1

1

ANALITIKA HIRALNIH JEDINJENJA

Doc. dr Biljana Stojanovi ć

2

• odgovarajuće grupe jedinjenja u živom organizmu su u obliku samo jednog enantiomera

• ugljeni hidrati (D), aminokiseline (L), proteini, hormoni, enzimi, alkaloidi...

Biološki organizam Hiralni selektor(hiralna sredina)

Lekovi na tržištu – 50 % racemati

Lekovi sa 50 % nečistoća ???

Homohiralnost prirode

2

3

Hiralne molekule

Hiralnost – molekule se odnose kao predmet i lik u og ledalu.

Par hiralnihmolekula u

rukama

par enantiomera

Podsetimo se...

4

Nehiralne molekule :

� Nemaju asimetrični centar

� Imaju ravan simetrije

� Nisu optički aktivni

Hiralne molekule :

� Imaju jedan asimetrični centar –

atom povezan sa 4 različita

supstituenta

� Optički aktivni

Hiralne i nehiralne molekule

3

5

Osobine enantiomera

Iste fizi čko-hemijske osobine

(MS spektar, NMR spektar, IR spektar, hemijske reakcije...)

Razlikuju se po ravni skretanja polarizovane svetlosti:

-jedan skre će u smeru kazaljke na satu (+) - dekstrogiri

- jedan skre će u smeru suprotnom kazaljke na satu (-) -levogiri,

-smeša (+) i (-) oblika u odnosu 50:50 je racemat

-racemat ne obr će ravan polarizovane svetlosti

6

Bitne osobine hiralnih lekova

� Farmakološki aspekt� Toksikološki aspekt

� Farmakokinetički aspekt

� Aspekt analitike hiralnihlekova

� Komercijalni aspekt

4

7

Farmakološki aspekt

Upotreba lekova racemata u kliničkoj praksi:

1. jedan enantiomer aktivan (eutomer) , a drugi inaktivan ili je

aktivnost smanjena (distomer) ili prouzrokuje toksičnost ili

neki drugi željeni ili neželjeni efekat

2. oba enantiomera imaju istu aktivnost

3. jedan ili oba enantiomera podležu hiralnoj inverziji

8

1. Enantiomeri sa različitom aktivnošću

S(-) - propranolol

100 x aktivniji kao β-blokator

R(+) - propranolol

Terapija hipertireoidizma

R(-) - albuterol S(+) - albuterol

aktivan, 5 x skuplji od racemata inaktivan i neželjeni efekti

O NH

OHH

O NH

H OH

HO

HO

HN

HO H

HO

HO

HN

HHO

5

9

2. Oba enantiomera sa istom aktivnošću

R,S flekainid(antiaritimik)

R,S fluoksetin(antidepresiv)

O

F3C

HN

CH3 O

NH

O

F3C

CF3

HN

O

10

3. Enantiomer(i) podležu hiralnoj inverziji

R(-) - ibuprofen S(+) - ibuprofen

R(-) - oksazepam S(+) - oksazepam

CH3

H3C

COOH

CH3H

CH3

H3C

COOH

CH3H

in vivo

100 x aktivniji

N

HN

Cl

O

OH

H N

HN

Cl

O

OH

Hin vitro

100 x aktivniji

6

11

Toksikološki aspekt

HO

OH

COOH

NH2H

L - dopa D - dopa

(antiparkinsonik) (agranulocitoza)

S(-) - sekobarbitalR(+) - sekobarbital

(antikonvulziv) (antikonvulziv)

potentniji i toksičniji anestetik

HO

OH

COOH

H NH2

HN N

O O

OH

CH3

H

HN N

O O

OH

H

CH3

12

N

NH

O

O O

O N

NH

O

O O

Oin vivo

R(+) - talidomid S(-) - talidomid

sedativ, imunomodulator, teratogen??

7

13

1. Transformacija prohiralne supstance u hiralni metabolit

ketoni 2° alkoholi

fenitoin (R,S)-4-hidroksifenitoin

2. Transformacija hiralne supstance u hiralni metabolit

(S)-varfarin (S)-7-hidroksivarfarin

redukcija

oksidacija

oksidacija

HN

NH

O

O

HN

NH

O

O

OH*

O O

OOH

H

O O

OOH

H

OH

Farmakokinetički aspekt

14

3. Transformacija hiralne supstance u dijastereoizomerni metabolit

(-)-mentol (-)-mentol glukuronid T1/2 = 2,4h

(+)-mentol (+)-mentol glukuronid T1/2 = 4,0h

OH

OH

OGlu

OGlu

2° met.

2° met.

8

15

Razvoj postupka za dobijanje čiste hiralne aktivne farmaceutske supstance

zahteva:

�Određenu kontrolu procesa sinteze

�Farmakološku i toksikološku procenu oba enantiomera

� Odgovarajuću procenu metabolizma i distribucije

�Odgovarajuću kliničku procenu lekova

Da li je lako dobiti čist aktivan enantiomer?

Odgovor: Dobijanje čistih enantiomera je složen i skup postupak!

16

Analitika enantiomera

Određivanje enantiomerne čisto će:

1. Polarimetrija2. Gasna hromatografija3. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC)

Veliki zna čaj u:

1. Farmaceutskoj industriji 2. Analizi iz biološkog materijala

9

17

1. Polarimetrija

PrednostiBrza, jednostavna i jeftina metodaNajčešće se upotrebljava za određivanje optičke aktivnosti

NedostaciZahteva da uzorci budu homogeniNe sme doći do kristalizacijeUgao rotacije čistog enantiomera mora biti poznatUgao rotacije osetljiv na promene temperature i koncentracije rastvoraKod koncentrovanih rastvora specifična optička rotacija i koncentracija nisu u linearnoj zavisnosti

α= dobijeni ugao rotacijel = dužina ćelije u dm

c = koncentracija u g/mL

18

Hiralna stacionarna faza koja sadrži hiralni agens visoke enantiomerne čistoće, adsorbovan na površinu silikeReverzibilne dijastereoizomerne interakcije – razdvajanje enantiomera

PrednostiBrza i jednostavna metoda

Nečistoće u tragovima ne utiču na rezultateVeoma osetljiva metodaNa osnovu faktora selektivnosti, α moguće je odrediti jačinu interakcije između pojedinačnih enantiomera i hiralne stacionarne faze

Moguće određivanje apsolutne konfiguracije (uz standard)NedostaciSkupa metoda

Analizirane supstance moraju biti isparljive i termostabilne

2. Gasna hromatografija

U Ph. Eur. za određivanje hiralne čistoće.

10

19

Hiralno razdvajanje:−građenje dijastereoizomernih soli−enzimsko razlaganje enantiomera (mikroorganizmi)−klasična HPLC−hiralna HPLC

najkorisnija u analizi hiralnih lekova

3. Tečna hromatografija pod visokim pritiskom

20

Hiralna HPLC

Direktna Indirektna

Hiralni derivatizacioni agens�hiralna mobilna faza�hiralna stacionarna faza

Mehanizam razdvajanjaFormiranje kompleksa između enantiomera i stacionarne faze različite energije vezivanja razdvajanje

11

21

Za razdvajanje enantiomera HPLC metodom potrebno je obezbediti hiralnu sredinu!

Načini postizanja hiralne sredine su:

� Primenom hiralne mobilne faze i nehiralne stacionarne faze

� Primenom hiralne te čne stacionarne faze i nehiralnemobilne faze

� Primenom hiralne čvrste stacionarne faze i nehiralnemobilne faze

22

Najznačajniji hromatografski parametar za razdvajanje enanatiomera je faktor selektivnosti:

Pri čemu je k2 > k1

Cilj : razdvajanje na baznoj liniji uz α<3

12

23

���� Hiralne mobilne faze

Hiralni agens

+ enantiomeri dijastereoizomeri

Različita raspodela između stacionarne i

mobine faze

24

Princip : u mobilnu fazu doda hiralni agens koji gradi komp leks sa

parom enantiomera, nagra đuju se dijastereoizomeri koji imaju

razli čite distribucione koeficijente izme đu mobilne i stacionarne

faze.

hinin

PrImer hiralnog selektora:

13

25

Primer: razdvajanja enantiomera N-(1-feniletil)ftalamske kiseline uz upotrebu hinina kao hiralnog agensa

Hromatografski uslovi : stacionarna faza, LiChrosorb SI 100, 5 µm; mobilna faza, dihlormetan–butan-1,2-diol (99:1 V/V) koja sadrži 0,35 mM hinina i sirćetne kiseline; UV detektor.

26

Prednosti primene hiralnog agensa:

� postojanje velikog broja hiralnih agenasa

� ekonomična (hiralni agensi se dodaju u malim količinama)

� nema ograničenja pri izboru mobilne faze

� ne mora imati visok stepen optičke čistoće

Ograni čenja primene hiralnog agensa:

� nakon razdvajanja enantiomeri nalaze u obliku dijastereoizomernih

kompleksa, čija je disocijacija u nekim slučajevima onemogućena

14

27

� Hiralne te čne stacionarne faze

Primer: razdvajanja β aminoalkohola norefedrina na (+)-dibutil tartarat stacionarnoj fazi

Hromatografski uslovi: kolona, (+)-dibutil tartarat Phenyl Hypersil 150 mm ×4,6 mm, 5 µm veličina čestica; mobilna faza, fosfatni pufer (pH 6,0) koji sadrži heksafluorofosfat, zasićena dibutil tartaratom; UV detektor, 254 nm.

Ako se hiralnom tečnom fazom obloži površina stacionarne faze, pri čemu je mobilna faza zasićena stacionarnom fazom, dobija se tečno – tečni hromatografski sistem raspodele.

28

���� Hiralne čvrste stacionarne faze

1. vodonične veze

2. π-π interakcije

3. dipol interakcije

4. stvaranje inkluzionih kompleksa

5. sterno uslovljene interakcije

Da bi hiralna stacionarna faza mogla da interaguje sa svakim enantiomerom i prevede ga u odgovarajući dijastereoizomerni kompleks potrebno je da se ostvare najmanje 3 od sledećih interakcija:

15

29CSP Biphenyl derivative

30

16

31

Na osnovu mehanizma razdvajanja hiralne stacionarne faze dele se na:

1) „ Brush-type” hiralne stacionarne faze - mali molekuli,

najčešće sa grupama koje sadrže π – elektrone vezane za

površinu silike

2) spiralni polimeri - uglavnom celuloza i njeni derivati

3) šuplje faze - tipa ciklodekstrina, policikličnih etara i

makrocikličnih glikopeptidnih antibiotika

4) proteinske faze

5) ligand – izmenjiva čke faze

32

1. “Brush-type” hiralne stacionarne faze

Primer: prva sintetisana i najviše korišćena je sa dinitrobenzoilfenilglicinom– Pirkle faza

Osnovne karakteristike:

Ima dve amidne grupe

Mogu da ostvare dipol-dipolinterakcije, vodonične veze

dinitrobenzoilgrupa

akceptor π – elektrona

Stupa u interakciju sa donorima

π – elektrona

Jedinjenje mora imati u strukturi aromatičan

prsten!!!

17

33

Primer: Primena DNBPG silike za razdvajanje (D, L)-propranolola(u obliku oksazolidonskog derivata) iz krvi.

Hromatografski uslovi: uzorak, puna krv, 2,5 h nakon primenjene doze od 80 mg racemske smeše propranolola, koji je derivatizovan fozgenom do oksazolidonske strukture; kolona, 3,5-DNB-fenilglicin silika, 25 cm × 4,6 mm, 5 µm veličina čestica; mobilna faza, heksan – izopropanol –acetonitril (97:2:1 V/V/V), protok, 2 ml min-1; fluorescentni detektor, 290 – 335 nm; IS, interni standard (oksazolidonski derivat pronetalola).

34

Primeri brush type hiralnih stacionarnih faza

18

35

2. Spiralni polimeri

Vrste:

a) nederivatizovana mikrokristalna celuloza

b) derivatizovana mikrokristalna celuloza – triacetil, tribenzoat, trifenilkarbamat...

Nederivatizovana mikrokristalna celuloza

36(a) celuloza tris(3,5-dimetillfenilkarbamat) ; (b) amiloze tris(3,5-dimetilfenilkarbamat) i

(b) celuloza tris(4-metilbenzoat)

Derivatizovana mikrokristalna celuloza

19

37

Primeri spiralnih hiralnih stacionarnih faza

38

3. Šuplje faze

a) Ciklodekstrinske

α - cikodekstrin – sadrži 6 jedinica glukoze

β - cikodekstrin– sadrži 7 jedinica glukoze

γ - cikodekstrin– sadrži 8 jedinica glukoze

struktura zarubljene kupe

Koriste se u :

-hromatografiji reverznih faza

-hromatografiji normalnih faza

-hromatografiji sa veoma polarnim mobilnim fazama

20

39

b) policikli čni etri

-selektivno interaguju sa aminokiselinama i primarnim aminima

40

c) makrocikli čni antibiotici

vankomicin

-voluminozni molekuli koji pored nekoliko benzenovih prstenova sadrže i nekoliko prstenova peptidnog tipa

aglikon

glikon

21

41

Neke osobine stacionarnih faza sa makrolidnim antibi oticima:

1. stabilne u većini rastvarača

2. bilo koja promena u stacionarnoj fazi je reverzibilna

3. visoka selektivnost u svim tipovima hromatografije (može se

koristiti i u hromatografiji normalnih i u hromatografiji reverznih

faza)

4. pogodne je za optimizaciju i razvoj metode

42

4. Proteinske faze

Princip : mnogi proteini, pogotovo enzimi, ali transportni proteini, poput albumina, pokazuju visok stepen enantioselektivnosti u interakciji sa malim hiralnim molekulima. Ovo je iskorišćeno u enantioseparaciji tako što je vezivanjem proteina za površinu silike dobijena nova klasa stacionarnih faza namenjena za razdvajanje hiralnih lekova

22

43

�Komercijalno dostupne proteinske stacionarne faze su: albumini, α-kiseli

glikoprotein, ovomukoid, avidin, celobiohidrolaza I i pepsin.

�Proteini se nalazi vezan za sferne čestice veličine 5 µm. Enantiomeri

pretežno kiselih jedinjenja mogu se razvojiti direktno bez prethodne

derivatizacije.

Prednosti i ograni čenja:

Proteinske faze su skupe, teške za rukovanje, a zapremine uzorka koje se

mogu analizirati na njima su male. Međutim u mnogim slučajevima njihova

izvanredna enantioselektivnost nadomešćuje ove nedostatke.

44

5. Ligand izmenjiva čke faze

Princip: aminokiseline vezane za površinu stacionarne faze u prisustvu Cu2+ jona mogu stereoselektivno da interaguju sa aminokiselinama iz vodenih rastvora.

Grafički prikaz dijastereoizomernog kompleksa D- i L-fenilalanina na L-prolin silika stacionarnim fazama u prisustvu jona bakra

23

45

�Upotreba ligand – izmenjivačkih stacionarnih faza je odgovarajuća za

razdvajanje aminokiselina, β-aminoalkohola i sličnih struktura jer sadrže

dve polarne funkcionalne grupe na odgovarajućem rastojanju.

�Interesovanje za ovakav pristup je ograničeno zbog niske efikasnosti

ovih kolona, problema prilikom detekcije nederivatizovanih uzoraka i

prisustva jona bakra u mobilnim fazama.

46

Primeri ligand-izmenjiva čkih hiralnih stacionarnih faza

Prolin-bakar kompleks

24

47

Indirektno razdvajanje enantiomera

Princip : ako se enantiomeri derivatizuju sa hiralnim, optički čistim reagensom,

dobija se par dijastereoizomera. Dijastereoizomeri su molekuli sa dva ili više

hiralnih centara, koji imaju različite fizičke osobine.

Dijastereoizomeri mogu biti razdvojeni u nehiralnom hromatografskom sistemu,

ali derivatizacioni agens mora biti pažljivo odabran.

Dervatizacioni agens mora biti visokog stepena čistoće da ne bi došlo do

nastajanja dva para enantiomera

Pri procesu derivatzacije voditi računa da ne dođe do racemizacije

Derivatizacioni agens mora biti u višku

Funkcionalna grupa koja se derivatizuje treba da bude blizu hiralnog centra

48

Reakcija (R,S)-metoprolola sa (S)-terc-butil-3-(hloroformoksi)-butirat i određivanje odnosa enantiomera u humanoj plazmi.

Hromatografski uslovi: stacionarna faza, oktadecil silika; mobilna faza, fosfatni pufer – acetonitril (50:50 V/V); fluorescentni detektor, 272/312 nm.

Primer

Pogodno za analizu bioloških

uzoraka

25

49

Primeri ispitivanja enatiomerne čisto će

Levodopa

1.

Ph. Eur za određivanje enantiomerne čistoće propisuje metodu tečne hromatografije.

Određuje se D-dopa (nečistoća D).

Hromatografski uslovi:

Kolona: C18 150 mm × 4,6 mm, 10 nm veličina čestica

Mobilna faza: rastvor bakar(II)-acetata i N, N-dimetil-L-fenilalanina u vodi sa pH podešenim glacijalnom sirćetnom kiselinom na 4,0 i metanol.

Talasna dužina: 280 nm.

Protok: 1 mL min-1

Limit za ne čisto ću D je 0,5 %.

50

Metotreksat

2.

Ph. Eur za određivanje enantiomerne čistoće propisuje metodu tečne hromatografije.

Određuje se (R)-metotreksat (nečistoća F).

Hromatografski uslovi:

Kolona: 150 mm × 4,6 mm pakovana sa goveđim albuminom vezanim za silika gel za hromatografiju veličine čestica 7 µm sa porama veličine 30 nm

Mobilna faza: rastvor anhidrovanog dinatrijum-hidrogenfosfata i natrijum-dihidrogenfosfata, pH podešen na 6,9 pomešan sa propanolom.

Talasna dužina: 302 nm.

Protok: 1,5 mL min-1

Limit za ne čisto ću F je 3,0 %.

26

51

Naproksen

3.

Ph. Eur za određivanje enantiomerne čistoće propisuje metodu tečne hromatografije.

Određuje se (R)-naproksen (nečistoća G).

Hromatografski uslovi:

Kolona: 250 mm × 4,6 mm pakovana sa stacionarnom fazom tipa π-akceptor/π-donor za hiralno razdvajanje, 5 µm veličine čestica

Mobilna faza: glacijalna sirćetna kiselina, acetonitril, 2-propanol i heksan.

Talasna dužina: 263 nm.

Protok: 2,0 mL min-1

Limit za ne čisto ću G je 2,5 %.

52

Zaklju čak

1. Razdvajanje enantiomera je od velikog značaja u farmaceutskoj inustriji

2. Zbog malih razlika u osobinama između enantiomera (samo u smeru okretanja ravni linearno polarizovane svetlosti) mora se posvetiti posebna pažnja razvoju metode

3. Najveći značaj u analitici enantiomera ima hiralna hromatografija

4. Hiralna hromatografija je složena i zahteva veliko iskustvo ekpserimentatora