33
Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila completamente sequenciado de numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (E essas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies Fatos: - Barateamento do preço dos sequenciamento “Revolução” da pesquisa na área de ciências biológicas Quando? Década de 90 Porque? Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recomb Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e protei - Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino - Genoma do camundongo completamente sequenciado

Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Pesquisas em genoma funcional

- O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados

- O genoma de duas plantas completamente sequenciado

- Genoma de Drosophila completamente sequenciado

Grande numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (EST) Expressas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies

Fatos:

- Barateamento do preço dos sequenciamento

“Revolução” da pesquisa na área de ciências biológicas

Quando? Década de 90

Porque? Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante

Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e proteinas

- Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino

- Genoma do camundongo completamente sequenciado

Page 2: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Consequências atuais

- Grande quantidade de informação disponível

- Formação de grandes consórcios de pesquisa: Projeto 2010

- Análise científica mais holística

Consequências futuras:

- Predição dos fenótipos que resultariam de mudancas genéticas específicas

- Identificar quais mudanças genéticas poderiam acelerar a domesticação de espécies selvagens

Facilitar a manipulacao genética que garantiria a manutenção e expansão das bases de germoplasma

Descrição dos mecanismos responsáveis pela heterose; habilidade de utilizar este fenômeno mais efetivamente

Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica

Caracterização do grupo mínimo de genes para o funcionamento de um organismo

Compreensão da base genética da evolução::: melhor compreensão da diversidade da vida na terra

Compreensão das interações entre os organismos e seu ambiente a nível de ecosistema

Page 3: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Montagem de uma combinação de genótipos em plantas transgênicas

Estudos genéticos

Testes funcionais

Estudos de expressão in situ

Estudos das interações

Clonagem e sequênciamentoData mining

Posição no mapa gen. ou físico;Baseado na inserção de

sequência alvo

Estratégia de Genoma funcional: Ex: tolerância a estresses abióticos

Descoberta de genes

Homologia como critério para identificar genes em bancos de sequências EST e genômicas

Estudo expressão gênica em larga escala

cDNA macro/microarrays; genechips

Seleção de mutantes

EMS, radiação, T-DNA, transposons

Criação e análise de um banco de dados

Complementação leved.

Mutante em Arabidopsis

Superexpressão

Antisenso.

Supressão por RNAi

Sistema duplo-hibrido de leveduras

Phage display

Interação in vitro (crom. Afinidade, imunoprecipitação

AlelismoAditividade

EpistasiaSupressãoFusão proteína com GFP

Expressão GFP ou luciferina com o promotor

Construção de modelos de controle dos processos envolvidos

Modificação de plantas de interesse agrícola baseados nesses modelos: modificação simultâneada expressão de vários genes

Page 4: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila
Page 5: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Transcriptoma:

Análise dos níveis de RNAde varios genes simultaneamente

Um genoma possui variostranscriptomas

…varios transcriptomas temporais

Ex: tempo apos sujeicao a um estresse

Ex: tempo apos uma determinada fase do desenvolvimento

…varios transcriptomas espaciais

Ex: transcriptoma celular-especifico

Ex: transcriptoma tecido-especifico

Ex: transcriptoma orgao-especifico

Page 6: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Etapas para a realizacao de um transcriptoma

Page 7: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

1) Filme Macroarray.mov

2) Filme oligochip.mov

Page 8: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila
Page 9: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Isolamento de DNAdo banco de cDNA

1a Etapa de um transcriptoma

Preparacao do Micro/Macroarranjo(Micro/macroarray)

Page 10: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

2a Etapa de um transcriptoma: produção da sonda

Duraçãodo protocolo: 5 horas

Page 11: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

2a Etapa de um transcriptoma: hibridação

Page 12: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem

Typhoon: Fosforescência,quimioluminescência; fluorescênica

DNA alvo imobilizado: cDNA do genótipo toleranteSonda marcada com o fluorocromo “verde”: genótipo tolerante na ausência do estresseSonda marcada com o fluorocromo “vermelho”: genótipo tolerante na presença do estresse

Gene com reduzida expressãona presença do estresse

Gene expressão acentuadana presença do estresse

Genes sem alteraçãona expressão

a

bd

Nível de expressão na presença do estresse:a) + x%

b) + y% (y>x)c) -z%

Page 13: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem

11

2 3

4

5

Page 14: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Descoberta da função de genes desconhecidos

Análise da homologia das sequênciasAnálise da biologia molecular do gene: co-regulação?

Confirmação pela genética reversa

6626 genes alvos19 sondas

197 genes orgão-específicosraiz=64

folha=94flor=36

influorescencia=3

Matriz da expressãonos orgaos

Analise da abundância do transcrito

Agrupamento deexpressão global

Exemplo de data mining

Agrupamento

Dinamica daexpressao

Identificação de sequências regulatórias

Caracterizacaogene/rota

347 genes constitutivos

5247 genes alvossondas: 5 pontos temporais

8300 genes alvos

Sondas:

folha =6raizes=4flores=2

Siliqua=3Influorescencia=2

Plantula=2

Zhu et al. (2001) Plant Physiol Biochem 39,221-241

Page 15: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma

Análise de agrupamento da expressão de fatores transcripcionais na resposta a diferentes estresses

ambientais em Arabidopsis

Comparação dos transcriptomas na presença de dois diferentes estresses

Page 16: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Análise de Grupos: 2 genótipos

Genótipo sensível ao estresse salino: IR29 (direita)

Genótipo tolerante ao estresse salino: Pokkali (esquerda)

Page 17: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Comparação de diferentes transcriptomas temporais durante um processo celular

Page 18: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Diferentes Transcriptomas de genes que responde a estresses abióticos

Classe 1: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos associada ao f ator

transcripcional DREB1A

Classe 2: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos independente do f ator

transcripcional DREB1A

Page 19: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Confirmação dos resultados do transcriptoma: análise por Northern Blot

Page 20: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Classes de genes afetadas pelo estresse salino

Page 21: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Análise de grupos: Transcriptomas da resposta a patógeno

Sonda 1e 2: Mutantes na síntese de ácido salicílico

Sonda 3: Mutantes na síntese de ácido jasmônico

Sonda 4: Mutantes na síntese do etileno

DNA alvo: fatores transcricionais do genoma de Arabidopsis

Page 22: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Kits completos com microarranjos com oligonucleotideos e sonda de referencias

Vantagens:oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes com baixa homologia a outros genes

- estringencias das pos-lavagens pode ser maior: menor nivel de hibridizacao cruzada

Page 23: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress

8100 genes (Genechip)

Genes > 2x = Total 2678 Genes

ControleMeio Fresco

741 genes

4oC

2086 genes

58% 42%

Manitol(200 mM)

NaCl(100 mM)

1123 genes

46% 53%

1008 genes

Raízes: 3 horas após

NaCl Manitol

4oC

85

235

106

65

78 29

375

Page 24: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Folhas: 3 horas após

NaCl Manitol

4oC

279

243

68

65

78 29

120

Raízes: 3 horas após

NaCl Manitol

4oC

85

235

106

65

78 29

375

Page 25: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Raízes: 27 horas após

NaCl Manitol

4oC

63

1111

9

5

59 23

87

Folhas: 27 horas após

NaCl Manitol

4oC

82

1094

4

19

47 90

59

Folhas: 3 horas após

NaCl Manitol

4oC

279

243

68

65

78 29

120

Raízes: 3 horas após

NaCl Manitol

4oC

85

235

106

65

78 29

375

Page 26: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Raízes: Sobreposição entre 3 e 27h

NaCl Manitol

4oC

6

173

4

2

9 8

22

Folhas: Sobreposição entre 3 e 27h

NaCl Manitol

4oC

40

188

4

8

5 40

5

Estresse salino: sobreposição 3-27 h na raizEstresse por frio: sobreposição 3-27h

Page 27: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila
Page 28: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Estresses regula a expressão de mais de 370 genes cuja função é totalmente desconhecidaÇPistas: especificidade de tecido e regulação por múltiplos estresses: CBF1 e ABA2 sim folha, não raiz

Maioria das mudanças são estimulo-específicas: sob. De 5% e 0,5% (3-27h)

200 mM Manitol=100 mM NaClÇ 40% sobreposição foi observada em folhas (sem contato)

Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do que os outros estressesMais induzido gene ELIP: liga a chl a

Maioria das sobreposições foram específicas à folhas ou raízes

Sobreposições podem ser perdidas em experimento que examina um limitado número de pontos temporais ou ignora as diferenças tecido-específicas

3 -> 27h: redução em 4 vezes nas respostas comuns: respostas mais específicas a cada estresse se seguem após o choque inicial

Transcriptoma do estresse ao frio: movimento para um novo e diferente “steady-state”

Raízes e folhas apresentam diferentes modificações no seu transcriptoma para cada estresse:ExÇ 86% das mudanças induzidas pelo frio não são compartilhadas entre folhas e raízes

Maioria 2409 genes reg. pelo estresse: não tem seq tipicas dos fat. transc. CBF1 e DREB1:a) Presença de outros elementos importantes nas sequências dos promotores

b) Um grande número de mudanças podem ser causadas por diferenças na estabilidade do RNA ao invés da reg transc.

Page 29: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila
Page 30: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Segregacao alelica

Transcriptoma

Caracteriz. do fenotipo

Proteoma

Caracteriz. do genotipo

Identificacao degenotipos tolerantes

e susceptiveis

Transcriptoma e proteoma

Identificacao de genes eproteinas associados a tolerancia

Mapeamento de populacoes

QTL

Locus genico candid.

Locus quant. transcrito

Locus quant. proteina

Mapa genetico

Identificacao de genes/marcadores

ligados a tolerancia

Selecao assistida por marcadores

Transformacao

Melhoramentomolecular

Page 31: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Sugestao de proposta para elaboracao de projeto genoma funcional na UFV: 1) transcriptoma

Em colaboracao:Instituto de Quimica USP

Embrapa-CenargemUnicamp

UNESP-Araraquara

Realizado na UFV

Page 32: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila

Múltiplas repetições : teste de repetibilidade: anãlise estatística : seq. diferentes

Melhores resultados

Page 33: Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de duas plantas completamente sequenciado - Genoma de Drosophila