in Veterinary Medicine. Vol. 41, 539-550. Heppell, J.; Davis, H. L. (2000). Application of DNA vaccine technology to aquaculture. Advanced Drug Delivery Reviews 43, 29-43. Antgeno: sustancia que induce la formacin de anticuerpos, debido a que el sistema inmune la reconoce como una amenaza.

25

a) Mtodos de vacunacin Factores tan importantes como la temperatura, la edad de los peces a vacunar, va de administracin, dosis, estacionalidad y el estado inmunolgico del pez, pueden influir en la induccin de una determinada respuesta inmune y por tanto en el proceso de vacunacin. Los peces pueden ser inmunizados mediante tres mtodos, inyeccin intramuscular o intraperitoneal, inmersin y administracin oral, que ofrecen distintos niveles de proteccin y eficiencia para cada tipo de vacuna. Hasta el momento, tan solo la inyeccin y la inmersin han sido desarrollados para su uso en una escala industrial. Existen varios tipos de vacunas orales que estn siendo aplicadas en fase experimental en peces de cultivo, con varias patentes concedidas56, pero por el momento no es una opcin tan efectiva como los otros mtodos de vacunacin.

Dentro de la acuicultura se han realizado diferentes estudios para obtener vacunas orales eficaces frente a patgenos como Y. ruckerii para el que existe una vacuna oral comercial eficaz en el tratamiento de la enfermedad entrica de la boca roja en trucha aro iris, V. anguilarum, V. vulnficus, A. salmonicida, A. hydrophila entre otros57. En Espaa, podemos destacar el desarrollo de la vacuna oral para anguilas Vulnivacuna58, por parte del departamento de Microbiologa y Ecologa de la Facultad de Biologa de la Universidad de Valencia.

COMPARACIN DE LOS MTODOS DE ADMINISTRACIN DE VACUNAS MS COMUNES EN PECESInmersin Aplicacin Nivel de estrs Laboriosidad Eficacia Duracin de la proteccin Control de la dosis Coste Sencilla Bajo Moderada Buena 3-12 meses Impreciso Bajo Inyeccin Moderada Moderado Alta Muy buena 12-24 meses Preciso Alto Oral Muy sencilla ninguno Baja Baja 2-4 meses Impreciso Bajo

Tabla. 8. Comparacin de los mtodos de administracin de vacunas ms comunes en peces (Fuente: Vinitnantharat, S., et al. (1999). Advances in Veterinary Medicine. Vol. 41, 539-550; Heppell, J., et al. (2000). Adv. Drug Deliv. Rev. 43, 29-43).

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Oral vaccines. WO03020040 AquaVacTM. Schering-Plough Animal Health/Aquaculture Vaccines Ltd. (http://www.avl.co.uk). Esteve-Gassent, M. D.; Barrera, R.; Fouz, B.; Amaro, C. (2003). Effectiveness of oral re-immunisation after vaccination against Vibrio vulnificus serovar E in farmed European eel. Aquaculture In press. Vaccine against vibriosis produced by Vibrio vulnificus biotype 2 in eels. ES2127702.

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Segn la mayora de expertos consultados, parece necesario avanzar en el conocimiento del consumo y absorcin de las vacunas incorporadas a los piensos secos, y desarrollar sistemas de proteccin que permitan la absorcin efectiva de dichos antgenos. b) Tipos de vacunas El primer paso en el desarrollo de vacunas pisccolas consiste en la identificacin de factores de virulencia del organismo infeccioso, es decir, los antgenos responsables de desencadenar la infeccin. Una vez realizada esta caracterizacin, la induccin de la respuesta inmune debe ser optimizada de modo que el animal vacunado desarrolle una respuesta inmune de larga duracin contra el patgeno del que procede el factor de virulencia59. Existen dos tipos de vacunas pisccolas, las vacunas tradicionales (inactivadas o vivas), y las nuevas vacunas desarrolladas mediante ingeniera gentica (recombinantes y de ADN).

VACUNAS TRADICIONALES Vacunas inactivadas o muertas60: procedentes de extractos bacterianos, son las denominadas bacterinas61, que generalmente se administran mediante mtodos de inyeccin e inmersin. Efectivas en varias enfermedades infecciosas provocadas por bacterias, con pocos efectos secundarios. Necesitan coadyuvantes en caso de ser administradas mediante inyeccin. Vacunas vivas o atenuadas: organismo patgeno vivo atenuado. Tienen la capacidad de distribuir el antgeno a toda la poblacin mediante la administracin de la vacuna en dosis bajas, y estimulan la respuesta celular del sistema inmune de los peces.

NUEVAS VACUNAS Vacunas recombinantes62: insercin de genes codificantes de antgenos en bacterias, virus o levaduras para conseguir la expresin de la protena antignica que ser usada como vacuna. Vacunas ADN: plsmido que contiene un gen codificante para protenas antignicas.

Patgeno

Gen codificante del antgeno

Expresin de la protena en un vector Purificacin de la protena antignica

Gen codificante del antgeno insertado en un plsmido Vacunacin

VACUNA DE ADN

VACUNA RECOMBINANTE

Fig. 5. Desarrollo de vacunas recombinantes y de ADN (Fuente: elaboracin propia).

59

60 61

62

Factor de virulencia: cualquier factor que aumenta la capacidad de un agente infeccioso de infectar un organismo hospedador (protenas externas, toxinas, etc). Prepn of deactivated dual vibrio vaccine for sea fish. CN1360948. Bacterinas: son un tipo de vacunas compuestas por bacterias inactivadas o muertas mediante la accin de agentes fsicos, agentes qumicos o de ambos conjuntamente. Tecnologa de ADN recombinante: tecnologa molecular que hace posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

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Actualmente slo varias enfermedades causadas por bacterias se han podido controlar utilizando vacunas tradicionales inactivadas o atenuadas. Por este motivo, la posibilidad de introducir en el mercado nuevas vacunas ms eficientes y eficaces es necesaria en acuicultura. La investigacin sobre vacunas recombinantes pisccolas se centra en las vacunas vricas, aunque se han desarrollado diversas vacunas contra infecciones bacterianas de salmnidos63. Hasta el momento, la nica vacuna vrica recombinante autorizada en acuicultura en Estados Unidos se utiliza para vacunar salmones mediante inyeccin contra la necrosis infecciosa pancretica (consultar tabla de la presente seccin). Una de las vas de investigacin ms prometedoras en la obtencin de vacunas recombinantes es la expresin de protenas patgenas en levaduras64 o plantas transgnicas, que permitiran la produccin de protenas antignicas a gran escala. Esta tecnologa an no se ha aplicado a la piscicultura por lo que es una investigacin abierta que ya se ha propuesto a la UE65. Por otro lado, se han obtenido resultados positivos con vacunas de ADN contra la Septicemia hemorrgica viral (VHS) y la Necrosis infecciosa hematopoytica (IHN) en salmnidos66. El principal mtodo de administracin de ADN suele ser la inyeccin en peces lo suficientemente grandes, aunque en la actualidad, se estn experimentando otras tcnicas ms novedosas, como pueden ser el bombardeo con partculas de oro o tungsteno que llevan adheridas ADN, ultrasonidos, electroporacin (sistemas libres de aguja), tecnologa MircoPorTM, intestinal o a travs de las branquias67. Otras alternativas que se estn investigando son la administracin oral por inmersin mediante complejos de ADN-liposomas

y ADN microencapsulado en truchas68. La introduccin de ADN por medio de tcnicas de sonicacin es una de las ltimas aternativas que se encuentran en desarrollo. Esta tcnica emplea ultrasonidos administrados de forma continua, en pulsos, o ms frecuentemente de manera conjunta con mtodos de inmersin, para introducir con xito ADN en peces69.

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64 65 66

67 68

69

A vaccine against piscirickettsia salmonis based on a recombinant 17 kd protein. CA2281913. Fish vaccine against piscirickettsia salmonis. EP1282710. Yeast Derived Vaccine Against Ipnv. WO0238770. Rocha A.; Coll, JM. Investigacin actual en vacunas para la acuicultura. Revista AquaTIC, n 11, Octubre 2000. Prieto, A. (2002). La prevencin y el control de enfermedades en el cultivo de peces. Aspectos a considerar. CIVA 2002 (http://www.civa2002.org), 583-605. Workshop on DNA vaccination 19 th june 2001.5th Nordic Symposium on Fish Immunology, 19th June 2001. Variables en Vacunacin DNA en el Modelo Trucha-Rabdovirus, Fernndez-Alonso, M.; Coll, J. M.; Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 14 (1, 2 y 3), 1999. Zhou, Y-C., et al. (2002). Ultrasonic immunization of sea bream, Pagrus major (Temminck & Schlegel), with a mixed vaccine against Vibrio alginolyticus and V. Anguillarum. Journal of Fish Diseases Vol 25. 6, 325. Fernndez-Alonso, M.; Rocha, A.; Coll, J. M. (2001). DNA vaccination by immersion and ultrasound to trout viral haemorrhagic septicaemia virus. Vaccine 19: 3067-3075.

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En la siguiente tabla se comparan las principales ventajas y desventajas de cada uno de los tipos de vacunas descritos anteriormente.

COMPARACIN DE LOS TIPOS DE VACUNAS EN ACUICULTURATipo de vacuna Ventajas Desventajas Administracin con coadyuvantes (pueden causar alteraciones en las vsceras). Vacunas inactivadas (muertas) Pocos efectos secundarios. Slo estimulan la respuesta inmune humoral. El antgeno puede perder su conformacin. Estimulan la respuesta inmune humoral y celular (mayor memoria y eficacia). Bajas dosis de vacuna. Slo una vacuna autorizada hasta el momento. Costosas de producir en grado de pureza y cantidad suficiente. Sin efectos secundarios. No son capaces de evitar la infeccin y la generacin de portadores asintomticos. Slo estimulan la respuesta inmune humoral. Sin efectos secundarios. Estimulan la respuesta inmune humoral y celular (mayor memoria y eficacia). Inmunidad de larga duracin. Tecnologa aplicable a todas las enfermedades. Presentacin del antgeno en la conformacin adecuada. Vacunas de ADN Actividad adyuvante del ADN (presencia de dinucletidos CpG repetidos en el ADN bacteriano). Termoestables y capaces de ser utilizadas en cualquier especie y edad. Posibilidad de fabricar vacunas multivalentes contra varios patgenos en el mismo o en diferentes plsmidos.Tabla 8. Ventajas y desventajas de los diferentes tipos de vacunas en acuicultura (Fuente: elaboracin propia).

Vacunas atenuadas (vivas)

Riesgo de dispersin incontrolada. Posibles efectos secundarios.

Vacunas recombinantes

Slo estudiada para vacunas vricas. Posible riesgo de integracin del plsmido de ADN en el genoma del hospedador.

29

c) Principales enfermedades infecciosas de especies pisccolas La mayora de las vacunas comerciales para peces estn diseadas contra enfermedades bacterianas. Actualmente no existen vacunas contra patgenos parsitos, y muy poca como tratamiento preventivo en enfermedades vricas. Las razones de esta escasez de vacunas son el alto coste de desarrollo de nuevos productos, unido al tamao relativamente pequeo de la industria en acuicultura, as como el bajo precio de los peces cultivados. Por otra parte, muchas vacunas se encuentran en desarrollo experimental y sin embargo no son viables comercialmente debido a su alto coste y baja rentabilidad, insuficiente proteccin, o falta de seguridad70. No obstante, entre los expertos consultados, no cabe duda que estas vacunas tendrn una importancia creciente en el futuro. Las parasitosis71 propias de las especies pisccolas no tienen tratamientos eficaces, especialmente contra las que pueden considerarse ms patgenas, como la escuticociliatosis y la mixosporosis72. Slo en el caso de ciertos ectoparsitos se conocen algunos tratamientos

eficaces, pero son caros y su aplicacin en la prctica est limitada por su elevado coste y por las normas legales vigentes, cada vez ms restrictivas en estos aspectos. Algunos de estos tratamientos se basan en la inyeccin de compuestos inhibitorios de la sntesis de la quitina, componente principal de la envoltura externa de estos parsitos73. La obtencin de vacunas contra parsitos est limitada por numerosos factores, incluyendo entre otros la complejidad de los ciclos y la variabilidad antignica de los parsitos. En el caso de los peces, hay que considerar tambin el escaso conocimiento de su respuesta inmunitaria a los parsitos. En el caso de los virus, no hay medidas teraputicas efectivas ni han podido comercializarse an vacunas tiles y eficaces. Los mayores esfuerzos en la investigacin de virus propios de peces se han realizado con aquellos virus que afectan a las especies de mayor inters comercial, y que ocasionan por ello grandes prdidas a la industria del sector. Debido a este inters, se sabe ms sobre virus de salmnidos que del resto de especies pisccolas74.

PRINCIPALES ENFERMEDADES VRICAS QUE AFECTAN A DIVERSAS ESPECIES DE SALMNIDOS

Necrosis pancretica infecciosa (IPNV): responsable de la mayor parte de las infecciones vricas en truchas en Espaa. Necrosis hematopoytica infecciosa (IHNV): afecta a varias especies de salmnidos, de reciente introduccin en Europa. Septicemia hemorrgica viral (VHSV): en la actualidad prcticamente erradicado. Necrosis nerviosa viral o encefalopata viral (NNV): producida por un nodavirus, afectando a cultivos europeos, aunque no se ha registrado en Espaa todava. Enfermedad del pncreas (PD): producida por un togavirus, afecta al salmn atlntico. Anemia infecciosa del salmn (ISA): producida por un ortomixovirus, afecta al salmn atlntico.

70

71

72 73 74

Heppell, J.; Davis, H.L. (2000). Application of DNA vaccine technology to aquaculture. Advanced Drug Delivery Reviews 43, 29-43. Parasitosis: enfermedad por la simbiosis de un organismo, parsito, que vive a expensas de otro, hospedador, causndole algn tipo de patologa. Pellitero, P. A., et al. Parsitos del rodaballo: Un nuevo reto para su cultivo. Biopress.net 6 enero. Control of parasitic infestations in farmed and wild fish. WO9963824. Prez Prieto, S. I.; Rodrguez Saint Jean, S. (2002). Virus en la acuicultura de peces Telesteos y su impacto en instalaciones espaolas. Biopress.net 6 enero.

30


La importancia de estas enfermedades sobre la prdida de produccin y sus consecuencias econmicas llevaron a la UE a la puesta en marcha de un programa de erradicacin de rabdovirus en todos los pases miembros, basado en la aplicacin de mtodos de diagnstico rpido y sensible que permiten detectar el virus en peces enfermos y en peces portadores, evitando la diseminacin de estos patgenos. Por otra parte, algunos virus con escasa virulencia pueden convertirse en patgenos altamente virulentos cuando los peces se someten a condiciones de stress o malas condiciones ambientales. Las vacunas contra enfermedades bacterianas suelen estar formadas por bacterias inactivadas, y el mtodo de administracin ms comn es mediante inmersin o inyeccin junto con adyuvantes oleicos. La investigacin en Espaa en cuanto a vacunas contra enfermedades

bacterianas en peces es una de las ms activas, destacando la presencia de varias patentes sobre desarrollo de vacunas contra vibriosis, por parte de grupos de investigacin procedentes de la Universidad de Santiago de Compostela y la Universidad de Valencia (ver siguiente tabla). El Instituto Nacional de Investigacin y Tecnologa Agraria y Alimentaria (INIA) posee a su vez dos patentes en trmite relacionadas con el virus de la septicemia hemorrgica de la trucha, as como un nuevo vector para vacunas de ADN (ver ANEXO II). Las especies pisccolas que centran la atencin de los investigadores espaoles son los salmones y truchas en su mayora, seguidos de la anguila, el rodaballo y la dorada (ver ANEXO I). La siguiente tabla recoge las vacunas desarrolladas o que actualmente se encuentran en vas de desarrollo para las enfermedades de mayor incidencia en acuicultura.

COMPARACIN DE LOS TIPOS DE VACUNAS EN ACUICULTURATipo de vacuna Patgeno V. anguillarum75 V. ordalii V. salmonicida V. viscosus Enfermedad Estado Especies pisccolas ms afectadas Anguila, dorada, lubina, rodaballo trucha Saln y trucha de pases fros

Vibriosis (70% mortalidad)

Empleadas desde hace tiempo

lcera de invierno Vibriosis Patgeno humano oportunstico

Experimental76 Experimental77 (bacterina toxoide)

V. vulnificus

Anguila

A. salmonicida Bacteriana (inactivada o atenuada) P. piscicida

Furunculosis

Vacunas inyectables usadas con xito78

Principalmente salmnidos y otras especies de agua dulce en menor medida Salmnidos, lubina, dorada Rodaballo, trucha arcoiris, tilapia

Pasteurelosis Pseudotuberculosis Estreptococias Enterocisis

Experimental79 Vacunas inyectables usadas con xito80,81 Experimental (resultados pobres) Experimental82 Experimental83

S. parauberis

E. ictaluri

Septicemia entrica Flexibacteriosis Lactococis

Pez gato

F. maritimus L. garvieae

Rodaballo, salmn Trucha arcoiris (Contina en pg. sig.)

75

76 77

Anti-Vibrio anguillarum vaccine (gava-3) for the prevention of the vibriosis disease in the turbot and salmonidae, and preparation process. EP1001016, WO9955835 (desarrollada en la Univ. de Santiago de Compostela). Fish vaccine comprising an avirulent, invasive bacterium. WO8909616 Vinitnantharat, S.; Gravningen, K.; Greger, E. (1999). Fish Vaccines. Advances in Veterinary Medicine. Vol. 41, 539-550. Collado, R.; Fouz, B.; Sanjun, E.; Amaro, C. (2000). Effectiveness of different vaccine formulations against vibriosis caused by Vibrio vulnificus serovar E (biotype 2) in European eels Anguilla anguilla. Diseases of Aquatic Organisms. 43:91-101. Vaccine against vibriosis produced by Vibrio vulnificus biotype 2 in eels. ES2127702 (desarrollado en la Univ. de Valencia). (Continan citas en pg. sig.)

31

COMPARACIN DE LOS TIPOS DE VACUNAS EN ACUICULTURA (Continuacin)Tipo de vacuna Patgeno Enfermedad Septicemia hemorrgica viral (VHS) Necrosis hematopoytica infecciosa (IHNV) Enfermedad hemorrgica de la carpa (GCHV) Viremia Primaveral de la carpa (SVC) Necrosis infecciosa pancretica (IPNV) Necrosis hematopoytica infecciosa (IHNV) Septicemia hemorrgica viral (VHS) Criptobiosis Piojo del salmn Estado Especies pisccolas ms afectadas

Rhabdovirus

Experimental

Trucha, salmn

Rhabdovirus Viral (inactivadas o atenuadas) Iridovirus

Experimental

Trucha, salmn

Producida comercialmente en China84 Vacunas inyectables usadas con xito Usada en Noruega, y EEUU85

Carpa herbvora

Rhabdovirus

Carpa, tenca

Birnavirus

Trucha, salmn

Viral (recombinante)

Rhabdovirus

Experimental86

Trucha, salmn

Rhabdovirus

Experimental87

Trucha, salmn

Parastica (atenuada)

C. salmositica L. salmonis

Experimental88 Futuro

Trucha Salmn

Tabla. 9. Comparacin de los mtodos de tipos de vacunas en acuicultura (Fuente: elaboracin propia, adaptado de: Gudding et al. (1999) Veterinary Immunology and Immnunopathology 72, 203-212).

78

79

80

81

82

83 84

85

86 87 88

Gudmundsdottir, B. K.; Gudmundsdottir, S. (1997). J. Fish Dis. 20, 343. Salmonicida iron regulated protein and lipopolysaccharide vaccine. US5702708. Attenuated aeromonas strains; fish vaccine NZ237421. Attenuated strains of Aeromonas salmonicida useful as fish vaccines. US549841. Fish vaccine for aeromonas salmonicida infection. WO9221370. Fish vaccine. EP1200121. Attenuated Pasteurella piscicida vaccine for fish. US6350454. Vaccine. WO0110459. Procedimiento de obtencin de la vacuna anti-Pasteurella piscicida (DI) para la prevencin de la enfermedad pasteurelosis en dorada y lubina. ES2115550 (desarrollada en la Univ. de Santiago de Compostela). Gudding, R.; Lillehaug, A.; Midtlyng, P. J.; Brown, F. (1997). Fish vaccinology. Dev. Biol. Stand. Karger, Basel, pg. 490. Chondroitinase attenuated Edwardsiella ictaluri and a vaccine for prevention of enteric septicemia (es) in fish.US5536658. Anti-Enterococcus sp. (ET-2) vaccine for the prevention of enterococcal disease in turbot and process for obtaining it WO9955835 (desarrollada en la Univ. de Santiago de Compostela). Vacuna anti-Flexibacter maritimus (FM-95) para la prevencin de la enfermedad flexibacteriosis marina en rodaballo y peces salmnidos, y procedimiento de obtencin. ES2139549 (desarrollada en la Univ. de Santiago de Compostela). Dra. Alicia Gibello, Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid (mediante comunicacin personal). Dixon, P. (1997). En: Gudding, R.; Lillehaug, A.; Midtlyng, P. J.; Brown, F. Fish vaccinology, Dev. Biol. Stand., Karger, Basel, 191. Vaccine and diagnostic agent for iridovirus infectious disease for fish and production of the same and the like. JP9176043. Frost, P. & A. Ness 1997. Vaccination of Atlantic salmon with recombinant VP2 of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), added to a multivalnet vaccine, suppresses viral replication following IPNV challenge. Fish and Shellfish Immunology 7: 609-619. Vaccine for immunizing fish against infectious pancreatic necrosis virus. US5165925. Fish pancreatic disease virus. EP0712926. Vaccine to control the viral infection of fish. US5354555. Recombinant polypeptides of the haemorrhagical septicemia virus in fish. EP0377349. li, S.; Woo, P.T.K. (1997). J. Fish Dis. 20, 369.

32


Las vacunas hasta ahora mencionadas son monovalentes, es decir, proporcionan proteccin contra una nica enfermedad. Sin embargo, es posible administrar vacunas polivalentes, para ms de una enfermedad, debido a los fenmenos de reactividad cruzada. Los niveles de proteccin frente a algunas enfermedades son mayores cuando se suministran vacunas con varios antgenos procedentes de varios patgenos relacionados, en vez de suministrados por separado89. De esta forma, un mismo anticuerpo sera capaz de reconocer antgenos procedentes de patgenos diferentes, ya que comparten ciertos determinantes antignicos. Se ha observado que el sistema inmune de los peces se encuentra menos diversificado que el de los mamferos, y las vacunas polivalentes han presentado una mayor capacidad de induccin de la respuesta inmune que las vacunas monovalentes. De esta forma se ha establecido que vacunas con antgenos de Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida y Aeromonas salmonicida han dado mayores niveles de proteccin frente al proceso de la Forunculosis que aquellas vacunas monovalentes empleadas frente a este proceso. Esto puede deberse a la existencia de reacciones cruzadas entre Vibrio y Aeromonas.

4.4. Seleccin Asistida por MarcadoresLos peces pasan un periodo relativamente largo hasta la maduracin sexual, y por ello los mtodos de seleccin gentica tradicionales han evolucionado de forma mucho ms lenta que en el sector ganadero, as por ejemplo en salmn tan solo se han estudiado 10 generaciones en 20 aos de investigacin. Por este motivo, las tcnicas moleculares de seleccin asistida por marcadores, se estn convirtiendo en una herramienta imprescindible para acelerar la produccin de progenies de peces con caractersticas ventajosas o deseables comercialmente.

APLICACIONES DE LOS MARCADORES GENTICOS EN ACUICULTURA

Seleccin de reproductores: Mayor tamao y conversin alimenticia Resistencia a enfermedades Resistencia a stress Asignacin de parentesco entre los peces cultivados para evitar problemas de endogamia. Identificacin de secuencias susceptibles de ser empleadas en la elaboracin de transgnicos.

89

Gudmundsdottir, B. K.; Gudmundsdottir, S. (1997). J. Fish Dis. 20, 343.

33

Los marcadores genticos son fragmentos o secuencias de ADN que se pueden relacionar con un rasgo gentico. Estos marcadores se distinguen por ser variaciones genticas que caracterizan poblaciones y subpoblaciones, los llamados polimorfismos 90. Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequvocamente con un rasgo gentico, se dice que forman un QTL91 (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables). Estas regiones del genoma pueden controlar caracteres cuantitativos tales como resistencias a enfermedades, tolerancia a condiciones ambientales extremas, produccin, calidad, y en general toda caracterstica que posea una base gentica. Estos marcadores se utilizan para realizar Mapas genticos por ligamiento, los cuales aunque no proporcionan informacin de la secuencia del genoma, permiten localizar QTLs de inters en el genoma.

POLIMORFISMOS EMPLEADOS COMO MARCADORES GENTICOS

Polimorfismos del tamao de los fragmentos de restriccin (RFLP 92): tcnica de deteccin de fragmentos de ADN de distinto peso molecular, generados mediante la digestin con enzimas de restriccin. Perfiles mltiples arbitrarios de amplificacin: tcnicas que emplean oligonucletidos arbitrarios para generar patrones genticos. RAPD93 (Polimorfismo del ADN amplificado con cebadores arbitrarios): amplificacin por PCR de reas especficas distribuidas al azar por el genoma. Mtodo sencillo, que no requiere conocimientos previos sobre la secuencia. No da informacin sobre el nmero de copias de la secuencia amplificada, y los fragmentos amplificados no suelen corresponder a ADN ligado a algn carcter. SSCP94 (Polimorfismo en la conformacin de las cadenas sencillas de ADN): anlisis del polimorfismo a travs de las diferencias de conformacin de fragmentos de ADN de cadena sencilla. Puede llegar a distinguir cambios de pocos nucletidos. AFLP95 (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): combina el uso de enzimas de restriccin y oligonucletidos para PCR, de manera que se obtienen marcadores moleculares muy especficos sin necesidad de conocer la secuencia con anterioridad. Capaz de generar muchos marcadores moleculares en una sola reaccin. Polimorfismos de repeticin: nmero variable de repeticiones en tandem o VNTR96. Microsatlite (STR97): repeticin en tandem de secuencias de entre 2 y 5 nucletidos. Distribuidos de forma casi homognea por todo el genoma y con alta heterozigosidad. Minisatlite: repeticin en tandem de secuencias de unos pocos nucletidos. Presentan el inconveniente de que no estn distribuidos por todo el genoma. Otros marcadores: SNP98 (Variaciones de una sola base nucleotdica). EST99 (Fragmentos de genes expresados): a diferencia de los anteriores, este tipo de marcador es dependiente de secuencia.

90

91 92 93 94 95 96 97 98 99

Polimorfismo: existencia de dos cromosomas alelos de un gen presentes en una poblacin, en una frecuencia significativa. QTL = Quantitative Trait Loci. RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism. RADP = Random Amplified Polymorphic DNA. SSCP = Single-Stranded Conformational Polymorphism. AFLP = Amplified fragment lenght polymorphism. VNTR = Variable Number of Tandem Repeats. STR = Short Tandem Repeat. SNP = Single Nucleotide Polymorphism. EST = Expressed Sequence Tag.

34


Cromosoma

Gen a identificar

TG TG TG TG TG TG TG TG TG

microsatlites

TG TG TG TG TG TG TG TG TG

Clonacin del gen

Seleccin mediante microsatlites

Secuenciacin de EST

Banco de vectores con fragmentos de cADN

Identificacin del gen mediante anlisis de la expresin gnica

Gen a identificar

Fig. 6. Identificacin de genes de inters a partir de marcadores (Fuente: adaptado de Houdebine, L. M. (2002). Transgenesis to improve animal production. Livestock Production Science 74 255-268).

35

4.5. TransgnesisLa seleccin de especies pisccolas se ha venido realizando tradicionalmente por medio de sucesivos cruces e hibridaciones, por los cuales era posible conseguir individuos con mutaciones naturales. No obstante, la transferencia del material gentico no se puede dirigir ni controlar mediante estas tcnicas, por lo que actualmente se estudian otras tcnicas de mejora gentica tales como la transgnesis. La aplicacin de las tecnologas de transgnesis en el cultivo de especies pisccolas es complementaria a la utilizacin de otras tcnicas moleculares de seleccin, diagnstico o ingeniera de vacunas.

La transgnesis se puede definir como la introduccin de ADN forneo en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las clulas en los organismos multicelulares. El ADN forneo o transgen se introduce en cigotos por medio de diferentes mtodos. Los embriones que hayan integrado el ADN extrao en su genoma producirn un organismo transgnico, de modo que el transgen pasar a las siguientes generaciones a travs de la lnea germinal (gametos).

PASOS A REALIZAR EN LA ELABORACIN DE UN PEZ TRANSGNICO1. Eleccin del gen que se quiere introducir. 2. Obtencin del cADN del gen/Clonacin del gen que codifica la protena a insertar. 3. Preparacin de la construccin gentica a clonar. 4. Insercin de la construccin gentica en un plsmido bacteriano. 5. Insercin del plsmido en una cepa bacteriana y amplificacin del nmero de copias del vector millones de veces. 6. Aislamiento de los plsmidos y fragmentacin del segmento que contiene nicamente el trasgn. 7. Insercin de millones de copias del transgn en cada huevo fecundado. 8. Incubacin y cultivo de los alevines resultantes. 9. Identificacin y seleccin de los transgnicos que expresen la caracterstica deseada. 10. Establecimiento de un programa de cultivo para estabilizar el transgn en sucesivas generaciones. 11. Aprobacin legal para su comercializacin.Fig. 7. Pasos a realizar en la elaboracin de un pez transgnico (Fuente: elaboracin propia, tomado de, Matheson, J. C. (1999) Transgenic Fish Developments: Are Transgenic Catfish in Our Future? Catfish Farmers of America Annual Meeting, New Orleans. http://www.fda.gov/cvm/biotechnology/catfish).

36


La introduccin del ADN forneo en el genoma puede realizarse mediante varios mtodos, siendo los principales la microinyeccin, transferencia mediante vectores virales y manipulacin de clulas embrionarias. No obstante, existen otros mtodos alternativos que estn siendo perfeccionados en la actualidad tales como la electroporacin (emisin de pulsos elctricos de alto voltaje y corta duracin), siendo el ms novedoso la electroporacin con radiofrecuencia100.

PRINCIPALES TCNICAS DE TRANSGNESISDescripcin Ventajas Desventajas

Microinyeccin de ADN

Microinyeccin directa de un gen determinado o de una combinacin de genes de un miembro de la misma o de distinta especie, en el proncleo de un vulo fecundado in vitro. Una vez realizada la microinyeccin, los vulos se introducen en las hembras.

Fcilmente aplicable a una amplia variedad de especies.

El gen se inserta al azar en el genoma.

Transferencia mediante vectores virales

Los retrovirus son capaces de transportar la secuencia gnica que se quiera insertar hasta el ncleo de las clulas receptoras.

El transgn suele estar presente en todas las clulas de los individuos trangnicos, incluyendo tambin a la lnea germinal.

El gen se inserta al azar en el genoma.

Transgnesis por manipulacin de clulas embrionarias

Introduccin de ADN forneo en lugares especficos del genoma de clulas embrionarias mediante electroporacin, transfeccin o microinyeccin. Las clulas transfectadas son reintroducidas en un embrin que se reimplanta en una hembra.

El gen se inserta en lugares especficos del genoma.

Todos los individuos transgnicos son quimeras (slo un cierto porcentaje de sus clulas portan el transgn).

Tabla 10. Principales tcnicas de Transgnesis (Fuente: elaboracin propia).

100

Hostetler, H. A., et al. (2003). High efficiency production of germ-line transgenic Japanese medaka (Oryzias latipes) by electroporation with direct current-shifted radio frequency pulses. Transgenic Research 12:413-424.

37

Las aplicaciones de las tcnicas de transgnesis en organismos acuticos estn dirigidas por un lado a disminuir los costes de produccin derivados de las actividades de acuicultura, y por otro a reducir los costes asociados al empleo de antibiticos y mortalidad debido a enfermedades infecciosas.

PRINCIPALES OBJETIVOS DE LA GENERACIN DE PECES TRANSGNICOS

Mejora de la tasa de crecimiento. Control de la maduracin, diferenciacin sexual y esterilidad. Mejora de la supervivencia por medio de la resistencia a enfermedades. Adaptacin a condiciones medioambientales. Alteracin de la composicin nutricional de la carne. Alteracin de determinadas capacidades metablicas: biofactoras.

La transgnesis como tcnica de mejora gentica animal presenta todava una serie de problemas que todava no estn resueltos. Uno de los principales problemas consiste en la posibilidad de ocasionar algn tipo de impacto en funciones biolgicas controladas por mltiples genes. Sin embargo, esto no quiere decir que tan solo aquellos genes que controlan caractersticas monognicas pueden ser objeto de transgnesis. Los genes implicados en el crecimiento y desarrollo se encuentran regulados por un gran nmero de genes, y su expresin tiene lugar por

medio de complejas cascadas de sealizacin. Sin embargo, la sobreexpresin de la hormona del crecimiento es un ejemplo claro de transgnesis en especies pisccolas, la cual se explicar ms adelante. Las especies de peces sobre los que se han desarrollado un mayor nmero de especies transgnicas han sido la trucha, el salmn, el pez gato, la tilapia y la carpa dorada. En Espaa la industria no utiliza estas tcnicas y tan solo se desarrollan a nivel cientfico.

PECES MODIFICADOS GENTICAMENTE EN DESARROLLOEspecie Gen forneo Efecto Estatus En fase experimental EEUU, Canad Pas

AFP Salmn atlntico AFP Salmn GH

Tolerancia al fro.

Aumento de crecimiento y conversin alimenticia. Tras un ao, aumento del crecimiento en un factor de 10-30. Aumento de crecimiento y conversin alimenticia.

En espera de aprobacin Mtodo patentado

Salmn coho

Salmn chinook GH+AFP

En fase experimental

Canad

Salmn chinook

AFP Salmn GH


Nueva Zelanda

Salmn

Gen lisozima de la trucha arcoiris y gen de la pleurocidina del lenguado.

Resistencia enfermedades.


EEUU, Canad

(Contina en pg. sig.)

38


PECES MODIFICADOS GENTICAMENTE EN DESARROLLO (Continuacin)Especie Gen forneo Efecto Aumento de crecimiento y conversin alimenticia. Aumento de crecimiento. Aumento de crecimiento y conversin alimenticia. Herencia estable. Aumento de crecimiento y herencia estable. Produccin de insulina humana para diabticos. En espera de aprobacin Estatus Pas

Trucha arcoiris

AFP Salmn GH


EEUU, Canad

Trucha Cutthroat

Salmn chinook GH+AFP


Canad

Tilapia

AFP Tilapia GH


Canad, Reino Unido

Tilapia

Tilapia GH

Cuba

Tilapia

Gen modificado de produccin de insulina en tilapia


Canad

Lubina rayada

Genes procedentes de insecto

Aumento de crecimiento y conversin alimenticia (factor de 2-30). Herencia estable.


EEUU

Misgurnus mizolepis (mud loach)

Mud loach GH+ y promotes de genes de mud loach y ratn

Mejora del crecimiento en cultivo del 33%. Mejora del crecimiento en cultivo del 150%.


China, Corea

Pez gato

GH

Mejora de la resistencia enfermedades. Tolerancia a bajos niveles de oxgeno.


EEUU

Carpa comn Carpa mayor de la India GH AFP Pez dorado

GH de salmn y humano GH de humano

Aumento de crecimiento. Aumento de crecimiento. Tolerancia al fro. Aumento de crecimiento.

En fase experimental En fase experimental En fase experimental En fase experimental

China, EEUU

India

AFP

China, Canad

Abaln

GH

EEUU

Tabla 11. Peces Modificados Genticamente en desarrollo (Fuente: Elaboracin propia, tomado de, Diouf, J. (2000) Genetically Modified Organisms and Fisheries. FAO Report; Future Fish: Sigues in Science and Regulation of Transgenic Fish (2003) Pew Initiative on Food And Biotechnology). GH - Hormona del crecimiento / AIP - Protena Anticongelante.

39

Algunas de las aplicaciones de la transgnesis en acuicultura que poseen un mayor desarrollo tecnolgico son las siguientes: a) Control de la maduracin La mayora de las especies pisccolas no maduran normalmente en condiciones de cautiverio, especialmente cuando las variables ambientales que condicionan el desarrollo gonadal y la maduracin de gametos estn alteradas o ausentes. En ciertas circunstancias es necesario acelerar o retrasar la maduracin, a fin de optimizar y sincronizar la produccin de gametos de machos y hembras, de adelantar o desfasar el desarrollo embrionario y la produccin de juveniles, o facilitar la hibridizacin de especies o cepas que difieren en sus perodos de maduracin. Las estrategias reproductivas de las especies pisccolas consisten generalmente en la produccin de una enorme cantidad de huevos, lo que implica un gran desarrollo de las gnadas, que pueden llegar a suponer un importante porcentaje del peso corporal. Esto da lugar a que en la poca de maduracin sexual se paralice casi por completo el crecimiento del animal. Dado que para las especies cultivadas el principal inters se encuentra en la carne, a los productores les interesa controlar el momento en el que se produce la maduracin sexual. El esturin es una excepcin ya que lo que se pretende es que la maduracin tenga lugar, al ser el caviar el producto que tiene valor comercial. Tradicionalmente el control de la maduracin se ha conseguido mediante la administracin de compuestos bioactivos anlogos a hormonas de mamferos o peces, que son efectivos en peces telesteos, tales como extractos de gonadotropina, o compuestos que estimulan la sntesis y liberacin de gonadotrofina endgena. El desarrollo de tcnicas de induccin de maduracin ha superado varias etapas, desde el uso de preparaciones crudas de extractos pituitarios conteniendo gonadotrofinas, preparaciones de gonadotrofinas semipurificadas, hasta el uso de compuestos que estimulan la sntesis y liberacin de gonadotrofina endgena.

En la actualidad se est investigando la creacin de peces transgnicos estriles cuya actividad reproductiva pueda ser activada por medio de promotores inducibles. Como consecuencia, se conseguira no slo controlar la reproduccin y el crecimiento ptimo de los peces, sino que en caso de fuga no sera posible el cruzamiento con especies salvajes. Hasta el momento esta estrategia tan solo ha sido demostrada en mamferos 101. La tcnica ms prometedora para controlar la expresin de genes consiste en la tecnologa antisentido. Esta tcnica se basa en la introduccin en la clula de pequeas secuencias de ADN o ARN que bloquean la expresin de una protena determinada mediante la unin a ADN de cadena doble o a ARN mensajero. Basndose en esta tcnica, se ha desarrollado un promotor del gen de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) fusionada con la secuencia antisentido de este gen. Este fragmento es introducido en el genoma de la trucha arcoiris, permitiendo la expresin de ARN antisentido en cerebro, y observndose una reduccin en la produccin de esperma 102. Una alternativa al uso de tecnologa antisentido es la introduccin de un transgen codificante para ribozimas, secuencias catalticas de ARNm que cortan la secuencia de ARN de manera selectiva. En peces todava no se ha desarrollado esta tecnologa. b) Crecimiento y conversin alimenticia Prcticamente la mitad de los costes operativos en acuicultura se atribuyen a la alimentacin, y por tanto uno de los principales intereses de la industria de acuicultura consiste en acelerar el crecimiento y mejorar la tasa de eficiencia en la conversin alimenticia de las especies cultivadas. Los niveles endgenos de hormona de crecimiento o somatotropina (GH) son inferiores a los necesarios para el mximo crecimiento en la mayora de los peces, incluyendo los salmnidos. Para contrarrestar esta limitacin natural tradicionalmente se emplea la administracin de factores inhibidores de la somatostatina, o lactgeno placental aislado de la placenta de mamferos.

101 102

Melamed, M., et al. (2002). The potential impact of modern biotechnology on fish aquaculture. Aquaculture 204, 255-269. Melamed, M., et al. (2002). The potential impact of modern biotechnology on fish aquaculture. Aquaculture 204, 255-269.

40


La habilidad para manipular la tasa de crecimiento a travs de la introduccin de genes de la hormona del crecimiento (GH) ha sido demostrada en caso de ratones103, y ha sido empleada con xito en peces, concretamente en el salmn104. El salmn transgnico engorda dos veces ms rpido y come menos que las variedades naturales105, creciendo incluso en invierno, cuando normalmente casi no aumenta de peso, y tiene un efecto acelerador sobre la secrecin de la hormona del crecimiento al inicio del ciclo de vida del pez. Este nuevo transgnico, al que se ha denominado AquAdvantage, podra obtener autorizacin por parte de la FDA si se demuestra que no tiene una capacidad de adaptacin superior para viabilidad, reproduccin o fertilidad. Estados Unidos carece de medidas especficas para evaluar los riesgos presentados por un pez transgnico, por lo que la FDA les considera como un medicamento y por tanto han de ser sometidos a un proceso de autorizacin similar al de los medicamentos 106.

EFECTOS DE LA SOBREEXPRESIN DE HORMONA DEL CRECIMIENTO EN SALMONES

Aumento del apetito. Aumento de la eficiencia de conversin alimenticia. Aumento de la tasa de crecimiento. Mejor adaptacin de salmnidos a aguas marinas.

En comparacin con los mamferos, tan solo existe un nmero limitado de promotores bien caracterizados procedentes de genes de especies pisccolas. Estos incluyen el gen de la metalotionena de trucha y salmn, actina B de la carpa, histona del salmn, protamina, y protena anticongelante del lenguado (AFP107), siendo este ltimo el que ms se emplea como promotor en la induccin de la expresin d

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