Gasna hromatografija

Seminarski rad Oktobar,2012.

Gasna hromatografija (GC) 1 je čest tip hromatografije koji se koristi u analitičkoj hemiji za odvajanje i analizu jedinjenja koja mogu isparavati bez razlaganja. Tipična upotreba GC ukljucčuje ispitivanje čistoće pojedinih supstanci ili razdvajanje različitih komponenti smješe ( takođe može biti određena relativna količina takve komponente). U nekim slučajevima GC može pomoći u identifikaciji jedinjenja. U peparativnoj hromatografiji, GC se može koristiti za dobijanje čistih jedinjenja iz smješe.

U gasnoj hromatografiji mobilna faza ( ili faza koja se kreće) je gas nosač, obično inertni gas kao što je helijum, ili neki nereaktivni gas tipa azota. Stacionarna faza je mikroskopski sloj tečnosti ili polimer na inertnoj čvrstoj podlozi, unutar dijela stakla ili metalne cijevi koja se naziva kolona. Instrument koji se koristi za izvođenje gasne hromatografije naziva se gasni hromatograf (slika 1).

Slika 1. Gasni hromatograf

Gas nosač se sa analiziranim uzorkom propušta kroz kolonu i komponente iz uzorka raspodjeljuju se između dvije faze, na osnovu svojih koeficijenata raspodjele. Zbog toga svaka komponenta eluira u različito vrijeme, što je poznato kao vrijeme zadržavanja komponente,tj

1 GC – engl. gas chromatpgraphy

1


retenciono vrijeme. Uporedjivanje vremena zadržavanja je ono što je korisno u gasnoj hromatografiji.

Gasna hromatografija je u principu slicna kolonskoj hromatografiji ( kao i ostali oblici hromatografije, tipa HPLC, TLC ), ali ima nekoliko značajnih razlika. Prvo, proces odvajanja komponenti u smješi se vrši između tečne stacionarne faze, dok je kod hromatografije u koloni stacionarna faza čvrsta, a mobilna faza tečna. Drugo, kolona kroz koju gasna faza prolazi je smještena u rerni gdje se moze kontrolisati temperatura gasa, dok kod kolonske hromatografije obično nema kontrole temperature. Treće, koncentracija komponenti u gasnoj fazi je samo funkcija napona pare gasa.

GC je takođe slična frakionoj destilaciji, jer je kod oba procesa odvajanje komponenti u smješi prvenstveno zasnovano na različitim tačkama ključanja ( ili naponima pare). Međutim, frakciona destilacija se obično koristi za odvajanje komponenti iz smješe u većim razmjerama, dok se GC koristi za mnogo manje razmjere ( mikrorazmjere).

GC se u naučnoj literaturi nekad označava i kao gas – liquid partitation chromatography.

1. ISTORIJA

Hromatografija datira jos od 1903. godine, iz radova Ruskog naučnika Mikhaila Semenovića Tswetta. Njemacki diplomac Fritz Prior je 1947. godine gasnu hromatografiju sa čvrstom stacionarnom fazom. Archer John Porter Martin, koji je dobio Nobelovu nagradu za rad na otkriću tečno – tečno (1941) i hromatografije na hartiji (1944), postavio je osnove za razvoj gasne hromatografije i kasnije je proizveo tečno – gasnu hromatografiju (1950). Erika Cremer postavila je podlogu i nadzirala je većinu Priorovih radova.

2. GC ANALIZA

Gasni hromatograf je instrument za hemijsku analizu koji služi za odvajanje hemikalija u kompleksnom uzorku. Gasni hromatograf koristi usku tubu koja se naziva kolona, kroz koju različite hemijske komponente uzorka prolaze sa gasnom strujom (gas nosač, mobilna faza) različitom brzinom zavisno od njihovih hemijskih i fizičkih osobina i njihove interakcije sa specifičnim punjenjem kolone, koje se naziva stacionarna faza. Kada komponente dođu do kraja kolone one se detektuju i identifikuju elektronski (slika 2.). Funkcija stacionarne faze u

2


koloni je da razdvoji različite komponente, uzrokujući da svaka od njih napusti kolonu u različito vrijeme (retenciono vrijeme). Ostali parametri koji se mogu koristiti za promjenu reda ili vremena zadržavanja su: brzina protoka gasa nosača, dužina kolone i temperatura.

Slika 2. Aparatura za gasnu hromatografiju

U GC analizi poznata zapremina gasnog ili tecnog analita se ubrizgava u ‘ulaz’ (glavu) kolone, koristeći obično mikrošpric. Kako gas nosač povuče molekule analita kroz kolonu, ovo kretanje je inhibisano adsorpcijom molekula analita ili na zidovima kolone ili na materijalu pakovanja u koloni. Brzina kojom molekuli prolaze kroz kolonu zavisi od snage adsorpcije, koja zavisi od tipa molekula i materijala na stacionarnoj fazi. Kako svaki tip molekula ima različitu brzinu napredovanja, različite komponente analizirane smješe se razdvajaju zbog različitog progresa duž kolone i dostizanju kraja kolone u različito vrijeme (retenciono vrijeme). Detektor se koristi da prati ispust iz kolone, tako, vrijeme za koje svaka komponenta napusta kolonu i količina te komponente moze biti odredjena.

Generalno, supstance se identifikuju pomocu reda kojim eluiraju iz kolone i preko vremena zadržavanja analita u koloni.

3


3. FIZIČKE KOMPONENTE

3.1.Autouzorkivači

Autouzorkivači obezbjeđuju sredstva za automatsko uvođenje uzorka u zaton. Rucno uvođenje uzorka je moguće, ali se više ne koristi. Automatsko uvođenje omogućava bolju reprodukciju i optimizira vrijeme.

Postoje različite vrste autouzorkivača. Mogu biti klasifikovani zavisno od kapaciteta uzorka (autoinjektori – autouzorkivači, gdje auto – injektori mogu odraditi mali broj uzoraka), od robotike ( XYZ robot – rotirajući robot – najčešće korišteni), ili od analize:

Tečnost Statična glava – razdvajanje pomoću šprica Dinamična glava – razdvajanje pomoću transfer – line tehnologije Čvrsta faza mikroekstrakcija (SPME)

3.2. Injektor

Injektori predstavljaju sredstvo za uvođenje uzorka u kontinuirani tok gasa nosača. Injektor predstavlja dio hromatografa koji je povezan sa glavom kolone.

Najčešći tipovi injektora su:

S/SL (Split/ Splitless) injektor; uzorak se uvodi u malu zagrijanu komoru pomoću šprica. Gas nosač onda unosi ili cijeli uzorak u kolonu (splitless – bez razdvajanja) ili samo njegov dio (split - razdvajanje). Kod oblika kod koga imamo razdvajanje dio uzorak/gas nosač smješe u injekcionoj komori je iscrpljen kroz otvor. Ovakvo injektovanje se preferira kod rada sa uzorcima sa velikom koncetracijom analita ( > 0.1%), dok je injektovanje bez podjele kod analiza uzoraka kod kojih su analiti prisutni samo u tragovima ( < 0.01%).

Injektori na koloni; u ovom slucaju uzorak se unosi u kolonu u cijelosti bez zagrijavanja. PTV injektor; temperaturno programirano uvođenje uzorka prvo je opisao Vogt 1979. U

startu je Vogt otkrio tehniku za uvodjenje uzoraka velikih zapremina u kapilare GC. On je uvodio uzorak u postavu sa kontrolisanom brzinom injiciranja. Temperatura te postave je izabrana malo iznad temperature ključanja rastvarača. Rastvarači sa nižom temperaturom ključanja konstantno su isparavali i oni su ispuštani. Na osnovu ove tehnike, Poy je razvio Programmed Temperature Vaporising injector; PTV.

4


Injektor izvora gasa; gasni uzorci sakupljaju se u bocama i povezani su najčesce sa ventilom sa prekidačem. Gas nosač protiče bez prekida dok se uzorak ne proširi na, predhodno evakuisanu, spiralu. Po prekidanju, sadržaj spirale se unosi u tok gasa nosača.

P/ T (Purge-and-Trap) sistem; inertni gas se unosi kroz vodeni uzorak uzrokujući pročišćavanje nerastvornih volatilnih komponenti iz smješe. Volatili se zarobljavaju (trap) na kolonu sa absorbentom (tzv. Zamka ili koncentrator) na sobnoj temperaturi. Ovako zarobljeni volatili se zagrijavaju i usmjeravaju se u struju gasa nosača.

Jako je važan izbor mobilne faze, a najbolji razdvajanje postiže se primjenom vodonika. Helijum postiže slične rezultate kao i vodonik, s tim što nije zapaljiv, a može i da radi sa velikim brojem detektora, pa se zbog toga i najčešće koristi.

3.3.Detektori

U gasnoj hromatografiji koristi se veliki broj detektora. Najčešće korišten detektor je plameno – jonizacioni detektor detektor na bazi toplotne provodljivosti (katarometar). Oba su osjetljiva na širok opseg komponenti i oba mogu raditi sa širokim opsezima koncentracija. Dok je katarometar prevashodno univerzalan i može se koristiti da detektuje bilo koju komponentu osim gasa nosača (dok god je njihova toplotna provodljivost različita od toplotne provodljivosti gasa nosača, na temperaturi detektora), plameno – jonizacioni detektor osjetljiv je prvenstveno na hidrokarbonate, znatno osjetljiviji nego katarometar. Međutim, plameno – jonizacioni detektor ne može detektovati vodu. Katarometar je neuništiv, pa može raditi u serijama prije plameno – jonizacionog detektora, koji je uništiv, što omogućava komplementarnu detekciju jednog analita.

Ostali detektori su osjetljivi samo na specifične tipove supstanci, ili rade dobro samo u užim opsezima koncentracije. Oni uključuju:

Katalitički zapaljivi detektor, koji mjeri zapaljivost hidrokarbonata i vodonika. Ispuštajuci jonizacioni detektor, koji koristi visokovoltazno električno izlučivanje za

proizvodnju jona. Suvi elektrolitički provodljivi detektor, koji koristi vazdušnu fazu i visoku temperaturu za

mjerenje hlornih jedinjenja. Detektor na bazi zahvata elektrona, koji koristi radioaktivne β cestice – β- emitere koji

mjere zahvat elektrona. Plameni – fotometrični detektor Plameni – jonizacioni detektor

5


Helium –jonizacioni detektor Azot – fosforni detektor Infrared detektor Maseni spektometar Foto- jonizacioni detektor Pulsirajući – ispuštajući jonizacioni detektor Detektor na bazi toplotne provodljivosti Termojonski jonizirajuci detektor.

Neki gasni hromatografi su povezani na maseni spektrometar koji služi kao detektor. Ova kombinacija je poznata kao GC – MS. Neki Gc – MS su povezani na NMR spektrometar koji služi kao detektor pojačivač. Neki GC – MS –NMR su povezani sa infracrvenim spektrometrom koji ovdje služi kao pojačanje. Ova kombinacija je dosta rijetka, jer je za većinu analiza dovoljna kombinacija GC – MS.

4. METODE

Metode predstavljaju sumu stanja u kojima GC radi na datu analizu. Razvoj metode je proces odredjivanja stanja koja su adekvatna i/ili idealna za traženu analizu.

Stanja mogu biti raznovrsna da bi odgovorila zahtjevima analize, koji uključuju: temperaturu injektora, temperaturu detektora., temperaturu kolone i temperaturni program, gas nosač i brzinu protoka gasa nosača, stacionarnu fazu kolone, prečnik i dužinu, tip injektora i brzinu protoka, veličinu uzorka i tehniku njegovog injiciranja. Zavisno od detektora koji je instaliran na GC-u, moze biti različit broj stanja tog detektora. Neki GC-i uključuju i ventile koji mogu da preusmjere uzorak i tok gasa nosača. Vrijeme otvaranja i zatvaranja ovih ventila moze biti vazno za razvoj metode.

4.1. Izbor gasa nosača i brzina protoka

Tipični gas nosač uključuje helijum, argon, azot i vazduh. Koji će se gas upotrebiti zavisi od detektora koji se koristi, npr. Ispuštajuci jonizacioni detektor zahtjeva korišćenje helijuma kao gasa nosača. Kada se analiziraju gasni uzorci, medjutim, gas nosač se odredjuje na bazi matrice uzorka, npr, kada se analizira smjesa u argonu, preferira se da se koristi argon kao gas nosač, jer

6


se argon u uzorku ne pojavljuje na hromatogramu. Bezbjednost i dostupnost takodje moze uticati na izbor gasa nosača, npr, vodonik je zapaljiv, a helijum visoke čistoće je teško dobiti u nekim djelovima svijeta.

Čistoća gasa nosača je često djelimično određena detektorom, gdje nivo osjetljivosti ima značajnu ulogu. Obično se koristi čistoće od 99.995% ili više. Najčešći stepen čistoće koji zahtjevaju moderni instrumenti je 99.999%, što znači da u gasu nosaču ima 10 ppm nečistoća koje mogu uticati na rezultate analize. Najveći stepen čistoće je 99.9999%, ali neke forenzičke aplikacije i aplikacije vezane za zaštitu životne sredine zahtjevaju stepen čistoće gasa nosača od 99.99999% i gasovi nosači ove čistoće su sada i komercijalno dostupni.

Linearna brzina gasa nosača utiče na analizu na isti način kao i temperatura. Što je veća linearna brzina brža je i analiza, ali je slabija separacija komponenti. Podešavanje linearne brzine zbog toga mora biti optimalno, da bi se dobilo zadovoljavajuce razdvajanje komponenti i zadovoljavajuca brzina analize. Iz istog razloga i temperatura mora biti optimalna. Linearna brzina protoka gasa zavisi od unutrašnjeg prečnika kolone.

Kod GH-a napravljenih prije 1990. godine brzina protoka gasa nosača je kontrlisana indirektno kontrolisanjem pritiska ubrizgavanja gasa nosača ili ’pritiska na glavu kolone’. Sada se brzina protoka gasa mjeri na izlazu iz kolone ili detektorima sa elektronskim protokometrom. Pritisak se ne može mjenjati tokom procesa, tako da je protok konstantan u toku trajanja analize. Relacija izmedju brzina protoka i pritiska ubrizgavanja se računa pomoću Poiseuilliove jednačine za fluide koji se mogu sabijati.

Većina modernih GC, međutim, elektronski mjere brzinu protoka i elektronski kontrolisu pritisak gasa nosača da bi podesili brzinu protoka. Stoga, brzina protoka i pritisak gasa nosača mogu se podesiti u toku procesa, pomoću pritisak – protok programa sličnom temperaturnom programu.

4.2. Izbor stacionarne faze (komponente)

Polarnost rastvora presudna je za izbor stacionarne komponente, koja u optimalnom slučaju ima sličnu polarnost kao i rastvor. Najčešće stacionarne faze u otvorenim cjevastim kolonama su cianopropilfenil dimetil polisiloksan, karbovaks polietilenglikol, biscianopropil

7


cianopropilfenil polisiloksan i difenil dimetil polisiloksan. Za zatvorene kolone dostupno je više opcija.

4.3. Tipovi injektora i brzina protoka

Izbor tipa injektora i injekcione tehnike zavisi od toga da li je uzorak u tečnoj, gasovitoj, adsorbovanoj ili čvrstoj formi i da li rastvarač mora da ispari. Rastvoreni uzorci mogu se uvesti direktno na kolonu pomocu COC injektora, ako su uslovi dobro poznati; ako rastvarač mora da ispari ili da se djelimično ukloni, koristi se S/SL injektor; gasni uzorci se najčešće injiciraju korišćenjem injektora kao izvora gasa; adsorbovani uzorci se uvode ili korištenjem eksterne desorpcje ( P-T sistem) ili desorpcijom u S/SL injektoru.

4.4. Veličina uzorka i injekciona tehnika

4.4.1. Unošenje uzorka

Hromatografska analiza pocinje unošenjem uzorka na kolonu. Razvoj kapilarne gasne hromatografije rezultirao je mnogim praktičnim problemima sa injekcionim tehnikama. Tehnika injektovanja na koloni, često korištena sa pakovanim kolonama, obično nije moguća sa kapilarnim kolonama. Injekcioni sistem u kapilarnoj gasnoj hromatografiji mora u potpunosti da odgovori na dva zahtjeva:

1. Injektovana količina ne smije preopteretiti kolonu.2. Širina injektovanog čepa treba biti uporediva sa širenjem u dužini u procesu

hromatografije. Ukoliko se ne odgovori na ove zahtjeve doći će do promjene u sposobnosti separacije kolone. Kao generalno pravilo, injektovana zapremina V inj, i zapremina ćelije detektora Vdet , trebaju biti oko 1/10 zapremine koju zauzima porcija uzorka koji sadrzi molekule analita kada oni napuste kolonu.

8


Neki generalni zahtjevi koje dobra injekciona tehnika mora zadovoljavati su:

Treba biti moguce dobiti kolonu koja ima optimalnu separacionu efikasnost. Treba omoguciti tačno i reproduktibilno injektovanje manjih kolicina tipičnih uzoraka. Ne smije biti promjena u sastavu uzorkane smije se pokazati diskriminacija zasnovana na

različitim tačkama ključanja, polarnosti, koncetracijama ili termalno/ katalitičkoj stabilnosti.

Treba biti primjenjiva za analizu tragova isto kao i za nerazblazene uzorke.

4.5.Selekcija kolone

Izbor kolone zavisi od uzorka. Glavna hemijska osobina koja se uzima u obzir prilikom izbora kolone je polarnost smješe, ali i funkcionalne grupe mogu imati veliku ulogu prilikom izbora kolone. Polarnost uzorka mora se poklapati sa polarnošću stacionarne faze kolone da bi povećali rezoluciju i separaciju, kao i vrijeme samog procesa. Separacija i vrijeme odigravanja procesa takodje zavise od debljine filma (na stacionarnoj fazi), prečnika kolone i dužine kolone.

4.6. Temperatura kolone i temperaturni program

Kolone u GC-u se nalaze u pećima, čija se temperatura precizno kontroliše elektronski.

Brzina kojom uzorak prolazi kroz kolonu je direktno proporcionalna temperaturi kolone. Što je veća temperatura kolone, uzorak brže prolazi kroz kolonu. Međutim, što se uzorak brže kreće kroz kolonu slabija je interakcija sa stacionarnom fazom, pa se i komponente slabije razdvajaju.

Generalno, temperatura kolone se podešava tako da se napravi kompromis između dužine analize i stepena razdvajanja.

9


Metoda kod koje je temperatura kolone konstantna tokom cijele analize naziva se izotermalna. Kod većine metoda, međutim, temperatura se u toku analize povećava, pa se inicijalna temperatura, stepen povećanja temperature i finalna temperatura nazivaju temperaturni program.

Temperaturni program omogućava da se analiti koji eluiraju ranije u toku analize adekvatno odvoje.

5. REDUKCIJA PODATAKA I ANALIZA

Kvalitativna analiza:

Generalno su hromatografski podaci predstavljeni kao grafik, kod koga se na y- osi nalazi signal detektora, a na x- osi retenciono vrijeme. Ovakav grafik naziva se hromatogram. Na grafiku se vidi serija pikova, gdje svaki pik odgovara određenoj komponenti iz uzorka, koji eluiraju iz kolone u različito vrijeme. Retenciono vrijeme se može koristiti za identifikaciju komponenti ukoliko su uslovi pri kojim se izvodi metoda konstantni. Takođe, šablon po kojem se prikazuju pikovi biće konstantan za uzorak pri konstantnim uslovima, što omogućava identifikaciju

10


komponenti složenih smješa. U modernijim primjenama se, međutim, koristi GC povezan sa masenim spektrometrom ili sličnim detektorom koji omogućava identifikaciju komponenti predstavljenih pikovima.

Kvantitativna analiza:

Oblast ispod pika je proporcionalna količini komponente prisutne u hromatogramu. Računanjem oblasti ispod pika korišćenjem matematičke funkcije integracije, može se odrediti koncetracija komponente u orginalnom uzorku. Koncentracija se moze izračunati korišćenjem kalibracione krive konstruisane pronalaženjem odgovora za serije koncentracije komponenti ili određivanjem relativnog odgovornog faktora komponente. Relativni odgovorni faktor je očekivani odnos komponene i unutrašnjeg standarda (ili spoljasnjeg standarda) i računa se pronalaženjem odgovora poznate količine komponente i konstantne količine unutrašnjeg standarda (hemijski dodatog uzorku u konstantnoj koncetraciji, sa različitim retencionim vremenom u odnosu na komponentu).

U najmodernijim GC – MS sistemima, kompjuterski softver se koristi da nacrta i integrise pikove.

6. APLIKACIJA

Generalno, supstance koje isparavaju iznad temperature od 300℃ ( i pri tom su stabilne do te temperature) mogu biti kvantitativno izmjerene. Uzorci takođe moraju biti bez soli, ne smiju sadržati jone. Veoma male količine supstance mogu se izmjeriti, ali to često zahtjeva da uzorak mora biti mjeren u odnosu na određeni standard.

Različiti temperaturni programi mogu biti korišćeni da obezbjede da očitavanja budu značajnija, npr da se napravi razlika između supstanci koje se ponašaju slično u toku GC procesa.

Rad sa GC-om omogućava i analiziranje sadržaja hemijskih produkata, npr za utvrđivanje kvaliteta produkata u hemijskoj industriji, ili mjerenje toksičnih supstanci u soli, vazduhu ili vodi. GC je veoma precizan ako se pravilno koristi i može mjeriti pikomole supstance u 1 ml tečnog uzorka, ili miliardite djelove koncentracije u gasnom uzorku.

Na praktičnim kursevima na fakultetima, studenti se nekad upoznavaju sa GC-om proučavanjem sadržaja u lavandinom ulju ili mjerenjem etilena koji je izlučen iz Nicotiana benthamiana biljke nakon vještačkog ozlijeđivanja njenog lišća. U tipičnim eksperimentima, pakovane kolone se

11


koriste za odvajanje lakših gasova, koji se kasnije detektuju pomoću katarometra. Hidrokarbonati se odvajaju pomoću kapilarnih kolona i detektuju pomoću plamenog – jonizirajućeg detektora. Komplikacija kod analize lakih gasova je sto H2 i He, koji se najčešće koristi kao gas nosač, imaju gotovo identičnu termalnu provodljivost. Iz ovog razloga koristi se dvostruki katarometar sa odvojenim kanalom za vodonik, koji koristi najčešće azot kao gas nosač. Argon se obično koristi kada je analizirana gasna faza hemijski reaktivna.

7. GC U MODERNOJ KULTURI

Filmovi, knjige i TV emisije pogrešno predstavljaju mogućnosti gasnog hromatografa. U SAD-ovim emisijama CSI, npr, GC-i da brzo identifikuju nepoznate uzorke. ’Ovaj benzin je kupljen na pumpi Chevron u proteklih dvije nedjelje’, analitičar obično kaže pedeset minuta nakon primanja uzorka.

Zapravo, tipična GC analiza zahtjeva mnogo više vremena; ponekad jedan običan uzorak mora se obrađivati više od sat vremena zavisno od izabranog programa, a još više vremena je potrebno da se zagrije kolona tako da bude zagrijana za prvi uzorak, a može se koristiti i za sledeći. Isto tako, potrebno je nekoliko obrada da se potvrde rezultati studije .

Takodje, GC ne identifikuje pozitivno većinu uzoraka, i ne moraju sve supstance u uzorku biti identifikovane. Ono sto GC istinski govori je u kom je vremenu komponenta eluirala iz kolone i da je detektor osjetljiv na nju. Da bi rezultati bili značajni, analitičari moraju znati koje komponente i u kojim koncantracijama se očekuju, ali i tada se mala količina supstance može sakriti iza supstance koja ima veću koncetraciju i isto relativno vrijeme eluiranja. Na kraju, potrebno je i provjeriti rezultate uzorka analiziranog pomocu GC-a u odnosu na referentni uzorak koji sadrži samo očekivane supstance.

GC –MS moze otkloniti većinu ovih dvosmislenosti, jer maseni spektrometar može identifikovati komponente molekulske težine. Ali ovo takođe zahtjeva vrijeme i vještinu da bi se obavilo kako treba.

Slično, većina GC analiza nisu ’pritisni dugme’ operacije. Ne može se jednostavno staviti uzorak u autouzorkivač, pritisnuti dugme i sačekati da kompjuter kaže sve što se želi znati o uzorku.

12


’Pritisni - dugme’ operacije mogu se koristiti za obradu sličnih uzoraka koji se obradjuju jedan za drugim, kao npr u hemijskoj proizvodnji ili za upoređivanje 20 uzoraka iz istog eksperimenta da se izračuna glavni sastojak iste supstance.

13

Documents

Gasna hromatografija