Upload
peconi-car
View
25
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
qweqeq
Citation preview
GENETIĈKI
INŽENJERING
REKOMBINANTNA
DNK
TEHNOLOGIJA
Genetiĉki inženjering
Veštaĉko (manipulativno) prenošenje stranih
gena u postojeće genome ćelija.
Stvaraju se novi genotipovi ćelija , sposobni za
samostalnu reprodukciju.
Poĉetak 1973.godine
Kombinovanje raznih i sistematski vrlo
udaljenih organizama
– Geni ĉoveka → genom bakterije
Insulin
Hormoni rasta
Interferon
– Geni biljaka → genom bakterije
– Geni životinja → genom bakterije
– Geni bakterija → genom eukariota
1982. godine kompanija Eli Lilly
Odobrenje za prodaju insulina za ljudsku
upotrebu, dobijenog genetiĉkim inženjeringom
Zašto mikroorganizmi?
Jednostavni
Laki za manipulaciju
Brzo se razmnožavaju
Koriste jednostavne hranljive podloge
Primena
Mikrobiološke fermentacije: antibiotici, vitamin C
Vakcine: virus slinavke i šapa, hepatitis B, AIDS (?)
U poljoprivredi:
– genetski modifikovani organizmi (GMO)
– Rekombinantni mikroorganizmi
Zaštita voća od mraza – Pseudomonas syringae
Insekticid – Bacillus thuringiensis
– Transgene biljke – biljke sa uspešno ugraĊenim stranim
genom
Transgene biljke
Otpornost prema biljnim parazitima: bundeva
Otpornost prema štetnim insektima: krompir,
kukuruz, pamuk
Tolerantnost prema herbicidima: kukuruz, soja
Modifikacija u sastavu proteina, masnih
kiselina, ugljenih hidrata
Poboljšanje kvaliteta biljnih proizvoda
Transgene životinje
I dalja primena
Zaštita životne sredine
– Biodegradacija razliĉitih zagaĊivaĉa
– Toksiĉni otpad
– Otpadne vode
Regulacija gena i genetiĉka terapija
– Leĉenje genetskih oboljenja
Metode rekombinantne DNK tehnologije
Transfer DNK od jednog organizma u drugi
1. Klonirajući vektor i domaćin
2. Konstrukcija rekombinantnog plazmida
Karakteristike klonirajućih vektora
Moraju biti sposobni za nošenje dela DNK donora
Mora ih lako usvojiti klonirani domaćin
PLAZMIDI
– mali, dobro karakterisani,
– laki za manipulaciju i
– mogu biti prenešeni u odgovarajućeg domaćina transformacijom
BAKTERIOFAGI
– imaju prirodnu sposobnost da ubace svoju DNK u bakteriju domaćina transdukcijom
Osnovne procedure genetiĉkog inženjeringa
1. DNK koja sadrži odreĊen, specifiĉan gen
2. Plazmidna DNK
3. Tretiranje enzimom – restriktivna endonukleaza
4. Modifikovan plazmid – rekombinantni plazmid
5. Transformacija
6. Identifikacija kolonije bakterija sa modifikovanim plazmidom
7. Bakterije dobijene GI se umnožavaju u velikom broju, i proizvod kodiran prenešenim genom se izdvaja iz kulture i preĉišćava
1. DNK koja sadrži odreĊen specifiĉan gen
Dobija se iz organizma donora
Može biti sintetisana iz nukleotida
2. Izolacija plazmidne DNK
Služi kao nosaĉ odreĊenog gena
Odvajanje od ćelije i hromozomalne DNK
Centrifugiranje u razliĉitom gradijentu gustine
sa cezijum hloridom i etidijum bromidom
3. Tretiranje enzimom –
restriktivna endonukleaza
Prisutna u gotovo svim mikroorganizmima
Vrše identifikaciju i uništavanje “strane DNK”
Ćelija markira sopstvenu DNK metil (-CH3) grupom
Proces dodavanja metil grupe – DNK modifikacija
DNK donora i plazmidna DNK se tretiraju istim
enzimom
Seĉe DNK stvarajući komplementarne jednostruke
krajeve “lepljivi krajevi” (“sticky ends”)
4. Konstrukcija rekombinantnog plazmida
Lepljivi krajevi fragmenta DNK donora
spajaju se sa lepljivim krajevima plazmidne
DNK obrazujući rekombinantni, modifikovani
plazmid koji nosi fragment DNK donora.
Enzim ligaza ponovo uspostavlja veze fosfat-
šećer koje su prekinute endonukleazama
Prvi rekombinantni plazmid – rezistentnost na
dva antibiotika (1973. god)
Teorijski: bilo koja dva molekula DNK,
razliĉitih vrsta, mogu da se spoje.
Gen iz južnoafriĉke žabe ubaĉen u plazmidnu
DNK bakterije.
Pitanje: iskazivanje (ekspresija) gena kod
bakterija
DNK eukariotskih ćelija: introni i egzoni
Bakterije ne vrše uklanjanje introna prilikom
transkripcije iRNK
Rešenje: Izolacija iRNK umesto DNK iz
eukariotske ćelije
iRNK se koristi kao matrica za sintezu
komplementarne DNK (kDNK) koja može biti
ubaĉena u plazmid
Enzim: reversna transkriptaza (RNK-directed
DNK-polimeraza)
5. Unošenje rekombinantnog plazmida u
bakteriju recipijenata
Transformacija
CaCl2 transformaciona procedura
– Tretiranje ćelija recipijenta sa CaCl2 na niskim
temperaturama (0-4C za E. coli)
– Dodavanje plazmidne DNK
– Zagrevanje ćelije recipijenta (do 42C za E. coli)
Elektroporacija – tretman kratkim
elektropulsevima
6. Identifikacija bakterija koje su primile
plazmid
Upotreba antibiotika
Umnožavanje rekombinantnog plazmida
Kada je rekombinantni plazmid uspešno
ubaĉen u bakterijsku ćeliju, ona može da stvara
veliku populaciju identiĉnih ćelija –
KLONOVA u kojima su novi geni prisutni u
svakoj ćeliji
Novi gen je ušao u nasleĊe – KLONIRANI
GEN
Identifikacija bakterija koje iskazuju novi gen
Koja bakterija sadrži pravilno konstruisan
rekombinantni plazmid sa kloniranim genom?
Bakterija koja stvara proizvod koji kodira gen
Problemi u kloniranju gena
1. Restriktivne endonukleaze mogu iseći i
uništiti gen koji treba klonirati. Više od
jednog gena povezano u ekspresiji odreĊene
karakteristike.
2. Gen donora nepravilno ubaĉen u plazmidni
vektor. Bakterija ne može da iskaže gen, ne
prepoznaje start i stop signale.
I dalje problemi
3. Protein – proizvod unutar ćelije u velikim,
nerastvorljivim agregatima. Izolacija proteina
neće dati odgovarajući proizvod.
4. Može se stvarati previše produkta – letalan
za bakterijsku ćeliju (primer: geni za sintezu
fenilalanina – aminokiselina koja se koristi u
stvaranju aspartama, veštaĉki zaslaĊivaĉ
Problemima nikad kraja
5. Proizvod može biti uništen nakon sinteze.
Bakterije imaju sisteme za otkrivanje i
uništavanje stranih proteina ukoliko se jave u
ćeliji
6. Nestabilnost plazmida. Ne nasleĊuje svaka
ćelija ćerka plazmidni vektor za vreme deobe
ćelija.
I sad KRAJ
7. Ekstrakcija i preĉišćavanje proizvoda
Gram (-) bakterije (E.coli) ne izdvajaju proteine u spoljašnju sredinu; neophodno da se unište bakterijske ćelije.
Gram (+) bakterije (Bacillus subtilis) izdvajaju proteine, ali stvaraju i proteolitiĉke enzime koji uništavaju proizvod
Kvaci nemaju spoljašnju membranu i obiĉno ne stvaraju protelitiĉke enzime (geni za bakterijsku celulazu klonirani u ćelijama kvasca)