UNIVERSIDAD A U T ~ N O M AMETROPOLITANA IZTAPALAPA

POSGRADO EN BIOTECNOLOGA

EFECTO BACTERIOSTTICO ACEITES DE ESENCIALES DE AJO (Allium sativum) Y CEBOLLA (Allium cepa) SOBRE DOS MICROORGANISMOS PRESENTES EN CARNES.CrnRDlbJACIQN DE $Fr:by:.v Da;ilMEKTALES . BJ#;.J/:I Ii.L.,

TESIS QUE PRESENTA: El Ing. JAVIER MORALES LPEZ PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN BIOTECNOLOG~A DIRECTORAS:Dra. MARA ISABEL GUERRERO LEGARRETA

Dra. EDITH PONCE ALQUICIRA

MCxico D.F.

Julio de 1999

Dedico tesis esta a realizacindelpresentetrabajo

mi Madre Vivian Esquivo Rechy, quien posible hizo la

y tambinhizoposibleelsueodehacerrealidadlaun anticancergeno.Tambinami Madre Alba Zabeth

investigacin y eldesarrollode Lpez Forero por

suimpulso y amor,dondequieraqueests;Madre.

A lacompaa

INFOODS. A mi Famila, a ti Pap porque era tu sueo ser cientfico investigador enseaste que es &ente de luz

y me

un libro abierto. A m i s sobrinas Natalia Mara y Eileen

Jimena as como a sus Padres Eileen Rafico. A m i s hermanos. Pero muy especialmente al y ciclpeo pueblo de Mxico y su cultura milenaria; con mi eterna gratitud. Al pueblo de Colombia, porque en cada uno de

sus hijos y su trabajo hay una contribucin para que

mi cambien las cosasy construir un mejor pas; ste es aporte.

Deseo agradecer a la Doctora MaraIsabelGuerrero ascomodirigir

Legarreta, Directora del al Comit de

Grupo de Investigacin de Bioqumica de Macromolculas,en primer trmino, el escuchary disearmetodolgicamente la propuestapresentada

Admisin del posgrado en Biotecnologa de UAM-1; en segundo trmino su enseanza y la disciplinaparaaprendery conocer el mtodo cientfico. Tambin le

agradezco a la

Doctora Mercedes Guadalupe Lpez Prez su enseanza, su tiempo en el laboratorio de Qumica de Productos Naturales del Centro de Investigacin de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional - Irapuato, Gto. (CINVESTAV-IPN) y los amplios aportes que heron hndamentales en el conocimiento de los constituyentes de los aceites as como la interpretacin y revisin de los resultados, a la Maestra Elsa Bsquez Molina por sus consejos y en especial por su interpretacin de la vida, a la Doctora Edith Ponce Alquicira por sus comentarios e ideas y al Maestro Rubn Moreno,Coordinador delPanel EvaluacinSensorial de laUniversidadIberoamericana,porsuapoyo evaluacin del chorizo tipo espaol. Un agradecimientomuy especial a Otto Klemperer por ensearmea conocer un ser humano de pensamiento atemporal, a Beethoven, en la magistral direccin de sus sinfonas dey tiempoenla

y en particular el segundo movimiento de la Herica. Tambin mi admiracin a SergeiRachmaninoff por sus cuatro conciertos sinfnicos. Al Caribe colombiano aquella tierra Chimila, Africana y Europea. A la tierra Vallenata!. Y en general, a los que con su trabajo han aportado al desarrollodelpensamientohumano,conideas combustible obtenidoy mtodos queson

el

resultado de la energa que requiere el cerebro para desarrollarlas y no son otra cosa que a partirlos de alimentos consumimos necesidad que como hndamental de la existencia.

Fue de casa en casa arrastrando dos lingotes metlicos, todo el mundo se espant y al verqueloscalderos, laspailas,lastenazasy los andes secaandesusitio,los clavos y los tornillos tratando de

y las

maderas crujan la por desesperacin de

desenclavarse, y aun los objetos perdidos desde haca mucho tiempo aparecan por donde ms se les haba buscado, y se arrastraban en desbandada turbulenta detrs de los fierros mgicos de Melquiades. -Pregonaba el gitano con spero acento- Las cosas tienen vida propia, todo escuestindedespertarleselnima.

Y tambindecaMelquiades,La

ciencia ha eliminado las distancias, dentro de poco, el hombre podr ver lo que ocurre en cualquier lugar de la tierra, sin moverse de su casa.....

Entonces dio otro salto para anticiparse a las predicciones averiguar la fechay las y circunstancias de su muerte. embargo, de al final haba Sin antes llegarverso ya comprendido que no saldra jams de ese cuarto, pues estaba previsto que la ciudad de los espejos (o los espejismos) sera arrastrada por el viento y desterrada de la memoria de los hombres en el instante que Aureliano Babilonia acabara de descifrar los pergaminos, y que todo lo escrito en ellos era irrepetible desde siemprey para siempre, porque las estirpes

condenadas acien aos de soledad no tenan una segunda oportunidad sobre la tierra.

Gabriel Garcia Mrquez, CienAos de Soledad

RESUMENSe determin el efecto antimicrobiano del aceite esencial de ajo (Allium sativum) y cebolla (Allium cepa) sobre dos cepas puras, una est vinculada con la descomposicin de alimentos Pseudomonasy Lactobacillus pentosus es utilizado en procesos de

bioconservacin de algunos alimentos fermentados. El propsito central

fue conocer las1: 1,

(Allium sativum) y de cebolla concentraciones de inhibicin de los aceites esenciales de ajo (Allium cepa) por separado as como el efecto sinrgico cuando se combinaron 2: 1, 1:2;entotalcincotratamientosconcinco nivelesdeconcentracinpropuestas,(0.03,

0.36, 3.69, 49.6 y 196 p de aceite(s) esencial(es)/ml de medio de cultivo), en la cual se 1 reduce el crecimiento celular. En ajo, el nivel de concentracin de 196 pVml inhibi hasta 17.76 % a P.Ragi y 33.19 % L. pentosus. La cebolla present menor mezclasnoinhibicin comparada con ajo y en las

se apreciefectosinrgicoquesuperaraacadaaceiteporseparado.La

inhibicin microorganismos en ambos disminuy en que la medida aument la concentracin del aceite esencial de cebolla.En las concentraciones de 0.039 y 0.39 pVml se favoreci mayor crecimiento de los microorganismos comparado con un blanco al que no se incluy ningun aceite. En los niveles de y 3.9 pl/ml no hubo diferencia entre siy 49.6 ambospresentaronvaloresdealrededorde12 respectivamente.Los aceites esenciales probados se obtuvieron mediante el mtodo de arrastre de

y 15 % en L. pentosus y P. fragi,

vapor en condiciones de vaco estndar y se report para cebolla un rendimiento de 42 % porarribadelasreferenciasbibliogficasy de misma la forma 35% paraajo.La

caracterizacin por cromatografia de gases acoplada a espectrometramasas indic que de los10compuestosalifticosidentificadosenajoscontienenazufre,mientrasqueen cebollasdelos20identificados,dosdelosms abundantessonaldehdoscarentesde

azufre, de los 18 restantes9soncclicosdeloscualesdoscontienennitrgeno,los9 restantes son alifticos. Tambin sobre los aceites se determin el contenido de grupos sulfhidrilo y se encontr que el de ajo contiene 25 % ms que el de cebolla y entre las

combinaciones de los aceites, la cantidad de grupos sulfhidrilo diminuy en forma que baj la concentracin de aceite esencial de ajo. Con el fin de conocer si las concentraciones inhibitorias de aceites esenciales eran aceptadas o rechazadas al ser incorporadas en chorizo tipo espaol como sazonadores, se probaronconcentracionesde49.6y 196 pVml, y conellos

se mejoranlosatributos

sensoriales del producto crnico, la mejor combinacin,

y segn el panel de evaluacin,

p fue la de ajoy cebolla en proporcin 1:2 en nivel de 196 LVml.

De lamismaforma,losobjetivosparticularesincluyeronademsdemontar adaptar metodologasmanera de secuencia], otros, entre establecer el mtodo de

y

extraccin, prueba analtica de cromatografia de gases acoplada a espectroscopa de masas (GC-MS) y qumica con el reactivo de Ellman; prueba especfica para caracterizar grupos se sulfhidrilo. Los bioensayosrealizaron en caldoscultivo de selectivos, los con tratamientos y niveles sealados, para medir la absorbancia a 560 nm respecto del tiempo, el cual es un mtodo indirecto de medir el crecimiento celular. Para evaluar las curvas de crecimiento y medir su modificacin de acuerdo con la concentracin

y combinacin de

los aceites se realizaron regresiones lineales y se calcul mediante integrales definidas, las reas bajo la curva en intervalos que llegan hasta el inicio de la fase estacionaria de cada microorganismo. cebolla La importancia de la tcnica de extraccin de los aceites esenciales de yajo mediante arrastre de vapor en condiciones de vaco estndar radica, adems del bajo costo al compararlo con otros mtodos como el de (COZ) en lquido estado (fluidos se

supercrticos) y laextraccinporsolventes,enqueconlametodologaempleada puedenobteneresenciaspuras, de pesticidas y restos solventes metodologa que lo aseguraba ya no arrastran que se oleorresinas otras ni grasas, en la muestra. Por estas razones, utiliz se esta la obtencin compuestos los se de con que podan

experimentar, analizar y comparar con especificaciones y trabajos publicados. El trabajo desarrollado, adems de aportar la metodologa de extraccin de aceites esenciales de ajoy cebolla, pilar sta tesis, deja la opcin de otras investigaciones de inters.

!Como nos

acordamos del pescado que comamos de de los pepinos y las sandas y los

balde Egipto, en

puerros y las cebollas y el ajo!

Nmeros 11:5

La Biblia.

NDICE GENERAL

NDICE GENERAL NDICE DE FOTOS Y AUTORES NDICE DE TABLAS NDICE DE FIGURAS 1.I.

RESUMENINTRODUCCI~N

1 6 78

11.

ANTECEDENTES Principales microorganismosde descomposicin Grupos bacterianos importantes en alimentos Principales microorganismos de descomposicin carnes rojas de Pseudomonasfiagi Lactobacillus plantarum Metabolismo celular Allium Mecanismos de accin de aceites esenciales del gnero sobre microorganismos Antecedentes histricos medicina folklrica y Antecedentes medicinales sistemticos ajos y cebollas de Generalidades qumicasde los aceites esencialesEl gnero Allium

11.1 11.1.1. 11.1.1.1.11.l . 1.2.

11 12 13 15 17

11.1.1.3. 11.2. 11.2.l .

11.3. 11.3.1. 11.4. 11.5. 11.6. 11.6.1.

20 22 25 26 26 30

Generacin y extraccin de los compuestos voltiles Allium en Principios del proceso de extraccidi por arrastre de vapor en condiciones de vaco estndar Anlisis de compuestos presentes en aceites esenciales ajo y de cebolla de Fundamento y determinacin por cromatografia gases acoplada a espectrometra de masas (GC-MS) Fundamento y determinacin qumica degrupos sulfhidrilo con el reactivo deEllman

11.7. 11.7.l . 11.7.2.

31

31 34

11.8.

Fundamento y determinacin del crecimiento bacteriano mediante 34 turbidimetra 3536

11.8.1.11.9.

El Crecimiento bacteriano Evaluacin sensorial Prueba de estmulo nico Prueba pareada Prueba do-tro Prueba triangular OBJETIVOS General Particulares

11.9.l . 11.9.2. 11.9.3. 11.9.4.11 1.

37 37 38 38 39 39 39 40 40 41 41 42 43 44 44 45 45 46 47

NB)IV. IV. 1* IV.1.1. IV.1.1.1. IV. l. 1.2. IV.1.1.3. IV.2. IV.2. l. IV.2.2. IV.2.3. IV.3. IV.3.1 IV.3.1.1. IV.3.1.1.1. IV.3.1.1.2. IV.4. IV.4. l. IV.4.2.

MATERIALES Y MTODOSDiagrama generalde la metodologa experimental la tesis de Extraccin de aceites esenciales Materiales y equipo Extraccin de voltiles Pruebas fisicas Anlisis de compuestos voltiles los aceites esenciales en Diagrama de flujo general de la caracterizacin cromatografia por de gases acoplada a espectrometra de masas Equipo y condiciones de operacin Anlisis de radicales sulfhidrilo Crecimiento de microorganismos en medios sintticos Diagrama de flujo general de los bioensayos Metodologa experimental Crecimiento de PseudomonasfiagiLactobacillus pentosus (3 103 5)

4748 48 49 49 50

Anlisis sensorial Formulacin del producto Muestras parael anlisis sensorial

IV.4.2. l . IV.4.3. IV.4.3. l. IV.4.3.2. IV.4.3.3. V.

Ingredientes utilizados Procedimiento en la elaboracin de la pasta Preparacin y presentacin de las muestras Panel de jueces Diseo experimental y anlisis estadstico

50 51 52 53 53 54 5455

RESULTADOS Y DISCUSI~NExtraccin de aceites Anlisis de compuestos voltiles en aceites esencialesde ajo y los cebolla

v.1.v.2.

v.2.1. v.2.2. V.2.3. v.3. V.3.1. V.3.2. v.3.3. v.3.4.

Ajo Cebolla Concentracin de grupos sulfhidrilo SH Crecimiento de microorganismos en medios sintticos

5669

939596

Lactobacillus pentosus PseudomonasfragiAlteracin del puentedisulhro -S-S- (-SH) Modificacin del potencial redox en la cadena del flujo de electrones

103

110111

v.3.5. V.3.6. v.3.7. v.4. VI

Alteracin de la permeabilidad celular, accin sobre la acetil CO-A Alteracin del potencial de oxidacin de la glutation reductasa

112 115115

Alteracin de la transferencia de electrones durante la sntesis del material gentico para la divisin celular Anlisis sensorial Conclusiones BIBLIOGRAFA

116

123 126

VI1

NDICE DE FOTOS Y AUTORES

Foto 1.

Bifacialhalladoen

el Shara.Coleccin I F A N , Dakar,Senegal.@os Millones de

1

Foto, MaximilienBruggmann,Yverdon,Suiza.

Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny,

Ian Horman)

Foto 2.

Vendedor de pescado. Pintura mural, siglo Thera, Grecia. Museo Arqueolgico

XI11 a. de C., isla de

1

de Atenas. Foto, Erich

Lessing / Magnun @os Millones deAos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny, Ian Horman)2

Foto 3.

Campesinos egipcios cribando

el grano palas con

de madera.

Detalle de pintura mural. Tumba de Mennah, Tebas, Egipto. Foto, Erich Lessing / Magnun @os Millones de Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny, Ian Horman)

Foto 4.

Cal, tequezquite

y sal. Minerales utilizados como

mtodos de

2

conservar y procesar alimentos. La nixtamalizacin del maz con la cal (1 a 3 % y hervir durante 20 a 40 minutos con reposo de 10 a12 horas) es uno de los aportes de la cultura prehispnicade Meso

Amrica al consumo de alimentos en el mundo. Foto, Michel Zab (Presencia de laComidaPrehispnica.CastellYturbide,Zab Pia Lujn)y

Foto 5. Foto 6.

Pez alado, Cultura Agustn, San aos

100 a. C.

-

800 d. C.,

Colombia. Museo del Oro, Santaf Bogot, Colombia. de Una de las primeras latas de harina lacteada Henri Nestl, fin del siglo XIX. Foto, archivos Nestl Horman)

(Dos Millones de Aos deIan3

Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny,

Foto 7.

Tienda de ultramarinos, Florencia, Italia.Foto, F. Sciana / Magnum

(Dos Millones de Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat,Renaud Alberny, Ian Horman)

Foto 8.

Tienda de especias, Estambul, Foto, Turqua.Maximilien Bruggmann, Yverdon, Suiza @os Millones de Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny, Ian Horman)

4

Foto 9.

Ampliacin el con microscopio electrnico moho de filamentoso formando una capa blanca en ciertos quesos. Foto, Archivos Nestl (Dos Millones de Aos de Industria Alimentaria. Toussaint-Samat, Renaud Alberny, Ian Horman)

6

Foto 10.

Fotografia de barrido electrnico de Pseudomonasfiagi.

12 13

Foto 11. MicrografiadeescaneoelectrnicodeWSO. Escala bar=

Lactobacillus plantarum.

1 pm.21

Foto 12.

Ilustracin del siglo XIV da muestras de la profbsin de su uso con finesmedicinales,cuandonocomobulbocomestible,enaquella poca.

Foto 13.

Ajos despus de la operacin de limpieza.

41 42

el Foto 14. Equipo de destilacin de aceites esenciales ms densos que agua, con modificacin para termopozo recuperacin de voltiles.y mayor de volumen

Foto 15. Foto 16. Foto 17. Foto 18.

Acumulacin del aceite esencial de ajo durante el proceso. Aceitesesencialesdeajo vidrio. Chorizo tipo espaol Las muestras con tratamientos se presentaron individualmente cada sesin, los6 jueces degustaron 15 porciones de producto en

42 44

y cebollacontenidosenrecipientesde

50

51

grupos de 3, dos de las muestras son iguales y una es el blanco. En

Foto 19. Prueba triangular para detectar diferencias Foto 20. Foto 21.Una muestra Chorizo tipo espaol Microscopa de barrido electrnico de de extracto acuoso

52

52

C. albicuns KCCC 1417237 "C. (a) en ausencia

113

crecida en medio de cultivo con agitacin a

de(EAA); clulas ajo son elongadas

o

esfricas, (b) en presencia de ( Mse tienen clulas deformadas y E ) distorcionadas y en algunos casoscolapsadas;como de a) es de 4 p m. (Mahmoud y Ghannoum, 1988)

lo indicala

flecha; CD seala los restos citoplsmicos y la barra (parte inferior

NDICE DE TABLAS

Tabla 1.

Principales factores que afectan la ecologa microbiana de los alimentos.

8

alimentos. Grupos importantes en Tabla 2. bacterianos importantes Gnero 3. de Tablabacterias alimentos. en

9

10

Tabla 4.

Composicin promedio muscular 11 qumica del tejido de algunas especies.

Tabla 5. Tabla 6.

especies Divisin lasde de

Lactobacillus en grupos. (Allium

14

Algunasenzimasinhibidasporlaalicinaencontradaenelajosativum)

18

Tabla 7.

Espectrodeaccindelajo

(Allium sativum) y cebolla (Allium cepa)

19

reportados en microorganismos.

Tabla 8. Tabla 9.

Generacin de algunos compuestos voltiles azufiados ajo en Carta comercial de especificaciones fisicoqumicas de los aceites esenciales de ajo(Allium sativum) y cebolla (Alium cepa). Reineccius, (1994); Extract Mex, (1998).

27

43

Tabla 10. Tabla 11.

Concentracin de aceites esenciales aadidos a medios de cultivo Tratamientos y niveles de aceites esenciales de ajo cebolla en la y formulacin de chorizo espaol

4650

Tabla 12.

Compuestos identificados enel aceite esencial de ajo(Alliumsativum)

57

Tabla 13.

Patrones de fragmentacin de10 compuestos identificados enel

58

aceite esencialde ajo obtenido por el mtodo de arrastre vapor. de Metildi1sulfbro.1.69%,h 1.45 min, 88 g/mol

58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 71

Dimetil disulfbro. l. 11%, tr 2.37 min, 94g/mol 3-3"tiobis,1-propeno.4.8%,tr 3.40 min,114@mol

2 Propenil metil disulfbro. 11.35%, tr 6.22 min, 120 g/mol Dimetil trisulhro. 4.6%, tr 8.55 min,126g/mol 2-Propenilpropil disulhro. 0.24%, tr 9.7 min, 148g/mol 3-(alil tio),cidopropinico.0.86%,t, 10.64 min,146g/mol

Dialil disulhro. 35.59 %, tr 11.35 min,146g/mol Metil,2-propenil trisulhro. 16.36%, tr 13.78min,152g/mol di-2-propenil trisulhro. 18.39%, tr 18.45 min, 178g/molTabla 14.

Compuestos identificados en el aceite esencial de cebolla (Allium cepa)

Tabla 15.

Caracterizacin mediante espectrometra de masas de 20 compuestos voltiles encontrados en cebolla (Alliumcepa) Metanetiol.2.5%,t,0.86 Propanal.27%, min, 48g/mol

72

72 73 74 75 76 77 78

tr 0.95 min, 58 g/mol

Dimetil disulhro. 2.8%, tr 2.40 min, 94g/mol 2-pentenal, 2-metil(2-etil-t-butanal). 13.82%, tr 3.63 min, 98 g/mol Metilpropildisulfbro.1.52%,t,5.2 min, 122g/mol

Metiletil disulhro. 1.6%, tr 5.46 min, 1O8 @mol 2,Sdimetil-tiofeno. 5.7%, t, 5.805 min, 112g/mol

173-ditiano. 1.1%, tr 6.10 min, g/mol 120 1,3-propan ditiol. 1.1%, tr 6.34 min, 108g/mol 1,4-ditiano. l.8%,tr 6.91 min, 120 g/mol Tiazolidina. 8.4%, tr 8.13 min, 122g/mol Dimetiltrisulfbro.3.5%, tr 10.17 min,126g/mol

79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92

2-propenilpropil disulhro. 0.90%, tr 11.53 min, 148g/mol 1,3-Ditiolano.1.12%,& 12.69 min, 106 @mol

3,3-tienil- 2- cido propenico. 2.6%, t, Metiltirano.1.2%, t, 18.13 min, g/mol 74

16.30 min, 154 g/mol

Dipropiltrisulfbro.0.64%,

t, 24.07 min, 182g/mol

172,4-tritiolano,3,Sdietil. 1.65%, tr 29.10 min, 180g/mol trans-3,5-Dietil-1,2,4-tritiolano.2.09%, tr 30.40 min, 180 g/mol 2,5-dimetil-tiazolio.0.43%,t, 36.13 min, 113 g/mol

Tabla 16. Compuestos azufrados encontradosen los aceites esenciales de ajo ycebolla.

Tabla 17. Tabla 18. Tabla 19.

Ecuaciones que describen la concentracin de los grupos tiol (pmoledml) en los5 tratamientos probados microbiolgicamente Concentracin de grupos tiol (SH) pmoledml en Comparacin de las reas y porcentajes de inhibicin a 30 horas en

93

94 96

Lactobacillus pentosus. Calculados a partir de las ecuacionesy obtenidas con las regresiones con el aceite esencial de ajo a 196pVml como referencia de la mxima inhibicin.

Tabla 20.

Ecuaciones de cada curva de crecimiento de Lactobacilluspentosus en la que se encuentran los clculos del punto terico mximo, el

102

rea bajo la curvao integral a 30 horas y el porcentaje de inhibicin tomando como referencia el nmero menor (ajo a 196 pVml).

Tabla 21. Comparacinreas de

y porcentajes inhibicin de a

24 horas en

103

Pseudomonasfiagi. Calculados a partir de las ecuaciones obtenidas

con las regresiones y con el aceite esencial de ajo a 196 pVml como referencia de la mxima inhibicin.

Tabla 22.

Ecuaciones de curva crecimiento cada de de

Pseudomonasfiagi en

1 o9

la que se encuentran los clculos del punto terico mximo, el rea bajo la curvao integral a 24 horas y el porcentaje de inhibicin tomando como referencia el nmero menor (ajo a 196 pVml).

Tabla 23. Resultados la deevaluacin sensorialtratamiento

y la comparacin acuerdo de 117

con las pruebas de significancia por el mtodo triangular para cada

Tabla 24.

Planilladecontrol

119

NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Figura 2.

Estructura del msculo estriado. Micrografia electrnica tres miofibrillas en seccin longitudinal

de partes de

Estructura qumica de la Acetil coenzima A. El enlace tioester de alta indica energa se con un segmento curvo; el grupo acetil es reemplazado por hidrgeno.

Figura 3.

Rutas catablicas. El ATP y NADPH son las hentes de energa libre de reaccionesbiosintticas.Ellassongeneradasentreladegradacin de

y hnciones biolgicas. metabolitos complejos utilizadas en las diversas Figura 4.Accin de un inhibidor enzimtico. Puede ser reversible o irreversible y depende del tipo de uniones establezca la que con enzima. irreversible cuando se genera electrostticas es reversible.un enlace covalente, con

Esherzas

Figura 5.

Dialil disulhro o alicina.Sustanciaazufi-ada,inhibidorenzimticodel metabolismocelular.Compuestomsabundante de ajo. enel aceiteesencial

Figura 6.

Ajoeno, estructura qumica, 2-vinil-4H1,3-ditina. No CAS 31 2-Propenil 3-(2-propenilsulfinil)-l-propenildisulhro

[92285-014,5,9-tritio-

1,6,11 dodecatrieno 9-xido [92284-99-6, 92285-00-21 Sintetizado por Block y col. en1986 a partir de alicina calentando en acetona-agua. Djerassi C. y col., 1994. Dialil trisulfuro. Estructura qumica H2CCHCH2SSSCH2CHCH2 Estructura qumica esenciales de aceites clasificacin de Reineccius 1994. en de cada grupo en la

Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figurall.

Formacin de la alicina a partir de alina por la accin Reaccin estequiomtrica.

de la alinasa.

Compuestos azufiados extrados de ajo (Allium sativum) por diversos mtodos. Compuestos azufiados extradosde la cebolla, el factor lacrimgeno es

un ismero estructural de la alina.Figura 12.

Representacinesquemticadelosdestiladoresdeaceitesesenciales por arrastre de vapor en condiciones de vaco estndar. Consta de tres partes, dedo refrigerante enla parte superior, cuerpo del destilador matraz para contener muestra. lay

30

Figura 13. Figura 14. Figura 15.

Principio general deun espectrmetro de masas. Esquematizacin fbndamento del espectrmetro de masas. Representacin de un espectrmetro de masas en donde en la primera etapadeactivacin;lasmolculas,iones o tomossonactivados al

31 32

y principios operacin un de de

32

aumentar sunivelenergtico(energiapotencial,partesuperior

de la

rampa). Posteriormente se aceleran al descender y la energa potencial adquirida anteriormente se transforma energa cinticay es igual para en todas.Figura 16.

Espectro de masas, patrn del dialil disulfbro

comparado con el patrn

33

de la biblioteca NBS, parte inferior. Se puede apreciar que el fragmento ms abundante tiene 41 unidades de masa atmica.Figura 17. Figura 18. Figura 19.

Patrn de fragmentacin del dialil disulfbro. Reactivode Ellman 5,5-di-tio (cido bis 2-nitro benzico) DTNBc1a8N208S2 Reaccin del reactivo de Ellman en la formacin del pigmento

33 34

3435

Curvatpica de clulas bacterianas de Figura 20. crecimiento en cultivo por lote.Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura24.

Diagrama de flujo general de la extraccin de los aceites

41

Diagrama de flujo general de la caracterizacin mediante espectrometra 44 de masas Diagrama de flujo general de los bioensayos Las Curvas de destilacin por arrastre de vapor en la queaprecia la se disminucin de la temperatura respecto del tiempo, una vez que logrado las condiciones de vaco estndar se han47 54

" .

.

.

Figura 25. Figura 26. Figura 27. Figura 28.

Cromatograma de aceite esencialdeajo (Allium sativum) obtenido por arrastre de vaporen condiciones de vaco estndar Cromatogramadeaceite esencial de cebolla (Allium cepa) obtenido

56

70

por arrastre de vapor condiciones de vaco estndar en Prueba delreactivodeEllmanenloscincotratamientos Curvas de crecimiento de Lactobacillus pentosusy loscinco

93 97 97 98

niveles, mismos que se probaronen las cinticas microbianas

Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de ajo Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de ajo cebolla yen proporcin 2: 1

Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de ajo cebolla yen proporcin1: 1

99

Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de ajo cebolla yen proporcin 1:2

1O0

Lactobacilluspentosus en presencia de aceite esencial de cebolla Figura 29.Curvasdecrecimientode Pseudomonasfiagi

101 104

Pseudomonasfiagi en presencia de aceite esencial de ajo Pseudomonasfiag en presencia de aceite esencial de ajo cebolla en yproporcin 2: 1

104

105

Pseudomonasfiagi en presencia de aceite esencial de ajo cebolla en yproporcin 1: 1

106

Pseudomonasfiagi en presencia de aceite esencial de ajo cebolla en yproporcin 1:2

107 108 110

Pseudomonasfiag en presencia de aceite esencial de cebolla Figura 30.Un posible mecanismo de intercambio de grupos tiolo intercambio de disulfho es el catalizado por la glutation reductasa. La cinta prpura representa el esqueletopolipeptdicodeunaprotena.Elataquedel grupo ti01 o mercapto puede ser ionizado en forma de tiolato.

Figura 31.

Diagrama de

la cadena del

transporte electrones de mitocondriales,

111

indicando la ruta de la transferencia

(negro) y labomba de protones

(rojo).Los electrones son transferidos entre los Complejosy I11 por la I

coenzima Q, solubleenlamembrana;

y el Complejo I11 y IV por el

citocromo C entre la membrana y la protena perifrica.

Figura 32.

CitocromoC.Participa

en transportedeelectronesdelprocesode112 el

obtencin de energa desde el alimento hasta el oxgeno. El interior de cadaprotenaesungrupoprosteticollamadogrupohemo,decolor naranja en la ilustracin. Alterna entre los estados oxidados y reducidos de hierro y azufre, en contra de la prdida de electrones que pasan a lo largo de la cadena del transporte de electrones tiamina

Figura 33. de Figura 34. Figura 35.

Pirofosfto

GSH; y-glutamil-cisteinil-glicina, 115 glutationAlgunasreaccionesqueinvolucranalaglutation:(1)detoxificacincon115 la glutation peroxidasa (2) regeneracin de GSH a partir de GSSG por la glutation reductasa, (3) modulacin de la tiol transferasa; encargada del balance disulhro de las protenas y (4) biosntesis de leucotrienos mediante la glutation -S-transferasa

Figura 36.

Ruta detransferencia electrones la la de parareduccin del (Nuclesido de en el di fosfato)participa que en formacin la de

NDP

1 16

desoxiribonucletidos. El NADPH proporciona equivalentes reductores procesoentrelosintermediariosdelatioredoxinareductasa,

tiorredoxina, y reductasa ribonucletido

Figura 37.

Hojamaestradeevaluacin,paracadajuez,enlaqueseanotaronlos comentarios realizados en los grupos de muestras evaluadas

118

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZ4ClON QUMICA Y ANALISIS SENSORIAL.

1

Nuestro universo sera cosa muy limitada si una

no ofreciera a cada poca algo investigar que

....

La naturaleza no revela sus misterios de una vez para siempre.SNECA, CUESTZONES N A T U M E S ,

libro 7, siglo primeroI.

INTRODUCCI~N

Una necesidad fundamental

de la humanidad es alimentaria

alimentarse, podra decirse que la industria apareci en el momento que'

se invent primera 'la

herramienta, hace ya unos dos millones de aos, la historia de nuestra

alimentacin es tan vieja como la historiaFoto 1. BifacialhalladoenelShara. Coleccin IFAN, Dakar, Senegal. (Toussaint y col., 1991).

de humanidad. la Desde millones hace

de aos compartimos con nuestros alimentos una evolucin comn. La adaptacin ha sido recproca, tratando de mantener el equilibrio biolgico, que desde siempre, es uno de los secretos kndamentales de la vida. La produccin de alimentos viene participando a travs del tiempo en la lucha por la sobrevivenciade la especie, an vigente hoy. Surgi,la industria alimentaria, de nuestra necesidad de disponer de recursos, de la historia de la domesticacin de nuestros comestibles y del control de nuestra alimentacin.Foto 2. Vendedor pescado. de Pintura mural, siglo XI11 a. de C., isla Grecia. de Thera, Museo Arqueolgico de Atenas. (Toussaint y col., 1991).

2

ACEITESESENCIALESDE AJO Y CEBOLLA,EFECTOBACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI~N Q-CA

Y ANALISIS S E N W ~ .

Desde el momento que dieta nuestra se diversific y mejor, el ser humano se las ingeni para preservar los vveres del deterioro o la descomposicin microorganismos por mediante coccin, la la fro, acidificacin, la sal, las grasas, la miel, los azcaresy el alcohol.

tcnicas

de

conservacin, como son: la desecacin, el ahumado, el

El fuego, el fro y la sal permitido nos haban primeras hacer lasFoto 3. Campesinos egipcios cribando el grano conpalasdemadera. Detalle depinturamural. Tumba de Mennah, Tebas, Egipto. (Toussaint y col., 1991).

provisiones. El aceite, la miel, el vino y luego loscal, tequezquite y sal. ~. Mineralesutilizadoscomomtodosde y procesar alimentos, La

adcoholes enriquecieron

nuestros mtodos

y prolongaron el tiempoconservacin. deo

Foto 4.

Procedimientos que ancestrales slo seran sustituidos modificadosen elsiglo XTX por laqumica,labiologa,la diettica y la tecnologa que, en imaginacin eny resultados.

nixtamalizacin del maz con la cal (1 a % y hervir durante 2o a 4o minutos

la actualidad, compitenHoy, entre los mtodosde

con de lo a l 2 horas) es uno de los aportes de la cultura prehispnica de Meso Amrica alde alimentos consumo enelmundo. (Castell y col., 1991)

conservacintambinsedisponedeaditivos,quesegn de cinco fracciones de funciones primarias;estas: son mejoramiento en el valor nutricional, conservacin, mejoramientoen la textura,adicin de color y adicindej

su

usoen un comestible, generalmente se clasifica como parte

..

I:.

aroma y sabor. De las cinco, las ms fcilmente justificablessoh el mejoramiento nutricional en valor el' .

Foto 5. Pezalado, CultuA :San.Agustn, aos loo a. C. - 800 d. C., Colombia. (Museo del Oro, Santa F de Bogot, Colombia., 1994).

y la

conservacin; evitar proliferacin microorganismos al la de indeseables consumo impiden posterior. su que

ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA. EPECFO BACTwrOSTTICO, CARACTERIZACldN Q m C A Y ANLISIS SENSORIAL

3

Materias primas son producidas en una regrny transportadas otra hasta paras proceso o u

industrializacin, posteriormente

se distribuyen en

diferentes lugares pueden meses donde pasar

o

incluso aos desde su produccin hasta el consumo. Para realizar manejo el

y soportar tiempo el de

conservacin se requiere de un sistema de mercadeo ascomo

un medioefectivodeconservacin.

Las

nuevas formas de preparacin de los alimentos

han

Foto 6. Una las de primeras latas de harina ladeada Henri Nestl, fin del siglo XIX.(Toussaint y col., 1991).

incrementado la necesidad de almacenarlos y por consipente conservarlos; ejemplos de nuestro tiempo son: la industria productos lcteos, crnicos,botanas, conservas, alimentos de alimentos sustitutos casos, para bajas calorias, de los

y otros. algunos En

lograr su conservacin, se

utilizancompuestosqumicos

o mtodosFoto 7. Tienda ultramarinos, de Florencia, Italia. (Toussaint y co1.,1991).

fisicos, pero fue en los umbrales del siglo

XX cuandoseusaronextensivamenteforma de aditivos, preferentemente origen natural.

ende

4

ACEITESESENCIALESDE AH)Y CEBOLL4. EFECTO BACTERIOST,hTCO,CARACl-ERQACIbNQUiMICA Y ANALISIS SENsoT(IAL.

Las fuentes naturales, como con usan gradualmente industrialmente con

las especias y

otros vegetales para el control antimicrobiano, se

m&las

frecuencia desplazando sustancias sintetizadas Un el mismo propbsito.

mtodo conservacidn de empirico

en el que

se

inhibi el crecimiento de microorganismos, siglos atrs, se relaciona con el principio aromhtico y de sabordealgunosvegetales,debido

a los aceites

u esenciales que son s principio activo y pueden ser

inhibidores y saborizmtes segn la concentracidn (Conner, 1993; Jeanflis y col., 1991; Farag y col.,Foto 8. Tienda de especias, Estambul, Turqua (Toussaint y col., 1991).

1989; Collins y Charles, 1987; Hitokoto y col., 1980; Hargreaves y col., 1975).

Los aceites esenciales y en general los aromas son de primordial importancia en la quimica del olor y sabor; en productos biolgicos proporcionan el aroma distintivo dela fuente de donde provieneny son los de principales atributos sensoriales de

los

alimentos de consumo humano @ m

y col., 1995; Reineccius, 1994; Maarse y Visscher,

1989; Pafumi, 1986; Zaika y Kissinger, 1981; Shelef y col., 1980).

Los voltitiles responsables del sabor y aroma, se sintetizan durante ciertas etapasdel desarrollo de plantas, animales y cultivos celulares. Segn Administration (FDA) de Estados los UnidosNorte de Amrica sustancias "son consideradas en el grupo de los aditivos alimentarios de origen natural, tienen comosaborizantesestatus

la Food and Drug

regulatorio GRAS o Generalmente Recomendados Como Seguros", se pueden etiquetar100 % naturales y su uso esth limitadoporbuenasprikticasdeSIN, no se enumeran y no

manufactura. En el Sistema Internacional de Nomenclatura

estn sujetas a dosis mximas legales, la cantidad de aceite esencial, se autolimita por

razones sensoriales. Esto significa que la cantidad de la sustancia afiadida al alimento en la fabricacin no exceded la necesariapara obtener aceptacin la

por del parte

consumidor(Leung y Foster, 1996; Davison y Branen, 1993; Tainter y Grenis, 1993;

ACEITES ESENCIALESDE AJO Y CEBotLA. EFECTO BACTERIOSTATICO,CARACTERDACINQUMICA Y ANALISIS SENSORIAL.

5

Smith, 1992). En vegetales,sucomposicinqumica,proporcin,cantidad depende,enprimertrmino,de abiticostalescomo laespeciebotnica-variedad,gentica-,el medioambiente,clima,condicionesdelsuelo

y calidad

y defactoresy defactores

socioculturales prcticas como culturales, estado desarrollo, de manejo poscosecha previoa laextraccin y mtodode extraccin(Sass-Kiss y col, 1998; Randle y col.,1994; Chieko y col., 1993; Tung y col., 1994; Mazza y col., 1992).

Los trabajos de investigacin sobre aceites esenciales de ajo {Allium sutzvum) y

cebolla {Allium cepu) en microbiologa y medicina, ser por inhibidores algunas de enzimas involucradas en las rutas metablicas celulares, han generado amplio inters en experimentar conocer para

y desarrollar potenciales sus como

f h a c o as como

antimicrobiano y sazonador(Dainty y MacKay, 1992; Talaat y col., 1989; El- Khateib,1987; A z z o u z , 1982; Danker y col., 1979). Milenariamente se han utilizado a

l o s ajos ylos

cebollas enmedicina la tradicional

o tambin llamada emprica

o folkl6rica, enla generacin de

tratamientosdiversos. Se han publicado estudios incluyen que microorganismos,tambinhayinvestigacioneseneltratamientode hasta como estimulador de la brotacin de yemas de ciruelo japons Lindl)enlugarescon baja acumulacindefro(Snchez

compuestos en el tejido vegetal as como rutas bioqumicas delos aromas producidos conalgunos tiposdey

cncer, como antitrombtico, insecticida, antimicrobiano alimentos, en samnador,

(Prunus sulicinu

y col. 1997; Singh y Singh,

1995; Kammerer, 1993; El-Shourbagy, 1993; Fenwick, 1985; Shelef y col. 1984).

Con presente la investigacin reporta se

el mtodo de

extraccin de aceitesy se

esenciales, por elmtododearrastredevaporencondicionesdevacoestndar, probaron inhibidores crecimiento como del celular; la dadatendencia uso del de sustancias de origen natural como mtodos de conservar problemasdesaludpblica

y sazonar alimentos as como

posibles principios activos en el desarrollo de medicamentos con

sus implicaciones en

y con la consecuente importancia econmica. Tambin se

realiz la caracterizacin cromatogrfica qumica mediante el reactivo de Ellman de los y compuestos voltiles de dos variedades vegetales cultivadas en Mxico de los que no se tenan reportes previos.

6

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA,EFECTOBACTWOSTTKO,

C A R A C T m C I b N QUIMICA Y ANLISIS SENSORIAL.

combustin lenta de carbono hidrgeno, lacual es e completamente similaral fenmeno que ocurre en una lmpara o un candil iluminado,y que desdeeste punto de vista, o animales que respiran combustible ls son verdadero quese encienden y consumen asi mismos."ANTOINE LAVOISIER ARMAND SEGUIN, 1789.

"...en general, la respiracin

no es otra cosa que una

-

IL

ANTECEDENTESlosmicroscopios fueron

Cuando

suficientemente poderosos,

Louis Pasteur, en

1860, demostrelprocesodeenvenenamiento

microbian0 de los alimentos al establecer que la fermentacinescausadapormicroorganismos. En la actualidad, la industria alimentaria domina tratamientos especficos capaces impedir de queamenazan ylo quepuedenproliferarenlos diversos grupos de alimentos;sonejemplos: vaco, aditivos, alimentos fermentados como quesos, aceitunas, etc. (Toussainty col. 1991)Foto 9. Microfotografia de barrido

o

favorecer el desarrollo de los millones de clulas la

pasteurizacin, productos enlatados, envasado al

de moho filamentoso formando una capa blanca en ciertos quesos (Toussaint y col., 1991)

Los

factores se microbiolgicos

consideran los ms importantes riesgos dentro de

la perspectiva devehculo. En la industriaalimentariaesbsico mtodosqueeviten Anlisisde

salud publica son porqueesel

capaces causar manera de de extensiva enfermedades las el en que alimento la proliferacindemicroorganismos,comosonlosprogramasde

asegurar lacalidaddelproductocon

Riesgos enPuntosCrticosdeControl(ARPCC)

o sus siglas eningls

HACCP. El sistema es de tipo preventivo y se encarga de la seguridad de los alimentos;

ACEITES ESENCIALESDE AJO Y CEBOLLA. EETCTU

BACTFXICJST+~CO, CARACTFZUZ~CI~N u i r u Y ANLISIS SENSORIAL ~ ~c~

7

est basadoenimpidiendo el

disefiar el procesodesde

la produccin hasta el consumidorfinal

crecimiento de microorganismos patgenos, mediante manejo el de alimento conprincipiostcnicos

factoresecolgicosdel

y cientficos(Multon, 1996;

Stevenson y Bernard, 1995; Middlekauff y Shubik, 1989).IL1.

Principalesmicroorganismos de descomposicin

Los alimentos, se pueden considerar como un medio ambiente selectivo para elcrecimiento celular en los que sus variables fisicas y composicin qumica seleccionan aquellosmicroorganismos que poseen los atributosbioqumicos

y fisiolgicospara

proliferar.Enotrostrminos,elquemejorse

adapta al ambiente, crece ms rbpido.

Cuando un comestible -de un ambiente definido- es colonizado por clulas, al ocurrir el crecimiento, cambia el ecosistema de tal forma que modifica las asociaciones que son capaces de desarrollarse. SegnRay (1996), Leistner y Gorris (1995) y Gould (1992), los cinco factores que afectan el metabolismocelular y corno consecuencia la ecologa microbiana de los alimentos se agrupan en la Tabla1, la combinacin y el manejo de

stos en la pdctica para evitaro inducir el desarrollo celular se conocen como tecnologa de barrera. Muchos microorganismos patgenos (bacterias, mohos contaminar el alimento durantelasetapas deSU

y virus) puedenmanejoentrelaproduccin

y elel

consumo. La ingestindealgunosmicroorganismosno sistemadigestivo los elimina antesdequepuedan

es peligrosaparalasalud;el causar elmenortrastorno.Por

contrario, su multiplicacin en los alimentos y la generacin de sustancias txicas es la causadelproblemacuandosoningeridos.Serequierecomomedidadecontrolpara evitarlaproliferacin

y comoconsecuencialageneracin

de toxinas, un proceso

adecuado e higiene rigurosa desde el inicio hasta el consumidor.

g

ACEITFS ESENCIALES DE M0 Y CEBOLLA,EFECTO

BACTERIOSTATICO,

CARACTERWACIdNQLkWCA Y A N h S I S SEIVSORIAL.

Tabla l.

Principales factores que afectan la ecologia microbia de los alimentos (Ray, 1996; Leitsner y Gorris, 1995; Gould, 1992).FfSIcoActividadde Agua aw Hielo y sus efectos de Concentracin por congelamiento

QufMICONutrientes presentes Naturaleza de los solutos pH y capacidad de amortiguacin

FACTORES DEPROCESO

FACTORES EXTR~NSECOSTemperatura Humedad relativa

FACTORES IMPL~CITOS Y

Cambios en los tipos de microorganismos Cambios en el nmero microorganismos Cambios en la composicin del alimento Cambios en la estructura del

MICROBIOL~GICOSMicroorganismos presentes

M 1 n parcial Crecimiento de oxgeno Presencia otros gases de

Fase microbiolgica lag y velocidad de

Efectos sinrgicosEfectos antagnicos

Potencial de xido Viscosidad reduccin Microestructura Presencia de aditivos y compartamentaliza cin sustanciasantimiCrObianas

alimento

II.l.l. Grupos bacterianos importantes en alimentos

De la cantidad de microorganismos y contaminantes encontrados en alimentos, las bacterias constituyenel grupo ms importante entre insectos, helmintos y desechos de aves y roedores. Factores que influyen o son relevantes en el desarrollo celular son: su rpida velocidad de crecimiento, facilidad de proliferar en los ms diversos ambientes, facilidad utilizar nutrientes, de sus habilidad crecer de en temperatms, aerobiosis, pH, actividad de agua

un intervalo amplio de(h), como a s el potencial de

sobrevivencia -como las esp.ras a temperaturas altas-. Los factores antes mencionados

son los criterios de decisin en la implementacin de programas de calidad, respecto de

los microorganismos en lugares donde manejan alimentos. seLas bacterias en alimentos se han dividido y agrupado sobre la base de algunas caractersticas similares, recopiladas en la Tabla 2.

ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA EFECTO BACll?RIOZFFATICO,CARACTEUIZACI6N QUMICA ANLISIS SENSORIAL Y

9

Tabla 2.DIVISI~N1) A&ticas 2) Butricas

Grupos bacterianos importantes alimentos enCARA~ER~STICAS Produce cid0 dtico. Produce bid0 butrico.

(Ray, 1996).MICROORGANISMOS

Acetobacter aceti algunas Clostridium spp.como I Clostridium butiricum 3) Lcticas I Produce relativamente grandes cantidades de I Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, cid0 lctico a parti-de carbohidratos. Lactobacillus y Streptococcus thermophilus. 4) Propinicas Son usadas en fermentacin lctea. Propionibacteriumfreudenreichii 5) Acidrica Algunos Lactobacillus,Pediococcus, Capaz de sobrevivir a pH abajo de4. por Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus. PrincipalmenteEscherichia, Enterobacter, 6 ) Coliformes Son usados como ndice sanitizacin. de Citrobacter, Klebsiella. 7) Coliformes fecales Son usados como ndice de sanitizacin. Escherichia coli 8) Esporulados Bacillus, Clostridiumy Desulfotomaculum Habilidad de producir esporas spp. 9) Halotolerantes Algunos Bacillus, Micrococcus, Capaces de sobrevivir a altas Staphylococcus Pediococcus, Yibrio y concentraciones de sal (arribao iguales al 10 %) Corynebacterium. 1O ) Lipoliticas Capaz dehidrolizar trigli&ridos, debido a la Micrococcus, Staphylococcus, prodwxin de lipasas extracelulares Pseudomonas,Alteromonasy Flavobacterium relativamente 11) Osmofilica Staphylococcus. Leuconostoc, Pueden crecer en altas concentraciones Lactobacillus osmticas,son mucho menos osmofilicas que las levaduras y mohos. 12) Patgenos entriw Salmonella, Shigella, Campylobacter, Causan infecciones gastrointestinales Yersinia, Escherichia, Vibrio, Listeria, Hepatitis A 13) Productores de Debido a la sntesis polisacridos de Xanthomonas, Leuconostoc, Alcaligenes, gomosidad Enterobacter, Lactococcus y Lactobacillus. Leuconostoc, Lactobacillus, Producen COZ,Hz, HzS durante el 14) Productoras de gas Propionibacterium, Escherichia, metabolismo de nutrientes. Enterobacter, Clostridium y Desulfotomaculum. 15) Proteolticas Hidrolizan protenas, debido a la produccin Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Alteromonas, de proteinasas extra-ceiulares Flavobacterium,Alcaligenes, algunas Enterobacteriaceaey Brevibacterium. 16) Psicrotrficas Pseudomonas, Alteromonas, Alcaligenes, Pueden crecer en temperaturasde Flavobacterium, Serratia, Bacillus, refrigeracin (menoreso iguales de 5 "C) Clostridium,Lactobacillus,Leuconostoc, Carnobacterium, Brochotrix, Listeria, Yersinia y Aeromonas Bacillus, Clostr?dium, Aeromonas, 17) Sacarolticas Hidrolizan carbohidratos complejos. Pseudomonas, Enterobacter 18) Termofilicas Capaz de crecer por arriba de50 "C Algunos Bacillus, Clostridium, pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus 19) Tennduica Algunos Micrococcus, Enterococcus, Capaz de sobrevivir atemperaturas de Lactobacillus, Pediococcus, Bacillus pasteurizacin. (esporas)y Clostridium (esporas)

Con base a la clasificacin del manualde Bacteriologa Determinativa editado por Holt(1993) as como Ray por(1996) en al baseGneroy Familia, pors u

importancia, se tomanestos

grupos de bacterias porqueestnpresentesenalimentos.

Se encuentran ordenadas en secciones y se recopilan en la Tabla 3.

Tabla 3.

Gnerodebacteriasimportantesenalimentos(Ray, col., 1993)Familiano indicada Pseudomoneaceae Acefobacteraceae Nisseriaceaeno indicado

1996; Holt y

DescripcibnGram-negativos,aerbico/ microaerofllico, mviles, heticoides/ vibrioides

MneroCampilabacter Pseudomom, Xantomonas Acetobacter, Gluconobacter Acineiobacter,Morarella Alteromonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Brucella, Psychbocter Citmbacter, Escherichia, Enterobacter, Edwarsiello, Ewinia, Hafiia, Klebsiella, Morganello, Proteus, Salmonella, Shigella, Serratia, Yersinia, Vibrio,Aeromonar,Plesiommarcome1la

Gram-negativos,aerbico,bastones y cocci

Gram-negativos,ana&bios facultativos, bastones

Enterobacteriaceae

VibrionoceaeRickettsias

Rickettsiaceaceoe Micrococcaceae no indido

Gram-positivos cocci

Micrococcus, Staphylococcus

Streptococats, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Sarcinia Bacillus, Spomlactobacillus,Clostridium, Desulfotomaculum"

Gram-positivos, fomador de endosporas,bastones cocci y

no indiada

Gram-positivos, no espulados, bastones regulares Gram-positivos, no espodados, bastones uregulares

no indicado

Lactobacillus, Carnobacierium, Brochotrix, Listeria,

no indicado

Corynebacterium, Brevibmterium, Pmpionibacterium.B~~dobactertum

'Las e6luias Desulfotmacuhm son gram negativas

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6NQ U h C A Y ANLISIS SENSORIAL.

11

II.l.l.l.

Principales microorganismos de descomposicin de carnes rojasEl msculo animal (Figura 1) es un

mediodecultivoricoennutrientes,est conformadomanojo por un de fibras contrctilesrodeadodeunacoberturade tejido conjuntivo, que constituye una proteccin contra efectiva contaminacin Qumicamente, externa. en promedio,lacarne de losmamferos la

contiene 18 % de protenas, 75 % de agua, el contenido de carbohidratos es bajo y el de grasas variable muy (Bourgeois y Leveau, 1995). Tabla La 4 presenta composicinpromedio qumica del msculo magro para varias especies.Figura 1. Estructura del msculo estriado. Micrografia electrnica de partes de tres miofibrillas seccin en longitudinal.Estanseparadasporaberturashorizontales.La la parte clara es la banda I, la cual contiene filamentos delgados arreglados hexagonalmente; la banda A, marcada en obscuro contiene solamente filamentos empacados hexagonalmente; aquellos obscuros la exterior segmentos de parte son que y filamentos delgados; contienen traslapamientos delgados como los discos Z que estn anclados; y eldisco M aparece como protuberancia el una encentro cada de filamento delgado. La unidad fincional de las miofibrillas, el sarcmero, Z es la regin entre dos discos sucesivos en el msculo (Voety Voet, 1995).

Tabla 4.

Composicin qumica promedio del tejido muscular de algunas especies (Dainty y Mackey, 1992; Fennema, 1984).

ESPECIESBacalao Cerdo Cordero Pollo Res Salmn~~

AGUA81.2 68 - 70 73 73.764

PROTENA

L ~ I D O S CENIZAS

1

17.6 19 - 20 9 - 11 20 5-6 20 - 23 4.7 20 - 22 70 -73 4 - 8 20 - 22 - 15

~ T R ~ ~ ~ O M ~ ~ S T O S (%, P N ) EN GENERAL 1.2 0.3 L (+) Acido lctico0.9 1.4 . 0.1 Glicgeno Nuclehtidos 0.3 1.6 Aaicares fosfatados O. 1 1.o Productos de ATP 0.3 1.o 0.4 Aminocidos 1.3 13

Tan pronto como se sacrifica un animal, el msculo asume el estado rgido-o de

rigor mortis, esta transformacin est acompaadade una cada progresiva del potencial

12

ACEITES ESENCIALESDE A O Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTElUZACI6NQUfMICA Y ANLISIS SENSORIAL, J

de xido-reduccin o potencial elctrico (Eh) del msculo; que en su estado normal es de 250 mVydesciendehasta -50 mV.Tambinocurre un descensoenel hasta 5.5 y se este produce cuando glucgeno convertido el es hasta cid0pH de 7.4

lctico.

Por otro lado, cesan los mecanismos de defensa del animal haciendo al tejido muscular ms vulnerable al crecimiento bacteriano, aunque microbiolgicamente, en el momento de la matanza,elmsculoestprcticamentelibredemicroorganismos,cuandode animales sanos se trata (Bourgeoisy Leveau, 1995; Voet y Voet, 1995). Las fuentes iniciales de contaminacin del tejido muscular, algunas veces, sonlos ganglioslinfticoscuandoestncontaminadosconmicroorganismos.Tambinpueden ser aquellos que se encuentran en el tracto dlgestivo, donde al cruzar la barrera intestinal son transportados por el flujo sanguneo con los que se pueden causar contaminaciones profundas (Bourgeois y Leveau, 1995; Dainty y MacKey, 1992). En la superficie de las canalessepuedeencontrar

un gran nmerodemicroorganismosdediversostipos;seun lugaranatmicoaotroy

puededesarrollarunafloracaractersticaquevarade1992). Tpicamente, las canales de carne

depende en gran medida dela temperatura, pH y la atmsfera gaseosa (Daintyy MacKey,y algunos productos crnicos tienen bacterias

mesofilas (entre

100 y 10 O00 por Una cm2). recopilacin principales de los

microorganismos encontrados incluyen: carne en laBacillus,

Acinetobacter, Brochotrix, Pseudomonas, Lactobacillus, Flavobacterium, Streptococcus, Aeromonas, Corynebacterium, Clostridium y Arthrobacter

(Bourgeois y Leveau, 1995; Dainty y MacKey,1992; Van der Zanty Splittstoesser, 1992).

II.1.1.2.

Pseudomnasfragi

El gnero Pseudomonas, pertenece a

los procariontes, clulas sus tienen formas rectas o bastonesligeramentecurvos,miden alrededorde 0.5-1.0 x 1.5-5.0 pm (Foto 10).Foto 10. Fotogrda de barrido electrnico de

Pseudomonasfragi (Campbell, 1993).

ACEITES ESENCIALES DE m Y CEBOLLA, EFECTO B A ~ ~ ~ O S T T I C CARACTERIZ~CI~N Q, QWCA Y ANALISISSENSORIAL

13

Se encuentran ampliamente distribuidas en naturaleza. Muchas especies de familia la esta acumulan f3-hidroxibutirato como material de reserva de carbono, las clulas se tifien de forma gram negativa. La mayora especies de de condicionesticidashasta pH=

Pseudomonas pueden crecer en

4.5, no requiere de

factores de crecimiento para su

desarrollo. Tienen metabolismo respiratorio estrictamente aerbico en el cual el oxgeno es el aceptorfinaldeelectrones. segn positivas o negativas

En pruebasbioqumicas,seconocequesonoxidasala cepa, soncatalasa positivas y adems quimio

organotrficas, son psicrotrficas y pueden crecer a 5 "C aunque su temperatura ptima es entre 10 y 25 "C. (Ray, 1996; Holt y col., 1993). Algunas cepas de Pseudomonas se han utilizado frecuentemente en reacciones de biotransformacin ya que tienenla habilidad de romper oxidativamente enlaces C-C y losC-O (Hui y Khachatourians, 1995). Son capaces de metabolizar una amplia variedad de

carbohidratos, protenas y lpidos en alimentos, pero principalmente en came

y pescadoy

producen proteinasas y lipasas extracelulares que son estables trmicamente; por lo que

l a s Pseudomonaceae sonrelevantesen

los procesosdeconservacindealimentos

constituyen puntos de riesgo en programas de calidad de acuerdo conHACCP. IL1.1.3.

Lactobacillus sp.

Varan ampliamente en cuanto a forma y tamaiio, algunos pueden ser cadenas cortasmuy largos otros

pueden ser cocobacilares, pueden estar solos o en

o largas (Foto

11).

Los

Lactobacillus se encuentran ubicados dentro del

grupo de los grampositivosnoesporuladoscon formadebastones.Sonanaerobiosfacultativos, la mayorade l a s especies noson general son psicrotrofas,homo pueden ser mviles,en o heteroFoto 11. Microfotografla de barrido de Lactobacillus pkmturum. WSO. Escala bar = lpm (Hui y Khachatourians, 1995)

mesoflicas aunque algunas son

fermentadores lcticos (Tabla 5). Pueden crecer

" .

.

a pH entre 3.5 hasta 5 (Ray, 1996; Hui y Khachatourians, 1995). Algunasespeciespueden crecer a bajas tambin forman de parte temperaturasproductos en almacenados temperatura a de leche, m e , heces y la flora de productos acucolas. Muchos usados son en refrigeracin (L. sake, L. curvatus). Se encuentran plantas, en

bioprocesos alimenticios (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus, L.plantarum) y algunos son usados como probiticos (L. acidophilus, L. reuteri, L. casei

subsp. casei). Diversas producen cepas bacteriocinas, se que pueden como usar bioconservadores alimentos impedir de al e1 crecimiento deotros microorganisrnos

(Lactobacilluspentosus) (Davison y Branen, 1993). Tabla 5.

Divisindelasespeciesde

Lactobacillus en grupos (Ray, 1996).

Designacin previa

carbohidratospatrn d fmentacin e

Obligado homofamentativoI

Fwultativo

obligado heterofmentativoI

Productos hales de la

I lactato, acetato,emlo4

heterofmenmivo

Lactato,acetato,etanol

famentacin deCarbOhidratoS

coz,formato

positivo positivo Fermentacin de las

negativo

Pa=Especies representativas

L. delbrueckii subsp.: delbrueckii:bulgaricus :lactis

L. casei subsp.: casei:rhamnosus : pseudopantarum

L. fermenturnL. divergens

L. kt$rL. conjuus

L.. leichmanniiL. acidophilus

L. plantarumL. curvatus

L. brevisL. sanj-rancisco

L. helveticus

L. saque

L. reuteri

ACEITES ESENCIALESDE AJO Y CEBOLLA. EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACION QUkWCA Y ANLISIS SENSORIAL.

15

II.2.

Metabolismo celular

El crecimiento rpido de los microorganismos, una vez que se han adaptado al alimento, debeacoplamiento reacciones se al de bioqumicas consecutivas transferencia de electronesejecutadas por las enzimas.Elmetabolismocelularesla globalidad de procesos dirigidos enzimticamente mediante los cuales las clulas utilizan la energa que ellas mismas generan en forma ATP. de Los organismosvivientesnoestnenequilibrio,parasurpidocrecimiento requierenpermanentementeelflujodelcompuestomsimportanteanivelbiolgico conocido como ATP para mantener funcionando en orden su sistema bioqumico. Este compuesto energtico es derivado del cido fosfrico y derivados de cidos carboxlicos. El ATP seformaapartirdeladenosinmonofosfato acopladas entre la fosforilacin oxidativa del sustrato o fuente de carbono y, tambinse puede generarpor otro proceso conocido

y de

(AMP),mediantereacciones

como la quimismosis. Una caracterstica metabolismo del degradativo es que convierte un gran nmero de sustancias diversas (carbohidratos, lpidosy protenas) a intermediarios comunes. Luego

estos intermediarios son metabolizados en una ruta oxidativa que pocos centralgenera productos finales y despus a unintermelario comn, acetil

- coenzima A (Figura 2);grupo acetilodeyFigura 2. Estructura qumica de la Acetil coenzima A. El enlacetioesterde "alta energa" se indica curvo; grupo acetil es con un segmento el reemplazado por hidrgeno (Voet y Voet, 1995).

seguido porlaoxidacindel

hasta C 0 2 y H 2 0 poraccionessecuenciales del ciclo del ctrico, cido cadena transporte electrones de oxidativa. En un sistema alimenticio los fosforilacin

sustratos metabolizables principalmente son

16

ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO, CARACIWZQACI6NQLdMICA Y ANALISIS SENSORIAL

los carbohdratos, protenas y lpidos. Los microorganismos en alimentos se consideran tambin quimio-organotrofos son usando compuestos heterotrofos y por otro lado, orgnicos como donadores electrones generar de para energa (Voet Campbell y col., 1993; Colby, 1987). Las rutas de reacciones las biolgicas agrupan dos se en categoras: de las degradacin o de catabolismo y las de biosntesis o anabolism0 (Figura 3). En las rutas catablicas, los metabolitos complejos desdoblados exergnicamente hasta productos son simples. Las enzimas son de importancia en central la desecuencia complicada conducen al que eventos crecimiento, maduracin, almacenamiento y procesos transformcin de materiales Cualquier alteracin el en comportamiento normal de enzimas delas tenerPro.ductwsimples

y Voet, 1995;

k

yi \

:;~~"-.0 -

Metabolitos complejos

\

\

Regradacin

biolgicos. Biosntesis

A_

P"\puede

un de el desarrollo

microorganismo consecuencias funcionamiento y por lo tanto afectar celular (voet Y voet, 1995; Campbell y col., 1993).

Figura 3. Rutas catablicas. El ATP y NADPH son las &entes de energa libre de reacciones biosintticas. Ellas son generadas entre la degradacindemetabolitoscomplejos y utilizadasenlasdiversas fbnciones biolgicas (Voet y Voet, 1995).

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO, CARACTERIZACI6N QUMICA ANALISIS S E N S O W . Y

17

II.2.1.

Mecanismos de accin de aceites esenciales gnero Allium del sobre microorganismos

Figura 4. Accin deun inhibidor enzimtico. Puede ser reversible o irreversible y depende del tipo de uniones que establezca y con la enzima. Es irreversible cuando se genera un enlace covalente, con fierzas electrostticas es reversible (VoetVoet, 1995; Campbell, 1993).

Cualquier compuesto velocidad que la reduce

de reaccin del

metabolismo celular es un inhibidor de enzimas (Figura 4 . Se ha comprobado que la ) cebolla (Allium cepa) y elajo (Allium sativum) inhibenlaactividadmetablicaen microorganismos segn la concentracin (Whitaker, 1995; Rees y col., 1989; Shashikanty col., 1988; Vries y Klasen, 1979).

En los vegetales del gnero Allium los principales compuestos encontrados en sus aceites esenciales son de naturaleza azufrada. Por poseer estos compuestos dos pares de electroneslibresencadaunodelostomosdeazufrecuando (Figura 5), presentan un orbital hbrido de tipoforman enlacessigma

SP3(Pierce, 1986), adems pueden establecerpuentes de hidrgeno. Como inhibidores, son especficos a travs de sus grupos tiol o de xidoy

mercapto y modificanelbalance nivel a reduccin. Hay teoras celular mecanismos propuestos el enbloqueo del

metabolismo celular, en los que se tiene como comn denominador al azufrey s qumica. u

Figura 5. Dialildisuiiro o Alicina.Sustanciaazufiada, inhibidor enzimtitico del metabolismo celular. Compuesto ms abundante en el aceite esencial de ajo.

18

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6N Q-CA

Y ANALISIS SENSORIAL.

La Tabla 6 , recopilaalgunasdelasenzimascelularesinhibidasporlaalicina encontrada en ajo, as como las referencias donde se reporta.

Tabla 6.

Algunas enzimasinhibidaspor laalicinaencontradaen (Allium sativum)

el ajo

IAqetato kinasa

ENZIMA..

.,

,...

Zb

,... ....4b

.

.

I

.

6b

d l

.

I

.

.

-

1

.

.

.

I

"

I0

ld0

do

....

I

.

.

I

m . ?

140

180

P.M. 41 g/mol

~~

90

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACINQ W Y ANALISIS SENSORIAL. C A

COMPUESTO (CEBOLLA)

FRAGMENTOS

trans-3,SDietiE1,2,4-tritiolano. 2.09%, Rf30.40 min, 180 @mol

P.M. 180 d 0 m1 corresponde al ion padre

ESPECTRO

P.M. 73 @mol

P.M. 115 @mol

P.M. 41 @mol

ACEITES ESENCIALESDE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO. CARACTERKUCIN m C A Y Q

ANALISIS

SEVSORIAL.

91

COMPUESTO (CEBOLLA) 2,5-dimetil-tiazolio.0.43%, Rf36.13min, 113 g/mol

FRAGMENTOS

P.M. 18 @mol

ESPECTRO

J8000 6000 -

99

lf3

4000

1I

1

P.M. 113glmol ion padre

1841

idd_ .39

8000

-

6000 -

iP.M. 99 @mol

40002000 I

La Tabla 16 resume a los compuestos identificados en los aceites esenciales deajo y cebolla extrados por arrastre de vapor en condiciones de vaco estndar, as como su abundancia relativa, tiempo retencin y peso molecular. deTabla 16.Compuestosazufradosencontradosenlos y cebolla.

aceites esenciales deajo

Familiade compuestosMonoazufrados

I

-1

Disulfuros

-

-

Trisulfuros

Sin azufre

Col?Apadmdclieos

Cempucstos comunes en los dos v q ~ t a l e s

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI~NQU~MICA ANLISIS SENSOR~AL Y

93

V.2.3. Concentracin de grupos sulfhidrilo SH

Con la ecuacin general C,(pmol SH /ml) = (A / 13 600 * D), reportada por Ellman (1959), se obtienen las curvas para cada tratamiento (Figura calcular la concentracin de grupos tiol a cada valor de concentracin de aceites 27). Conellassepuede

Aceites esenciales de y cebolla en presencia ajo del reactivo de Ellman

esenciales(Tabla 17). Delasecuaciones,A es el valor de la absorbancia leda en la

A

solucin 420 problema a nanmetros (nm), 13 600 es el coeficiente de extincin, D eselfactordedilucin [(Volumeny secalcula:i

O

50de aceit+)

100

150

200

totalNolumen la

de

Concentracin/

ml de medio

muestra)*(Volumen de la solucin de fosfato + Volumen del reactivo de Ellman) Nolumen de la muestra)].Tabla 17.Figura 27. Pruebareactivo del de Ellman en los cinco tratamientos y los cinconiveles,mismosqueseprobaronen los bioensayos.

Ecuaciones que describen la concentracin de los grupos sulfhidnlo (pmoles/ml) en los5 tratamientos probados en los bioensayos.

[

TRATAMIENTOAjo Ajo+cebolla (2: 1) Ajo+cebolla (1 : 1) Ajo+cebolla (1 :2) Cebolla

1

ECUACI~N DEL TRATAMIENTO

R20.9987 0.9993 0.9989 O.9993 O.9994

[SH(pmoledml)] = 4E-O7*(pI de aceite) + 1E-06 [SH(pmoledml)] = 3E-O7*(pl de aceites) + 7E-O7 [SH(pmoledml)] = 3E-O7*(pl de aceites) + 6E-07 [SH(pmoledml)] = 3E-O7*(pl de aceites)+ 3E-07 [SH(pmoledml)] = 3E-O7*(p1 de aceites) + 8E-07

Los coeficientes de correlacin de cada una de las ecuaciones obtenidas con los datosexperimentalesestporarribadel0.99enloscincotratamientosprobados. tiene que considerar que el orden de magnitudentreelnivel Se

ms pequeo y elms

elevado de concentracin de los aceites es de

(5025) veces mayor por lo que los tres

primeros puntos se encuentran cercanos entre s comparados con los dos ltimos, (0.039, 0.39,3.99,49.6, 196) pl aceite(s)/ml.

94

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA.EFECTO BACTERIOSTATICO, CARACTERUACIbNQUfMICA Y AN.hlSlS SENSORIAL

Los resultados de la Tabla 18 indican una disminucin gradual de la concentracin

de grupos tiol a medida que aumenta el contenido del aceite esencial de cebolla. Con las ecuaciones obtenidas la concentracin de los grupos tiolen ajo y cebolla, al comparar los resultados, en un mismo nivel de concentracin se puede notar que en ajos es 25 % mayor respecto de la cebolla. De la misma forma, tambin se aprecia que entre las combinaciones hay en concentraciones grupo del fimcional. de los aceites no diferencia las constituyentes abundantes la ms encebolla contienen no tomos azufre de aldehdosquenogeneranelpigmentodetectadoconelreactivo,mientrasqueenLos dosy son

ajos

todos sus constituyentes si lo contienen. Aunque no se puede conocer cual o cuales de los constituyentes en cada aceite reaccionan, se debe sealar que el ajo se encuentra 25% por arriba en la concentracin de los grupos tiol detectados respecto de la cebolla mezclas no hay diferencia.Tabla 18.Concentraci6npl aceite@) / m 1

y entre las

Concentracindegrupostiol

(SH) en pmoledml

pmoledml de grupos tiolen cada tratamiento (lxlo-) ajo

I

ajoi-cebolla (2:1)

I

ajoi-cebolla (1:l)

I

ajo+cebolla (1:2)

I

cebolla5.96 1.55 O. 186 0.0817 0.0419 0.0711

196 49.6 3.99 0.39 0.039

2.08 0.259

5.95 7.94 1.55 O. 186

o. 101

5.94 5.91 1.5 18 1.548 O. 178 O. 1497 0.0717 0.0817 0.115 0.0611 0.0711 0.039

El nmero de compuestos azufrados en cebollas que tienen estructuras

cclicas son

9 y suman 18.99 % deabundanciarelativa(2,5-dimetil-tiofeno,tiazolidina,3,3-tienil-2cidopropenico,2,5-dimetiltiazolio,1,3-ditiano,1,3-ditiolano, 1,2,4-tritiolano-3,5-dietily el trans-3,5-dietil-l,2,4-tritiolano), demscompuestosalifticoscaracterizadosque los

contienen al anifre suman 15.76 % (metanetiol, metil propil disulhro, metil tirano, dimetil disulhro, metil disulhro, etil 1,3-propan 2-propenil disulhro, ditiol, propil dimetil trisulfbro, dipropil trisulhro); el restante 18.53 % corresponde a otros compuestos que no heron identificados y quedeformaindividualcadaunodeellostienenabundanciaspor

ACEITESESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA,EFECTO BACTERIOSTATICO,CARACTERIZACIONQUtMlCA Y A N h I S I S SENSORIAL

95

abajo de 1 % segn las reas del cromatograma. Considerando que un compuesto cclico comolosqueseencuentran encebollasadquierenmayorestabilidadalpresentarun fenmeno conocido como resonancia, que no es otra cosa que el movimiento continuo de

los electrones al interior dela molcula, que proporciona mayor estabilidad al compuesto ypor consiguiente menor actividad en la formacin del pigmento detectado en la prueba si se compara conlos compuestos alifticos del aceite esencial de ajo.V.3.

Crecimientodemicroorganismos en mediossintticos

El anlisis de resultados de las curvas de crecimiento los bioensayos, se realiz a en travs de las ecuaciones de cada tratamientoy cada nivel obtenidas a partir de las lecturas de la absorbancia. Las fbnciones polinnicas (y(x)) de tercer orden, en estos bioensayos, describen al crecimientocelularconsiderandolosfactoresenlistadosenlaTabla1. La

variable independiente x representa al tiempo en horas, entre el inicio del crecimiento y lapentosus y 24 horas para culminacin de la fase exponencial, 30 horas para Lactobacillus Pseudomonas @a@. Elintervalodeinterssejustificaenconocercomorespondeel

crecimiento a lo largo del tiempo y(x) con cada uno de los tratamientos y niveles probados entre la inoculacin y el inicio de la fase estacionaria (Figura20). El polinomio o ecuacin que simula el crecimiento est influido por la variable de tiempo (x3, x). x2, Las ecuaciones lineales, enlistadas las Tablas 20 y 22 tienen la misma tendencia, en se localiza un punto mximoel en mismo intervalo seleccionado, coeficientes de correlacinsimilaresporloquepuedensercomparadasenunrangodelavariable independiente tiempo para conocer el comportamiento del crecimiento equivalenteal rea, calculadaporelvalordelaintegraldefinida.Elporcentajedeinhibicin se obtuvo al comparar los valores de cada de las reas bajo la curva respecto de la que present la una menor rea y por consiguiente el menor crecimiento.

96

ACEITE3 ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO, CARACTEWClbN QUfMlCA Y ANhISlS SENSORIAL

V.3.1. Lactobacillus pentosus

Sugieren los resultados que como era de esperarse, la mxima inhibicin se alcanza a 196 pVml del aceite esencial ajo, tratamientoy nivel de referencia, respecto de las dems curvas. El porcentaje de inhibicin se calcul regresiones y conelaceiteesencialdeajoa inhibicin.Seguidoporlacombinacindeajo finalmentelamezclademayorproporcindeajo indican no que hay en base a las ecuaciones obtenidas con las196 pVml comoreferenciadelamximay cebolla (2: l), ajo y cebolla (1: 1) y y cebolla (1:2) en mximo el nivel

probado. La variacindelosresultadosdelasreascuandosecombinanlosaceites efectosinrgico.Paraelniveldeconcentracinde49.6 pl/ml, la

inhibicin est entre 27.98 % en la mezcla de ajo y cebolla (2:l)y 15.61% ajo y cebolla(1 :2) comparado con la referencia sugiere un posible efecto sinrgico en la combinacin2: 1 de ajo + cebolla (Tabla 1 y Figura 28). De igual forma para el nivel de 3.9 pVml no se 9

aprecia diferencia del porcentaje de inhibicin al compararlo con el nivel de49.6pVml. En elnivelde 0.39 pVml el efecto que presentan los aceites y sus combinacionesnosonde inhibidores y por contrario, evidente incremento el es el en los valores las de reas asociadas al crecimiento de L. pentosus, segn los datos los constituyentes de los aceites favorecen el desarrollo metablico cuando se probaron por abajo de 0.39pVml. La Figura28 recopila las curvas de crecimiento en L. pentosus, la comparacin de las curvas de los

resultados de las reas se encuentran en la Tabla 20.Tabla 19.

Comparacindelasreas y porcentajesdeinhibicina 30 horasen Lactobacilluspentosus. YO inhibicin a cada nivel de concentracin de los tratamientos de 196 3.9 49.6 0.39 I 0.039 I BlancoO

TRATAMIENTOConc.aceite esencial pVml Ajo Ajo+Cebolla (2:l) Ajo+Cebolla (1:l) Ajo+Cebolla (1:2) Cebolla

18.19 27.98

19.2

3

4.6

20.55 21.27 19.82 8.14 21.09 15.61 3 1.62 8.9 19.84 16.26

29.88 33.19 20.54 27.59 8.75 17.59 31 13.50 11.32 8.89 12

11.87

6.86

24.15

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTE3UZACI6N QuthlrCA ANLISIS SENSORIAL Y

97

Figura 28. Curvas ajustadas de crecimiento deLactobacilluspentosus

L a c t o b a c i l l u s p e n t o s u s en p r e s e n c i a d e aceite esencial de ajo i~

-Poly.

(Blanco)

A

.

I-Poly.

(0.039 m i c r o l i t r o s l m l )

"Poly.

(3.92 microlitros/mI) (49.7m icrolitroslm I)(1 96 m icrolitroslm I)(0.39 microlitroslml)

-Poly.

-Poly.

-Poly.

40

O

30 10

20

T i e m p o en b o r a sLactobscilhrrpentoaus en presencia de aceite esencial & ajo 49.6 p l l h

R2= 0.9847

O

10T"kr

20

30

40

peto oars en presencia deaceite awcial de ajo 3.9 flml

~

p

m

s

s

*BLANCO .

5T

98

ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6NQUhiICA Y ~ L I S I SSENSORIAL

Figura 28. C r a ajustadas de crecimiento deLactobacilluspentosus (continuacin) uvsLactobacillus pentosus en presencia de aceites esenciales de ajo+cebolla (2:l)-Poly.

(0.39(Blanco)

microliroslml)

-Poly.

-Poly.

(0.039Poly. (196

microlitrodml) microlltroshl)

-Poly.

(3.9Poly. (49.7

mkrolitroslml) microlitroslml)

O5 15

10

20 40 2535

30

Tiempo en horas

LuetobaciUuspentmus en presencia de aceites esencides de ajo+cebotla ( 2 1 ) 0.039 pd U

L-aparonrs 5T

M pnseocia de aceites exndaks de ajo+cebolla ( 2 1) 49.6 p h l

y = -0.0004d 0.02152 0.0992%+ 0.038 + R2= 0.991~

eO10

y = -0.0001~~ . 0 0 2 + 0.1695~ o,2895 +0 ~~~

-

R = 0.9827 O 10

20

30

40

MTiempo en horas

30

40

Tiempo en horu

y = -0.0003d+ 0.0156~~. 4 -00% R2= 0.9829

- 0.0471

y = -0.0003$ + 0.01262 + 0.0113~ 0.1398 -

41020

R2= 0.9739O10

30

40

Tiempo en horn

20

30

40

Tkmpoenhoras

LectObeciNus pondDsus en presenciade aceltes l n l esenciales de ajo+cebolla (2:l) 3.S @

Lectobacllhrs pentorut BLANCO

,006~0.0143 1

-

Rz= 0.98051

41o b (O

4

O O10

-

y = -0.0003~~ + 0.0104xf + 0.087~ 0.2081

-

R2= 0.9772i

I

20

30

40

10

20

30

40

Tiempo en horn

Tiempo en horn

ACEkTE6 ESENCIALES DE AJOY CEBOLLA EFECTO BACTERIOSTTICO, CARAcTERIzACI6N QlJMICA Y ANLISIS S E N S O W

99

Figura 28. Curvas ajustadas de crecimiento de Lactobacillmpentosm (continuacin)Lactobacillus pentosus en presencia de (1:l) aceites esenciales de ajo+cebolla

-Poly. -Poly.

Poly. (0.39 microlitrodml)

1j

-Poly.(3.92microlitrodml)

(196 microlitrodml)(0.039 microlitrodml)

-Poly.

(49.7microlitrodml)

-Poly.

(Blanco)

O

30

10

20

40

Tiempo en horas

LacfobaciRwpentdPw en prosenda de aceitesesenciales de ajocCcbolb (1:l) 0.039 pUml5T5-

R 'O 1 0 2 0 3 0

= 0.9748

y = -O.ooOlx'+ 0 . 0 0 6 5 ~ ~ . 0 7 3 6 ~ 0.1668 +0 it2= 0.97655 0

-

4

0

Tiempo m boras

L & a i np &u en p-dn a bc sa s s U de aceites m e l de a]o+cebdh ( 1 9 ) 0.39 pUmi nh n

y = - 0 . W x 3+ 0 . 0 2 2 4 ~ 0.13%~+ 0.2462 ~

-

o o138O10

UO1020

R*= 0.99073040

mTiempo en horas

30

T p ea h o r a mo

Loctobaci&spad~ en prasemcia de aceites esenciales de oio+cebolla (1:l) 3.9 ~ U m l

y =. o

m&+ 0.01I& + o.M)41x R' = O 07491

O O10

20 Tkmpoenborns

30

40

O

10

20T i m po m Mras

30

4 9

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6NQLh4ICA Y ANhISIS SENSORIAL

Figura 28. Curvas ajustadas de crecimientode Lactobacillus pentosus (continuacin)Lactobacillus pentosus en presencia de aceites esenciales d e a j o y cebolla (1:2)5-Poly. (0.39 micro litroslml)

z4; 3

-Poly. (0.039 micro litoslml)

-Poly.

( 4 9 . 7 micro litroslml) (196 micro litroslm I)

4

-Poly.

es$

8 2-Poly. (Blanco)

1-Poly. (3.92 micro litroslml)

OO

10

20

30

40

T i e m p o en h o r a s

I

Lactobacillus pentosns e n p r e s e n c i a d e a c e i t e s esenciales de ajo y cebolla (1:2) 0.039 pllml d emedio

Lnctobacilluapmtosws en presencia de aceites esenciales de ajo y cebolla 49.7 (1:2) PUml de medio

*y=

!0.246 R = 0.9646 '2030

- 0 . 0 0 0 2 ~ ~0 . 0 0 8 2 ~ ~ . 0 8 3 3 ~ + +0

O 10

y

= -2E-05x' - 0.0035~'+ 0.2714~ O 7763 .2030

10

40

40

Tiempo en horns

Tiampo en horas

L a c t o b a c i l l u s p s en presencia de aceites esenciales de ajo y cebolla (1:2)0.39 w l / d de medio

L.aobacilhu pentoas en p-aa de .eeites esencides de ajoy ceboll. 1% (12) p d medio l de /

-2 2 515

.,

y = O W01x3 + 0.W33x' + 0.1877~. .O5837

R'

= 0.9554O

O O10

10

M

30

40

Tiempo en hornsLactobacillus pentosus en presencia de aceites esenciales de a p y cebolla (1:2) 3.9 Pllml de medio5 T

"2010

30

40

Lactobacillus pentosusBlanco

1' 4

. i 2

/jO

y = O 0004~' 0,01342 + O 08x - O 3127 + R ' = 0.9633

y = -5E-O&

- 0.0048~'+ O 3404x .11081R 2= O 986840

5

10

15

20

25

30

35

O

20

30

Tiempo en horns

Tiempo en horas

Figura 28. Curvas ajustadas de crecimiento de Lactobacillus pentosus (continuacin)Lactobecillus pentosus en presencia de aceite esencial de cebolla6 7S

"Poly. -Poly. -Poly. -Poly. (49.7 -Poly. -Poly.

(3.92 microlitroslml) ( 0 . 0 3 9 m icrolitroslm I

5-1

(1 96 m icrolitroslm I )m icrolitroslm I)

(Blanco)(0.39microlitroslml)

O

10

20 Tiempo en horas

30

40

LactobacilluFpentmus en presencia de aceite 0.039 mVml de medio esencial de cebolla

Ladobacillus penlasug en presmcia de aceite esencial de cebolla49.7 d m 1 de medio

O. 1 4 7 5 ~ .

0.4438 R= 0.9329 '

f I1O

y=-0wOlx3+00088x'+0.057~-000831 R' = O 9437

O

10

20

30

40

io

M

30

40

Tiempo en horn

Tiempo en h o w

LactobacHluspentosus en presencia de aceite esencial de cebolla0.399 r h lde medio Jn5T

Ladobacilluspenhw en presencia de aceite esenaal de cebolla1% N m l de medio

a

3

cO10

y=OWOix3+00051x2+00832x-01914 R2 L. O 9376

+o0408

20

30

40

O

io

MTiempo en horas

30

40

Tiempo enhoras

Ladobacilluspentows Blanco5;

0.2173

R2= 0.9667O1 0

20

3)

40

20

30

40

-1

Tiempo en horas

102

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y CEBOLLA,EFECTO BACTERIOSTATICO, CAFL4CTEMZACl6N QUfMlCA Y ANALISIS SENSORIAL

Tabla 20.

Ecuaciones decrecimientode Lactobacillus pentosus,punto terico mximo, rea bajo la curva a horas y porcentaje de inhibicin tomando 30 como referencia la menor rea (ajo a 196 pVml).

..

.

" "

V.3.2. Pseudomonasfragi Tambin para lasPseudomonasfiagi la mxima inhibicin se alcanza conel mayor nivel probadode196pVml. Calculadopartir las a de ecuaciones obtenidas las con

regresiones y con el aceite esencial de ajo al mximo nivel probado como referencia de la mxima inhibicin. El intervalo seleccionado h e de 24 horas ya que a diferencia deL.

pentosus, P.@a@ tiene crecimiento ptimo en la temperatura de 19 "C por lo que llegams rpidamente al punto mximo y por consiguiente a la fase estacionaria en un intervalo ms corto de tiempo. Para el nivel mximo probado, el resultado indica que con cebolla se logra mayor rea, comparndola con o lo es es queigual,menos inhibidora crecimiento del celular el rea respecto ajo. de Aunque debe se sealar cuando que se

combinan los aceites en proporcin 1:l surge el efecto sinrgico en la inhibicin en ste nivel de concentracin. En el nivel de 49.6 y 3.9 pVml no hay diferencias considerables en cuanto a las reas nuevamente esel ajo el que tiene el mayor porcentaje de inhibicin conlo que se puede suponer que no

haydiferenciausarelnivel

de 3.9 a respecto de 49.6 0.39 y 0.039 pVml el

pVml. Finalmente, en el caso de las concentraciones menores de

fenmeno contrario a la inhibicin se presenta con lo que se favorece el desarrollo celular y es posible que ello se deba a la utilizacin de los compuestos presentes en los aceites durante los procesosmetablicos, al compararlosaceitesduranteestefenmeno,la cebolla induce an ms crecimiento que el ajo (Tablas 21 y 22, Figura 29). el

Tabla 21.

Comparacin de reas y porcentajes de inhibicin a 24 horas enPseudomonasJizrgi.

104

ACElTES ESENCIALES DEATO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIZACI6NQ m C A Y ANLISIS SENSORIAL

Figura 29. Curvas ajustadas de crecimiento de Pseudomonasfragi

7 6 --

P s e u d o m o n a s fragi en presencia de aceite esencial de ajor-Poly. -Poly. -Poly. -Poly. -Poly.

(0.039m icrolitrosllml)(0.39microlitrosllml)(3.9 m icrolitrosllml)

O

5( I

5 " 4"

3

3

H ii 9

3 "

( 4 9 . 6 microlitrosllml) (1 96 m icrolitrosllm I)

2 "1"

O

O

10

20

30

i

-Poly.

(Blanco)

Tlern P O e n h o r a s

0

5

10

15

20

25

30

35

T l e m p o en horas

Pseudomonas tragt en presencla de aceite esencial de ajo 0.39 pllml7 T

Pseudomones

m en presencia de aceite esencial idb ajo 188 plhnl

'T

10

20

30

Ti.mpo .nuor..

Pseudomonas tragi en presencla de aceite eSenCial de ajo 3.9 pllml67

Psaudomonas tragi Blanco

*l

y = 4 O O O d + O 02072- O 0 2 4 6 ~ O 0412 R' = O 98730

-

y

= -0.0004x' 1 O 0155x'+ O 0545x - O 0478R ' = 0.9701

10

20Tlompo en home

"I " "

..

..

""

"

L

.

. "." . ." l

"

-..

Figura 29.

Curvas ajustadas de crecimiento de Pseudomonas fragi (continuacin)P s e u d o m o n a s tragi en presencia de aceltes esenciales de ajo-+cebolla ( 2 : l )

7

7

O

5

io

15

30 20

25

35

TIem p o o n h o r a s

Pseudomon8s fragi en P n s e n c h de acelte esenchl de ajo 0.039 pNml

PSWdOmOn8S fragi en presencla de aceite esencial de ajo+cebolla( M )4S.S pllml

Y = -0 0006~+ O 023% f O 0046~. 1234 O R 2 = 0.9622

,O

~/#10

~=-O0003~+0.0i23x+0.07115x-oi508 !?=O974 20

30

nempo m Horas

Pssudomona8 h

g / en presencia de aceite esencial de rp+ceboUa (2:l) 196 pUml

T

i 41y = -0 0005~+ O 02079 + O 005h O 0447 R2 = O 9876

E 4 1

-

0.0089

Pseudomonas fngi en presench de .celta esencial de ajo+cebolla( 2 1 ) 3.9 pllml

Pseudomonas f n g i Blanco

e

6T54

eTI35

4

y=-O.OOO4r+OOi7lr+I10$47r.00157R1

O

0059

O

o O10

20Tiempo en horas

30

106

ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTTICO, CARACTERIzACI6NQUhICA Y ANALISIS SENSORIAL

Figura 29. Curvas ajustadas de crecimiento de Pseudomonasfrugi (continuacin)P s e u d o m o n a s fragi en presencia de aceite e s e n c i a l de ajo+cebolla ( 1 : l )

I

"Poly

(O 038 m ~ c r o I ~ t r o s l 1I) m (O 3 9 microlltrorilml)

-Poly

-Poly(3.9

m~crolitrorllmI)

-Poly.

( 4 9 6 m icrolitrosllmi)

-Poly

(196 mrcrolitrosllml)

-Poly30

(Blanco)

O

5

10

15

20

25

35

Tlem po e n horas

pseudomonas mgl en presencia de aeelta esencialde ajo+ceboAa (1:l) 0.039 pllmi

Pseudomonas h g l en praranch de acelte esenclal da ajo+CebOll8 (1:l) 49.6 pllml

e5

--

y = -0.0008x3 + O 0 2 4 ~O~0 0 8 9 ~ . OB05 O R' = O 9925

-

y * 4.00032+ O 012 + O 1157x - 0 2074 R' = O 9514

O

10

20

30

O

51 5

1 0

20T i p o en hon.

25

30

35

,

Tiempo en horas

I

Pseudotmnes f @ en p m i a de aceite s e n c i a l n e de ap+cebolla (1:l) 0.39 PUml65 --

plsudomne8 fmgi en presencis de aceite esencial de ajo+cebollp (1:l) 196 rJhnl57

.'

. I

y = - o c m & + O . d + O . ~ . .0.1724

y = -o

wmx' + 0.m332- 0.0258x - 0.0535R2=OS91i

R' = O.gs38I

O

10

20

30

O

5

1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5Tkmpo an H r s od

Tiempo enhoras

1I

Pseudomonas h g l e n pnsancia da acelte esencbl de

P s e u d o m o n a s fragl Blanco

a)o+cebolla (1:l) 3.9 pllml'T

6 T

y = -0.0006x3 + 0.0256~' 0 . 0 4 5 2 ~ 0.0681 . R' = 0.9688

-

y = -0 0 0 0 4 ~ + O 0 1 5 4 ~ O 0 5 6 2 - O ' +~ R ' = O 9777

0561

O

5

10

15

20

25

30

35

ACEITES ESENCIALES DEAJO Y CEBOLLA, EFECTO BACTERIOSTATICO,CARACTERJZ~CI~N QUhICAANLISIS SENSORIAL Y

107

Figura 29. C r a de crecimiento de uvs Pseudomonasfragi (continuacin)Pseudomonas fragi en presencia de aceites esenciales de ajo+cebolla (1:2)7 7

-Poly

(0.39 mrcrolitrosllml)

"-Polyt .

(O 0 3 9 m ~ c r o l i r r o r l l r n l

I

1

-Poly

(3 9 m Icrolltroallrn I)

-Poly

(49

E

rncroltrosllrnl)

-Poly

(196 mIcrolltrosllrnI)

-PolyO15

(Blanco)

5

10

20

25

30

35

Tlem

PO

en horas

PSeUdOmon8S ?rag/

en prerencla de acelte eaenclal de ajoccebolla (1:2) 0.034 pllml

Pseudomonas fragl en preseneh de .celta esanclal de ajo+cebolla (1:Z) 49.6 pllml

-

y~00005x'+001951?+0Dd2lx-01488 R' = 0.9767

O O510

i

15

20

25

30

35

Tiempo m h n e .

Pseudomonas fragl en prosoncia de rcelt. esencial da aio+cebolla (f:2) 0.39 MUml7 T

y

= -0 0 0 0 4 ~ ' 0 . 0 1 7 8 ~ ~ . 0 5 2 7 ~ O 1284 0 U= OS884 'f f

O

5

10

15

20

25

30

35

Tiempo an horas

5. liOO

f :f.10

a

7-

20 T l m m en horas

30

O

ACEITES ESENCIALES DE AJO Y C E B O L ~ EFECTO BACTERIOSTATICO,

CARACTERIZACI~N QWCA Y ANLISIS SENSORIAL

Figura 29. Curvas ajustadas de crecimiento de Pseudomonasfrugi (continuacin)Pseudomonas fragi en presencia de aceite esencial de cebolla

-Poly.

(0.039 rnlcrolitrosUml)

-Poly.

(3 9 rnlcrolltrosllrnl)

1

1-Poly -Poly

Poly. (49 6 microlitrosllrnl)

(196 rnlcrolltrosUrnI)

(Blanco)

O

5

10

15

20

25

30

35

Tiempo en horas

Pseudomonas fmgl en pnsench de aceita esencial de cebolla 0.039 pllml65 7

Pseudomonas fragl an presanola da aceite *rrnclal de cebolla 49.6 fillml

1:3'1

e

5

r2025

~=-OO004x~r00158x'+O.iilix-02037 R 2= 0.97430 ~

O

I

I

O

5

10

15

20

25

30

35

O

5

10

I5

30

35

TImpo m horas

Ti.rnP0 .nuor..

I

Pseudomonas fmgl en presencie de aceite esenclal de cebolla 0.39 pUml

Pseudomonaa h g l en presencla de aceite esenclal de cebollm la6 pllml

7T

'T

y=-O0003x'+0.0124~+OO.1l67x-O2542 = O 0862

I?'

y~-0.0003x1*0.0i~'+0.1191)x-02106 R=. o 9751

io

20

30

Pseudomonas fngi en prasench de aceite esenclal de cebolla 3.9 pllml

Pseudomonas fmgl Blanco

7 T

Tabla 22.

Ecuacionesdecadacurvadecrecimientode Pseudomonasfragi, punto 24 terico mximo, rea bajo la curva a horas y porcentaje de inhibicin tomando como referencia el nmero menor (ajo a 196 pVml).

Koningsberg(1992)indicqueuninhibidor

es una molculaqueinterviene

directamente sobre alguna parte de cadena oxidativa mitocondnalen dos mecanismos, la el primero; puede ser unindose a alguna subunidad especfica O al@ grupo prosttico, el segundo puede ser compitiendo con los donadores y aceptores naturales por 10s sitios especficos de oxido-reduccin. Para el caso especfico de las sustancias encontradas en 10s aceites esenciales es imposible determinar cual o cuales son las que tienen el mayor efecto en los mecanismos propuestos, aunque se atribuye a la alicina su mhximo efecto (Feldberg y col. 1988), pero si es un hecho que los resultados indmn que con el aceite esencial de ajo se logra mayor inhibicin del crecimiento celular y como consecuencia una disminucin en los sistemas metablicos celulares y enzimticos recopilados en la

un Tabla 6 de la presente tesis, aunque hay bacterias resistentes segn reporte de Kyung ycol. (1996). Hay varios mecanismos de accin de los compuestos azufrados de ajos

y

cebollas que incluyen entre otros, la alteracin de los puentes disulfuro en protenas, la modificacin del potencial redox en la cadena del flujo de electrones, alteracin