Fluorescencine naviku diagnostika

1219Medicina (Kaunas) 2004; 40(12)

Fluorescencinė navikų diagnostika

Ričardas Rotomskis1, 2, Giedrė Streckytė1

Vilniaus universiteto 1Lazerinių tyrimų centras, 2Onkologijos institutas

Raktažodžiai: fluorescencija, savitoji fluorescencija, endogeniniai fluoroforai, endogeniniaiporfirinai.

Santrauka. Straipsnyje pateikiama informacija apie audinių savitąją fluorescenciją, jos kilmębei galimybes panaudoti ją navikinėms ligoms diagnozuoti. Aptariamos sveikų ir navikinių audiniųsavitosios fluorescencijos ypatybės ir jų taikymas audinių atpažinimui. Pateikiami in vivo matuotisveikos odos ir apgamų fluorescencijos spektrai. Atlikta skirtingų eksperimentinio navikohepatomos A22 sričių lyginamoji savitosios fluorescencijos spektrų skirtumų analizė. Nustatyta,kad skirtingų augimo stadijų navikiniai audiniai turi skirtingus savitosios fluorescencijos spektrus.Apibendrinus gautus eksperimentinius ir literatūros duomenis, daroma išvada, kad audiniųsavitosios fluorescencijos spektrai suteikia papildomos informacijos, galinčios padėti atpažintisveiką ir navikinį audinį, tačiau galutinė išvada turi būti daroma atsižvelgiant ir į kitus požymius,nustatomus vizualinės apžiūros metu.

Adresas susirašinėti: R. Rotomskis, Vilniaus universiteto Lazerinių tyrimų centras, Saulėtekio al. 3 korp., 10222 VilniusEl. paštas: [email protected]

ĮvadasNavikinių ligų diagnozavimas, ypač naviko pa-

žeistų audinių atskyrimas nuo sveikų yra viena opiau-sių onkologijos problemų. Jai spręsti ieškoma ir naujųoptinių neinvazinių metodų, kuriuos naudojant būtųgalima nustatyti audinių būklę arba įvertinti įvairiusaudinių parametrus. Šie optiniai metodai dažnai vadi-nami „optine biopsija“, tačiau jie turi privalumą –galima apseiti be audinių mėginio išpjovimo ir gautiinformacijos apie audinį atliekant tyrimą in situ. Ži-noma, histopatologiniai tyrimai nepraras savo svarbos,tačiau tikslią vietą, iš kur imti mėginį, pirmiausia gali-ma nustatyti neinvaziniu optiniu būdu.

Iš optinių metodų labiausiai paplito fluorescen-ciniai (1–9). Susidomėjimą optinės biopsijos meto-dais stiprina jų neinvazinis pobūdis, didesnis jaut-rumas ir skiriamoji geba palyginus su įprastais diag-nostikos metodais: branduolio magnetiniu rezonansu,kompiuterine tomografija arba ultrasonografija. Tai-kant optinius metodus, šviesos signalai registruojamiir apdorojami iškart apžiūros metu, be to, tas pačiassritis galima tirti daug kartų.

Fluorescenciniai diagnostikos metodai pagrįsti au-dinio sudėtyje esančių molekulių fluorescencijos ma-tavimu. Biologinius audinius sudaro baltymai, nukleo-rūgštys, lipidai ir fluorescuojantys bei nefluorescuo-jantys chromoforai. Biologinių fluoroforų fluorescen-cija paprastai sužadinama ultravioletinio ruožo švie-sos, o fluorescuoja jie ultravioletinės ar matomos švie-sos spektriniame ruože. Fluorescencinės diagnostikos

metodai skirstomi į nesensibilizuotosios ir sen-sibilizuotosios fluorescencijos metodus. Nesensibili-zuotoji fluorescencinė diagnostika pagrįsta audiniųendogeninių fluoroforų optiniu sužadinimu ir jų fluo-rescencijos stebėjimu. Endogeninių audinio fluoro-forų skleidžiama fluorescencija vadinama savitąjafluorescencija. Jau gana seniai pastebėta, kad navi-kiniai audiniai ne tik savo morfologija, ląstelių formabei augimo greičiu, bet ir optinėmis savybėmis skiriasinuo sveikųjų. Ikinavikinių ir navikinių audinių fluo-rescencija skiriasi nuo sveikų audinių fluorescenci-jos. Sveikų ir naviko pažeistų audinių fluorescencijosspektrų skirtumų atsiranda dėl ligos sukeltų endo-geninių fluoroforų sudėties pokyčių. Audinių fluo-rescencijos spektrai dažniausiai esti platūs be ryškiųjuostų, nes biologinius audinius sudaro daug įvairiųmolekulių, fluorescuojančių skirtingose spektro sri-tyse, todėl vienareikšmiai įvertinti sveikų ir navikopažeistų audinių sritis pagal jų savitosios fluorescen-cijos spektrus gana sunku. Nors savitosios fluores-cencijos metodai nėra tokie tikslūs ir jautrūs kaip sen-sibilizuotos fluorescencijos, jie gali būti sėkmingaitaikomi ankstyvajai navikų diagnostikai (10–14).

Siekiant geresnio sveikų ir pažeistų audinių fluo-rescencijos kontrasto, vartojamos egzogeninės fluo-rescuojančios medžiagos, geriau besikaupiančios na-vikiniuose audiniuose. Tomis medžiagomis gali būtiir fotosensibilizatoriai, kurie taikomi fotosensibili-zuotajai navikų terapijai (FNT). FNT – tai naujas na-vikų gydymo metodas, pagrįstas fotosensibilizatoriaus

1220

sužadinimu šviesa, t. y. sukeliant citotoksines reak-cijas. Fluorescencinės diagnostikos atveju naudojamosdaug mažesnės sensibilizatorių ir šviesos dozės arbaparenkami tokie sensibilizatoriai, kurie fotochemiškaineaktyvūs.

Sensibilizuotosios fluorescencinės diagnostikosmetu, panašiai kaip ir FNT, sensibilizatorius varto-jamas sistemiškai arba išoriškai. Po kelių ar kelioli-kos valandų (nelygu, kokia sensibilizatoriaus pri-gimtis) daugiau sensibilizatoriaus susikaupia navikopažeistuose audiniuose. Sužadinus tinkamo bangosilgio šviesa (bangos ilgis parenkamas toks, kurį geraisugeria sensibilizatorius) navike gausiau susikaupusįsensibilizatorių, matoma jo fluorescencija padedanustatyti naviko lokalizaciją įvairiuose organuose, pa-vyzdžiui, šlapimo pūslėje (15), virškinimo trakte (16)arba plaučiuose (17).

Fizikiniai fluorescencijos principaiOptinė biopsija, kurios duomenimis remiantis ga-

lima atpažinti audinius ir nustatyti jų pakitimus, pa-grįsta šviesos sąveika su audiniais. Šviesa su biolo-giniu audiniu gali sąveikauti įvairiai (1 pav). Krintantišviesa gali atsispindėti nuo audinio paviršiaus; prasi-skverbti per audinį, nesukeldama jame jokių vyksmų;būti sugerta audinio molekulių ir sukelti fotocheminesreakcijas; būti išsklaidyta audinyje, nes jis yra neho-mogeniškas; būti sugerta tam tikrų molekulių ir iš-spinduliuota kaip fluorescencija.

Šios audinyje esančios molekulės vadinamos fluo-roforais. Dar vartojamas terminas „pigmentai“, nes

daugelis audinio sudėtyje esančių fluoroforų yra spal-voti. Kaip pavyzdys pateikiamas širdies tarpskilve-linės pertvaros fluorescencijos vaizdas, išgautas ap-švietus ultravioletine šviesa (2 pav.) Paveiksle matyti,kad skirtingi audiniai spinduliuoja skirtingą šviesą,kurios bangos ilgis (spalva) priklauso nuo audiniųstruktūros ir audinyje esančių fluoroforų. Audiniai,turintys daugiau kolageno, elastino ar aromatinių ami-norūgščių (triptofano, tirozino), spinduliuoja mėlynąšviesą.

Visi fotofizikiniai ir fotocheminiai vyksmai prasi-deda audinio chromoforo (pigmento) molekulei sugė-rus šviesos fotoną. Sugerties (absorbcijos) metu fo-tonas savo energiją gali atiduoti molekulei, kuri tampaelektroniškai sužadinta (3 pav. 1). Kambario tem-peratūroje beveik visos molekulės yra pagrindinės

1 pav. Šviesos sąveika su audiniu

2 pav. Širdies tarpskilvelinė pertvaraVaizdas dienos šviesoje (A), vaizdas apšvietus mėlyna 366 nm bangos ilgio šviesa (B).

Išspinduliuota šviesa (fluorescencija)

Išsklaidyta šviesa

Išsklaidyta šviesa

Praėjusi šviesa Praėjusi šviesaIšsklaidyta šviesa

Krintanti šviesa Atspindėta šviesa

Išsklaidytašviesa

Išspinduliuotašviesa

(fluorescencija)

Ričardas Rotomskis, Giedrė Streckytė

Medicina (Kaunas) 2004; 40(12)

1221

(nesužadintos) būsenos (3 pav. S0). Tai būsena, kaimolekulės energija mažiausia ir elektronai išsidėstęenergiškai žemiausiuose molekulės lygmenyse. Suža-dinus molekulę, elektronas iš aukščiausio užpildytolygmens (S0) peršoka į aukštesnį neužpildytą energinįlygmenį (S(1...n.)), turintį didesnę energiją – taip mole-kulė sužadinama, tai reiškia, kad ji turi energijos per-teklių.

Sužadinti molekulę gali fotonas, kurio energija lygimolekulės elektroninių lygmenų energijų skirtumui:

Efotono = hν = E2 – E1 = DE,

kai: h yra Planko konstanta, ν – fotono dažnis, E1 ir E2nesužadintos ir sužadintos molekulės būsenų energijos(1).

Kiekviena elektroninė energinė būsena atitinka tamtikrą skaičių vibracinių lygmenų, o kiekvienas vib-racinis lygmuo – tam tikrą skaičių rotacinių lygmenų.Sugėrusi fotoną, molekulė sužadinama į aukštesnįdidesnės energijos lygmenį S(1...n.). Paveiksle pavaiz-duotoje Jablonskio daugiaatomės molekulės lygmenųdiagramoje (3 pav.) pažymėti galimi elektronų šuoliai

bei sužadintos molekulės energijos praradimo būdai.Sužadintoje molekulėje per labai trumpą laiką (10–13 s)elektronas iš aukštesnių didesnės energijos lygmenųnespinduliniu būdu peršoka į energiškai žemiausiosužadinto elektroninio lygmens nulinį virpesinį poly-gmenį, atiduodamas aplinkai energiją šilumos pavi-dalo (virpesinė relaksacija). Nespindulinis šuolis tarpelektroninių lygmenų vadinamas vidine konversija.Iš žemiausio sužadinto elektroninio energinio lygmensS1 galimi trys relaksacijos vyksmai: vidinė konversijaS1→S0 (3 pav. 3) (energija atiduodama aplinkai šilumospavidalo), interkombinacinė konversija S1→T1 (3 pav.4) (elektronas peršoka į tripletinę energinę būseną, iškurios molekulė gali sukelti fotocheminius vyksmus,kurie FNT atveju sukelia vėlesnę ląstelės žūtį) ir fluo-rescencija S1→S0 + hνfluorescencijos (3 pav. 2) – molekulėssugrįžimas į pagrindinę S0 būseną išspinduliuojantfotoną. Kaip tik ši audinį sudarančių molekulių iš-spinduliuota šviesa ir yra savitoji fluorescencija. Kiek-vieno fluoroforo savitoji fluorescencija pasižymi spe-cifinėmis charakteristikomis, kurios priklauso nuofluoroforo sąveikos su aplinkos molekulėmis, nuoaudinio struktūros ir audinyje vykstančių apykaitosprocesų. Ligos pažeistų audinių struktūra ir apykaitosprocesai dažniausiai būna pakitę, todėl sveikų ir pa-žeistų audinių savitosios fluorescencijos spektrai ski-riasi ir tai sudaro prielaidas audinius aptikti fluores-cencinės diagnostikos metodais.

Endogeniniai fluoroforaiBiologiniai audiniai silpnai fluorescuoja juos ap-

švietus tam tikro bangos ilgio šviesa. Įprastoje baltosšviesos aplinkoje akimi audinių fluorescencija beveiknematoma. Tačiau, žadinant reikiamo bangos ilgiošviesa ir matuojant spektrus jautriais spektriniais prie-taisais, galima užfiksuoti specifinį įvairių audiniųšvytėjimą. Audinius sudaro sudėtingas įvairiausių mo-lekulių mišinys, tačiau už audinių fluorescenciją at-sakingi keli fluoroforai (lentelė) (18), kurių fluores-cencijos spektrų juostos yra plačios ir persiklojančios,todėl tikslus šių fluoroforų atpažinimas yra sunkus.Tam dažnai padeda tinkamai parinktas fluorescencijosžadinimo bangos ilgis (19, 20).

Pagrindiniai biologinių audinių endogeniniai fluo-roforai – kolagenas ir elastinas (21) lokalizavęsi skai-duliniame jungiamajame audinyje. Kolageno fluores-cencijos smailė in vivo yra ties 330 nm, elastino – ties350 nm (22). Fluorescencijos smailės padėtis gali kistipriklausomai nuo audinio tipo. Jungiamajame audi-nyje kolageno fluorescencijos smailė yra ties 390 nm,elastino – ties 410 nm (18). Jungiamasis audinys, ku-riame daug kolageno ir elastino, pasižymi labai inten-

3 pav. Jablonskio daugiaatomės molekulėsenergijos lygmenų diagrama

Šviesos sugertis iš nesužadintos pagrindinės molekulėsbūsenos (S0) į elektroniškai sužadintas molekulės būsenas(S1...n) (1). Fluorescencija vykstant elektrono šuoliui iš že-miausios neužpildytos būsenos (S1) į pusiausvirinę būseną(S0) (2). Nespindulinė sužadintos molekulės relaksacija įenergiškai žemesnę būseną (3). Interkombinacinė konversijaiš sužadintos singuletinės būsenos (S1) į tripletinębūseną (T1), iš kurios vyksta fotocheminiai procesai (4).

1 Sugertis 2 Fluorescencija3 Vidinė konversija4 Interkombinacinė konversija

Ene

rgija

1 – sugertis2 – fluorescencija3 – vidinė konversija4 – interkombinacinė konversija



1222

syvia savitąja fluorescencija. Jungiamojo audinio fluo-rescencijos spektrai yra daug platesni negu grynųjųkolageno ir elastino spektrai.

Kiti endogeniniai fluoroforai, ypač svarbūs navi-kų fluorescencinei diagnostikai, yra su ląstelės me-džiagų apykaita susiję junginiai – tai redukuotas ni-kotinamidadenindinukleotidas (NADH) (23) ir fla-vinai (24), aptinkami mitochondrijose ir citoplazmo-je. NADH fluorescencijos smailė in vivo yra ties 500nm, flavinų – ties 550 nm. Kadangi navikiniuose au-diniuose vyksta intensyvesnė medžiagų apykaita,NADH fluorescencija tokiuose audiniuose gali būtikitokia negu sveikuose (25). Be to, sveikų ir navikiniųaudinių pH skirtingas, dėl to gali kisti redukuotos(NADH) ir oksiduotos (NAD+) formų santykis. Ka-dangi oksiduota forma fluorescuoja gerokai silpniau,mėlyna navikinių ir ikinavikinių audinių savitoji fluo-rescencija yra silpnesnė (23, 26).

Kiti endogeniniai fluoroforai – tai trumpabangėjespektro srityje fluorescuojančios aromatinės amino-rūgštys (triptofanas, tirozinas, fenilalaninas). Paprastaiaudiniuose fluorescuoja tik triptofanas, nes baltymi-nėje globulėje kitų aminorūgščių sugerta šviesos ener-gija yra perduodama triptofanui. Be minėtų biomo-lekulių audinių fluoroforais gali būti lipopigmentaibei endogeniniai porfirinai (27). Endogeninių porfi-rinų fluorescencijos spektrų fiksavimas tapo ypač svar-bus atradus endogeniniais porfirinais sensibilizuotąjąnavikų terapiją (28).

Sveikų ir navikinių audinių savitosiosfluorescencijos ypatybėsSavitąja audinių fluorescencija pagrįsta diagnos-

tika remiasi tuo, kad navikinių darinių fluorescencijaskiriasi nuo sveiko audinio (1,10,29). Daugumos fluo-roforų fluorescencijos charakteristikos yra susijusiossu tarpląstelinės medžiagos sandara ir medžiagų apy-kaita ląstelėje, todėl ir morfologiniai, ir citologiniaisveikų ir navikinių ląstelių pokyčiai, jų išsigimimas

gali būti nustatyti registruojant audinių fluorescenci-jos spektrus. Navikinių darinių diagnozavimas ir tiks-lus naviko ribų nustatymas susijęs su fluoroforų (trip-tofano, porfirino) koncentracijų pokyčiais, struktūri-niais (kolagenas, elastinas) pakitimais, kvėpavimograndinės aktyvumu (NADH, flavinai) arba šių poky-čių deriniais (30). Intensyvesnė triptofano fluores-cencija pakitusios histologijos audiniuose pastebėtatiek in vitro eksperimentuose (31), tiek in vivo diag-nozuojant šlapimo pūslės vėžį (20). Jungiamojo audi-nio fluorescenciją slopina jį dengiantis gleivinėssluoksnis. Epitelinės kilmės navikams (net ir anksty-vų stadijų) būdingas gleivinės sluoksnio sustorėjimas,dėl kurio susilpnėja jungiamojo audinio fluorescencija(32). Kadangi fluorescuoja tik redukuota NADH for-ma, oksiduotos-redukuotos formų koncentracijų po-kyčius, susijusius su ląstelių kvėpavimo grandinėsveikla, galima pastebėti registruojant NADH fluores-cencijos intensyvumą (33).

Pirmasis savaiminę raudoną eksperimentinių na-vikų fluorescenciją pastebėjo ir teisingai priskyrė jąnavike susikaupusiam porfirinui prancūzas A. Poli-kardas (34). Manyta, kad raudonai fluorescuoja iš-opėję navikai (35), todėl fluorescencija buvo priskirtaendogeniniams porfirinams (36). Nekrozinėse navikųzonose aptinkami endogeniniai porfirinai priskiriamibakterijų veiklai (37, 38). Šio tyrimo duomenimis, navi-kinio audinio nekrozinėse srityse nėra endogeninioporfirino (39). Tačiau greitai proliferuojančiose navi-kinio audinio ląstelėse kaupiasi endogeniniai porfi-rinai, kurie pasižymi fluorescencija raudonoje spektrosrityje. Navikinių audinių savitosios fluorescencijosspektruose (4 pav.) gerai matoma endogeninių por-firinų juosta 600–700 nm srityje. Nekroziniuose na-vikų audiniuose esantys mikroorganizmai iš 5-ami-nolevulino rūgšties gali sintetinti raudonai fluorescuo-jančius porfirinus (40). Manoma, kad navikiniuose au-diniuose dėl pakitusio metabolizmo (41) ir navikų hiper-vaskulizacijos (42) kaupiasi daugiau porfirinų (43, 44).

Lentelė. Endogeniniai fluoroforai

Žadinimo bangos Apytikslis fluorescencijosilgis, nm bangos ilgis, nm

Triptofanas 275 350 baltymaiKolagenas 335 390 jungiamasis audinysElastinas 360 410 jungiamasis audinysNADH 340 470 kvėpavimo grandinėFlavinas 450 520 kvėpavimo grandinėPorfirinas 405 635 bakterinės infekcijos,

hemo biosintezė

Fluoroforas Fluoroforo šaltinis



1223

Savitosios fluorescencijos pritaikymas navikųdiagnostikaiPirmasis darbas, kur buvo pastebėti sveikų ir na-

vikinių audinių savitosios fluorescencijos spektrų for-mos skirtumai, paskelbtas 1984 metais (1). Buvomatuota žiurkių inkstų, šlapimo pūslės ir prostatossveikų ir navikinių audinių bei pelių šlapimo pūslėssveikų ir navikinių audinių savitoji fluorescencija ža-dinant 488 nm šviesa. Sveikų ir navikinių audiniųspektriniai skirtumai priskirti skirtingai flavinų ir por-firinų fluorescencijai sveikų ir pakitusių ląstelių ter-pėse. Pirmieji moksliniai tyrinėjimai teikė vilčių ga-limam navikų diagnozavimui ir paskatino atlikti to-lesnius navikinių audinių savitosios fluorescencijostyrimus in vitro ir in vivo.

Tiriant įvairių organų: plaučių, skrandžio, žarny-no, gerklės, šlapimo pūslės, smegenų navikų pažeistusaudinius, pastebimas žymus fluorescencijos intensy-vumo sumažėjimas mėlynai žalioje spektro srityje (12,23, 45). Sumažėjęs fluorescencijos intensyvumas, ža-dinant azoto lazerio 337 nm bangos ilgio impulsu,siejamas su kofermento NAD+/NADH oksiduotos irredukuotos formų kiekių pokyčiais. Oksiduota formafluorescuoja silpniau negu redukuota.

Išmatuoti sveikų ir navikinių liežuvio (46), gau-biamosios žarnos (47), kiaušidžių (12) ir plaučių (13)audinių savitosios fluorescencijos spektrai patvirtino,kad navikinių audinių fluorescencijos intensyvumasmažesnis už sveikų.

Naudojant fluorescencinius metodus, galima įver-

tinti odos vėžio išplitimą. Odoje yra keletas fluoroforų,tačiau dažniausiai fiksuojama kofermento NADHfluorescencija. Pirmasis bandymas – fluorescenciniumetodu aptikti melanomas atliktas 1988 metais (48).Autoriai nustatė, kad, žadinant 365 nm šviesa ir ma-tuojant fluorescenciją ties 470 nm, galima atskirti me-lanomą nuo ikivėžinių odos pakitimų. Pastebėta, kadmelanomos srityje fluorescencijos intensyvumas buvolabai mažas, o pereinant į sritį tarp melanomos irsveikos odos fluorescencijos intensyvumas didėjo.Savo hipotezę autoriai patikrino atlikę studiją, kuratrinkta daug pacientų (49). Kitos mokslininkų grupėsatlikti tyrimai nepatvirtino duomenų apie savitosiosfluorescencijos intensyvumo pasiskirstymą esant žmo-gaus odos melanomai (50). Šių tyrimų metu atliktas408 pacientų odos savitosios fluorescencijos vaizdi-nimas (įtarus melanomą) žadinimui naudojant 366 nmšviesą ir registruojant signalą ties 475 nm. Melanomaodoje formuojasi stipriai pigmentuotų audinių vieto-se, dažniausiai apgamuose, kuriuose yra dideli kiekiaipigmento melanino. Pigmentuota oda – apgamai pa-sižymi skirtingu savitosios fluorescencijos spektru (5pav. B), kurio forma kinta priklausomai nuo apgamoatspalvių. Dėl to iš savitosios odos fluorescencijosspektrų sunku tiksliai atpažinti melanomines odosligas. Tiksliam melanominių susirgimų identifikavi-mui fluorescenciniai duomenys buvo lyginami su his-tologinių tyrimų rezultatais. Buvo sukurtas melanomosnustatymo algoritmas, pagrįstas santykio tarp mak-simalios savitosios fluorescencijos melanomos išorėje

4 pav. Sveiko ir navikinio (hepatoma 22) audinio savitosios fluorescencijos spektrai ex vivo1 – sveiko raumens audinio fluorescencija; 2 – navikinio audinio savitosios fluorescencijos spektras.

500 600 700 8000,0

0,4

0,8

1,2

1

2

Bangos ilgis, nm

Fluo

resc

ensi

jos

akty

vum

as (s

nt. v

nt.)



1224

(iki 40 mm nuo melanomos krašto) bei minimaliosfluorescencijos melanomos viduje apskaičiavimu.Naudojant šį algoritmą, melanomos atskyrimo nuonemelanominių odos darinių selektyvumas buvo 82proc., o specifiškumas – 78 proc.

Diagnozuojant lytinių organų navikus, tinkamiau-sias fluorescencijos žadinimo ruožas yra 300–340 nm(12). Raudona navikinių audinių savitoji fluorescen-cija, sužadinama UV diapazono šviesos, panaudotadiagnozuojant gerklės, skrandžio ir lytinių organų

5 pav. Skirtingų žmonių rankos įvairių vietų odos savitosios fluorescencijos in vivo spektrai (A). Normaliosir pigmentuotos odos savitosios fluorescencijos in vivo suvidurkinti spektrai (B): (1) apgamų spektrųvidurkis, (2) nepigmentuotos odos spektrų vidurkis (visi spektrai normuoti į vienetinį intensyvumą, ties

488 nm)Fluorescencijos žadinimui naudotas diodinis mėlynos šviesos šaltinis, spinduliuojantis 406 nm bangos ilgio šviesą. Visi

spektrai matuoti vienodomis sąlygomis.

400 500 600 700 800 900

50

100

150

200

250

300

a

Bangos ilgis, nm

Fluo

resc

enci

jos

inte

nsyv

umas

, san

t. vn

t.

400 500 600 700 800 9000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

b

2

1

Bangos ilgis, nm

Fluo

resc

enci

jos

inte

nsyv

umas

, san

t. vn

t.



1225

navikus (43).Nustatyta, kad endoskopiniai fluorescenciniai ma-

tavimai padeda geriau atskirti navikinius darinius nuoBareto metaplazijos (51). Žadinant 330 nm šviesa,Bareto metaplazijos pažeista stemplės gleivinė fluo-rescuoja silpniau negu sveika, tačiau jos spektro formaišlieka nepakitusi. Savitosios fluorescencijos intensy-vumo sumažėjimas bei spektro formos pakitimai pa-stebėti esant vėlyvos stadijos displazijai bei gleivinėskarcinomai. Tolesnei duomenų analizei naudoti savi-tosios fluorescencijos intensyvumų santykiai ties 390ir 450 nm (kolageno ir NADH), 550 ir 450 (flavinų irNADH) bei 390 ir 550 (kolageno ir flavinų). Taikantpastarąjį santykį, neoplazijos nuo Bareto metaplazijosnustatymo selektyvumas buvo 86 proc., specifišku-mas – 95 proc.

Naudojant įprastą baltos šviesos bronchoskopiją,pavyksta diagnozuoti tik 50 proc. kvėpavimo takų na-vikų, todėl būtini alternatyvūs bronchų ir plaučių navi-kų diagnostikos metodai. Bronchų bei bronchų navikų(vėlyvos stadijos displazijos, karcinomos in situ, inva-zinio naviko) savitoji fluorescenciją in vivo tirta žadi-nimui naudojant 405, 442 bei 488 nm šviesą (13).Spektrams būdingos dvi smailės ties 520 ir 595 nm, ofluorescencijos intensyvumas palaipsniui mažėja, kaidisplazija virsta karcinoma in situ bei pereina į inva-zinio naviko stadiją.

Kelios mokslininkų grupės paskelbė daug vilčiųteikiančius rezultatus, kai savitoji fluorescencija nau-dota viršutinių kvėpavimo takų navikams diagnozuo-ti. Visais atvejais pastebėtas dėsningumas: ties 500 nmnormalios gleivinės fluorescencijos intensyvumas yradidžiausias, tačiau jis pradeda mažėti sveikam audiniuiperaugant į navikinį (52, 53).

Panašūs savitosios fluorescencijos intensyvumopakitimai pastebėti esant bronchų navikams (54). Bur-nos gleivinės navikų savitosios fluorescencijos spekt-re, žadinant 410 nm šviesa, matomos juostos ties 635ir 700 nm (52, 55). Panašius duomenis pateikia ir kitiautoriai (56), tyrę viršutinių kvėpavimo takų displa-zijos savitąją fluorescenciją. Santykinai padidėjusisavitoji fluorescencija raudonoje spektrinėje srityjebuvo priskirta endogeniniams porfirinams.

Taikant savitosios fluorescencijos diagnostiką šla-pimo pūslės vėžiui aptikti taip pat pastebėta, kad na-viko (karcinoma in situ) ir sveikos šlapimo pūslės sie-nos spektro forma skirtinga (20). Žadinant šlapimopūslės audinių savitąją fluorescenciją 337 nm šviesair matuojant fluorescencijos intensyvumų santykį ties385 nm ir 455 nm, navikinių ir sveikų audinių atpaži-nimo selektyvumas ir specifiškumas buvo 95 proc.(19).

Odos savitosios fluorescencijos spektraiOptinės odos savybės atspindi odos struktūrą bei

cheminę sudėtį. Šviesai sąveikaujant su oda, fotonaisugeriami arba išsklaidomi. Dalis šviesos atspindimanuo odos paviršiaus, o į odą patekusios šviesos dalissugeriama, kita gi, daug kartų atspindėta, išeina perodos paviršių (1 pav.). Kuo stipresnė odos sugertis,tuo mažiau šviesos bus atspindėta arba išsklaidyta.Odoje yra fluoroforų, kurie fluorescuoja sužadinusjuos UV arba trumposiomis regimosios spektro sritiesbangomis. Net mažiausi odos pakitimai atsispindifluorescencijos spektruose. Taigi fluorescencijosspektrų matavimai įgalina pastebėti netgi ir nežymiusodos pažeidimus ir iš jų diagnozuoti navikines ligas.

Sveikos odos savitosios fluorescencijos matavimai450–800 nm spektriniame ruože, atlikti in vivo švie-solaidiniu spektrofluorimetru S2000-Fl (Ocean Op-tics) žadinimui naudojant 10 mW galios mėlynos švie-sos diodą, spinduliuojantį ties 407 nm, parodė, kadodos fluorescencijos spektrų intensyvumas ir formapriklauso nuo žmogaus odos tipo ir jautriai reaguoja įbet kokius odos pažeidimus arba pakitimus.

Tiriant sveikos odos savitąją fluorescenciją, nu-statyta, kad atskirų žmonių odos spektrai skiriasi. Topaties žmogaus skirtingų kūno vietų odos fluores-cencijos spektrai taip pat turi nedidelių skirtumų. Įvai-rių rankos vietų nenormuoti odos fluorescencijosspektrai pateikti 5 pav. A. Sunormavus spektrus, iš-ryškėja spektrų formų skirtumai. Didžiausi skirtumaimatomi tarp skirtingų žmonių odos fluorescencijosspektrų, o to paties žmogaus skirtingų vietų odosfluorescencijos spektrai gana panašūs. Apgamo sa-vitosios fluorescencijos spektrai matuoti keliose vie-tose iš esmės savo forma nesiskiria. Ties 488 nm su-normuoti apgamo fluorescencijos spektrai pateikiamidrauge su bendru dviejų žmonių odos fluorescencijosspektro vidurkiu (5 pav. B). Skirtumai tarp šių spektrųyra gerokai didesni nei tarp atskirų asmenų sveikosodos savitosios fluorescencijos spektrų, todėl galimateigti, jog apgamas turi specifinę savitąją fluores-cenciją, kuri apsunkina tikslią melanominių odos su-sirgimų diagnostiką.

Apibendrinant gautus rezultatus, galima pažymėti,kad atskirų žmonių odos savitosios fluorescencijosspektrai yra skirtingi, todėl, taikant optinę biopsijąnavikiniams odos pažeidimams aptikti, reikėtų remtisne apibendrintu žmonių odos fluorescencijos spektru,o atlikti lyginamuosius matavimus registruojant topaties žmogaus sveikos odos ir įtartinų odos vietųfluorescencijos spektrus. Tokiu atveju specifiniaifluorescencijos spektrų pokyčiai įtartinose vietose galibūti naudojami tam tikrų odos ligų arba vėžinių odospakitimų diagnozavimui bei jų diferenciacijai.



1226

Eksperimentinio naviko hepatomos A22savitosios fluorescencijos matavimai ex vivoDėl pakitusių apykaitos procesų navikiniuose audi-

niuose jų savitosios fluorescencijos spektrai turi spe-cifinių skirtumų palyginus su sveikų audinių spektrais.Vieni esminių skirtumų, sąlygojančių sėkmingą navi-kinių darinių diagnostiką fluorescencinės spektrosko-pijos metodu, yra daug mažesnis navikinių audiniųsavitosios fluorescencijos intensyvumas žaliojojespektro srityje (490–580 nm) ir intensyvesnė endo-geninių porfirino tipo pigmentų fluorescencija 600–700 nm srityje (4 pav. 2 kreivė). Sveikų audinių spekt-rams būdinga juosta su smaile ties 560 nm ir jų savitojifluorescencija yra žymiai intensyvesnė negu navikiniųaudinių (4 pav. 1 kreivė). Mūsų matavimai patvirtinokitų autorių (57, 58) duomenis apie tai, kad navikiniųaudinių savitoji fluorescencija 490–600 nm ruože yrasilpnesnė negu sveikų, taip pat išryškino atskirų navikosričių fluorescencijos specifiškumą.

Navikinių darinių savitosios fluorescencijos tyri-mams naudotos C57B1 linijos pelės (patelės, 21–25 gsvorio, 8–10 savaičių), kurioms buvo įskiepyta he-patoma A22. Matavimai pradėti praėjus septyniomsdienoms po įskiepijimo esant naviko dydžiui 0,07 cm3;kiti matavimai atlikti praėjus 9, 12, 14, 16 ir 19 dienųpo įskiepijimo (kol naviko dydis pasiekė 1 cm3). Kont-roliniams matavimams paimti tų pačių pelių sveikųaudinių (raumens) bandiniai.

Fluorescencijos matavimams maždaug 3 mm storiomėginiai buvo patalpinti tarp dviejų stiklo plokštelių.Naviko zonos – nekrozinė, nepažeista nekrozės irhemoraginė nustatytos mikroskopiškai.

Mėginių savitoji fluorescencija buvo matuota 450-800 nm spektriniame ruože šviesolaidiniu spekt-rofluorimetru S2000-Fl (Ocean Optics). Fluorescen-cijos žadinimui naudotas mėlynos šviesos šaltinisLED (λžad = 405 nm).

Morfologinė navikinių darinių analizė parodė, kaddidelio tūrio navikams būdingos nekrozinės irnekrozės nepažeistos sritys (6 pav.). Taip pat nustatyta,kad savitosios fluorescencijos spektrai gali būti iš-kreipti kraujo ekranavimo efekto, atsirandančio dėlkraujavimo pjūvio vietoje (6 pav.). Šis ekranavimoefektas gali paslėpti specifinius sveiko ir navikinioaudinio savitosios fluorescencijos skirtumus, užtik-rinančius tikslų navikinių audinių atpažinimą. Tieksveikų, tiek ir navikinių audinių savitosios fluores-cencijos spektrai pasižymi heterogeniškumu. Todėlbuvo išmatuoti 90 nekrozės nepažeistų sričių, 60 nek-rozinių naviko sričių, 33 hemoraginių naviko sričių ir25 sveikų audinių mėginių savitosios fluorescencijosspektrai, kuriuos išanalizavę galėjome pateikti api-

bendrinančias išvadas, rodančias įvairių morfologiškaiatpažintų atskirų navikinio audinio sričių savitosiosfluorescencijos spektrų specifiškumą (39).

Lyginamoji savitosios fluorescencijos spektrų for-mos skirtumų analizė atlikta sunormavus spektrųvidurkius (7 pav.). Skirtingų navikų savitosios fluo-rescencijos spektrų vidurkiuose išryškėja du nekrozėsnepažeistų navikinių audinių spektrų tipai (7 pav. 1 ir2 kreivės). Esminiai skirtumai matomi 610–700 nmruože. Spektrai, turintys siaurą juostą ties 633 nm irplačią juostą ties 700 nm (7 pav. 2 kreivė), būdingiribotoms nekrozės nepažeistoms sritims didelio tūrionavikuose (praėjus 14 ir daugiau dienų po įskiepi-jimo). Kitas spektrų tipas (7 pav. 1 kreivė) neturi šiųjuostų ir forma yra panašus į nekrozinių naviko audinių(3 kreivė) ir sveikų audinių (4 kreivė) spektrus 610–710 nm ruože. Pirmojo tipo spektrams būdingos fluo-rescencijos juostos ties 633 ir 700 nm priskiriamosendogeniniam protoporfirinui IX (28). Taigi dideliotūrio navikams būdingas netolygus endogeniniųporfirinų pasiskirstymas atskirose nekrozės nepažeis-tose srityse. Antrojo tipo savitosios fluorescencijosspektrai (neturintys endogeniniams porfirinams bū-dingų juostų) būdingi mažo tūrio navikams ir kai ku-rioms didelio tūrio navikų nekrozės nepažeistoms sri-tims. Remiantis šiais duomenimis, darytina išvada, kadendogeninių porfirinų kaupimasis navikiniame (he-patoma A22) audinyje priklauso nuo naviko augimostadijos: kol navikas mažas, jame endogeninių porfiri-nų neaptinkama; dideliuose navikuose endogeniniaiporfirinai aptinkami tik atskirose nekrozės nepažeis-tose naviko srityse. Šie eksperimentinių tyrimų duo-menys rodo, kad, norint atskirti sveiką ir navikinį au-dinį, nepakanka išanalizuoti savitosios fluorescenci-jos pokyčius vien raudonoje spektro srityje (600–700nm), būtina atlikti platesnio spektrinio ruožo (495–750 nm) savitosios fluorescencijos spektrų analizę.

Nekrozinių navikinių audinių sričių savitosios fluo-rescencijos spektrų forma (7 pav.) gerokai skiriasi nuonekrozės nepažeistų naviko sričių ir sveikų audiniųspektrų 490-600 nm srityje. Nekrozinių sričių spekt-rams būdingas mažesnis fluorescencijos intensyvu-mas ir įdubos ties 536 ir 577 nm. Tokios pat įdubosbūdingos ir navikinių audinių hemoraginėms sritims(7 pav.). Kraujo sugerties juostų smailių padėtis su-tampa su navikinių audinių hemoraginėms sritims bū-dingomis įdubomis ties 536 ir 577 nm. Taigi šiosįdubos gali būti kraujo hemoglobino reabsorbcijospasekmė. Pirma, toks spektrų formos pokytis hemo-raginėse navikų srityse apsunkina tikslų navikinių irsveikų audinių ribų atskyrimą, antra, tokie savitosios



1227

6 pav. Išoperuoto naviko pjūvio vaizdasPažymėtos skirtingos morfologijos navikinio audinio sritys ir intarpuose pavaizduoti atitinkamų sričių savitosiosfluorescencijos ir kraujo sugerties spektrai: a – nekrozės nepažeistos navikinio audinio sritys, pasižyminčios intensyviaendogeninių porfirinų fluorescencija 600-700 nm ruože; b – nekrozės nepažeistos navikinio audinio sritys, neturinčiosendogeninių porfirinų; c – nekrozinės navikinio audinio sritys; d – kraujosruvų audinyje sritys (1 – audinio fluorescencijos

spektras; 2 – kraujo sugerties spektras).

500 600 700 8000

5

10

15

Fluo

resc

enci

ja (s

nt.v

nt.)

Bangos ilgis,nm

500 600 700 8000

5

10

15

Fluo

resc

enci

ja (s

nt.v

nt.)

Bangos ilgis,nm

500 600 700 8000

5

10

15

Fluo

resc

enci

ja (s

nt.v

nt.)

Bangos ilgis,nm

500 600 700 8000

5

10

15

0

0.5

1

1

2 Sug

ertis

(opt

.t.vn

t.)

Fluo

resc

enci

ja (s

nt.v

nt.)

Bangos ilgis,nm

a

b

c

d 4 mm

Bangos ilgis, nm

Bangos ilgis, nm Bangos ilgis, nm

Bangos ilgis, nm

Fluo

resc

enci

ja, s

ant.

vnt.

Fluo

resc

enci

ja, s

ant.

vnt.

Fluo

resc

enci

ja,

sant

. vnt

.Fl

uore

scen

cija

,sa

nt. v

nt.

Suge

rtis

, opt

. t. v

nt

1

0,5

0

7 pav. Normuoti sveiko ir navikinio (hepatoma 22) audinių savitosios fluorescencijos spektrai ir jųvidurkiai išmatuoti ex vivo

1 – sveiko audinio (odos virš raumens); 2, 4 – nekrozės nepažeisto navikinio audinio; 3 – nekrozinio navikinio audinio.

500 600 700 8000

5

10

15

1

3

2

4

Bangos ilgis, nm

Fluo

resc

enci

jos

inte

nsyv

umas

, san

t. vn

t.



1228

fluorescencijos spektrų pokyčiai gali padėti spektro-skopiškai atpažinti kraujosruvas audiniuose arbakraujo indų pažaidas.

Apibendrinant galima teigti, kad santykinai ma-žesnis fluorescencijos intensyvumas 495–600 nmspektriniame ruože ir endogeninių porfirinų fluores-cencijos juostų 600–700 nm spektriniame ruože for-mavimasis navikinių audinių spektruose galėtų būtipanaudotas navikiniams audiniams aptikti. Tačiautikslus navikinių audinių atpažinimas galimas tik re-miantis vizualia apžiūra, t. y. nustačius, ar apžiūrimojevietoje nėra kraujosruvų ar nekrotizavusio audinio.Taigi savitosios fluorescencijos spektrų analizė sutei-kia daug papildomos informacijos, galinčios padėtiatpažinti sveiką ir navikinį audinį, tačiau galutinė iš-vada turi būti daroma atsižvelgus ir į kitus faktorius,nustatomus vizualios apžiūros metu.

Žadinant audinio fluoroforus UV ar mėlyna šviesair naudojant jautrius fluorescencijos spektrų matuok-lius, galima vizualizuoti naviko pažeistas audinio sritisarba aptikti ankstyvos stadijos naviką, kai morfologi-niai audinio pakitimai akimi dar sunkiai pastebimi.Eksperimentiniai savitosios fluorescencijos matavi-mų duomenys sudarė prielaidas optinės biopsijos prie-taisui sukurti. Toks prietaisas (8 pav.) (59) gali padėtitiksliau nustatyti pažeisto ir sveiko audinio ribas vizua-lios apžiūros metu, apšviečiant įtartinas vietas mėly-no šaltinio skleidžiama šviesa. Tai dar nėra galutinėoptinės biopsijos metodo, pagrįsto audinių savitosios

fluorescencijos matavimu, realizacija, tačiau sukur-tasis prietaisas yra kompaktiškas ir paprastas naudoti,todėl gali būti naudojamas kaip papildoma diagnostinėpriemonė.

Padėka. Autoriai dėkoja Vilniaus universiteto On-kologijos instituto darbuotojoms prof. L. Griciūtei irdr. J. Didžiapetrienei už svarbias pastabas ir patarimusaudinių morfologijos ir histologijos klausimais; J. La-banauskienei ir A. Sukackaitei – už pagalbą dirbantsu eksperimentiniais gyvūnais. Taip pat dėkojameVilniaus universiteto Fizikos fakulteto Biofotonikosgrupės studentams ir doktorantams J. Makaryčevai,M. Tamošiūnui, J. Veniui ir V. Legeniui, kurie perkelerius metus padėjo surinkti didelę audinių savi-tosios fluorescencijos duomenų bazę, kuria remda-miesi autoriai galėjo išanalizuoti šimtus fluorescen-cijos spektrų ir pasiūlyti navikinių ir sveikų audiniųatpažinimo galimybes naudojant optinės biopsijos me-todą. Reiškiame padėką Odos ir lazerinės chirurgijoscentro vadovui dr. K. Babajanui už pateiktus odosbandinius, Valstybinio patologijos centro darbuotojuiE. Žurauskui – už pateiktus širdies audinių bandinius.Tyrimai buvo finansuojami Lietuvos valstybiniomokslo ir studijų fondo remiamos mokslo programos„Šviesa biomedicinoje: diagnostika ir terapija“ irkompleksinio tyrimo darbo „Žmogaus širdies laidžio-sios sistemos vizualizacija fluorescencinės spektro-skopijos metodu“ lėšomis.

8 pav. Portatyvus mėlynos šviesos šaltinis, skirtas paviršinių audinių vizualiai apžiūrai

Fluorescence diagnostics of tumors

Ričardas Rotomskis1, 2, Giedrė Streckytė1

1Laser-induced Research Center, 2Institute of Oncology, Vilnius University, Lithuania

Key words: fluorescence, autofluorescence, endogenous fluorophores, endogenous porphyrins.



1229

Summary. The intrinsic autofluorescence properties of biological tissues can change depending on altera-tions induced by pathological processes. In this paper, autofluorescence properties of normal and tumor tissueare presented and possibilities of the application of autofluorescence as a parameter for in situ cancer detec-tion in different organs are discussed. Data obtained during in vivo measurements of normal and pigmentedskin autofluorescence are presented. Autofluorescence of experimental tumor (hepatoma A22) was measuredto discriminate the optical differences between necrotic, non-necrotic and hemorrhagic areas of tumor andhealthy tissue. It was concluded that the uneven distribution of endogenous porphyrins fluorescence in non-necrotic tumor tissue as well as the absence of endogenous porphyrins fluorescence in the small experimentaltumors complicated the diagnosis of cancerous tissue based on the autofluorescence measurements.

Correspondence to R. Rotomskis, Laser-induced Research Center, Vilnius University, Saulėtekio ave. 3rd corps,10222 Vilnius, Lithuania. E-mail: [email protected]

Literatūra1. Alfano RR, Tata DB, Cordero J, et al. Laser induced fluores-

cence spectroscopy from native cancerous and normal tissue.IEEE J Quant Electron 1984;20:1507-11.

2. Profio AE. Review of fluorescence diagnosis using porphyrins.Proc SPIE 1988;907:50-156.

3. Andersson-Engels S, Wilson BC. In vivo fluorescence in clini-cal oncology: fundamental and practical issues. J CellPharmacol 1992;3:48-61.

4. Papazoglou TG. Malignant and atherosclerotic plaque diag-nosis - is laser induced fluorescence spectroscopy the ulti-mate solution? J Photochem Photobiol B 1995;28:3-11.

5. Bigio IJ, Mourant JR. Ultraviolet and visible spectroscopiesfor tissue diagnostics: fluorescence spectroscopy and elastic-scattering spectroscopy. Phys Med Biol 1997;42:803-14.

6. Andersson-Engels S, af Klinteberg C, Svanberg K, et al. Invivo fluorescence imaging for tissue diagnostics. Phys MedBiol 1997;42:815-24.

7. Wagnieres GA, Star WM, Wilson BC. In vivo fluorescencespectroscopy and imaging for oncological applications. Pho-tochem Photobiol 1998;68:603-632.

8. Hillemanns P, Weingandt H, Baumgartner R, et al. Photo-detection of cervical intraepithelial neoplasia using 5-ami-nolevulinic acid-induced porphyrin fluorescence. Cancer2000;88:2275-82.

9. Brewer M, Otzinger U, Silva E, et al. Fluorescence spect-roscopy for in vivo characterization of ovarian tissue. LasersSurg Med 2001:29:128-35.

10. Alfano RR, Tang GC, Pradhan A, et al. Fluorescence spectrafrom cancerous and normal human breast and lung tissues.IEEE J Quant Electron 1987;10:1906-11.

11. Lam S, Hung J, Palcic B. Detection of lung cancer by ratiofluorometry with and without Photofrin II. Proc SPIE 1990;1201:561-8.

12. Glassman W, Liu CH, Tang GC, et al. Ultraviolet excited fluo-rescence spectra from non-malignant tissues of the gynecologictract. Laser Life Sci 1992;5:49-58.

13. Hung J, Lam S, LeRiche J, et al. Autofluorescence of normaland malignant bronchial tissue. Lasers Surg Med 1991;11:99-105.

14. Makaryceva J, Tamosiunas M, Didziapetriene J, et al. Math-ematical methods of healthy and cancerous tissues autofluo-rescence spectra imaging. Abstracts of IX International Con-ference on Laser Applications in Life Sciences. Vilnius; 2002.p. 52.

15. Kriegmair M, Baumgartner R, Knuechel R, et al. Detectionof early bladder cancer by 5-aminolevulinic acid induced fluo-

rescence. J Urol 1996;155:105-10.16. Messmann H. 5-aminolevulinic acid-induced protoporphy-

rin IX for the detection of gastrointestinal dysplasia. GI EndoscClin N Am 2000;10:497-512.

17. Baumgartner R, Huber RM, Schulz H, et al. Inhalation of 5-aminolevulinic acid: a new technique for fluorescence detec-tion of early stage lung cancer. J Photochem.Photobiol B Biol1996;36:169-74.

18. Stepp H, Sroka R, Baumgartner R. Fluorescence endoscopyof gastrointestinal diseases: basic principles, techniques andclinical experience. Endoscopy 1998;30:379-86.

19. Koenig F, McGovern FJ, Althausen AF, et al. Laser-inducedautofluorescence diagnosis of bladder cancer. J Urol 1996;156:1597-1601.

20. Anidjar M, Ettori D, Cussenot O, et al. Laser-induced auto-fluorescence diagnosis of bladder tumours: dependence onthe excitation wavelength. J Urol 1996;156:1590-6.

21. Richards-Kortum R, Rava RP, Petras RE, et al. Spectroscopicdiagnosis of colonic dysplasia. Photochem Photobiol 1991;53:777-86.

22. Haringsma J, Tygat GN. Fluorescence and autofluorescence.Bailliere’s Clin Gastroenterol 1999;13:1-10.

23. Lohmann W, Mussmann J, Lohmann C, et al. Native fluores-cence of the cervix uteri as a marker for dysplasia and invasi-ve carcinoma. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1989;31:249-53.

24. Benson RC, Meyer RA, Zaruba ME, et al. Cellular auto-fluorescence – is it due to flavins? J Hisochem Cytochem 1979;27:44-8.

25. Halangk W, Kuntz S. Use of NAD(P)H and flavoprotein fluo-rescence signals to characterize the redox state of pyridinenucleotide in epididymal bull spermatoza. Biochim BiophysActa 1991;1056:274-8.

26. Lohmann W, Paul E. In situ detection of melanomas by fluo-rescence measurements. Naturwissenschaften 1988;75:201-2.

27. Schomacker KT, Frisoli JK, Compton CC, et al. Ultravioletlaser induced fluorescence of colonic tissue: basic biologyand diagnostic potential. Lasers Surg Med 1992;12:63-78.

28. Rotomskis R, Streckytė G, Griciūtė L. Fotosensibilizuotanavikų terapija: pirminiai vyksmai. (Photosensitized tumortherapy: primary processes.) Vilnius; 2002. p. 201-37.

29. Bottiroli G, Croce AC, Locatelli D, et al. Natural fluorescen-ce of normal and neoplastic human colon: a comprehensiveex vivo study. Lasers Surg Med 1995;16:48-60.

30. Van Dam J, Bjorkman DJ. Shedding some light on high-gradedysplasia. Gastroenetrology 1996;111:247-9.



1230

31. Pradhan A, Pal P, Durocher G, et al. Steady-state and time-resolved fluorescence properties of metastatic and non-meta-static malignant cells from different species. J PhotochemPhotobiol B Biol 1995;31:101-12.

32. Lam S, Becker HD. Future diagnostic procedures. ThoracEndosc 1996;6:363-79.

33. Schneckenburger H, Gschwend MH, Strauss WS, et al. Energytransfer spectroscopy for measuring mitochondrial metabolismin living cells. Photochem Photobiol 1997;66:34-41.

34. Policard A. Etudes sur les aspects offerts par des tumeurexperimentales examinee a la lumiere de woods. C R SocBiol 1924;91:1423-8.

35. Ronchese F. The fluorescence of cancer under the Wood’slight. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1954;7:971-6.

36. Ghadially FN, Neish WJP. Porphyrin fluorescence of experi-mentally produced squamous cell carcinoma. Nature 1960;188:1124-224.

37. Ghadially FN. Red fluorescence of experimentally inducedand human tumours. J Pathol Bacteriol 1960;80:345-51.

38. Harris DM, Werkhaven J. Endogenous porphyrin fluorescencein tumors. Lasers Surg Med 1987;7:467-72.

39. Tamosiunas M, Makaryceva J, Labanauskiene J, et al. Auto-fluorescence of transplantable hepatoma A22 (MH-A22):prospects of tumour tissue optical biopsy. EksperimentalnajaOnkologija 2004;26:118-24.

40. Ghadially FN, Neish WJP, Dawkins HC. Mechanismsinvolved in the production of red fluorescence of human andexperimental tumours. J Pathol Bacteriol 1963; 85:77-92.

41. Moesta KT, Ebert B, Handke T, et al. Protoporphyrin IX occursnaturally in colorectal cancers and their metastases. CancerRes 2001;61:991-9.

42. Kusunoki Y, Imamura F, Uda H, et al. Early detection of lungcancer with laser-induced fluorescence endoscopy and spect-rofluorometry. Chest 2000;118:1776-82.

43. Yang Y, Fe Y, Li F, et al. Characteristic autofluorescence forcancer diagnosis and its origin. Laser Surg Med 1987;7:528-32.

44. El-Sharabay MMH, El-Wassel AM, Hafez SA, et al. Porphyrinmetabolism in some malignant diseases. Br J Cancer 1992;65:409-12.

45. Andersson PS, Kjellen E, Montan S, et al. Autofluorescenceof various rodent tissues and human skin tumors samples.Lasers Med Sci 1987;2:41-9.

46. Andersson-Engels S, Johansson J, Stenram U, et al. Malig-nant tumor and atherosclerotic plaque diagnosis using laser-

induced fluorescence. IEEE 1990;26:2207-17.47. Yang Y, Tang CC, Bessler M, et al. Optical spectroscopy

methods to detect colon cancer. Proc SPIE 1994;2135:36-9.48. Lohmann W, Paul E. Native fluorescence of unstained cryo-

sections of the skin with melanomas and naevi. Naturwissen-schaften 1989;76:424-6.

49. Lohmann W, Nilles M, Boedeker RH. In situ differentiationbetween nevi and malignant melanomas by fluorescence meas-urements. Naturwissenschaften 1991;78:456-7.

50. Chwirot BW, Chwirot S, Redzinski J, et al. Detection of me-lanomas by digital imaging of spectrally resolved UV light-induced autofluorescence of human skin. Eur J Cancer 1998;34:1730-4.

51. Bourg-Heckly G, Blais J, Padilla JJ, et al. Endoscopic ultra-violet-induced autofluorescence spectroscopy of the esopha-gus: tissue characterization and potential for early cancer di-agnosis. Endoscopy 2000;32:756-65.

52. Ingrams DR, Dhingra JK, Roy K, et al. Autofluorescencecharacteristics of oral mucosa. Head Neck J Sci SpecialitiesHead Neck 1997;19:27-32.

53. Harries ML, Lam S, MacAulay C, et al. Diagnostic imagingof the larynx: autofluorescence of laryngeal tumors using thehelium cadmium laser. J Laryngol Otology 1995;109:108-10.

54. Lam S, MacAulay C, Hung J, et al. Detection and dysplasiaand carcinoma in situ with lung imaging fluorescence endo-scope device. J Thorac Cardiovasc Surg 1993;105:1035-40.

55. Roy K, Bottrill ID, Ingrams DR, et al. Diagnostic fluores-cence spectroscopy of oral mucosa. Proc SPIE 1995;2395:135-42.

56. Dhingra JK, Perrault DF, McMillan K, et al. Early diagnosisof upper aerodigestive tract cancer by autofluorescence. ArchOtolaryngol Head Neck Surg 1996;122:1181-6.

57. Andersson-Engels S, Elner A, Johansson J, et al. Clinical re-cording of laser-induced fluorescence spectra for evaluationof tumour demarcation feasibility in selected clinical speci-alities. Lasers Med Sci 1991;6:415-24.

58. Marchesini R, Brambilla M, Pignoli E, et al. Light inducedfluorescence spectroscopy of adenomas, adenocarcinomas andnon-neoplastic mucosa in human colon. J Photochem Photo-biol B Biol 1992;14:219-30.

59. Bloznelytė-Plesnienė L, Novickovas A, Liutkevičiūtė-Na-vickienė J, et al. Fluorescence diagnosis of different skin andmucosal malignances. Abstract book of IX International Con-ference on Laser Applications in Life Sciences. Vilnius; 2002.p. 105.

Straipsnis gautas 2004 06 02, priimtas 2004 09 30Received 2 June 2004, accepted 30 September 2004



Documents

Fluorescencine naviku diagnostika