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Producción de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 Análisis, diseño y optimización 28/02/2012
Acosta Dent Andrea
Arias Orozco Patricia Elizabeth
García Alvarado Laura
García Pérez Jessica Wendolyn
Hernández Gallardo Anna Karen
Juárez Yáñez David Guadalupe
Lemus Cruz Paulina Moreno Rodríguez Eduardo
Núñez Paulín Jacqueline Ortiz Robles Cynthia
Ramírez Mendoza Laura Arely
Vázquez Ahuatzín Itzel
1
Contenido
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... 2
1.1 Estructura y función de las pectinas ......................................................................................... 2
1.2 Microorganismos que producen pectinasas ............................................................................ 3
1.3 Las características de género Aspergillus .................................................................................. 4
1.4 Aspergillus flavipes FP-500 ........................................................................................................ 4
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 4
2.1 Objetivo General ....................................................................................................................... 4
2.2 Objetivos Particulares ............................................................................................................... 4
3 INGENIERÍA BÁSICA .......................................................................................................................... 5
3.1 Bases del Diseño ............................................................................................................................ 5
Capacidad Instalada .................................................................................................................... 5
Factor de Servicio ........................................................................................................................ 6
Sistema de Fermentación ............................................................................................................ 7
Productividad del fermentador ................................................................................................... 7
Volumen de trabajo del fermentador ......................................................................................... 7
Composición del Medio. .............................................................................................................. 7
Rendimiento en la recuperación y producción ........................................................................... 8
3.2 Biosíntesis del producto ............................................................................................................ 8
Cinética de fermentación ............................................................................................................ 8
Modelamiento ............................................................................................................................. 9
Simulación y optimización ......................................................................................................... 10
3.3 Recuperación y purificación del producto .................................................................................. 13
a) Información técnica sobre los diferentes bioprocesos existentes ............................................ 13
Recuperación y purificación de pectinasas ................................................................................... 15
BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................... 17
Anexo 1 .............................................................................................................................................. 18
2
1. INTRODUCCION
1.1 Estructura y función de las pectinas
La pectina es uno de los polisacáridos más complejos en la naturaleza. Su degradación es producto
de un conjunto de enzimas llamadas pectinasas.
Considerando la complejidad estructural de la pectina y el tamaño, resulta difícil su acceso al
interior de la célula microbiana. Los microorganismos deben secretar al medio las enzimas
necesarias para degradar la pectina y así poder ser metabolizada.
La producción de las pectinasas es un proceso complejo, regulado por diversos factores, de los que
destacan la naturaleza y cantidad de la fuente de carbono y el valor del pH del medio de cultivo.
Las pectinas es uno de los heteropolisacáridos más complejos de los que conforman a la pared
celular de las plantas y especialmente de los materiales cítricos, su función es la de estabilizar a las
microfibrillas de celulosa, así como a otros polímeros y proteínas. Es el componente principal de la
lamela media, y se encarga de mantener unidos a los componentes de la misma. Las sustancias
pécticas comprenden del 0.5 al 40% del peso seco de la planta (Singh Jayani et al, 2005)
La estructura de la pectina está constituida por dos grandes regiones homogalacturonano
(Ilustración 1) y ramnogalacturonano (Ilustración 2). La región homogalacturonano es la de
estructura más sencilla. Su cadena lineal esta constituida por unidades de acido D-galacturónico,
unidas entre si por enlaces alfa 1-4. A lo largo de dicha cadena se encuentran grupos acetilo (en los
grupos hidroxilo de los carbonos 2 y 3) o metilo (en el carbono 6), así como algunos iones de sodio,
potasio o amonio (Jayani et al, 2005)
Ilustración 1. Homogalacturano
3
En la región del ramnogalacturonano, las unidades de ácido galacturónico se intercalan con las de
L-ramnosa, mediante enlaces beta 1-2 y beta 1-4. Esta región se caracteriza por ramificaciones de
azúcar de diversos tipos, que van desde largas cadenas de arabinanos y galactanos, hasta
ramificaciones más pequeñas, conformadas por xilosa, ácido ferúlico, apiosa y fructosa, entre
otros (de Vries y Visser, 2001)
La complejidad estructural de la pectina puede limitar el rendimiento de diversos procesos
industriales que emplean como materia prima este elemento. Por otro lado, en la naturaleza este
tipo de materia prima es los sustratos de los microorganismos saprófitos, debido a la capacidad de
estos para producir pectinasas.
1.2 Microorganismos que producen pectinasas
Las enzimas pectinolíticas son producidas por una extensa variedad de organismos, tales como
nemátodos, protozoarios, levaduras, bacterias y hongos. De los anteriores destacan con potencial
industrial los hongos filamentosos, debido a su fácil cultivo, y su alta producción de enzimas
extracelulares. La diversidad de las enzimas producidas por estos microorganismos, así como su
elevada actividad, provienen de su diversidad metabólica inherente, que se refleja en su habilidad
para crecer sobre diversos sustratos bajo una gran variedad de condiciones. Los géneros más
utilizados para la producción de las diversas polipectinasas de interés industrial son Trichoderma,
Penicillium y Aspergillus, al ser clasificados generalmente como seguros para la salud humana
(GRAS, por sus siglas en ingles).
Ilustración 2. Rhamnogalacturano
4
1.3 Las características de género Aspergillus
Los microorganismos del género Aspergillus (Ilustración 3) son hongos filamentosos que crecen en
materia orgánica bajo condiciones aerobias. Se encuentran en suelo, compostas y en materiales
de plantas en descomposición. Se caracterizan por tener
una estructura mórfica conformada por un
conidiosporo, el cual tiene un tallo y una cabeza conidial
de más de 700 µm de diámetro, que surge desde la
delgada pared micelial, llamada célula pie.
Los hongos del género Aspergillus crecen en un rango
de temperaturas de 6-47 °C, con una temperatura
óptima entre 35-37 °C y un intervalo de valores de pH
de entre 1.4 y 9.8. Tiene la capacidad para crecer en
diversas fuentes de carbono.
1.4 Aspergillus flavipes FP-500
El grupo de los Aspergillus flavipes (Ilustración 4) está conformado por una
sola especie. Aunque no representan una de las especies de Aspergillus más
estudiadas se ha demostrado que producen enzimas degradadoras de
polisacáridos como las α-galactosidasas y pectinasas.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
Análisis, diseño y optimización de la producción de pectinasas mediante Aspergillus flavipes FP-
500.
2.2 Objetivos Particulares
Determinación de las bases de diseño para la producción de pectinasas.
Modelamiento y optimización de la cinética de fermentación para la síntesis del producto.
Ilustración 3. Aspergillus
Ilustración 4. Aspergillus flavipes
5
3 INGENIERÍA BÁSICA
3.1 Bases del Diseño
Capacidad Instalada
C. I (capacidad instalada) = (
(
) (
) (
)
de AG
Memoria de cálculo:
Conociendo que: 1U es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1umol de Acido Galacturónico (Condiciones dadas) Entonces:
Por lo tanto:
11080 umol de AG= 0.01108 moles de AG Peso molecular AG 194 g/mol C6H10O7
0.01108 moles(
/ L*h de AG
Factor de servicio=0.96 Los días de trabajo: Año de trabajo dura 350 días Con 3 turnos de 8 horas
Por lo tanto: Se trabaja 8400 horas /año
6
Factor de Servicio
De acuerdo a la Ley Federal del Trabajo (Última reforma publicada DOF 17-01-2006), en el artículo 74, son días de descanso obligatorio:
El 1 de enero
El primer lunes de febrero en conmemoración del 5 de febrero
El tercer lunes de marzo en conmemoración del 21 de marzo
El 1 de mayo
El 16 de septiembre
El tercer lunes de noviembre en conmemoración del 20 de noviembre
El 1 de diciembre de cada seis años, cuando corresponda a la transmisión del Poder Ejecutivo Federal
El 25 de diciembre Otros días:
24 de diciembre
31 de diciembre
1 de Enero
3 días de arranque El artículo 78 dice que los trabajadores deberán disfrutar en forma continua seis días de vacaciones. Sin embargo, la planta no dejara de laborar esos días pues las vacaciones serán asignadas en periodos diferentes para cada trabajador. Los trabajadores gozaran de un día a la semana de descanso, la ley marca de preferencia un
domingo, aunque puede ser cualquier otro día, no obstante la planta tampoco dejara de funcionar
ya que se manejaran turnos diferentes para los trabajadores. No se considerarán días no laborales
para mantenimiento ya que este se realizara periódicamente. En base a esto el factor de servicio
es:
7
Sistema de Fermentación
FERMENTACIÓN SUMERGIDA
El cultivo sumergido también llamado fermentación líquida es
el qué se refiere a un sistema en el cual los sustratos están
disueltos o suspendidos en un medio acuoso y son agitados
para conservar la homogeneidad del sistema (Ilustración 5).
Productividad del fermentador
En la simulación del proceso de producción en el fermentador se obtuvo la siguiente
productividad:
Cultivo por lote 6.843 KU/L *h
Cultivo por lote alimentado 11.08 KU/L*h
Volumen de trabajo del fermentador
Se propuso que el volumen de operación del fermentador de producción será de 50m3=
50,000 L.
Composición del Medio.
Aspergillus flavipes FP-500 se hizo crecer en medio basal que contenía en g/L: como fuente de carbono pectina; K2HPO4; KH2PO4; (NH4)2SO4. El pH del medio de cultivo se mantuvo constante durante toda la fermentación y se trabajó a 5 (se ajusto con ayuda de soluciones de NaOH o H2SO4 a 2M). El medio se esterilizó a 121°C y 1.5 psi durante 20 min.
Ilustración 5. Fermentación sumergida
8
Rendimiento en la recuperación y producción
Tabla 1. Purificación y recuperación en tres diferentes procesos de separación. (Anexo 1)
Fracción Proteína Total (mg)
Actividad Total (U)
Actividad específica (U/mg)
Purificación (veces)
Recuperación (%)
Filtrado 523.0 3818 7.30 1.0 100 Precipitación con etanol
67.8 2205 32.53 4.45 57.77
Sephadex G-100 (12%)
6.3 918 145.84 17.24 48.12
3.2 Biosíntesis del producto
Cinética de fermentación
La fermentación de Aspergillus flavipes sobre pectina como fuente de carbono para la producción
de pectinasas en un cultivo en lote presenta los valores mostrados en la tabla 1 de biomasa,
sustrato y producto
Tabla 2. Cinética de fermentación
t (h) x (g/L) s (g/L) p (kU/L)
0 0.1 10 0
5 0.15 9.6 0.1
10 0.2 9.5 0.5
15 0.25 9.3 2.1
20 0.5 8.5 5.5
25 1 6.6 13
30 2 3.9 24.5
35 2.7 1.9 33
40 3.1 0.6 38
45 3.2 0.2 39
50 3.25 0.1 39.5
9
Con los valores anteriores fue posible calcular las constantes cinéticas (tabla 2) necesarios para
modelar la fermentación.
Tabla 3. Constantes cinéticas
Constante Valor
0.11h-1
Ks 0.49g/L
ms 0.01gsust/gcel h
Yg 0.40gcel/gsust
N 1
Α 10 kU/gcel
Β 0 kU/gcel h
Modelamiento
Se modelo la cinética de fermentación experimental utilizando el software matemático Mathcad
utilizando las constantes cinéticas previamente calculadas. El siguiente gráfico muestra la
correlación entre los datos experimentales y el modelo calculado.
Se modeló la cinética de fermentación experimental utilizando el software matemático Mathcad
utilizando las constantes cinéticas previamente calculadas. La ilustración 6 muestra la correlación
entre los datos experimentales y el modelo calculado. Podemos observar en la gráfica que los
datos experimentales se ajustan bastante bien a la gráfica del modelo calculado.
Ilustración 6. Relación entre los datos experimentales y el modelo calculado. Línea continua: modelo calculado y Línea punteada: datos experimentales.
10
Simulación y optimización
Cultivo por lote
Se realizó una simulación del modelo anterior en un cultivo por lote, cambiando las variables de
operación biomasa y sustrato inicial (x0 y s0 respectivamente), entre un rango de valores de 0.1 a
1 g/L, para la biomasa y de 10 a 50g/L para la pectina, los valores de esta ultima estuvieron
limitados por la solubilidad de la pectina en agua. (50g/L a 25°C)
La función objetivo para optimizar el cultivo por lote fue la productividad, así los valores de x0 y s0
con los cuales se alcanza la máxima productividad son:
x0=1 g/L
s0=50 g/L
Con los valores anteriores se alcanza una productividad de 6.843kU/L h, la cual es
significativamente mayor que la alcanzada en el cultivo sin optimizar que fue de 1.018 kU/L h.
Además el tiempo del cultivo disminuyo de 37.5 horas en el cultivo sin optimizar a 28 horas en el
cultivo optimizado. En la ilustración 7 se muestra el gráfico obtenido del cultivo por lote
optimizado, en el que se marca el término del cultivo y la productividad a lo largo del mismo.
Ilustración 7. Cultivo por lote que muestra el término de éste a las 28 horas después de iniciado el cultivo.
11
Cultivo por lote alimentado
Una vez que se optimizó el cultivo por lote, se procedió a la simulación y optimización de un
cultivo por lote alimentado. Los valores de biomasa, sustrato, producto y productividad al término
del cultivo por lote, y por lo tanto al inicio del cultivo por lote alimentado son:
Biomasa =20.161 g/L
Sustrato= 0.266 g/L
Producto=191.611 kU/L
Productividad=6.843 kU/L h
El gráfico obtenido del cultivo por lote alimentado, con una SF=50g/L y una F=1m3/h se muestra
en la ilustración 8.
Ilustración 8. Cultivo por lote alimentado sin optimizar.
Como se puede observar el producto y por lo tanto la productividad disminuyen, esto se debe a la
baja concentración del sustrato alimentado, 50g/L, que como explicamos antes esta limitado por
la solubilidad de la pectina. Al realizar la simulación variando SF nos damos cuenta que a un valor
de SF de 200g/L la productividad aumenta significativamente. Por lo tanto, se hace necesario
aumentar la solubilidad de la pectina hasta mínimo 200g/L para que el uso de un cultivo
alimentado sea factible de realizar. Una forma de aumentar la solubilidad de la pectina, que
podríamos utilizar, es mezclando la pectina con sacarosa previo a la solubilización.
El comportamiento del cultivo cuando SF=200g/L y F=1 m3/h se muestra en la ilustración 9.
12
Ilustración 9. Cultivo por lote alimentado con una SF=200g/L y F=1m3/h.
Se optimizó el flujo de alimentación del cultivo por lote alimentado con base en la misma función
objetivo que en el cultivo por lote, es decir maximizando la productividad, el flujo optimizado es
de 1.6m3/h, con el cual los valores de biomasa, sustrato, producto y productividad al término del
cultivo son:
Biomasa = 47.879 g/L
Sustrato= 2.191 g/L
Producto= 473.8 kU/L
Productividad=11.08 kU/L h
En la ilustración 10 se muestra el grafico del cultivo optimizado con SF=200g/L y F=1.7g/L.
I
Ilustración 10. Cultivo por lote alimentado optimizado, con SF=200g/L y F=1.7m3/h.
13
3.3 Recuperación y purificación del producto
a) Información técnica sobre los diferentes bioprocesos existentes
Los procesos fermentativos pueden dividirse en:
Fermentaciones líquidas sumergidas (ilustración 11) (FS)
Contenido de agua del medio 90-95 %
Fermentaciones en sustrato sólido (ilustración 12) (FSS)
El medio son partículas húmedas con ausencia o casi ausencia de agua libre. El sustrato no está ni
disuelto ni en suspensión en un gran volumen de agua.
Hay dos formas básicas de cultivos sólidos. • Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos agroindustriales). • Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo (perlita, bagazo,
poliuretano).
.
1. Preparación y esterilización del medio de cultivo y el inoculo.
2. Biotransformación. 3. Concentración y
purificación.
Ilustración 12. Tipos de reactores empleados en fermentaciones en sustrato sólido.
Ilustración 11. Reactores empleados en fermentaciones
líquidas sumergidas
14
Tabla 4. Comparación de dos bioprocesos existentes. Ver Anexo 1 para más información
PRODUCCION DE PECTINASAS MEDIANTE FERMENTACION SÓLIDA
A PARTIR DE Aspergillus foetidus NRRL 341, UTILIZANDO RESIDUUOS DE NARANJA, MARACUYA Y LIMON
• Fermentación sólida (30°C).
• Aspergillus foetidus.
• Inóculo 105 esporas.
• Residuos orgánicos: naranja, maracuya y limón.
• Altos niveles de actividad pectinolítica con sustratos orgánicos; RESPECTO AL USO DE PECTINA COMERCIAL.
• La FS permite mayor superficie de intercambio aire/sustrato y el uso de mayor concentración de pectina en el medio favorece la síntesis de pectinasa debido a que no existe el problema de elevado viscosidad.
PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PECTINASA A PARTIR DE
PENICILLIUM CHRYSOGENUM
• Fermentación sumergida (35°C, pH 6.5)
• Penicillium chrysogenum
• Inóculo 106 esporas/mL
• Distintas fuentes de carbono: pectina, galactosa, sacarosa , manitol y glucosa.
• pH 6.5, 50°C y hasta 60 minutos para la mayor actividad enzimática.
• El proceso de purificación donde se obtuvo mejor recuperación fue precipitación con etanol (57.7%). El proceso este proceso se especifica en la “Propuesta 1” del apartado de Recuperación y Purificación de Pectinasas.
15
Recuperación y purificación de pectinasas
Propuesta 1.
Propuesta 2.
Filtración
Diálisis contra agua destilada
(24 h, 4 °C)
Liofilización
(polvo)
Resuspensión del polvo en Solución
tampón de acetato de sodio pH 5 0.1 M, saturado a 20%
sulfato de amonio
Centrifugación
(8,000 x g por 30 minutos)
Saturado a 80% sulfato de amonio
Recuperación precipitado centrifugación
Resuspensión en el mínimo volumen de solución tampón de
acetato de sodio
Diálisis
(contra agua destilada y luego contra solución tamón de acetato de
sodio)
Cromatografía Ultragel AcA 34
Cromatografía en CM Biogel-A
Cromatografía en DEAE Bio-gel A
Cromatografía en Ultragel Aca 44
Electroforesis
SDS-PAGE
Centrifugación (10,000 x g, 15 minutos a 4°C)
Recuperación del sobrenadante
Precipitación con etanol
(3 volúmenes de etanol incubado durante la
noche a 4°C)
Disolución del precipitado en 10 mL
de solución tampón de citrato de sodio (pH
6.5).
Diálisis
(contra agua destilada)
Liofilización a 5 mL
(para mayor purificación)
Filtración en gel
(SEPHADEX G-100 12%, columna de 1.5 x 45 cm, equlibrada con solución
tampón de citrato de sodio pH 6.5 y eluida con la misma
solución, 10 mL/h)
16
Propuesta 3.
Técnicas de extraccion y purificacion.
PECTINASAS
(Enzima Extracelular)
A partir del caldo de fermentación, separado por
centrifugación y/o filtración del micelio.
Se inició el proceso de extracción por fraccionamiento salino, con sulfato de amonio al 80% en frío
(4ºC) bajo agitación.
Cuando se disolvió completamente la sal, se dejó en reposo durante 12 horas y luego se centrifugó a 6500 rpm por 30
min.
El sobrenadante fue descartado y el sedimento fue lavado con sulfato de amonio al 80% .
Resuspendido en buffer Tris-HCl (pH 7,5) 20 mM; NaCl 350 mM y
Glicerol al 2%; extracto parcialmente purificado.
Dicho extracto fue sometido a una cromatografía de exclusión molecular, en Sephadex G-25, para eliminar el exceso de sal.
La columna fue equilibrada en el buffer de resuspensión y a las fracciones obtenidas se les determinó la presencia de sulfato de amonio, la cantidad de proteínas por estimación 260-280 nm y la actividad enzimática.
Este volumen fue concentrado por ultrafiltración usando
membranas de corte en 10 kD (AMICON).
El concentrado fue sometido a cromatografía en una columna
de DEAE-Sephacel (Sigma) equilibrada en Tris-HCl (pH 7,5)
10 mM. La elución de la proteína se efectuó mediante un
gradiente optimizado Rendimientos de purificación ver anexo 1
17
BIBLIOGRAFIA
Martínez trujillo, Aurora; Aranda, Juan S y Aguilar Osorio, Guillermo (2008). Kinetic study
on inducibility of polygalacturonases from Aspergillus flavipes FP-500. Electron. J.
Biotechnol. [online]. 2008, vol.11, n.4, pp. 8-9. ISSN 0717-3458. Jayani, Ranveer Singh; Saxena, Shivalika and Gupta, Reena; Microbial pectinolytic
enzymes: a review Process Biochemistry, vol 40, no. 9, pp: 2931-2944.
Visser, J. and Vorgen, A.G.J. eds (1996); Pectin sans pectinases: Proceeding of an
International Symposium (December 3er to 7th, 1995, Wageningen, The
Netherland). Progress in Biotechnology, 1996, vol 14, pp: 915-920
A. Rasheedha Banu, M. Kalpana Devi, G. R. Gnanaprabhal, B. V. Pradeep and M.
Palaniswamy (2010). Production and characterization of pectinase enzyme from
Penicillium chrysogenum. Indian Journal of Science and Technology Vol. 3 No. 4
(Apr. 2010) ISSN: 0974- 6846
Elizabeth Viguria, Giuliana Noratto, David Campos (2005). PRODUCCION DE PECTINASAS
MEDIANTE FERMENTACION SOLIDA A PARTIR DE Aspergillus foetidus NRRL 341,
UTILIZANDO RESIDUUOS DE NARANJA, MARACUYA Y LIMON. SMBB Veracruz, México.
18
Anexo 1 ARTÍCULO 1. BIOTRANSFORMACIÓN.
PRODUCCIÓN DE PECTINASAS MEDIANTE FERMENTACIÓN SÓLIDA A PARTIR DE Aspergillus
foetidus NRRL 341, UTILIZANDO RESIDUOS DE NARANJA, MARACUYA Y LIMON.
Elizabeth Viguria, Giuliana Noratto, David Campos. UNALM
Las enzimas pectinolíticas, poligalacturonasas (PG), pectinmetilesteras (PE) y pectinliasas (PL) son
utilizadas en la industria para la extracción y clarificación de jugos.
Estas son producidas a nivel industrial a partir de Aspergillus foetidus y principalmente mediante
fermentación sumergida. La técnica de la fermentación sólida en los últimos tiempos ha
despertado el interes de muchos investigadores, ya que constituye una alternativa importante por
sus requerimientos en equipos y sistemas de control menos costoso, menores gastos de energía,
menor generación de efluentes y los metabolitos son más concentrados reduciendo costos en la
purificación.
El objetivo del trabajo fue desarrollar un proceso de fermentación en sustrato sólido (FSS) para
producción de pectinasas a partir de residuos de naranja, maracuyá y limón.
Metodología.
Se inoculó 105 esporas de Aspergillus foetidus NRRL 341/ de medio preparado con residuos de
naranja, maracuyá y limón, previamente acondicionados y adición de fuente de nitrógeno y sales
minerales.
La fermentación se realizo a 30°C y se evaluó la influencia de la humedad (60, 70 y 80%), fuente de
pectina (comercial o procedente de los residuos) y concentración (0.125, 0.5, 1 y 2 %); presencia
de azucares reductores en el medio, fuente de nitrógeno y técnica de fermentación: FSS, respecto
a la fermentación sumergida FS.
Resultados y discusión.
El uso de residuos de naranja, maracuyá y limón con 80% de humedad permitió obtener mayor
actividad de PG, PL y PE debido a su complejidad y alto contenido de pectina con respecto a la
mezcla de pectina comercial. La actividad pectolítica se incremento en proporción a la
concentración de pectina comercial utilizada, demostrando el carácter inducible de la enzima.
La presencia de azucares reductores no ejerció efecto represor en la síntesis de pectinasas, más
bien favoreció el crecimiento y ello se reflejo en la mayor producción de pectinasas. Se logro la
mayor actividad PL a las 48 hrs de fermentación para los tres sustratos estudiados; PG entre 72 y
96 hrs y PE entre 48 y 96 hrs dependiendo del sustrato utilizado.
Cuando se evaluó la influencia de la técnica de fermentación, se encontró que con FS la
producción de PG, PL y PE fue inferior que con FSS, al respecto, menciona que esta técnica permite
19
mayor superficie de intercambio aire/sustrato y el uso de mayor concentración de pectina en el
medio favorece la síntesis de pectinasas debido a que no existe el problema de elevado viscosidad
que se genera en medio líquido lo que dificulta la agitación del medio e incorporación del oxígeno.
Conclusiones.
El uso de residuos de naranja, maracuyá y limón con 80% de humedad en FSS permite obtener
elevados niveles de actividad pectinolítica; RESPECTO AL USO DE PECTINA COMERCIAL. La técnica
FSS, permite obtener mayores niveles de actividad enzimática PG; PL y PE con respecto a la técnica
de fermentación sumergida.
PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PECTINASA A PARTIR DE PENICILLIUM CHRYSOGENUM A. Rasheedha Banu, M. Kalpana Devi, G. R. Gnanaprabhal, B. V. Pradeep and M. Palaniswamy Department of Microbiology, Karpagam University, Coimbatore - 641 021, Tamil Nadu, India [email protected]
La utilización de enzimas microbianas ha encontrado una amplia aplicación en diferentes procesos
industriales. Entre la variedad de enzimas comercializadas muchas son producto de la
fermentación de hongos filamentosos (Piccoli-valle et al., 2001). El género de Penicillium es
mundialmente conocido por la producción de metabolitos secundarios y enzimas extracelulares de
alto valor comercial, incluyendo las pectinasas.
El objetivo de este artículo era producir enzimas pectinolíticas a partir de una nueva cepa aislada de Penicillium chrysogenum por fermentación sumergida y la evaluación de proceso. Además, las características físico-químicas de la enzima también se reportaron.
20
Especificaciones de la Fermentación:
250 mL de medio de cultivo (Erlenmeyer 500 mL)
Inóculo 10% (106
esporas/mL)
Temperatura: 35 °C
pH: 6.5
Agitación: 175 rpm
Duración: 5 días
Medio de cultivo:
Compuesto g/L
Sacarosa 10
citrus pectin 10
(NH4)
2SO
4 1.4
K2HPO
4 6
KH2PO
4 2
MgSO4.7H
2O 0.1
Resultados:
Distintas fuentes de carbono y nitrógeno fueron estudiadas para la optimización
del medio de cultivo. Dichas fuentes se evaluaron respecto a la actividad
enzimática. La sacarosa y el persulfato de amonio la mejor fuente de carbono y
nitrógeno respectivamente.
De igual forma se estudiaron los efectos del pH y la temperatura sobre la
producción de pectinasas, siendo un pH de 6.5 y una temperatura de 35°C las
condiciones que optimizan la producción (Gráfica 2).
Se determinaron las condiciones óptimas para maximizar la actividad enzimática tales como el pH,
la temperatura y el tiempo de incubación con resultados de 6.5, 50°C y hasta 60 minutos
respectivamente.
Por último se determinó el peso molecular de la enzima mediante SDS-PAGE siendo de 31 kDa el
peso molecular de las pectinasas
En forma de resumen a los resultados obtenidos se presentan en la tabla las propiedades de la
enzima pectinasas y la proteína total producida y recuperada después del proceso de recuperación
y purificación (Tabla 2). El proceso de purificación en este proceso se especifica en la “Propuesta
1” del apartado de Recuperación y Purificación de Pectinasas
21
Tabla 1. Propiedades de la Pectinasa
Propiedades P. chrysogenum
pH óptimo 6.5
Temperatura optima (°C) 50
Termoestabilidad (min) 60
Vmax (U/ mg de proteína) 85
Km (mg/mL( 1.0
Peso Molecular (Kda) 31
Tabla 2. Purificación de la pectinasa a partir de P. chrysogenum
Fracción Proteína Total (mg)
Actividad Total (U)
Actividad específica (U/mg)
Purificación (veces)
Recuperación (%)
Filtrado 523.0 3818 7.30 1.0 100
Precipitación con etanol
67.8 2205 32.53 4.45 57.77
Sephadex G-100 (12%)
6.3 918 145.84 17.24 48.12
