日本薬学会日本薬学会129129年会年会 11

㈱ クロマニック テクノロジーズ

長 江 徳 和

シラノール基シラノール基は塩基性化合物のテーは塩基性化合物のテーリングの原因リングの原因 –– いや違う！いや違う！

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 22

【【緒言緒言】】

逆相型固定相中の残存シラノール基は，吸着や

ピークテーリング等の原因であるとされている

残存シラノール基に基づく主な相互作用は，吸着，

イオン交換，水素結合である

これらの二次効果相互作用を積極的に利用するこ

とで，極性化合物に対して特異的な保持を示す新

規な逆相固定相の創出が可能であると思われる

二次効果相互作用の制御方法として熱処理を行っ

たC18固定相を用いた塩基性化合物と金属配位性

化合物の分離を行った

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 33

シラノールの形態とピリジンのピークシラノールの形態とピリジンのピーク

OSi

O

OH

OSiSi

O

SiO

OH

Si

OH

OSi

O

HH

C18カラムを用いた場合の

ピリジンのピーク形状

60% CH3OH/H2O

Column AColumn B

Column C

Isolated Silanol

Vicinal Silanol

Geminal Silanol

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 44

疑問疑問

シラノール基は塩基性化合物のテーリングの原因か？

シリカゲルを用いた，逆相と同じ移動相で分離するヒリックモードでは，塩基性化合物はテーリングしない！

従って，シリカゲル表面に存在するシラノール基は塩基性化合物のテーリングの原因ではない

しかし，残存シラノール基を含むC18固定相では

塩基性化合物はテーリングする

なぜか？

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 55

シリカゲルによるシリカゲルによるヒリックモードのヒリックモードの塩基性化合物の分離塩基性化合物の分離

Waters技術資料より

塩基性化合物は有機溶媒と緩衝液の移動相でテーリングすることなく溶出する

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 66

シリカゲルのヒリックモードにおける保持機構シリカゲルのヒリックモードにおける保持機構

※日本ウォーターズ㈱資料を基に作成

Silica gel(HILIC)Gradient2.0mL/min

ODS silica(RP)Gradient1.4mL/min

1

2

2

O Si

O

OHO

Si

OH

O

Si

Si OH

O

SiO

O

Si

O

O

Si O

Si

O

Si

OSi

OSi

O

OH

O

OHO

Si

OH

O-

Si

O-

Si

O

O O-

OH

O-

OH

O

O

O OSi

Si

O

O

OSi

OH

OH

SiO OSi

O

O

O

Si

O

O

Si

O

Si

O

OO

O

SiO

O

SiO

O

OHO

O

O

O

Si

O

O

O

Si

OH

O

O O

Si

O

O

O

Si

O

O

O

O

O

Si

OO

OO

Si

SiO

O

Analyte

Analyte

Analyte

Mobile PhaseMobile Phase

ElectrostaticInteraction

HydrophilicPartitioning

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

1

Morphine3-β-D-Glucuronide

Morphine

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 77

逆相での塩基性化合物のテーリングの原因は？逆相での塩基性化合物のテーリングの原因は？

疎水場の近くに存在するシラノール基は，疎水場の影響により

水和が妨害され，不完全な水和状態である

シラノール基が安定に水和している状態では塩基性化合物はテーリングしない

シリカゲルを用いるヒリックモードでは塩基性化合物良好

もし不完全な水和状態のシラノール基が存在すれば

イオン交換的吸着により塩基性化合物はテーリングする

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 88

C18C18固定相の残存シラノール基の状態固定相の残存シラノール基の状態

高吸着性シラノール

O

Si

HO

Si

HO

SiO

O

SiSi

HO

HH

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 99

塩基性化合物をテーリングさせなくする方法塩基性化合物をテーリングさせなくする方法

水和の不十分な，または水和していないシラノール基をなくす

シラノール基のシロキサン化

疎水場近くのシラノール基のみシロキサン化，疎水場から離れた水和しているシラノール基はそのまま

塩基性化合物はテーリングせず，イオン交換相互作用で，保持増加

TMS化などのエンドキャッピング

エンドキャップにより，さらに疎水場が増え，全てのシラノール基をエンドキャップすることになる

塩基性化合物はテーリングしないが，疎水性が増し，保持は減少する

一般的なエンドキャップ型C18 新規なノンエンドキャップ型C18

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1010

C18C18固定相の残存シラノール基の状態固定相の残存シラノール基の状態

高吸着性シラノール

O

Si

HO

Si

HO

SiO

O

SiSi

HO

HH

シロキサン結合に変換

O

Si

HO

SiO

O

SiSi Si

OHH

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1111

【【実験実験】】

基材シリカゲル細孔径：12 nm，比表面積：340 m2/g，粒子径：5 µm

オクタデシルトリクロロシランの導入炭素含量：14%比較対象として，TMS化固定相も調製

熱処理 (真空乾燥機中で熱処理，シロキサン化)処理温度：200 °C，処理時間：48時間

有機溶媒/緩衝液で水和出来る部位の再シラノール化

比較対照として，未熱処理固定相も調製

評価カラム：内径4.6 mm，長さ150 mm移動相：メタノールまたはアセトニトリル/水または緩衝液

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1212

ピリジンピリジンののピークピーク形状形状比較比較

移動相: CH3OH/H2O(30:70)流 速: 1.0 mL/min温 度: 40 ºC試 料: 1=ウラシル

②②==ピリジンピリジン

3=フェノール

a)

b)

c)

１

１

１

3

②②

3

3

0 5 10 15 20Retention time / min

②②

②②

熱処理C18Sunrise C18-SAC

未熱処理C18

TMS化C18Sunrise C18

OH

NNH

NH

O O

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1313

キサンチン類の分離キサンチン類の分離

カラムサイズ：4.6 x 150 mm移動相：メタノール/20mMリン酸二水素カリウム pH4.5 (30:70) 流 速：1.0 mL/min温 度：40 ºC

1=テオブロミン 2=テオフィリン

3= カフェイン 4=フェノール

N

N NH

NH

O

CH3

O

CH3

N

N N

NH

O

CH3

O

CH3

CH3 OH

N

NH N

NH

O

O

CH3

CH3

熱処理C18Sunrise C18-SAC

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Time (min)

1

1

2

2

3

3

4

4

TMS化C18Sunrise C18

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1414

三環系抗うつ剤の分離三環系抗うつ剤の分離

TMS化 C18 Sunrise C18

アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH6.0 (80:20)

熱処理C18 Sunrise C18-SAC

アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH6.0 (80:20)

1

23

4

5

1

23

4

5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

保持時間(min)

NH

NH

O OO

OH

NH CH3

CH3

NHCH3

NCH3

CH3

1=ウラシル 2=プロプラノロール 3=ノルトリプチリン 4=アミトリプチリン 5=トルエンCH3

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1515

移動相移動相pHpHによる保持時間の制御による保持時間の制御

イオン交換相互作用の保持機構が働く成分は移動相pHにより保持を大きく変化させることが可能

アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH3.0 (50:50)

アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH4.5 (50:50)

1

1

2

2

3

3

4

5

5

カラム：TMS化C18, Sunrise C184.6 x 150 mm

熱処理C18, Sunrise C18-SAC4.6 x 150 mm

流速：1.0 mL/min温度：40 ºC試料：1=ウラシル，2=プロプラノロール，

3=ノルトリプチリン，4=アミトリプチリン，5=トルエン

アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH6.0 (80:20)

1

2 34

5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

保持時間(min)

4

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1616

酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の分離：分離：pHpHの影響の影響

0 5 10 15 20 25 30 35 40保持時間(min)

カラム：熱処理C18，Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm移動相：

アセトニトリル/100mM 酢酸アンモニウム (70:30)流速：1.0 mL/min温度：40 ºC試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール，

4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン

pH 6.8

pH 4.1

pH 5.0

pH 5.9

pH 3.5

pH 2.7

N=13,000

N=12,500

N=11,500

N=11,500

N=11,500

1

1

1

1

1

1

2

2

2

2

2

2

3

3

3

3

3

3 4

4

4

4

4

4

5

5

5

5

5

5

アンチカオトロピックイオンであるアンモニウムイオンが安定な水和層を形成

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1717

酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の分離：塩濃度の影響分離：塩濃度の影響

カラム：熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm

移動相：

アセトニトリル/ 酢酸アンモニウム pH 4.1 (70:30)流速：1.0 mL/min温度：40 ºC試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール，

4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン

25 mM

100 mM

50 mM

200 mM

15

5

5

5

4

4

4

4

3

3

3

3

2

2

2

2

1

1

1

N=13,500

N=12,000

N=12,500

N=13,000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26保持時間(min)

10 mM 543

21

N=12,000

25 mM

100 mM

50 mM

200 mM

15

5

5

5

4

4

4

4

3

3

3

3

2

2

2

2

1

1

1

N=13,500

N=12,000

N=12,500

N=13,000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26保持時間(min)

10 mM 543

21

N=12,000

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1818

緩衝液濃度と保持指数との関係緩衝液濃度と保持指数との関係

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0log [buffer concentration]

log

k

0

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

N [a

mitr

ipty

line]

Toluene Propranolol Nortriptyline Amitriptyline N (ami)

log log[ ] log[ ] log logkzz

Azz

AVV z

KB

A

B

A

r

m AAB= − + + +

1

AA：：溶離剤イオン，溶離剤イオン，BB：測定：測定イオン，イオン， kk：：BBの保持指数，の保持指数，KK：：選択係数選択係数ZZAA, , ZZBB：各：各イオンの電荷イオンの電荷，，VVrr, , VVmm：カラム内の樹脂体積と移動相体積：カラム内の樹脂体積と移動相体積

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 1919

緩衝液の塩の保持時間への影響緩衝液の塩の保持時間への影響

リン酸

ナトリウム

クエン酸

ナトリウム

酢酸

ナトリウム

ギ酸

ナトリウム

リン酸

アンモニウム

クエン酸

アンモニウム

酢酸

アンモニウム

ギ酸

アンモニウム

トリス

0

5

10

15

20

25

プロカインアミド

N-アセチルプロカインアミド

保持時間

(分）

カラム：熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm

移動相：メタノール/20mM 緩衝液 pH 6.8 (50:50)流速：1.0 mL/min温度：40 ºC試料：1=プロカインアミド

2=N-アセチルプロカインアミド

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 2020

リン酸

ナトリウム

クエン酸

ナトリウム

酢酸

ナトリウム

ギ酸

ナトリウム

リン酸

アンモニウム

クエン酸

アンモニウム

酢酸アンモニウム

ギ酸

アンモニウム

トリス

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

プロカインアミド

N-アセチルプロカインアミド

緩衝液の塩のピーク対称性への影響緩衝液の塩のピーク対称性への影響対称性

（テーリングファクター）

カラム：熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm

移動相：メタノール/20mM 緩衝液 pH 6.8 (50:50)流速：1.0 mL/min温度：40 ºC試料：1=プロカインアミド

2=N-アセチルプロカインアミド

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 2121

金属配位性化合物の分離金属配位性化合物の分離

カラム：他社高純度ODS 5μm, 4.6x150 mm熱処理C18, Sunrise C18-SAC4.6x150 mm

移動相：A)アセトニトリル/20mM リン酸 (10:90)B)アセトニトリル/50mM ギ酸 (10:90)C)アセトニトリル/50mM 酢酸 (10:90)

流速：1.0 mL/min温度：40 ºC試料：1=8-キノリノール，2=カフェイン

0 2 4 6 8 10 12 14 16保持時間(min)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22保持時間(min)

1 2

1

1

1

1

1

2

2

2

2

2

A: 20mM リン酸

C: 50mM 酢酸

B: 50mM ギ酸

他社高純度ODS 熱処理C18Sunrise C18-SAC

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 2222

核酸塩基類の分離例核酸塩基類の分離例

カラム：熱処理C18, Sunrise C18-SAC, 5 µm4.6 x 150 mm

移動相： 20 mM KH2PO4 pH4.5流 速： 1.0 mL/min温 度： 25 ºC試 料： 1=シトシン

2=ウラシル

3=シチジン

4=チミン

＊=不純物

12

4

3

Retention time / min0 5 10 15

＊

N

NH

O NH2

NH

NH

O O

N

N

O NH2

O

H

OH

OH

H

CH3

HOH

NH

NH

O O

CH3

日本薬学会日本薬学会129129年会年会 2323

【【まとめまとめ】】

C18固定相中にシラノール基を高度に残存させることにより，極性化合物，特に塩基性化合物の保持を増加させることが可能であった

熱処理により調節されたシラノール基は塩基性化合物をテーリングさせなかった

さらに，シラノール基によるイオン効果相互作用が認められ，塩基性化合物の保持を移動相のpHや塩濃度により調整可能であった

金属配位性化合物の分離に有効であり，詳細は未解明であるが，シラノール基の水和状態や特性の変化が金属不純物の影響の抑制に寄与していると推定された