Metode Metode molekularnmolekularnee genetigenetike u direktnoj ke u direktnoj

ili indirektnoj detekciji ili indirektnoj detekciji monogenskih bolestimonogenskih bolesti

Podela Podela tehnikatehnikaAnalitičke tehnike

Izolovanje DNK

Umnožavanje DNK

Enzimska digestija DNK

Rekombinovanje DNK

Kloniranje DNK

Sekvenciranje DNK

Hibridizacija DNK

Preparativne tehnike

Centrifugiranje

Elektroforeza

Preparativne tehnike: Preparativne tehnike: Izolovanje DNKIzolovanje DNK

Maceriranje tkiva – mehaničkoMaceriranje tkiva – mehaničko Razaranje ćelija Razaranje ćelija

– Mehanička liza (sonikacija, smrzavanje, Mehanička liza (sonikacija, smrzavanje, mlevenje)mlevenje)

– deterdženti- SDS, deterdženti- SDS, – Enzimi - lizozim, proteinazeEnzimi - lizozim, proteinaze– Helirajući agensi – EDTAHelirajući agensi – EDTA– Redukujući agensi - DTTRedukujući agensi - DTT

Izvori biološkog materijalaIzvori biološkog materijala

KrvKrv Semena tečnostSemena tečnost

PljuvačkaPljuvačka UrinUrin

DlakaDlaka ZubZub KostKost

Bilo koje tkivoBilo koje tkivo

Purifikacija DNKPurifikacija DNK Rastvaranje organskim rastvaračima Rastvaranje organskim rastvaračima

(fenol:hloroform:izoamilalkohol 25:24:1) i (fenol:hloroform:izoamilalkohol 25:24:1) i taloženje u etanolutaloženje u etanolu

Precipitacija DNK cetiltrimetilamonijum Precipitacija DNK cetiltrimetilamonijum bromidom-CTAB, resuspenzija solima, bromidom-CTAB, resuspenzija solima, digestija RNazom, taloženje etanolom.digestija RNazom, taloženje etanolom.

Precipitacija DNK na silikatne čestice u Precipitacija DNK na silikatne čestice u haotropnim solima (guanidintiocijanat-haotropnim solima (guanidintiocijanat-GTC) u dva formata (u rastvoru i u koloni)GTC) u dva formata (u rastvoru i u koloni)

Izolacija helirajućim smolamaIzolacija helirajućim smolama Izolacija pomoću paramagnetnih česticaIzolacija pomoću paramagnetnih čestica

Elektroforeza u geluElektroforeza u gelu U zavisnosti od U zavisnosti od

veličine fragmenataveličine fragmenata U zavisnosti od U zavisnosti od

potrebne rezolucijepotrebne rezolucije– Agarozna i Agarozna i

poliakrilamidna (i poliakrilamidna (i drugi polimeri)drugi polimeri)

– Nativna i Nativna i denaturišućadenaturišuća

Razdvajanje po Razdvajanje po veličini i veličini i naelektrisanjunaelektrisanju

Elektroforeza u geluElektroforeza u gelu

DNK je negativno DNK je negativno naelektrisana naelektrisana (putuje ka anodi)(putuje ka anodi)

Veći fragmenti Veći fragmenti putuju sporijeputuju sporije

Molekularno Molekularno “sito”“sito”

Vizualizacija DNK molekulaVizualizacija DNK molekula

Max apsorpcije Max apsorpcije 260 nm- 260 nm- providnaprovidna

DNK-vezujuće DNK-vezujuće boje (Etidijum boje (Etidijum bromid, Cyber bromid, Cyber Green...)Green...)

Vizualizacija DNK molekulaVizualizacija DNK molekula

Kapilarna Kapilarna elektroforeza elektroforeza

Fluorescentno Fluorescentno obeleženi obeleženi fragmenti DNKfragmenti DNK

Tačkasti polimorfizmiTačkasti polimorfizmi: :

SNPsSNPs

adenine

thymin

guanine

cytosine

G C T T GC

Single nucleotide polymorphismsSingle nucleotide polymorphisms

A

T

G

CG C T T GC

C G A A CG

C G A A CG

Sekvenciranje DNKSekvenciranje DNK

Maxam Maxam Gillbertova Gillbertova hemijska hemijska metoda metoda degradacijedegradacije

Sangerova Sangerova enzimska enzimska metoda metoda terminacije terminacije sinteze lanacasinteze lanaca

Šta je potrebno za Sangerovu Šta je potrebno za Sangerovu metodumetodu

Više kopija molekula koji se sekvencira Više kopija molekula koji se sekvencira (klonirani fragment ili PCR produkt)(klonirani fragment ili PCR produkt)

Odgovarajući prajmerOdgovarajući prajmer DNK polimeraza (Sekvenaza)DNK polimeraza (Sekvenaza) dNTPs, ddNTPsdNTPs, ddNTPs Sistem za razdvajanje DNK fragmenataSistem za razdvajanje DNK fragmenata Sistem za detekciju DNK fragmenataSistem za detekciju DNK fragmenata

Sekvenciranje molekula DNK Sangerovom metodom

DNK sekvenciranje

Tokom elektroforeze se fragmenti razdvajaju po veličini

Pristupi za sekvenciranjePristupi za sekvenciranje

ManuelnoManuelno– Radioaktivno obeleRadioaktivno obeležen prajmer ili dNTPsžen prajmer ili dNTPs– Veća vernostVeća vernost– Vrlo sporoVrlo sporo– Zahteva puno radaZahteva puno rada

AutomatskoAutomatsko– Fluorescentno obeležen ddNTPFluorescentno obeležen ddNTP– Vrlo brzoVrlo brzo– Walk-away procedureWalk-away procedure

Manuelno sekvenciranjeManuelno sekvenciranje

Nalivanje denaturišućeg (urea) Nalivanje denaturišućeg (urea) poliakrilamidnog gela (1 dan)poliakrilamidnog gela (1 dan)

Elektroforeza (min 6 sati)Elektroforeza (min 6 sati) Ekspozicija 1 dan (phosphoimager Ekspozicija 1 dan (phosphoimager

skraćuje)skraćuje) Čitanje 300-350 baza (par sati)Čitanje 300-350 baza (par sati) Niža cenaNiža cena

TipiTipičan izgled čan izgled autoradiogramaautoradiograma

Automatsko sekvenciranjeAutomatsko sekvenciranje

Formati: Formati: – Sva 4 nukleotida u isti Sva 4 nukleotida u isti

uzorakuzorak– 1000 baza po uzorku1000 baza po uzorku– 1 do 96 kapilara po mašini1 do 96 kapilara po mašini

Optimizovani polimeri Optimizovani polimeri (reusable)(reusable)

Detekcija fluorescentno Detekcija fluorescentno obeleženih nukleotidaobeleženih nukleotida

Automatski sekvenatoriAutomatski sekvenatori

Sa grafika fluorescentnih pikova može se pročitati sekvenca molekulaDNK u 5’ to 3’

Vreme

Inte

nzit

et f

luor

esce

ncij

e(4

raz

liči

te b

oje)

Automatski sekvenatori sa kapilarom

ABI 3101 kapilara10 uzorka 10 kBaza dnevno

ABI 310016 kapilara768 uzoraka845 kbaza dnevno

ABI 3730xl96 kapilara4600 uzoraka5 mega baza dnevnoE.Coli 4Mbp

RT-PCR (qPCR)

RT-PCR (qPCR) nastavak

Drugi Drugi DNDNKK polimorfizmipolimorfizmi : :

STRsSTRs

2-7 nuc=STR

10-100 nuc=VNTR

Uzastopno ponovljeni nizoviUzastopno ponovljeni nizovi

OGROMNA VARIJABILNOST!!!!

Kratki uzastopni Kratki uzastopni ponovci ponovci (STRs)(STRs)

Region sa ponovcima je varijabilan a uokvirujući segmenti su konstantni

7 ponovaka

8 ponovaka

AATG

Homozigot = Oba alela su iste dužine

Heterozigot = Aleli se razlikuju po dužini

Multiplex PCR Simultano umnožavanje Simultano umnožavanje

većeg broja gena većeg broja gena ((krakraće će vreme)vreme)

Osetljivost velika Osetljivost velika (manje od 1 ng)(manje (manje od 1 ng)(manje uzorka)uzorka)

Mogućnost analize mešanih i Mogućnost analize mešanih i degradovanih uzorakadegradovanih uzoraka

Različite fluorescentne boje Različite fluorescentne boje za razlikovanje STR alela koji za razlikovanje STR alela koji se preklapaju po veličinise preklapaju po veličini

Multiplex PCR

Izgled amplifikovanih Izgled amplifikovanih fragmenatafragmenata

PP16 Promega PP16 Promega CSF1PO

D5S818

D21S11

TH01

TPOX

D13S317

D7S820

D16S539 D18S51

D8S1179

D3S1358

FGA

VWA

AMEL

AMEL

D3S1358

TH01

D21S11

Amel

AmelD18S51

D5S818

D13S317

D7S820

D16S539

CSF1PO

vWAD8S117

9

TPOX

Penta E

Penta D

FGA