Upload
quito
View
32
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Fototermalna antitumorska aktivnost grafenskih nanočestica i ugljeničnih nanotuba pobuđenih zračenjem bliske IC oblasti. S. Misirlić Denčić, Z. Marković, B. Todorović-Marković, D. Kepić, K. Arsikin, Ž. Stanojević, N. Zogović, M. Dramićanin, V. Trajković. Uvod. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
S. Misirlić Denčić, Z. Marković, B. Todorović-Marković, D. Kepić, K. Arsikin, Ž. Stanojević, N. Zogović, M. Dramićanin, V. Trajković
Fototermalna antitumorska aktivnost Fototermalna antitumorska aktivnost grafenskih nanočestica igrafenskih nanočestica iugljeničnih nanotuba pobuđenih ugljeničnih nanotuba pobuđenih zračenjem bliske IC oblastizračenjem bliske IC oblasti
Uvod
U okolnostima nemogućnosti primene hirurške terapije, selektivna ablacija malignog tkiva toplotom je efikasna alternativna terapijska metoda.
Nažalost, glavne termičke ablativne tehnike (laser, ultrazvuk, mikro-talasi i radio-talasi) ne poseduju same po sebi selektivnost prema malignim ćelijama.
Uvod
U skladu sa tim, neophodno je povećati osetljivost malignih ćelija na iradijaciju u cilju povećanja efikasnosti i smanjenja toksičnosti pri primeni termalne ablacije tumorskog tkiva.
Jedna od mogućih, obećavajućih strategija fototermalne terapije maligniteta je upotreba nanočestica u cilju efikasne konverzije energije zračenja bliske IC oblasti u vibracionu energiju i sledstvenu toplotu koja ubija maligne ćelije.
Uvod
Upotreba zračenja bliske IC oblasti u opsegu 700-1000 nm za indukciju hipertermije je posebno interesantna, obzirom da biološki sistemi uglavnom nemaju hromofore koje mogu apsorbovati zračenja ovih talasnih dužina.
Uvod
Ugljenične nanotube (CNT) su cilindrične strukture do nekoliko stotina nanometara u dijametru, dužine nekoliko mikrometara, koje se sastoje od atomski-tankih listića ugljenika koji su zovu grafen.
Poslednjih par godina proučavanje osobenosti grafena ukazuje na svojstva koja prete da ugroze dominaciju CNT u nanotehnologijama, i otvaraju mogućnost primene grafena u biomedicini.
Uvod
Ipak, za razliku od potvrđenog fototermalnog antitumorskog delovanja CNT, efekti grafenskih nanočestica na ćelije tumora do danas nisu razjašnjeni.
Samo jedna skorašnja studija (Nano Lett 2010;10:3318) na mišjem modelu je pokazala da intravenski aplikovane grafenske nanočestice smanjuju veličinu tumora nakon hipertermije izazvane zračenjem bliske IC oblasti.
Uvod
Ipak, dva vrlo važna pitanja ostala su do danas bez odgovora:
1. Koji molekularni mehanizmi stoje u osnovi grafenom-posredovanog fototermalnog antitumorskog dejstva?
2. Kakva je fotermalna efikasnost grafena u poređenju sa CNT?
Cilj istraživanja
U ovom istraživanju poređeno je fototermalno antitumorsko dejstvo grafenskih nanočestica i ugljeničnih nanotuba pobuđenih kontinualnim IC laserom talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model „RLTMDL-808-1 W“proizvođača „Roithner LaserTechnik“), u trajanju od 30-300s.
Materijal i metode
U eksperimentima su korišćene stabilne vodene suspenzije sledećih nanočestica:
1. Polivinil-pirolidin grafenskih nanočestica (GPVP)
2. Ugljeničnih nanotuba funkcionalizovanih sa DNK- (CNTDNA)
3. Ugljeničnih nanotuba funkcionalizovanih sa natrijum dodecilbenzensulfonatom (CNTSDBS)
Materijal i metode
“Atomic force microscopy” (AFM) merenja su izvršena na AFM mikroskopu (Quesant Instrument Corp. Agoura Hills, CA).
UV-vis spektralna analiza nanougljeničnih suspenzija je vršena u opsegu talasnih dužina 500-1100 nm pomoću Avantes UV-vis spektrofotometra na 20°C uz automatsku korekciju za rastvarač (voda).
Materijal i metode
Iluminacija je vršena kontinualnim IC laserom talasne dužine 808 nm (2 W/cm2, model „RLTMDL-808-1 W“proizvođača „Roithner LaserTechnik“), u trajanju od 30-300 s.
Porast temperature je registrovan termoparom uronjenim u suspenziju tako da nije bio direktno izložen laserskoj svetlosti.
Analiza antitumorskog delovanja nanočestica je izvršena na ćelijskoj liniji humanog glioma (U251).
Materijal i metode
Za procenu vijabiliteta korišćeno je bojenje kristal violetom (CV) i MTT.
Analiza molekarnog mehanizma antitumorskog delovanja nanočestica (apoptoza/nekroza, oksidativni stres i depolarizacija mitohondrija) vršena je primenom protočne citometrije.
Rezultati
Karakterizacija ugljeničnih nanomaterijala
Large scale AFM images Small scale AFM images
Karakterizacija grafenskih nanočestica
Surface profile
Analiza dobijenih slika minimalno 200 grafenskih nanočestica je ukazala da se u suspenziji GPVP nalaze kao:
1. “single layer” čestice dijametra do 50 nm2. “bilayer” čestice dijametra 50-70 nm3. “multilayer” čestice dijametra 70-360 nm
Dominirale su “bilayer” čestice dijametra oko 70 nm debljine 2 nm.
Karakterizacija grafenskih nanočestica
Small scale AFM images
Surface profile
CNTSDBS
Large scale AFM images
Karakterizacija ugljeničnih nanotuba
Većina nanotuba CNTSDBS je u suspenziji formirala snopove prosečne dužine 1.6 µm, dijametra oko 60 nm i visine 3 nm.
Morfologija CNTDNA je bila slična.
Karakterizacija ugljeničnih nanotuba
Na osnovu koncentracije nanomaterijala u vodenoj suspenziji i njihove mase izračunata je koncentracija nanomaterijala.
Ona je iznosila oko 1015 grafenskih nanočestica/l u suspenziji koncentracije 20 µg/ml i oko 2 x 1012 CNTSDBS/l u suspenziji iste koncentracije.
Karakterizacija ugljeničnih nanomaterijala
Rezultati
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
UV-vis analiza absorpcije zračenja bliske IC oblasti od strane ugljeničnih nanomaterijala
CNT više apsorbuju svetlost bliske IC oblasti u odnosu na GPVP.
Kontrolni rastvori PVP, DNA i SDBS nisu apsorbovali zračenje bliske IC oblasti.
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
Suspenzije svih ispitivanih nanomaterijala su pokazale porast temperature nakon ekspozicije zračenju bliske IC oblasti koje je bilo zavisno od njihove koncentracije kao i od dužine trajanja ekspozicije.
Grafenske nanočestice su pod istim uslovima generisale veći porast temperature u poređenju sa CNT!!!
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
GPVP
65
∆TG ~ 35°C ∆TCNT ~ 18°C
48
CNTDNA
∆TG/ ∆TCNT ~ 2
65
49
GPVP CNTSDBS
∆TG ~ 35°C ∆TCNT ~ 19°C
∆TG/ ∆TCNT ~ 2
Sa druge strane, kapacitet povećanja temperature nakon apsorpcije zračenja bliske IC oblasti je bio skoro identičan za oba tipa CNT.
Iz ovoga se može zaključiti da način preparacije ovih nano suspenzija ne utiče na njihovu fototermalnu senzitivnost.
Veća fototermalna efikasnost grafenskih nano čestica verovatno se može objasniti njihovom boljom disperznošću
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
Uzimajući u obzir termodinamička, optička i geometrijska svojstva ugljeničnih nano materijala, upotrebili smo sledeće jednačine:
∆Q = toplotam = masa nanočesticec = toplotni kapacitet∆T = porast temperatureN = broj čestica u suspenzijim1 = masa reprezantativnog
grafenskog “bilayer”-a tj. ugljeničnog snopa nano tuba
A = apsorpcija zračenja (808 nm)
S = površina nano materijala koja apsorbuje zračenje
Ef = efikasnost apsorpcije (2.3% za “layer” grafena tj. 20% za snop CNT)
(1)
(2)
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
Aproksimovali smo da je razvijena toplota nakon zračenja nanočestica i CNT bliskom IC oblsti istog reda veličine.
Na osnovu jednačina (1) i (2) izvedena je jednačina za odnos relativnog porasta temperature za grafenske nanočestice i CNT:
dCNT = prosečan dijametar snopa CNT
hG = visina grafenske nanočestice
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
Izračunata vrednost odnosa ∆TG/ ∆TCNT je ~ 3.5 i slična je eksperimentalno dobijenoj vrednosti ~ 2.
Dakle, iako CNT imaju bolju fototermalnu senzitivnost, generišu manju količinu toplote u odnosu na grafenske nanočestice.
CNT, dakle, imaju tendenciju da agregiraju i formiraju snopove usled čega su u rastvoru manje dispergovane od grafena.
Fototermalna senzitivnost grafena i CNT
Rezultati
Fototermalna antitumorska efikasnost grafena i CNT
Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT na U251 ćelije
Dozno i vremenski zavisna citotoksičnost prema U251 ćelijama glioma
GPVP CNTDNA
Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT na U251 ćelije
U skladu sa izmerenim skokom temperature nakon primene zračenja bliske IC oblasti, grafenske nanočestice su pokazale nekoliko puta bolju efikasnost u ubijanju tumorskih ćelija u odnosu na CNT !!!
Fototermalno antitumorsko delovanje grafena i CNT na U251 ćelije
Rezultati
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog
antitumorskog delovanja
Nekroza i apoptoza su dva glavna modaliteta ćelijske smrti koja se u potpunosti razlikuju po mehanizmu nastanka i morfološkim promenama koje ih prate.
Nekrozu karakteriše gubitak integriteta ćelijske membrane, stimulacija imunološkog odgovora i oštećenje okolnih zdravih ćelija.
Apoptozu karakteriše fragmentacija nuklearne DNK u odsustvu oštećenja membrane, koja eksponira fosfatidilserin.
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja
U251 su bile izložene zračenju 3 min u prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja
Test aktivnosti LDH je ukazao na porast permeabiliteta ćelijske mebrane u 50% ćelija (49.2 ± 17.3; n=2)
Može se zaključiti da nekroza nije jednini mehanizam fototermalnog antitumorskog delovanja grafena.
Molekularni mehanizmi grafenom- indukovanog fototermalnog antitumorskog delovanja
FACS analize (morfologija ćelija)
Smanjenje veličine ćelija Porast granuliranosti ćelija
APOPTOZA24h
FACS – PI (fragmentacija DNK)
24h
FACS – Ann/PI (eksternalizacija fosfatidilserina)
Ann+/PI+ Ann+/PI+
Ann+/PI- Ann+/PI-Ann-/PI- Ann-/PI-
Ann-/PI+ Ann-/PI+
ZDRAVE
NEKROTIČNE KASNA APOPTOZA
RANA APOPTOZA
Ukupan broj Ann+ ćelija u kontroli 9.4% a u tretmanu 95.5%
24h
FACS – ApoStat (aktivacija kaspaza)
U251 su bile izložene zračenju 3 min u prisustvu/odsustvu GPVP (10µg/ml)
24h *p< 0.05 ANOVA
FACS – DePsi (depolarizacija mitohondrija)
4h
Gubitak mmp (Ψ)
*p< 0.05 ANOVA
FACS – DHR (produkcija ROS)
4h *p< 0.05 ANOVA
FACS – DHE (produkcija superoksida)
4h *p< 0.05 ANOVA
Zaključci:
1. Grafenske nanočestice pokazuju fototermalno antitumorsko dejstvo nakon pobuđivanja zračenjem bliske IC oblasti.
2. Bolja disperznost i manja veličina grafenskih nanočestica je odgovorna za superioran fototermalni antitumorski efekat u odnosu na CNT
3. Mehanizam antitumorskog delovanja je kombinacija apoptoze i nekroze usled indukcije oksidativnog stresa i oštećenja mitohondrija.
Zaključci:
S obzirom na veliku površinu, malu toksičnost i jeftinu proizvodnju, grafenske nanočestice mogu biti potencijalni kandidati za fototermalnu terapiju maligniteta.
REALIZATORI ISTRAŽIVANJA
Katarina ArsikinAleksandar Pantović
Rukovodilac: Vladimir Trajkovic