Tečna hromatografija (Liquid Chromatography – LC)

- niz metoda kod kojih je pokretna faza tečna: tečno-čvrsta hromatografija tečno-tečna hromatografija jonoizmenjivačka hromatografija gelna hromatografija hromatografija na hartiji hromatografija u tankom sloju

Tečna hromatografija

Vrste tečne hromatografije

Adsorpciona hromatografija

Podeona hromatografija

Jonoizmenjivačka hromatografija

Gel-filtraciona hromatografija

Vrste hromatografije

Adsorpciona hromatografija Podeona hromatografija

Jonoizmenjivačka hromatografija

Gel-filtraciona hromatografija

PRINCIP LC

razdvajanje se vrši na osnovu različite raspodele komponenti između dve tečne faze

MF i SF moraju biti nemešljive tečnosti SF se nanosi u vidu tankog filma na čvrst nosač čvrsti nosač ⇒ silika-gel ili staklene kuglice koeficijenti raspodele komponenti iz smeše treba

da budu što različitiji za odabrani par rastvarača veliki izbor rastvarača ⇒ veoma univerzalna

metoda

Nedostaci i unapređenje LC

1. dve tečnosti nikada nisu potpuno nemešljive ⇒ MF polako rastvara SF i ispira je iz kolone

problem se ublažava primenom predkolone koja ima isti sastav kao kolona

kroz predkolonu se propušta MF, pri čemu se ona zasićuje sa SF

kada uđe u kolonu, MF više ne može da rastvara SF, jer je njome zasićena

Nedostaci i unapređenje LC

2. difuzija komponenti iz jedne tečne faze u drugu je spora ⇒ analiza dugo traje

MF treba da bude što manjeg viskoziteta (heksan, acetonitril, metanol)

smanjuje se veličina čestica nosača ⇒ put koji komponenta prelazi je kraći, ali se povećava otpor protoku, pa se mora primeniti povišeni pritisak ⇒ modifikacija tečne hromatografije ⇒ HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY ili HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

HPLC (High-Performance Liquid Chromatography)

Tečna hromatografija

pod visokim pritiskom

Rastvarači Polarni rastvarači voda>metanol>acetonitril> etanol Nepolarni rastvarači n-dekan>n-heksan>n-pentan>cikloheksan

AUTOSEMPLER

Manuelni injektori - volumen

petlje može biti različit (10 µl, 20µl, 100 µl itd.) i njegov izbor zavisi od tipa analize koja se izvodi. Nedostatak je što se svaki uzorak mora injektovati.

Autosempleri - automatski injektorski sistem - volumen injektovanja se može podesiti od 1 µl pa do 100 µl i više što zavisi od vrste analize. Može se obezbediti da se bez prisustva analitičara uradi 100 i više analiza.

Kolona

Kolona – stacionarna faza predstavlja najvažniji deo HPLC sistema, mesto svih hromatografskih dešavanja. Stacionarne faze pakovane su u kolone od nerđajućeg čelika i njihov izbor zavisi od fizičko-hemijskih osobina supstanci koje se ispituju. Kolone mogu biti različite dužine, od 2,5 do 25 i više centimetara sa različitim unutrašnjim prečnikom, najčešće 4,6 mm i prečnikom čestica od 3 µm do 10 µm. Temperatura kolone održava se konstantnom u toku analize pomoću termostata za kolonu, jer promena temperature utiče na koeficijent raspodele, rastvorljivost komponenti i viskozitet mobilne faze.

STACIONARNA FAZA

Performanse su poboljšane korišćenjem čestica malog prečnika : analiza je u drugom slučaju gotova za 15 minuta, dok se u prvom

odvija deset puta brže

kolona sa česticama od 3 μm , dužine 6 cm

čestice 10 μm , dužina 20 cm

OSOBINE DETEKTORA

visoko osetljiv –detektor je utoliko bolji ukoliko je signal koji daje intenzivniji, a koncentracija analita manja. Osetljivost detektora zavisi od prirode analita.

odgovara svim analitima u smeši širok opseg linearnosti da se odgovor ne menja sa promenama u sastavu mobilne faze i

temperature lak i jednostavan za upotrebu da odgovor proporcionalno raste sa povećanjem koncentracije analita da ga rastvori ne mogu oštetiti da daje kvalitativne informacije za detektovani pik da brzo daje odgovor.

Detektori

Detektor koji meri indeks refrakcije Univerzalan - detekcija se zasniva na promeni indeksa

refrakcije pri prolasku analita kroz ćeliju za uzorak u detektoru dok se u referentnoj detektorskoj ćeliji nalazi mobilna faza. Veoma je osteljiv na sastav mobilne faze.

UV-VIS detektor (uglavnom 200-400nm ili 254 nm)

Fluorescentni

Elektrohemijski detektori

Maseni spektrometar

UV-VIS detektor

Najpopularniji i najviše korišćeni detektori, posebno u kontroli kvaliteta lekova. Detektuju samo supstance koje apsorbuju UV ili VIS zračenje. Supstance koje u sebi imaju aromatični prsten, dvostruke veze između O, S, N ili C kao i druge hromofore, apsorbuju UV ili VIS zračenje i mogu se određivati ovim detektorima. Količina svetlosti koju supstanca apsorbuje srazmerna je koncentraciji, prema Lamber-Beerovom zakonu.

Fluorescentni detektor

Detekcija komponente koja fluorescira zasnovana je na emisiji fluorescencije koja je praćena ekscitacijom na određenoj talasnoj dužini. Robusan i selektivan detektor koji je pogodan za komponente koje fluoresciraju kao i one koje se derivatizacijom mogu prevesti u supstancu koja ima sposobnost fluorescencije.

UV i fluorescentni detektori

Elektrohemijski detektor

Uglavnom se koristi kulometrijska detekcija. Tačno određeni potencijal se primenjuje izmeđ radne i referentne elektrode. Detekcija se zasniva na oksido-redukcionim procesima. Često se koristi za analizu lekova i bioloških materijala. Detektor visoke osetljivosti.

HPLC-MS

HPLC analiza Response

Retention Time

5 10 15 20 25

A

B

C

D

Kvalitativna analiza-retenciono vreme

Kvantitativna analiza-površina pika

46

Kalibraciona kriva

C1

C4

C3

C2

Concentration Area

P1

P2

P3

P4 C1 C2 C3

Concentration C4

P1

P2

P3

P 4

Pea

k ar

ea

Calibration curve

Mesta uzorkovanja

Primena

uzorak lekovi pesticidi

reka 4-FAA, 4-AAA, karbamazepin, azitromicin, lorazepam, metoprolol, bisoprolol, trimethoprim

karbendazim, atrazin, dimetoat, propazin, karbofuran

podzemna voda

4-FAA, 4-AAA, karbamazepin karbendazim, atrazin

sediment karbamazepin, diazepam, klopidogrel, eritromicin

dimethoat, atrazin, propazin, malation, karbofuran