Evaluasi Komponen Bioaktif Tanaman untuk Kesehatanseafast.ipb.ac.id/tpc-project/wp-content/uploads/2013/10/MODUL-TPC... · menghasilkan kurva oksidasi, dan titik belok dikenal sebagai

MODUL

EVALUASI KOMPONEN BIOAKTIF TANAMAN UNTUK KESEHATAN

(EVALUATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS OF PLANTS FOR HEALTH)

Oleh:

Nurheni Sri Palupi

Southeast Asian Food And Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center

Research and Community Service Institution BOGOR AGRICULTURAL UNIVERSITY

http://seafast.ipb.ac.id

DISCLAIMERThis publication is made possible by the generous support of the American

people through the United States Agency for International Development (USAID).

The contents are the responsibility of Texas A&M University and Bogor Agricultural

University as the USAID Tropical Plant Curriculum Project partners and do

not necessarily reflect the views of USAID or the United States Government.

Tropical Plants Curriculum

Nurheni Sri Palupi 1 | H a l a m a n

MODUL

Evaluasi Komponen Bioaktif Tanaman untuk Kesehatan (Evaluation of Bioactive Compounds of Plants for Health)

Nurheni Sri Palupi

Sejalan dengan meningkatnya kesadaran masyarakat akan pentingnya hidup sehat,

dan berkembangnya pemikiran back to nature maka penggunakan produk-produk alami

untuk mendukung kesehatan seseorang semakin meningkat. Penggunaan bahan-bahan

sintetis untuk pengobatan atau pencegahan terhadap suatu penyakit selain menyebabkan

ketergantungan, juga harganya relatif mahal dan kemungkinan menimbulkan bahaya

bagi kesehatan. Keadaan tersebut mendorong dilakukannya eksplorasi berbagai

komponen bioaktif asal tanaman. Berdasarkan Badan Kesehatan Dunia (WHO), hampir

sekitar 80 persen penduduk dunia menggantungkan pengobatan secara tradisional

menggunakan ekstrak utuh atau komponen bioaktifnya untuk pertolongan pertama

terhadap gangguan kesehatan. Komponen bioaktif merupakan senyawa di luar zat gizi

yang biasanya berada dalam jumlah kecil di dalam suatu bahan pangan. Senyawa tersebut

banyak dipelajari secara intensif untuk menguji khasiatnya terhadap kesehatan.

Beberapa studi epidemiologi menunjukkan bahwa mengonsumsi bahan pangan

berbahan baku tanaman dapat memberikan efek pertahanan terhadap penyakit jantung

koroner (cardiovascular disease/CVD) dan kanker. Hingga saat ini telah banyak ditemukan

senyawa bioaktif, yang dapat dikelompokkan berdasarkan struktur kimia dan fungsinya.

Senyawa fenolik yang merupakan kelompok flavonoid, banyak dijumpai hampir pada

semua tanaman dan yang telah dipelajari secara ekstensif adalah yang terkandung dalam

serealia, polong-polongan, kacang-kacangan, sayuran, buah-buahan, teh, dan sebagainya.

Banyak senyawa fenolik menunjukkan aktivitasnya sebagai antioksidan, dan beberapa

studi telah menunjukkan manfaatnya terhadap penyakit trombosis dan tumorogenesis.

Meskipun beberapa studi epidemiologi telah melaporkan manfaat perlindungan dari

senyawa flavonoid atau fenolat lain terhadap cardiovascular deaseas (CVD) dan kanker,

namun hasil penelitian lain tidak menemukan manfaat tersebut. Berbagai fitoestrogen

yang terdapat dalam kedelai, biji-bijian, buah-buahan, dan sayuran juga memiliki sifat

antioksidan. Beberapa studi baik menggunakan model hewan percobaan maupun kultur

sel kanker, menunjukkan efek menguntungkan terhadap faktor-faktor risiko CVD lainnya.

Namun, karena fitoestrogen bertindak baik sebagai agonis estrogen secara parsial

maupun antagonis, efeknya terhadap kanker cenderung kompleks. Hidroksitirosol

(hydroxytyrosol) yang merupakan salah satu senyawa fenolat dalam minyak zaitun

merupakan antioksidan kuat. Senyawa resveratrol yang ditemukan dalam kacang-

kacangan dan anggur merah, menunjukkan aktivitas antioksidan, antitrombotik, anti-

inflamasi, dan menghambat karsinogenesis. Likopen yang merupakan antioksidan

karotenoid kuat yang terkandung dalam tomat dan buah-buahan lainnya, diperkirakan



dapat melindungi terhadap penyakit kanker prostat dan kanker lainnya, serta

menghambat pertumbuhan sel tumor pada hewan. Organosulfur senyawa dalam bawang

putih dan bawang, isotiosianat dalam sayuran, serta monoterpen dalam buah jeruk, ceri,

dan rempah-rempah memiliki aktivitas sebagai antikanker serta kardioprotektif. Singkat

kata, senyawa bioaktif banyak memiliki kontribusi yang baik terhadap kesehatan. Banyak

penelitian ilmiah perlu dilakukan sebelum kita dapat memberikan rekomendasi diet yang

berlandaskan ilmu pengetahuan. Namun demikian, mengonsumsi bahan pangan yang

banyak mengandung senyawa bioaktif terbukti dapat direkomendasikan. Dengan kata lain

dapat dianjurkan untuk mengonsumsi diet yang kaya komponen bioaktif dalam berbagai

buah-buahan, sayuran, biji-bijian, kacang-kacangan, minyak, dan kacang-kacangan.

Komponen bioaktif yang juga dikenal sebagai komponen pangan non gizi

merupakan senyawa xenobiotik yang terdapat secara alamiah dalam bahan pangan.

Selain seperti yang telah disebutkan sebelumnya, khlorofil pada daun-daunan, karotenoid

yang berwarna kuning jingga pada sayuran dan buah-buahan, antosianin yang berwarna

ungu, komponen fenolik juga merupakan senyawa bioaktif. Senyawa alamiah ini,

meskipun merupakan senyawa xenobiotik, dalam proses ekskresinya dari tubuh tidak

menghasilkan senyawa metabolit reaktif dan sering menstimulir aktivitas enzim fase 2

yang bersifat melarutkan dan antikarsinogen. Komponen bioaktif dalam proses

pencernaan akan terlepas dari matriks pangan dan dapat terserap kedalam darah, dibawa

menuju hati. Setelah sampai di hati sebagian akan mengalami metabolisme sebagian akan

terdistribusi ke sel-sel lain dalam tubuh dan menjadi tersedia (bioavailable) untuk

metabolisme di tingkat seluler. Salah satu keuntungan dari senyawa-senyawa ini adalah

sifatnya sebagai antioksidan yang dapat menangkal senyawa radikal sehingga mencegah

kerusakan sel.

Secara umum, bahan pangan baik olahan maupun segar dapat merupakan sumber

komponen bioaktif yang bermanfaat bagi tubuh. Pada dasarnya aktivitas senyawa bioaktif

yang secara fisologis mendukung kesehatan dihubungkan dengan tiga sistem regulasi di

dalam tubuh, yaitu sistem imun, sistem hormon (endokrin) dan sistem saraf. Manfaat

komponen bioaktif terhadap kesehatan dapat dievaluasi atau ditentukan dengan

melakukan pengujian-pengujian, baik secara kimia, biokimia maupun biologi. Sebagian

besar pengujian komponen bioaktif dikaitkan dengan kemampuannya sebagai

antioksidan, antikanker, antihiper-kolesterolemia, antidiabetik, antitrombosis maupun

sebagai imunomodulator. Berbagai teknik pengujian terkait dengan kemampuan

komponen bioaktif dalam mendukung kesehatan tersebut akan dibahas selanjutnya.

A. Pengujian Komponen Bioaktif Sebagai Antioksidan

1. Pengujian Aktivitas Antioksidan, metode ransimat (Metrohm, 1999)

Metode rancimat banyak digunakan dalam industri pangan terutama untuk

mendeteksi adanya kerusakan oksidatif. Beberapa komponen bahan pangan sensitif



terhadap oksidasi, misalnya vitamin, asam amino dan asam lemak tak jenuh. Selain itu,

aktivitas senyawa fenol sebagai antioksidan yang terkandung banyak dalam tanaman,

juga dapat diuji menggunakan metode ini. Pada prinsipnya metode rancimat

menggunakan aliran udara yang dihembuskan melalui sampel pada suhu antara 50-

220oC, sehingga akan mengoksidasi asam lemak dalam beberapa tahap. Oksidasi akan

berlangsung berdasarkan reaksi radikal berantai, yang pada akhirnya akan terbentuk

produk-produk oksidasi yang bersifat mudah menguap, terutama asam formiat. Senyawa

tersebut akan ditransfer oleh aliran udara ke dalam tabung yang mengandung air

deionisasi, dan konduktivitas akan terukur. Plotting konduktivitas terhadap waktu

menghasilkan kurva oksidasi, dan titik belok dikenal sebagai periode induksi.

Sebanyak satu ml sampel ditambahkan ke dalam 10 ml minyak kedelai murni dan 3

ml tween 80 ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Setelah campuran dikocok, lalu

ditimbang 3 g dan dimasukkan ke dalam tabung ransimat untuk dianalisis menggunakan

alat ransimat pada 100oC. Metode ini menggunakan kontrol negatif minyak kedelai murni

dan kontrol positif campuran 200 ppm BHT dalam minyak kedelai murni. Alat ransimat

akan memberikan data berupa periode induksi (PI). Aktivitas antioksidan ditentukan

dengan rumus :

2. Analisis Kadar Total Fenol Metode Folin-Ciocalteu (Nantitanon et al. 2010 yang

dimodifikasi)

Pada prinsipnya total fenol dapat diukur berdasarkan kemampuan reagen Folin-

Ciocalteu (campuran fosfomolibdat dan fosfotungstat) dalam mereduksi gugus hidroksi

dari fenol. Inti aromatis pada senyawa fenol, yang berupa gugus hidroksi fenolik, dapat

mereduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat menjadi molibdenum yang berwarna biru.

Kandungan fenolik total dalam tumbuhan dinyatakan dalam GAE (Gallic Acid Equivalent)

yaitu jumlah kesetaraan miligram asam galat dalam 1 gram sampel.

Ekstrak pekat sampel dilarutkan dalam etanol absolut hingga diperoleh konsentrasi

akhir 0.2 mg/mL. Sebanyak 20 µL larutan ekstrak dalam etanol dicampurkan dengan 45 µL

reagen Folin-Ciocalteu dan didiamkan 3 menit. Sebanyak 135 µL Na2CO3 2 g/100 mL

ditambahkan ke dalam campuran, divorteks dan disimpan di tempat gelap pada suhu

ruang, 2 jam dan divorteks. Absorbansinya dibaca dengan spektrofotometer pada 750

nm. Asam galat digunakan sebagai standar sehingga satuannya dinyatakan dalam mg

GAE/100 mg ekstrak. Kurva standar dibuat menggunakan asam galat (0-130 µg/ml).

Selain itu kurva standar juga bisa dipersiapkan dengan menggunakan asam tanat dalam

etanol 95% dengan konsentrasi 0, 5, 10, 15, 20, dan 25 ppm.

Kadar total polifenol dihitung berdasarkan persamaan garis yang diperoleh dari

kurva standar. Absorbansi yang diperoleh diplotkan pada kurva standar. Kadar total

polifenol dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut:



Keterangan: A = absorbansi sampel pada panjang gelombang 750 nm S = slope kemiringan pada kurva standar Fp = faktor pengenceran W = berat sampel (mg)

3. Aktivitas Antioksidan, Metode DPPH (Kubo et al. 2002 yang dimodifikasi)

Pada prinsipnya pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan mereaksikan sampel dengan radikal bebas DPPH, buffer asetat dan etanol dalam methanol sehingga terbentuk warna ungu. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil. Tingginya aktivitas antioksidan pada sampel akan ditunjukkan oleh banyaknya DPPH yang direduksi yang terlihat dengan semakin pudarnya warna ungu. Warna yang terbentuk dibaca dengan spektrofotometer pada 517 nm. Trolox digunakan sebagai standar yang merupakan analog vitamin E yang larut dalam air. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam satuan TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity).

Analisis dilakukan dengan memasukkan 1 ml buffer asetat 100 mM (pH 5.5), 1.87 ml etanol dan 0.1 ml radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 3 mM dalam metanol ke dalam tabung reaksi. Kemudian sebanyak 0.03 ml larutan sampel ditambahkan ke dalam tabung tersebut, divorteks dan diinkubasi pada 25oC, selama 20 menit. Sebagai kontrol digunakan 0.03 ml aquades sebagai pengganti sampel. Kemudian absorbansinya diukur pada 517 nm. Standar digunakan adalah Trolox ® (6-Hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) 0; 1.25; 2.5 dan 5 mM sehingga satuannya dinyatakan dalam TEAC. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging atau aktivitas antioksidan.

B. Pengujian Komponen Bioaktif sebagai Antikanker

1. Pengujian secara in vitro

a. Persiapan media kultur dan pereaksi

Pembuatan Larutan RPMI 1640. Media yang digunakan untuk kultur sel adalah RPMI-

1640. Komposisinya dapat dilihat pada Lampiran 2. Bubuk RPMI sebanyak 10.42 g

dilarutkan dalam 1 liter aquabidest, kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1% penisilin-

streptomisin. Untuk kultur 90 ml RPMI-1640 ditambahkan 10 ml Fetal Bovine Serum

(FBS). Larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm.

Pembuatan MTT 0.5%. Bubuk MTT sebanyak 0.25 g dilarutkan dalam 50 ml PBS dan

diaduk hingga homogen. Larutan disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm.

Pembuatan Larutan HCl-isopropanol 0.04 N. Dipipet sebanyak 23.4 μl HCl 37% (pekat)

dan ditambahkan 8.9766 ml isopropanol p.a, kemudian diaduk sampai homogen sehingga



didapatkan larutan HCl-isopropanol 0.04 N. Larutan ini harus dibuat segar setiap kali

hendak digunakan.

Pembuatan larutan Concanavalin-A. Sebanyak 1 mg Con-A dilarutkan dengan sedikit

larutan RPMI-1640, diaduk hingga rata, kemudian dimasukkan dalam labu ukur 5 ml dan

ditambahkan larutan RPMI-1640 hingga tanda tera. Larutan stok tersebut divorteks

hingga homogen. Larutan tersebut disterilisasi dengan menggunakan membran steril 0.20

μm . Larutan stok tersebut disimpan direfrigerator. Pada saat persiapan kultur, diambil

sebanyak 0.2 mg larutan Con-A, selanjutnya dilarutkan dalam 0.8 ml larutan RPMI-1640.

Pembuatan larutan lipopolisakarida (LPS). Sebanyak 1 mg lipopolisakarida dilarutkan

dengan sedikit larutan RPMI-1640 dan diaduk hingga rata. Selanjutnya larutan tersebut

dimasukkan dalam labu ukur 5 ml dan ditambahkan larutan RPMI-1640 hingga tanda tera.

Larutan stok tersebut divorteks hingga homogen. Larutan LPS disterilisasi dengan

menggunakan membran steril 0.20 μm . Larutan stok tersebut disimpan di refrigerator.

Pada saat persiapan kultur, diambil sebanyak 0.2 mg larutan LPS tersebut dilarutkan

dalam 0.8 ml larutan RPMI-1640.

b. Pengenceran larutan stok dan pemeliharaan kultur sel kanker

Banyak alur sel kanker yang dapat digunakan untuk pengujian, namun pada modul

ini hanya akan dijelaskan untuk sel kanker K-562, sedangkan penggunaakn sel yang lain

pada prinsipnya sama, yang perlu mendapatkan perhatian adalah penggunaan media

pertumbuhan yang tepat. Perlu diketahui bahwa setiap jenis sel memerlukan media

pertumbuhan optimum yang berbeda-beda. Misalnya sel kanker K-562 dan hibridoma

MARK-3 baik tumbuh pada media RPMI, sedangkan sel HeLa lebih cocok tumbuh pada

medium DMEM. Untuk itu maka media yang digunakan untuk pertumbuhan dan

pemeliharaan sel K-562 adalah media RPMI 1640 yang disuplementasi dengan 10% serum

anak sapi (newborn bovine serum-NBS), serum janin sapi (fetal calf serum-FCS) atau

serum janin sapi (fetal bobine serum-FBS), serta gentamycin untuk menghambat

pertumbuhan bakteri (Palupi et al. 2000).

Sel K-562 dalam keadaan beku diencerkan (thawing) dengan meletakkan ampul

berisi sel beku di dalam penangas air (waterbath) pada suhu 37oC. Setelah mencair,

dengan segera sel dipindahkan ke dalam tabung sentrifus steril kemudian ditambahkan 5

ml media pencuci (PBS), selanjutnya disentrifus pada kecepatan 1000 rpm selama 5

menit. Supernatan dibuang dan ke dalam tabung sentrifus yang berisi endapan sel

ditambahkan 5 ml media pertumbuhan. Suspensi sel dipindahkan ke dalam tabung kultur

berukuran 10 cm2 dengan penambahan media pertumbuhan sebanyak 10 ml. Suspensi

sel diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC.

Pemeliharaan sel kanker dilakukan dengan mengganti media pertumbuhan, apabila

telah terjadi perubahan warna media (sebagai indikator terjadinya perubahan pH), dan

apabila pertumbuhan selnya sudah rapat (pengamatan menggunakan mikroskop).



Penggantian media kultur dilakukan dengan memindahkan suspensi sel ke dalam tabung

sentrifus steril, kemudian disentrifus pada kecepatan 1000 rpm selama 5 menit.

Supernatan dibuang dan endapan sel ditambah dengan media pencuci lalu disentrifus

kembali pada kecepatan dan waktu yang sama. Supernatan dibuang dan endapan sel

ditambah 5 ml media kultur baru lalu diaduk perlahan. Suspensi sel dimasukkan ke dalam

tabung kultur dan ditambah 10 ml media pertumbuhan kemudian diinkubasi.

Pemeliharaan sel dilakukan hingga diperoleh jumlah sel yang mencukupi untuk pengujian

antiproliferasi sel kanker. Penghitungan sel kanker dilakukan dengan metode trifan biru.

c. Kultur sel

Sebanyak 850 µL media RPMI yang telah mengandung FBS 10% dimasukkan ke

dalam tiap sumur pada lempeng dengan 24 sumur. Kemudian sebanyak 50 µL suspensi

sel dimasukkan ke dalam tiap sumur, selanjutnya sebanyak 100 µL sampel dan kontrol

dimasukkan ke dalam sumur sehingga setiap sumur berisi 1000 µL. Sebagai kontrol positif

antikanker digunakan senyawa doxorubicin sebanyak 6 µL dan 94uL media standar,

sedangkan kontrol negatif digunakan media standar. Inkubasi kultur dilakukan selama tiga

hari (3x24 jam).

d. Pemanenan dan penghitungan sel dengan metode trifan biru (trypan blue)

Setelah diinkubasi selama tiga hari, suspensi sel dalam tiap sumur diaduk perlahan-

lahan dengan mikropipet hingga homogen. Kemudian sebanyak 90 L suspensi tersebut

dipipet ke dalam salah satu sumur pada lempeng 96 sumur dan ditambahkan dengan 10

L larutan trifan biru 0,4%. Lalu campuran suspensi sel dan trifan biru tersebut dikocok

hingga homogen. Larutan suspensi sel dan trifan biru tersebut kemudian diteteskan di

atas hemasitometer dan ditutup secara perlahan-lahan dengan gelas penutup hingga

semua bagian di bawah gelas penutup dipenuhi larutan tersebut.

Penghitungan sel dilakukan dengan bantuan mikroskop cahaya menggunakan

perbesaran 40X. Sel yang dihitung adalah sel berbentuk bulat yang berada dalam 25 kotak

pada bagian tengah hemasitometer. Jumlah total sel adalah jumlah seluruh sel yang

hidup dan mati. Sel yang hidup tidak akan berwarna, sedangkan sel yang mati akan

berwarna biru. Jumlah sel per ml, persen proliferasi dan antiproliferasi dihitung dengan

rumus :



e. Pengujian aktivitas antiproliferasi, metode MTT (Kubota et al. 2003)

Pada pengujian ini menggunakan lempeng kultur dengan 96 sumur. Jumlah sel

kanker yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1.5 x 105 sel/ml dalam media RPMI

steril. Sebanyak 100µL larutan sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam sumur pada

lempeng kultur, sebanyak 50 µL suspensi sel ditambahkan ke dalam sumur dan

selanjutnya diinkubasi selama dua hari. Pada 6 jam sebelum masa inkubasi berakhir,

ditambahkan 100µl larutan MTT 0.5% (dalam PBS) ke dalam suspensi sel pada setiap

sumur lempeng mikrokultur. Pada akhir masa inkubasi, sebanyak 100µl HCl-isopropanol

0.04N ditambahkan ke dalam setiap sumur, selanjutnya absorbansi diukur menggunakan

microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. Jumlah sel hidup akan proposional

dengan nilai OD hasil pembacaan. Indeks penghambatan proliferasi sel kanker K-562

dinyatakan sebagai berikut :

2. Pengujian secara in vivo

a. Persiapan hewan percobaan

Pengujian aktivitas komponen bioaktif terhadap proliferasi limfosit secara in vivo

dilakukan menggunakan mencit sebagai hewan percobaan. Mencit yang digunakan

adalah mencit berumur 30 hari dengan jumlah 5-7 ekor untuk masing-masing perlakuan.

Mencit diadaptasikan selama dua minggu. Selama masa adaptasi mencit diberi

ransum dan minuman secara ad libitum. Formulasi makanan mencit yang diberikan

menurut American Institute of Nutrition (2003). Mencit yang digunakan menpunyai berat

antara 23 gram hingga 28 gram Masing-masing dikelompokkan berdasarkan

perlakuannya. Setiap hari mencit diberi makanan, minuman standar dan dicekok ekstrak

sampel dengan dosis yang diujikan. Kelompok kontrol dicekok air minum. Setiap minggu

dilakukan pembedahan terhadap masing-masing kelompok dengan masing-masing

perlakuan. Pembedahan berfungsi untuk mengambil organ limfa dan selanjutnya dihitung

jumlah sel limfositnya.

b. Persiapan media dan pereaksi

Pembuatan larutan NH4Cl 0.85%. Bubuk NH4Cl sebanyak 0.85 g dilarutkan dalam

100 ml aquabidest dan diaduk hingga homogen. Larutan tersebut selanjutnya disterilisasi

dengan membran sterilisasi 0.20 μm.

Pembuatan Indikator Tryphane Blue 0.20%. Sebanyak 0.05 g bubuk trifan biru

dilarutkan dalam 20 ml PBS dan diaduk hingga homogen.

Pembuatan Larutan RPMI 1640. Media yang digunakan untuk kultur sel adalah

RPMI-1640. Komposisinya dapat dilihat pada Lampiran 2. Bubuk RPMI sebanyak 10.42 g



dilarutkan dalam 1 liter aquabidest, kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1% penisilin-

streptomisin. Larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm.

Pembuatan Phosphate Buffer Saline (PBS). Komposisi PBS yang digunakan dapat

dilihat pada Lampiran 3. Semua bahan tersebut dicampur dan dilarutkan dalam 500 ml

aquabidest dan diatur hingga mencapai pH 7.2. Kemudian larutan tersebut disterilisasi

dengan membran sterilisasi 0.20 μm.

c. Pembedahan dan isolasi dan penghitungan sel limfosit

Mencit diterminasi dengan cara dislokasi cervicalis dan dibedah untuk diambil

limfanya secara steril (Gambar 1). Limfa dicuci dalam RPMI-1640 steril, selanjutnya limfa

dipindahkan ke dalam cawan petri lain yang berisi 3 ml RPMI-1640 steril. Limfa tersebut

digerus sehingga didapatkan sel limfosit. Gerusan tersebut dimasukkan ke dalam tabung

sentrifus steril 15 ml, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10

menit. Supernatan dibuang, pelet sel diberi 2 ml NH4Cl 0.85% steril untuk melisis sel-sel

darah merah selama 2 menit dan segera ditambahkan 3 ml RPMI-1640. Suspensi sel

kembali di sentrifus 3000 rpm selama 10 menit.

Gambar 1. Pengambilan organ limfa serta hati

Endapan mengandung sel limfosit, sedangkan supernatan yang berisi sel darah

merah yang telah lisis. Selanjutnya supernatan dibuang dengan menggunakan pipet

pasteur. Endapan sel limfosit dicuci kembali dengan RPMI-1640. Endapan yang sudah

dicuci, diencerkan dengan 2 ml media RPMI-1640 dan selanjutnya dihitung jumlah sel

yang hidup dengan bantuan pewarna tryphan blue serta hemasitometer. Jika 95% sel

limfositnya hidup, maka suspensi sel limfosit dapat diencerkan dengan RPMI-1640 agar

diperoleh jumlah sel (sel/ml) yang sesuai dengan yang diperlukan.



Suspensi sel dalam media standar dihitung dengan bantuan hemasitometer.

Suspensi sel dicampur dengan tryphan blue dengan perbandingan 1: 1. Sebanyak 50 μl

campuran ditempatkan dalam hemasitometer. Penghitungan dilakukan dengan pada

perbesaran mikroskop 45 kali, sel yang hidup akan tidak berwarna sedangkan sel yang

mati terlihat biru seluruhnya. Jumlah sel yang hidup dihitung pada area 2 kotak besar (@

16 kotak kecil) lalu dihitung per ml suspensi dengan rumus:

Jumlah sel/ml = jumlah sel x fp x 104, dimana fp = 2

Sel yang terhitung merupakan proliferasi limfosit mencit secara in vivo. Sel limfosit yang

diperoleh digunakan sebagai kultur sel. Jumlah sel minimum dalam suspensi yang

digunakan untuk kultur limfosit minimal adalah 1x105 sel dengan 95% limfositnya hidup

(Tejasari et al. 2000).

C. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Antihiperkolesterolemia

Pengujian senyawa bioaktif sebagai antihiperkolesterolemia dapat dilakukan dengan

mengukur total kolesterol, high density lipoprotein (HDL), trigliserida, low density

lipoprotein (LDL), penetapan indeks aterogenik, dan malonaldehida (MDA) dalam serum

darah sebagai parameternya.

1. Analisis Total Kolesterol (Metode CHOD-PAP)

Prinsip pengujian ini adalah mengoksidasi kolesterol hasil hidrolisis secara enzimatis. Hasil oksidasi tersebut menghasilkan senyawa kuinin (quinine) yang berwarna merah, sehingga dapat dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm. Prosedur analisis disajikan pada Gambar 2. Komposisi reagen kolesterol terdapat di Tabel 1. Nilai kadar kolesterol didapat dari persamaan berikut :

Kadar kolesterol (mg/dl) = (A sampel : A standar) x 200 mg/dl

Gambar 2. Prosedur Analisis Total Kolesterol.

0,01 ml serum/standar ditambah 1 ml reagen kolesterol

Dicampur

Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit

Dibaca absorbansi (A) pada λ 500 nm



Tabel 1. Komposisi Reagen Kolesterol

Komposisi Jumlah

Good’s buffer pH 6.7 50 mmol/l Phenol 5 mmol/l 4-aminoantipyrine 0.3 mmol/l Kolesterol esterase >_ 200 U/I Kolesterol oksidase >_50 U/I Poroksidase >_ 3 kU/I Standar 200 mg/dl (5.2 mmol/l)

2. Analisis High Density Lipoprotein (HDL) (Metode CHOD-PAP)

Prinsip analisis HDL adalah dengan cara mengendapkan kilomikron, VLDL, dan LDL dengan menambahkan asam fosfotungstat dan ion Mg. Proses sentrifugasi akan memisahkan HDL dalam supernatan, yang kemudian ditentukan secara enzimatis menggunakan pereaksi DSI-cholesterol-FS. Prosedur analisis disajikan pada Gambar 3. Komposisi reagen presepitasi terdapat di Tabel 2. Nilai kadar HDL didapat dari persamaan berikut :

Kadar HDL (mg/dl) = (A sampel : A standar) x 200 mg/dl

Tabel 2. Komposisi Reagen Presepitasi

Komposisi Jumlah

Asam fosfotungstat 1.4 mmol/l Magnesium klorida 8.6 mmol/l Standar kolesterol 0.3 mmol/l Standar kolesterol 200 mg/dl (5.2 mmol/l)

3. Analisis Trigliserida (Metode GPO-PAP)

Tahapan pengujian kandungan trigliserida dapat dilihat pada Gambar 3. Komposisi

reagen trigliserida yang digunakan tertera pada Tabel 3. Kadar trigliserida didapat dari

hasil perhitungan berikut :

Kadar TG (mg/dl) = (A sampel : A standar) x 200 mg/dl

4. Analisis Low Density Lipoprotein (LDL) (Friedward et al. 1972)

Setelah mendapatkan kadar total kolesterol, HDL dan TG, maka kadar LDL dapat

dihitung secara langsung menggunakan rumus :

Kadar LDL = total kolesterol – (HDL + TG/5); dengan asumsi TG/5 merupakan VLDL.



Gambar 3. Prosedur Analisis Total HDL.

Gambar 4. Prosedur Analisis Total Trigliserida Standar.

5. Indeks Aterogenik (Balsinska 1998)

Indeks Aterogenik (IA) dihitung dengan rumus sebagai berikut :

IA = (total kolesterol – HDL)/ HDL

0,01 ml Serum/standar trigliserida ditambah 1 ml reagen trigliserida

Dicampur



100 µl supernatan/standar ditambahkan 1 ml pereaksi kolesterol

Dicampur



200 µl serum ditambah 500 µl reagen presipitasi

Dicampur

Diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit

Disentrifuse 4000 rpm, 10 menit

Supernatan siap dianalisis



Tabel 3. Komposisi Reagen Trigliserida

Komposisi Jumlah

Good’s buffer pH 7.2 50 mmol/l 4-klorofenol 4 mmol/l ATP 2 mmol/l Mg 2+ 15 mmol/l glycerokinase >_ 0.4 kU/I peroksidase >_2 kU/I Lipoprotein lipase >_2 kU/I 4-Aminoantipyrine 0.5 mmol/l Glycerol-3-phosphate-oxidase >_ 0.5 kU/I Standar 200 mg/dl (2.3 mmol/l)

6. Analisis Malonaldehida (MDA) (Conti et al. 1999)

Analisis MDA ini dilakukan pada sampel organ hati dan limpa tikus. Prinsip analisis

MDA yaitu bahwa pemanasan akan menghidrolisis peroksida lipid sehingga MDA yang

terikat akan dibebaskan dan akan bereaksi dengan TBA dalam suasana asam membentuk

kompleks MDA-TBA yang berwarna merah. Intensitas warna merah tersebut dapat diukur

pada panjang gelombang 532 nm. Prosedur analisis MDA pada hati dan limpa dapat

dilihat pada Gambar 5.

Sebagai standar MDA digunakan 1,1,3,3 tetraetoksipropana (TEP). Pada suasana

asam, TEP terhidrolisis dan menghasilkan hemiasetal dan etanol. Hemiasetal yang

terbentuk kemudian terdekomposisi menjadi etanol dan malonaldehida. Penentuan kurva

standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan kadar MDA sampel

berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. Konsentrasi TEP yang

digunakan yaitu 0,0; 1,2; 2,4; 3,6; 4,8; 6,0; 7,2; 15,0; dan 24,0 x10-3 pmol/ml.

D. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Antidiabetes

Indeks glikemik adalah angka yang menunjukkan kemampuan suatu bahan pangan

untuk meningkatkan kadar gula darah. Dengan kata lain merupakan tingkatan suatu

bahan pangan menurut efeknya terhadap kadar glukosa darah. Dalam memilih makanan,

penderita diabetes harus memilih jenis bahan pangan sumber karbohidrat yang tidak

mudah meningkatkan kadar gula darah. Terdapat jenis karbohidrat yang cepat diserap

tubuh sehingga dapat meningkatkan kadar gula darah secara cepat, namun akan segera

merasa lapar lagi. Ada pula jenis karbohidrat yang lambat diserap, sehingga kadar

glukosa darah lebih stabil dan merasa kenyang lebih lama. Pengujian indeks glikemik

dilakukan untuk mengukur efek suatu bahan pangan yang mengandung karbohidrat

dalam meningkatkan kadar gula darah setelah dimakan, dibandingkan dengan glukosa

murni atau roti putih. Sebagai ilustrasi, bahan pangan dengan indeks glikemik tinggi

adalah bahan pangan yang cepat dicerna dan diserap sehingga dapat segera



meningkatkan kadar gula darah secara signifikan. Sebaliknya, bahan pangan dengan

indeks glikemik yang rendah akan lambat dicerna dan diserap, sehingga peningkatan

kadar glukosa dalam darah akan terjadi secara perlahan-lahan.

Gambar 5. Prosedur Analisis MDA pada Organ Hati dan Limpa.

Namun demikian, bahan pangan yang mempunyai indeks glikemik tinggi belum

tentu akan meningkatkan kadar gula darah secara signifikan jika dikonsumsi dalam jumlah

sedikit. Untuk itu maka jumlah konsumsi karbohidrat dalam bahan pangan harus

diperhitungkan karena sangat berkonstribusi menyebabkan terjadinya perubahan kadar

gula darah. Perkiraan banyaknya suatu jenis bahan pangan dalam meningkatkan kadar

glukosa darah seseorang setelah dimakan disebut sebagai beban glikemik (glycemic load).

Untuk itu maka beban glikemik atau bobot glikemik atau glycemic load (GL) adalah

perkiraan jumlah suatu jenis bahan pangan dalam meningkatkan kadar glukosa darah

Organ hati ditimbang sebanyak 1 g

Ditambah larutan PBS dingin sebanyak 9 ml

Dihancurkan dengan cara digerus

Disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit

Diambil supernatan 4 ml

Ditambah 1 ml larutan TCA 15%

Ditambah 1 ml TBA 0.37% dalam HCL 0.25 N

Dipanaskan di dalam water bath pada suhu 80 oC selama 15

menit

arutan TCA 15%

Didinginkan sampai suhu ruang

Disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit

Diukur absorbansi supernatan pada λ 532 nm

Organ limpa ditimbang dan dicatat beratnya



seseorang setelah makan makanan tersebut. Satu satuan beban glikemik kira-kira setara

dengan efek mengkonsumsi satu gram glukosa. Beban glikemik didasarkan pada indeks

glikemik (IG), untuk itu maka beban glikemik adalah jumlah gram karbohidrat yang

terdapat dalam bahan pangan dikalikan dengan indeks glikemik dibagi 100. Misalnya,

pepaya memiliki indeks glikemik tinggi, tetapi umumnya satu takaran saji pepaya adalah

satu potong sehingga tidak banyak mengandung karbohidrat, sehingga efek glikemik

makan pepaya rendah.engan kata lain maka pepaya mempunyai beban glikemik rendah.

Dengan demikian kalau indeks glikemik didefinisikan untuk tiap jenis makanan, maka

biasanya beban glikemik didefinisikan per takaran saji, atau per hari konsumsi. Dengan

konsep beban glikemik maka mudah dipahami bahwa mengonsumsi 25 gram makanan

yang memiliki IG 75 memiliki efek glikemik yang sama dengan mengkonsumsi 75 gram

makanan yang memilki IG 25.

Pada umumnya pengujian indeks glikemik suatu bahan pangan dilaksanakan dalam tiga tahapan yaitu: seleksi subjek, pengujian IG produk dan perhitungan BG produk.

1. Seleksi Subjek

Sukarelawan yang digunakan sebagai subjek pada pengujian IG harus memenuhi

kriteria wanita dan laki-laki sehat berumur 20-38 tahun, tidak menderita penyakit

penyerta, yaitu penyakit metabolisme yang berkaitan dengan kelainan kadar glukosa

darah, seperti diabetes mellitus, hipoglisemia dan hiperglisemia; memiliki indeks massa

tubuh (IMT) 18.5-24.99 kg/m2 (WHO 2006); tidak hamil dan menyusui; memiliki kadar

glukosa darah normal (kadar glukosa darah puasa kurang dari 110 mg/dL dan glukosa

darah 2 jam post prandial kurang dari 140 mg/dL (Mayfield 1998); memiliki pola respon

kadar glukosa darah selama 2 jam pengujian yang normal yaitu naik dan kemudian turun;

tidak merokok serta bersedia menjadi subjek. Sukarelawan harus mendapatkan

penjelasan sesuai naskah penjelasan untuk mendapatkan persetujuan subjek dan mengisi

formulir persetujuan setelah penjelasan (informed consent) untuk menjadi peserta

pengujian IG.

Seleksi dilakukan dengan cara wawancara, penimbangan berat dan tinggi badan

subjek serta pengujian IG glukosa murni untuk melihat respon glukosa darah subjek.

Seleksi ini dilakukan sampai diperoleh 12 subjek yang memenuhi kriteria tersebut. Tahap

seleksi subjek dan pengujian IG dilakukan di bawah pengawasan dokter dan pengambilan

darah dilakukan oleh tenaga analis kesehatan.

2. Pengujian Indeks Glikemik (IG)

Setiap sukarelawan diberikan sampel (produk pangan) yang jumlahnya setara

dengan 50 gram karbohidrat total. Kadar karbohidrat sampel diperoleh melalui analisis

proksimat (by difference). Apabila sampel yang diuji lebih dari satu, maka pengukuran

sampel diberi selang waktu setiap 2 hari untuk menstabilkan kondisi pencernaan tubuh.



Sebagai standar dapat digunakan 50 gram glukosa bubuk yang telah dilarutkan dalam 150

ml air.

Pengukuran kadar gula darah dilakukan setelah periode puasa selama 12 jam.

Selama dua jam pasca konsumsi bahan pangan yang diuji, diambil sampel darah

sukarelawan sebanyak 0.2 µl (finger-prick capillary blood samples method) diambil setiap

selang 30 menit sekali yaitu 0 menit (kadar gula darah puasa), 30 menit, 60 menit, 90

menit, dan 120 menit. Selang dua hari, hal yang sama dilakukan dengan memberikan 50 g

glukosa murni (sebagai pangan acuan) kepada sukarelawan. Hal ini dilakukan untuk

mengurangi efek keragaman glukosa darah dari hari ke hari. Pengukuran kadar gula darah

dilakukan dengan menggunakan glukometer merk one touch ultra.

Pengambilan darah dilakukan melalui pembuluh kapiler yang terdapat di jari

tangan. Pembuluh darah kapiler dipilih karena berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh

Ragnhild et al. (2004), menunjukkan bahwa darah yang diambil dari pembuluh darah

kapiler memiliki variasi kadar glukosa darah pada panelis yang lebih kecil dibandingkan

darah yang diambil dari pembuluh vena. Glukosa darah akan bereaksi dengan enzim

glucose oxydase (GOD) dan potasium ferosianida yang terdapat pada test strip, dan

dihasilkan potasium ferosianida. Jumlah potasium ferosianida yang dihasilkan setara

dengan jumlah glukosa yang terkandung pada sampel (Arkray 2001).

Nilai kadar gula darah ini kemudian diplotkan menjadi sebuah grafik dengan sumbu

X sebagai waktu pengukuran dan sumbu Y sebagai kadar gula darah. Indeks glisemik

dihitung sebagai perbandingan antara luas kurva kenaikan kadar gula darah setelah

mengkonsumsi sampel dan glukosa sebagai standar dikalikan 100 (Haliza et al, 2006). Nilai

indeks glisemik akhir adalah nilai rata-rata dari 8 orang sukarelawan tersebut.

3. Perhitungan Beban Glisemik (BG) Produk

Beban glisemik (BG) dihitung dengan mengalikan IG produk dengan kandungan

karbohidrat tersedia atau tercerna (available carbohydrate), atau kandungan pati dalam

satu takaran saji (serving size) pangan tersebut, dibagi 100 (Foster-Powell et al. 2002).

Perhitungan BG dilakukan untuk takaran saji kue basah dan cookies sebanyak 100 g. Hal

ini dilakukan karena kue basah dan cookies yang dijual dipasaran umumnya dikemas

untuk takaran saji dengan berat kurang lebih 100 g.

E. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Antitrombosis

Trombosis merupakan proses koagulasi dalam pembuluh darah yang berlebihan sehingga menyebabkan terjadinya penghambatan aliran darah, atau bahkan dapat



menghentikannya. Trombosis dapat terjadi di mana saja dalam sirkulasi darah manusia sehingga dapat menyebabkan berbagai gangguan terhadap kesehatan.

Pengujian senyawa bioaktif sebagai antitrombosis dilakukan dengan penentuan

kandungan trombosit darah secara in vivo. Trombosit berfungsi dalam sistem pembekuan

darah, dari trombosis jaringan yang rusak akan dikeluarkan tromboplastin yang bereaksi

dengan protrombin dan kalsium membentuk trombin. Trombin akan bereaksi dengan

fibrinogen membentuk fibrin yang akan menutupi jaringan yang terluka. Keadaan ini

sering terjadi pada penderita demam berdarah dengue (DBD).

1. Persiapan sampel darah

Pada pengujian ini digunakan hewan percobaan, yaitu rattus norvegicus dari galur

Sparague Dawley berumur tiga bulan dan berjenis kelamin jantan. Tikus yang digunakan

terdiri dari tiga kelompok perlakuan, dimana masing-masing kelompok terdiri dari enam

ekor tikus. Kelompok pertama hanya diberi ransum standar tanpa pemberian sari buah

jambu biji dan berfungsi sebagai kelompok kontrol. Kelompok kedua diberi ransum

standar dan sari buah jambu biji yang tidak dipasteurisasi, sedangkan kelompok ketiga

diberi ransum standar dan sari buah jambu yang sudah dipasteurisasi. Sari buah diberikan

pada tikus dengan cara pencekokan sebanyak 3 ml untuk masing-masing tikus. Pemberian

dilakukan satu kali sehari, selama 28 hari. Proses pencekokan tikus dilakukan perlahan-

lahan untuk mencegah agar tikus tidak terluka.

Sebelum dicekok, tikus diadaptasikan terhadap kandang dan ransum yang

digunakan terlebih dahulu selama 1 minggu. Ransum yang digunakan adalah ransum

standar dengan komposisi sebagai berikut (AOAC, 1995) :



Pada awal pengujian, diambil satu ekor tikus dari masing-masing kelompok untuk

mengetahui jumlah trombosit awal tikus. Penghitungan jumlah trombosit dilakukan di

laboratorium klinis dengan sampel darah tikus yang diambil dari bagian jantung.

Kemudian tikus yang lain diberi perlakuan selama 28 hari. Setelah 28 hari, dilakukan

pengujian jumlah trombosit darah tikus-tikus tersebut dengan sampel darah yang diambil

dari bagian jantung. Darah yang diambil harus segera dimasukkan ke dalam tabung

vacutainer yang berisi antikoagulan EDTA dan disimpan dalam wadah kedap yang diberi

pendingin untuk mencegah kerusakan darah.

2. Penghitungan jumlah trombosit (Metode QBC, Becton Dickinson, 1989)

Penghitungan kadar trombosit sampel darah dilakukan dengan metode semi

otomatis QBC (Quantitative Buffy Coat). Sampel darah ditempatkan pada tabung kapiler

yang berisi acridine orange, kalsium oksalat, agglutinating agent, dan penstabil. Tabung

ini kemudian disentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit. Komponen-

komponen pada sampel akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Sel darah merah

merupakan komponen terbesar, sekitar 35-50% dari total volume sampel. Bagian lain sel

darah, yaitu sel darah putih dan platelet atau trombosit akan membentuk lapisan

kekuningan yang disebut buffy coat dan berada diantara lapisan sel darah merah dan

plasma.

Tabung kapiler yang digunakan pada analisa ini adalah pipa kaca yang berisi

pelampung berbentuk bola yang terbuat dari plastic. Berat jenis pelampung ini

sedemikian rupa sehingga dapat mengapung diantara lapisan sel darah merah dan lapisan

plasma. Adanya pelampung ini membuat ruang antara dinding tabung kapiler dengan

dinding pelampung. Buffy coat yang terbentuk selama sentrifugasi akan terkumpul pada

ruang tersebut, sehingga panjang lapisannya menjadi 10 kali lebih panjang dari semula.

Perpanjangan ukuran lapisan ini dimaksudkan agar buffy coat lebih mudah untuk

dianalisa dan diukur.

Pereaksi yang ada di dalam tabung akan menyebabkan tiap lapisan menampilkan

warna yang berbeda pada saat dianalisa dengan QBC Autoread. Acridine orange akan

diserap oleh nukleoprotein, sehingga akan menimbulkan warna pada saat terkena cahaya

ultraviolet. QBC Autoreader akan menguji intensitas warna yang dihasilkan oleh DNA dan

RNA atau lipoprotein. Perbedaan intensitas warna digunakan untuk mendeteksi

perbedaan antar sel pada buffy coat. Berdasarkan persamaan intensitas warna tersebut,

jumlah sel tiap komponen lapisan buffy coat dapat dihitung. Platelet atau trombosit

mempunyai intensitas warna yang lebih rendah dibandingkan dengan komponen sel

darah lain pada lapisan buffy. Jumlah trombosit dinyatakan dalam jumlah sel/μl darah

(Becton Dickinson, 1989). Perbedaan lapisan pada tabung kapiler setelah disentrifuse

dapat dilihat pada Gambar 6.



F. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Imunomodulator

Imunomodulator adalah kemampuan untuk meningkatkan sistem imun. Beberapa senyawa yang dapat berperan sebagai imunomodulator antara lain karbohidrat, terpenoid, steroid, flavonoid, glikoprotein, alkaloid dan beberapa senyawa organik lain yang mengandung nitrogen. Pengujian senyawa bioaktif sebagai imunomodulator dapat dilakukan melalui mekanisme peningkatan proliferasi sel-sel dalam sistem imun, khususnya sel limfosit pada manusia. Adapun tahapan pengujiannya meliputi: (1) persiapan media kultur sel; (2) isolasi sel limfosit; (3) penghitungan jumlah sel limfosit; dan (3) pengujian proliferasi sel limfosit.

Gambar 6. Fraksi darah dalam tabung kapiler setelah sentrifugasi (Becton Dickinson, 1989).

1. Persiapan media kultur sel

Bahan yang digunakan sebagai media kultur sel berupa RPMI-1640 yang telah diperkaya dengan glutamin 10mM. Larutan RPMI standar dibuat dengan melarutkan RPMI dalam bentuk bubuk sebanyak 16.2g ke dalam 1L akuabides. Selanjutnya ditambahkan 2 g HaHCO3 sebagai bufer dan 10 mL penisilin-streptomisin (1%) sebagai antibiotik untuk mencega terjadinya kontaminasi. Apabila media standar tersebut akan digunakan sebagai media perttumbuhan sel diperlukan penambahan 10% serum yang dapatberupa serum darah AB manusia atau fetal calf serum (FCS), atau fetal bovine serum (FBS). Akhirnya larutan tersebut disterilkan menggunakan membran steril 0.22um.

Serum darah AB dapat diperoleh dari seorang donor darah sehat yang mempunyai golongan darah AB. Pengambilan darah dilakukan oleh tenaga medis dengan

Sel darah merah

Sel darah merah sekitar float

Granulosit

Limfosit dan monosit

Trombosit

Plasma



menggunakan jarum precisionglideTM steril sekali pakai dan telah dihubungkan dengan vacutainer. Darah yang diperoleh selanjutnya disentrifus pada kecepatan 4000 rpm selama 30 menit, kemudian serum dipisahkan dari endapan sel-sel darah menggunakan mikropipet. Serum yang diperoleh kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 56oC selama 30 menit dan selanjutnya disterilisasi dengan melewatkan melalui membran steril berukuran 0.22 um. Apabila digunakan FCS atau FBS dapat dibeli atau dipesan melalui agen atau toko bahan kimia.

2. Isolasi sel limfosit

Limfosit dapat diisolasi dari darah manusia. Darah diambil secara aseptis menggunakan syringe dan jarum butterfly nomor 23 sekali pakai yang telah dihubungkan dengan vacutainer yang telah berisi antikoagulan EDTA. Isolasi sel limfosit dari darah dilakukan di laboratorium dengan memisahkan dari komponen seluler menggunakan sentrifus dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Komponen seluler darah berupa eritrosit yang lebih berat dan berwarna merah akan berada pada bagian bawah, sedangkan serum darah yang berwarna kuning akan terpisah pada bagian atas. Kedua bagian tersebut dipisahkan oleh lapisan tipis yang disebut buffy coat, yang kaya akan sel limfosit.

Sebanyak 2 ml lapisan buffy coat dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang berisi 3 ml larutan ficoll-hystopaque (densitas 1.77 ± 0.001 g/ml) secara perlahan-lahan melalui dinding tabung sampai terbentuk dua lapisan. Selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit sehingga akan terpisah dua lapisan. Lapisan bagian atas yang mempunyai densitas lebih rendah dari larutan ficoll histopaque terdiri dari sel darah putih yang tidak bergranula atau agranulosit, seperti limfosit dan monosit. Sedangkan lapisan bagian bawah yang mempunyai densitas lebih tinggi terdiri dari sel darah merah dan sel lain yang bergranula atau granulosit. Lapisan bagian atas yang menyerupai cincin putih yang berisi sel limfosit kemudian diambil secara perlahan-lahan menggunakan mikropipet dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus. Selanjutnya disentrifugasi dengan menambahkan larutan RPMI standar dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit dan dilakukan sebanyak dua kali. Supernatan kemudian dibuang dan sel disuspensikan dalam larutan RPMI standar untuk dilakukan penghitungan jumlah sel sebelum sel limfosit digunakan untuk pengujian.

3. Penghitungan jumlah sel limfosit

Untuk mengetahui adanya perubahan jumlah sel selama pengujian, maka terlebih

dahulu harus dilakukan penghitungan jumlah sel limfosit awal. Penghitungan dapat

dilakukan menggunakan pewarna trifan biru dengan perbandingan suspensi sel dan

pewarna trifan biru sebesar 1:1. Sebanyak 50 µL pewarna trifan biru ditambahkan ke

dalam 50 µL suspensi sel di dalam sumur pada lempeng mikrokultur dan diaduk perlahan.

Sejumlah kecil suspensi sel dan pewarna diletakkan di hemasitometer (Gambar 7) dan

diamati di bawah mikroskop pada perbesaran 400x.

Sel limfosit yang hidup berwarna terang dan berbentuk bulat, sedangkan sel mati

berwarna biru dan berkeriput. Selain itu, sel yang hidup akan berukuran relatif lebih besar



dibandingan dengan yang mati. Jumlah sel yang hidup dan mati dihitung minimal dalam

dua bidang pandang. Penghitungan sel hendaknya dilakukan dalam waktu tidak lebih dari

tiga menit untuk mencegah terjadinya penyerapan warna oleh sel hidup. Pewarna trifan

biru mempunyai afinitas yang kuat terhadap DNA sel. Jumlah sel dalam setiap mililiter

suspensi ditentukan sebagai berikut :

N = jumlah sel/ml V = jumlah sel hidup atau mati rata-rata per bidang pandang F = faktor pengenceran (2 yang diperoleh akibat penambahan trifan biru 1:1) 104 = volume 1 bidang pandang pada hemasitometer 1 mm3 = 10-4 ml

Gambar 7. Bidang pandang hemasitometer di bawah mikroskop

4. Pengujian proliferasi sel limfosit

Sebelum digunakan untuk pengujian harus dipastikan bahwa viabilitas sel harus

sebesar 95%. Sebanyak 80 uL suspensi sel (2x106 sel/ml) dalam media lengkap

dimasukkan ke dalam sumur lempeng mikrokultur, kemudian masing-masing

ditambahkan 20uL larutan ekstrak sampel yang mengandung komponen bioaktif. Selain

itu sel limfosit juga dikultur dengan 20uL lipopolisakarida (LPS) dan pokeweed (PKW) pada

konsentrasi 50ug/mL (mitogen) sebagai kontrol positif. Sebagai kontrol negatif (standar),

suspensi limfosit juga dikultur dalam media RPMI standar, tanpa mitogen. Semua

perlakuan dan kontrol masing-masing dibuat tiga ulangan dan masing-masing dibuat

catatan pemetaan perlakuannya. Selanjutnya lempeng mikrokultur diinkubasi dalam

inkubator pada suhu 37oC, dengan atmosfer yang mengandung CO2 5%, O2 95% dan RH



96%, selama 3x24 jam (dapat bervariasi berdasarkan aktivitas komponen bioaktif

berdasarkan referensi penelitian terdahulu).

Enam jam sebelum inkubasi berakhir, ditambahkan 10uL pereaksi garam tetrazolium

(MTT) 5% ke dalam masing-masing sumur lempeng mikrokultur secara aseptis. Larutan

MTT 5% dibuat dengan cara melarutkan 0.25g bubuk MTT ke dalam 50 ml PBS dan diaduk

hingga homogen, kemudian disterilisasi dengan membran steril 0.22 um. Selanjunya

lempeng mikrokultur diinkubasi kembali sampai akhir masa inkubasi 3x24 jam. Setelah

masa inkubasi berakhir, ke dalam setiap sumur lempeng mikrokultur ditambah 80 μl HCl-

isopropanol 0,04N. Larutan HCl-isopropanol 0,04N dibuat dengan cara menambahkan

sebanyak 23.4 uL HCl 37% ke dalam 8.97 uL isopopanol PA. Selanjutnya dilakukan

pengukuran absorbansi setiap sumur lempeng mikrokultur menggunakan ELISA reader

pada panjang gelombang 570 nm. Nilai OD (absorbansi) hasil pembacaan bersifat

proporsional terhadap jumlah sel hidup. Indeks Stimulasi (IS) dihitung dengan

menggunakan persamaan berikut:

Referensi:

[AIN] American Institute of Nutrition. 1993. Components of the AIN-93 diets as improvements in the AIN-76 Diet. Journal of Nutrition 127 (5): 838S-841S.

[AOAC] Association of Official Analytical and Chemist. 1995. Official Methods of Analysis of AOAC International 16th edition. Airlington, Virginia.

Arkray. 2001. Instruction Manual for Glucometer. Arkray Corp. Kyoto, Japan.

Balasinska B. 1998. Hypocholesterolemic effect of food dietary evening primerose (Oenothera paradoxa) cake extract in rats. Food Chemistry 63(4):453-459.

Becton Dickinson. 1989. QBC Manual. Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes.

Conti M, Moramd PC, Levillain P, and Lemmonier A. 1999. Improve Fluorometric Determinant of Malonaldehyde. Am J Clin Nutr 53: 314-321.

Foster-Powell K, Holt SHA, Brand-Miller JC. 2002. International table of glycemic index and glycemic load values. Am J of Clin Nutr 76:5-56.



Friedward WT, Levy RJ, Fredricken DS. 1972. Estimation of HDL-c in the plasma without the use of preparative ultracentrifige. Clin. Chem 18:449.

Haliza W, Purwani E Y, Yuliani S. 2006. Evaluasi Kadar Pati Tahan Cerna dan Nilai Indeks Glikemik Mi Sagu. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. 17:149-152.

Kubo I, Masuoka N, Xiao P, Haraguchi H. 2002. Antioxidant activity of deodecyl gallate. J Agric Food Chem 50:3533-3539.

Kubota T, Egawa T, Otani Y, Furukawa T, Saikawa Y, Yoshida M, Watanabe M, Kumai K, dan Kitajima M. 2003. Cancer chemoteraphy chemosensitivity testing is useful in evaluating the appropiate adjuvant cancer chemoteraphy for stages iii/iv gastric cancers without peritoneal dissemination. Anticancer Res 23(1B): 583-587.

Mayfield J. 1998. Diagnosis and classification of diabetes mellitus: new criteria. Am Fam Physician 58:1355-62, 1369-70.

Nantitanon W, Yotsawimonwat S, Okogoni S. 2010. Factors influencing antioxidant activities and total phenolic content of guava leaf extract. LWT-Food Science and Technology XXX:1-9.

Palupi NS, Franck P, Guimont C, Linden G, Dumas D, Stoltz J, Belleville-nabet F, Nabet P

and and Dousset B. 2000. Bovine -lactoglobulin receptors on transformed mammalian cell (hybridomas Mark-3): characterization by flow cytometry. J Biotechnol 78:171-184.

Tejasari, Zakaria FR, dan Sajuthi D. 2002. Aktivitas Stimulasi Komponen Bioaktif Rimpang Jahe (Zingiber officinale Roscoe) pada Sel Limfosit B Manusia Secara In Vitro. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. XIII(1) : 47-52.

Documents

Evaluasi Komponen Bioaktif Tanaman untuk Kesehatanseafast.ipb.ac.id/tpc-project/wp-content/uploads/2013/10/MODUL-TPC... · menghasilkan kurva oksidasi, dan titik belok dikenal sebagai