Upload
neveah
View
125
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
FORELESNINGSPLAN DNA replikasjon Prokaryot: 2t, 16/2 Eukaryot: 2t, 25/2 DNA reparasjon 2t, 1/3 Erik Boye Avdeling for Cellebiologi Det norske Radiumhospital HF 22934256 [email protected]. Det sentrale problemet med cellesyklus. VEKST. CELLEDELING. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
FORELESNINGSPLAN
DNA replikasjonProkaryot: 2t, 16/2Eukaryot: 2t, 25/2
DNA reparasjon 2t, 1/3
Erik BoyeAvdeling for CellebiologiDet norske Radiumhospital [email protected]
Det sentrale problemet med cellesyklusDet sentrale problemet med cellesyklus
VEKST CELLEDELING
Hver dattercelle må få tildelt alle essensielle komponenter, som mitokondrier, ribosomer, organeller, etc. Disse er til stede i flere kopier, og da er det tilstrekkelig med en tilfeldig fordeling mellom dattercellene
Hver dattercelle må få et fullstendig sett av alt kromosomalt DNA. Kromosomene må derfor bli duplisert, og de to kopiene må segregeres til hver datter. Denne prosessen må være helt nøyaktig og presist regulert.
How does DNA replicate?How does DNA replicate?
Parent DNANew DNA
KEY
Parent double helix
Possible modes ofDNA replication
(a) dispersive
(b) semi-conservative
(c) conservative
Watson & Crick (1953) Nature 171: 737-738.“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.”
Parent DNA strand(15N)
New DNA strand (14N)
HH
HL
LL
HH
HL
LL
HH
HL
LL
The Meselson-Stahl experiment (1958)Meselson and Stahl (1958) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44: 671-682.
The Meselson-Stahl experiment (1958)Meselson and Stahl (1958) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44: 671-682.
E. coli cells were grown for many generations in ‘heavy’ medium (containing 15N, a heavy isotope of nitrogen). Cells were then transferred to ‘light’ medium (containing 14N). DNA samples were analysed by density gradient centrifugation.
Heavy medium Light medium,1 generation
Light medium,2 generations
Inter-pretation:
Hvilke oppgaver må løses under DNA replikasjon?
- Kopiering av alle DNA-sekvenser- Kopiering kun EN gang pr celledeling, hverken mer eller mindre.- Nøyaktig kopiering gir genetisk stabilitet.
Hvordan oppnå dette?
- Definerte startpunkter (origins)- Finregulering av initiering- Nøyaktige polymeraser- Reparasjonsmekanismer- Presis segregering
Mechanism of DNA synthesisMechanism of DNA synthesis
hydrolysis
deoxyribose
phosphate
Bases
adenine
thymine
cytosine
guanine
hydrogen bond
release ofpyrophosphate
OH3’
3’5’
5’ OH
5’
3’
triphosphate
Replikasjonsgaffel
?
DNA polymeraser kan bare syntetisere 5’-3’.Hvordan går det med to antiparallelle tråder?
Hvordan replikere en DNA-dupleks med enzymer som bare virker i én retning?
Vist eksperimentelt av Reiji Okazaki i 1968
Syntese av Okazaki-fragment og ny priming
Semidiskontinuerlig replikasjon
Elektronmikroskopisk bilde av replikerende D. melanogaster-DNA som bekrefter Okazaki-modellen (Kreigstein & Hogness 1974)
Sammensetning av primosomet
DNA polymerase III: En komplisert maskin
DNA polymerase III: En komplisert maskin
Andre proteiner som deltar i replikasjonen• DNA ligase - Covalently closes nicks in double-stranded DNA.
• Primase - the enzyme responsible for catalyzing synthesis of RNA primers.
• Clamps and clamp loaders - Protein from the DNA polymerase III holoenzyme complex holds the polymerase to the DNA. A multisubunit entity called the complex functions as the "clamp loader".
• Single-strand DNA-binding (SSB) proteins – stabilizes ssDNA in the replication fork
• Helicases – unwinds DNA by catalyzing the ATP-dependent unwinding of double-strand DNA. E. coli contains at least 6 different helicases--some involved in DNA repair and others in conjugation. The principal helicase in DNA replication is DnaB, which interacts with DnaG and other proteins to form the primosome.
• Topoisomerases - Bidirectional replication of the circular E. coli chromosome unwinds about 100,000 base pairs per minute. Relief of this torsional stress is essential for DNA replication to occur. Topoisomerases are enzymes with a "swivel" mechanism that can relieve this stress.
Opptvinning av DNA med DnaB og SSB
The DnaB helicase
”Clamp loader”-komplekset monterer β-subenheten på DNA
Clamp og Clamp loader
Replikasjonsgaffel hos E. coli
DNA-replikasjon i E. coli: Trombonemodellen
DNA topoisomeraser endrer linking number (supercoiling)
Hvordan oppnås høy nøyaktighet?
• Balansert nivå av de fire dNTP• Polymerasereaksjonen har høy nøyaktighet• 3’-5’-ekonukleaseaktiviteten til Pol I og Pol
III fjerner feil som polymeraseaktiviteten innfører
• En rekke reparasjonssystemer tar seg av gjenværende feil
Korrekturlesning: DNA polymerase I fjerner et feilinkorporert nukleotid
5’-3’-eksonukleasedomenet i DNA polymerase I fjerner nukleotider i 5’ –enden av et nick
Krav til initiering:
-Aktivt initiator-protein (DnaA)
-Supercoilet substrat
- AT-rikt område
Replikasjonsorigo: oriC
E. coli:
Genome, 4 Mb = 4 x 106 bpFork rate approx. 800 bp / secReplication time approx. 40 minutes = 2,400 secs
Amount replicated by 2 forks in 40 mins = 2 x 2400 x 800 = 3,840,000 bp (~4 Mb)
The rate of DNA replication
Terminering av replikasjonen
TerG
DNA metylering
I E. coli kan både cytosiner og adeniner bli enzymatisk metylert.
Dcm metylasen lager 5-metylcytosinDam metylasen lager 6-metyladenin
Begge virker etter replikasjon.Cytosin metylering: Funksjon ukjent/restriksjonAdenin metylering er viktig for
- Kontroll av DNA replikasjon- Reparasjon av DNA-skader- Genregulering- Beskyttelse mot fremmed DNA (?)
Identifikasjon av SeqA
oriC på et plasmid kan drive replikasjon
Metylert oriC Dam+ : +++
Metylert oriC Dam- : ---
Altså: Hemimetylert oriC blir ikke initiert.En mutant som mangler den negative regulator,vil tillate initiering av hemimetylert oriC, slik at
Metylert oriC Dam- SeqA+: +++
Umetylert oriC Dam- : +++
Fullt metylert oriC
Replikasjon gir hemimetylert oriC
Elongering og separasjon
Sekvestrering med SeqA (membran?)
Remetylering
Frigjøring
DnaA regulerer initieringstidspunktet.
Økende DnaA-konsentrasjon
Tidligere initiering og ved lavere cellemasse
(Løbner-Olesen et al, Cell 1989)
Men er DnaA nødvendigvis REGULATOREN in vivo?
Three levels ofnegative controlof DNA replication in E. coli:
1. Inactivation of the DnaA initiator
2. Sequestration ofthe origin of replication
3. Titration of DnaAto other chromosomal sites
FLOW CYTOMETRY
Initiering av DNA replikasjon er avhengig av
- Proteinsyntese- RNA syntese
Hemming av disse prosessene vil derfor gjøre at initiering stopper, mens elongering fortsetter.
Sluttresultat: Antall hele kromosomer = antall oriC
Asynkroni:
Når IKKE alle origins i en celle blir initiert samtidig
Antall kromosomer8 8
88
44A
ntal
l cel
ler
50 min
30 min
20 min
Mangel på initieringskontroll i en seqA mutant
seqA+ seqA-
(Lu et al, Cell 1994)
Del
ing
Del
ing
Del
ing
B C40 min
D20 min
En generell cellesyklus i E. coli
C og D er konstante.Hvordan går det når doblingstiden blir under 60 min?