Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un ...infoterre.brgm.fr/rapports/RP-51532-FR.pdf · Cette approche "écologie microbienne" était relativement nouvelle pour l'équipe

Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifere schisteux - site de

Naizin (Bretagne)

P. d'Hugues et M.C. Dictor avec la collaboration de

Ji. Psuwels et S. Castsgné

Avril 2002

BRGMIRP 51532 - FR

Eiude de /a micronore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux -site de Naizin (Bretagne)

Mots clés

En bibliographie, ce rapport sera cité de la façon suivante :

d'Hugues P. et Dictor M.C. (2002) - Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne), 82 p, 2 Figures, 22 Tableaux, 4 Annexes.

@ BRGM. 2002, ce daeument ne peut 8tre repdult en btdité ou m partie sms I'aubrisation e w m s e du BRGM.

2 Rapport B R G M RP 51532 - FR

Elude de la microflore baclérienne déndriiianle d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne)

Synthèse Pendant de nombreuses années, le BRGM a réalisé des études géochimiques et hydrogéologiques sur le devenir des nitrates au niveau de l'aquifère du bassin versant du Coët-Dan (Bretagne). Un processus de dénitrification naturel particulièrement rapide a été mis en évidence. Ce processus semblait essentiellement lié à l'action de bactéries anaérobies endogènes capables d'oxyder les sulfures présents dans l'aquifère. Le rôle des bactéries anaérobies hétérotrophes, impliquées dans la dénitrification par oxydation de la matière organique, semblait secondaire. Malgré ces résultats préliminaires, la biodiversité du site et l'influence des agents microbiologiques sur l'efficacité de la dénitrification restaient mal connues et peu étudiées. A partir de ce constat, il a été décidé en 2000 d'intégrer une composante microbiologique au module "Nitrate" du projet de recherche BRGM sur les pollutions difiùses (projet EAUR03). Une synthèse bibliographique a été réalisée. Elle a permis de préparer les travaux de l'équipe "Biotechnologie" du service EPI qui ont été réalisés sur ce projet en 2001, notamment : - Utilisation des techniques de biologie moléculaire pour une évaluation de la

biodiversité bactériologique du site de Naizin (technique 'SSCP'"). Obtention de cultures bactériennes "dénitrifiantes2" à partir d'échantillons (roche et eau "puits DNS3") provenant du site de Naizin, par réalisation d'expériences d'enrichissement microbiologique. Réalisation de cinétiques de dénitrification en fiole en cultures discontinues à partir des populations isolées durant les travaux d'enrichissement pour une identification des paramètres chimiques et biologiques responsables de l'abattement des teneurs en nitrates.

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Les objectifs scientifiques des travaux entrepris en 2001 étaient : - d'évaluer la biodiversité des agents bactériens intervenant dans le processus de

dénitrification identifié sur site ; - et d'obtenir une évaluation préliminaire du rôle de ces bactéries dans les cinétiques

de dénitrification. Cette approche "écologie microbienne" était relativement nouvelle pour l'équipe Biotechnologie. C'est pourquoi, les travaux entrepris en 2001 avaient également pour objectif de définir des méthodologies pouvant être transposées, à terme, sur les thèmes du projet BRGM sur la géomicrobiologie "géobio".

Différentes conclusions peuvent être mises en avant suite à cette étude préliminaire de la microflore bactérienne dénitrifiante du bassin versant du Coët-Dan.

L'approche de biologie moléculaire par "SSCP" sur un échantillon d'eau provenant du site (avant et après enrichissement au laboratoire) a permis de mettre en évidence 25 souches bactériennes différentes. Sur ces 25 souches bactériennes, 13 sont détectables dans l'eau DNS3, sans mise en culture au laboratoire ; les 12 autres, vraisemblablement

' SSCP = Single Strand Conformation Polymorphism

'Bactéries dénitrifiantes = dans le cas de cette étude, il s'agit des bactéries réductrices des nikates.

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Elude de le micronore bactérienne dénitrifianle d'un aquifère schisleux - siie de Naizin (Bretagne)

présentes à moins de 1 % dans l'échantillon d'origine, apparaissent après 1 étape d'enrichissement, en présence de nitrate et d'éléments nutritifs exogènes. Sur les 25 souches identifiées, 23 ont la capacité de se développer en présence de nitrate, 2 disparaissent dès la première culture d'enrichissement.

Lorsque l'eau DNS3 est mise en présence de nitrate exogène, les apports en éléments nutritifs (source de carbone et d'énergie) sont insuffisants pour permettre un développement des bactéries qu'elle contient. Par contre, lorsque la roche de Naizin, prélevée stérilement au cœur de la carotte, est mise en présence de nitrate exogène, une dénitrification complète et un développement bactérien sont observés. La roche contient donc les éléments nutritifs permettant le développement d'une biomasse dénitrifiante ; 4 souches différentes ont été mises en évidence en fin de culture par analyse "SSCP".

Les différentes cultures d'enrichissement ont été réalisées afin de favoriser soit les bactéries dénitrifiantes hétérotrophes, soit les bactéries dénitrifiantes autotrophes. L'analyse "SSCP" de ces cultures a été systématiquement réalisée et comparée aux profils SSCP obtenus par l'analyse directe de l'eau DNS3 et lors de la mise en culture de la roche. Cette approche comparative a permis de déterminer le caractère trophique majoritaire de ces 2 échantillons. Il a été démontré que des bactéries intervenant selon les 2 voies biologiques de dénitrification (hétérotrophe et autotrophe) sont présentes sur site. Cependant, la dénitrification hétérotrophe était probablement largement répandue dans l'écosystème (roche + eau), alors que la dénitrification autotrophe est vraisemblablement plus localisée dans des "microniches" (roche).

L'efficacité du potentiel dénitrifiant de la microflore hétérotrophe a été démontrée lors des études cinétiques (réduction des nitrates = 70 mg/l/j). Pour la microflore autotrophe, i'efficacité de la dénitrification est beaucoup plus dépendante des équilibres biochimiques du milieu et la vitesse de dénitrification maximum obtenue était de 6 mg/l/j. Les étude cinétiques correspondaient à la troisième phase d'enrichissement et ont été réalisée en présence de roche stérile (contrairement aux 2 premières réalisées uniquement en milieu liquide). En absence d'apports exogènes en sources de carbone et d'énergie, les cultures sélectionnées se sont avérées incapables de se développer malgré la roche. Ce résultat contradictoire avec celui obtenu par mise en culture directe de la roche peut s'expliquer soit par un effet négatif de la stérilisation, soit par la physiologie des souches sélectionnées au laboratoire.

La pression de sélection appliquée au laboratoire, par ajout de nitrate et de différentes sources de carbone et d'énergie, favorise le développement d'une microflore présente sur site mais pas forcément représentative de la microflore active dans les équilibres biogéochirniques de l'environnement naturel. Ainsi, certaines souches particulièrement adaptées aux conditions de culture du laboratoire, et dont la présence n'est pas toujours détectable à l'origine, peuvent jouer un rôle prépondérant qui ne correspond pas forcément à leur rôle dans le milieu naturel plus complexe.

4 Rapporl BRGM RP 51532 - FR

Elude de la microflore baciérienne dénitfianle d'un aquifère schisteux . site de Naizin (Bretagne)

Sommaire

Introduction ......................................................................................................................... 7

1 . Mise en place du programme de travail ........................................................................ 9

1.1 Etude bibliographique 2000 ............................................................................................ 9 . .

1.2 Perspectives detude .. 2001 ............................................................................................... 10

1.3 Présentation des travaux 2001 ........................................................................................ 11

2 . Matériels et Méthodes ..................................................................................................... 13

2.1 Présentation générale des expérimentations .................................................................... 13

2.2 Prélèvements sur le site de Naizin ................................................................................... 14

2.2.1 Prélèvement d'eau en profondeur .................................................................. 14 2.2.2 Forage, récupération des carottes .................................................................. 14

2.3 Culture d'enrichissement à partir de l'eau DNS3 ............................................................. 15

2.3.1 Définition des conditions de culture ............................................................... 15 2.3.2 Mise en oeuvre des tests ................................................................................. 17

2.4 Mise en culture de l'eau DNS3 et de la roche de Naizin en présence de nitrate ..................................................................................................................................... 18

. . . . . 2.5 Cinetique de denitnfication ............................................................................................. 19

2.5.1 Préparation des inocula .................................................................................. 19

2.5.3 Préparation des milieux de culture de la phase 2 ........................................... 20

2.6 Suivi de la biodiversité par les techniques de Biologie moléculaire ............................... 24

2.6.1 Description generale ....................................................................................... 24 2.6.2 Principe de l'analyse SSCP ............................................................................. 24 2.6.3 Préparation des échantillons pour l'analyse SSCP ......................................... 25

2.5.2 Préparation des échantillons de sol ................................................................ 20

. . , ,

3 . Résultats expérimentaux ................................................................................................. 27

3.1 Caractéristiques physico-chimiques de l'eau DNS3 ........................................................ 27

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Etude de la microilore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux . site de Neizin (Bretagne)

3.2 Résultats des cultures d'enrichissement (Phase 1) ........................................................... 27

3.2.1 Cultures sur milieu solide ............................................................................... 27 3.2.2 Cultures sur milieux liquides .......................................................................... 28 3.2.3 Biodiversité des cultures d'enrichissement ..................................................... 31

3.3 Résultats des études directes de l'eau DNS3 et de la roche de Naizin ............................ 33

3.3.1 Etude de la biodiversité de l'eau DNS3 .......................................................... 33

. .

3.3.2 Etude de la biodiversité à partir de la roche de Naizin ................................... 35

3.4 Résultats des études cinétiques (Phase 2) ........................................................................ 37

3.4.1 Cinétiques de réduction des nitrates ............................................................... 37 3.4.2 Biodiversité des cultures H4 et A4 ................................................................. 39

3.5 Bilan des études de biodiversité ...................................................................................... 40

Conclusion et Perspectives .................................................................................................. 43

Bibliographie ........................................................................................................................ 47

Liste des figures ................................................................................................................... 49

Liste des tableaux ................................................................................................................ 49

Annexe 1 . Analyse Bibliographique .................................................................................. 51

(Mémo du 27/10/2000) ......................................................................................................... 51

Annexe 2 . Organigramme technique des travaux ........................................................... 65

Annexe 3 . Présentation du site de Naizin ......................................................................... 69

Annexe 4 . Procédure de préparation des milieux de culture ......................................... 71

6 Rapporl BRGM RP 51532 . FR

Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifere schisteux -site de Naizin (6retagne)

Introduction

Si l'existence des processus de dénitrification a été mise en évidence dans divers contextes géologiques, il n'est pas exploité pour résorber les effets de la pollution diffuse par les nitrates (No3) dans les eaux souterraines. Avant d'envisager une méthodologie qui utiliserait ce processus naturel, il est nécessaire d'en connaître les paramètres fondamentaux et les conditions requises pour une efficacité maximale.

Au BRGM, le processus de dénitrification a été largement étudié dans l'aquifère du bassin versant du Coët-Dan (Bretagne). Un abattement jusqu'à 80 mg/i des teneurs en nitrate a été observé dans les eaux souterraines. Par ailleurs, il a également été démontré que la dénitnfication in situ était particulièrement rapide. Une division par 2 de la teneur en nitrate est observé pour un temps de 2 à 8 jours. Les 2 processus de dénitrification COMUS, par oxydation de la matière organique et par oxydation des sulfures ont été mis en évidence (Pauwels et al., 1998, Pauwels et al., 2000). Chaque processus est actif dans des compartiments aquiféres différents. Néanmoins, sur le site de Naizin (bassin SUT schistes), le processus de dénitrification par oxydation des sulfures (pyrite) semble de loin le plus important, la dénitrification par oxydation de la matière organique étant sujette aux variations climatiques et aux apports de matière organique.

Le principal enjeu de cette étude sur la pollution nitratée est d'éclaircir les mécanismes fixant le devenir des nitrates dans les eaux souterraines et notamment la cinétique de dénitrification. Plusieurs facteurs peuvent alors être en cause, notamment la nature des apports nitratés (plus ou moins riches en métaux), la composition intrinsèque du milieu (pyrite et roche encaissante) et la présence d'une microflore dénitrifiante. Des bactéries, intervenant dans la réaction de dénitrification, ayant été mises en évidence sur le site, il semblait important de joindre une étude microbiologique aux études géochimiques, isotopiques et hydrogéologiques déjà en cours sur ce site.

C'est sur la base de ces constatations qu'il a été décidé en 2000 d'intégrer une composante microbiologique au module "Nitrate" du projet de recherche BRGM sur les pollutions dimises (projet 00EAüR03). Il a ainsi été demandé à l'équipe biotechnologie du BRGM d'apporter un soutien scientifique et technique sur la compréhension du rôle des agents microbiologiques dans les processus de dénitrification identifiés dans les sols et les aquifères. A terme, le principal résultat du module serait de pouvoir définir les conditions favorables aux processus chimiques et biologiques permettant un abattement sur site des teneurs en NO3.


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Elude de la microflore baciérienne d4nilritiante d'un aquifàm schisteux - site de Naizn (ûrelegne)

Rapport BRGM RP 51532 - FR

Etude de la microflore bactérienne dhitmante d‘un aquifere schisteux - site de Naizin (ùreiagne)

1. Mise en place du programme de travail

1.1 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 2000

En 2000, une rapide synthèse bibliographique a été entreprise sur la thématique “dénitrification biologique” dans le but de préparer l’intervention de l’équipe biotechnologie au projet de recherche BRGM sur l’étude du transfert et du devenir des pollutions diffuses dans les eaux souterraines (projet EAUR03/1 Nitrates). Cette étude bibliographique est basée sur la consultation de documents (articles et thèses) provenant de la responsable du module nitrate (H. Pauwels), d’une recherche bibliographique sur les bases de données «Pascal» et INIST (thématique dénitrification biologique, 1999 - 2000) et d’une consultation des sites (( intemet )) liés à la thématique nitrate et dénitrification. Sur les 24 articles référencés sur cette thématique dans les 2 bases de données, aucun n’aborde le problème de la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dénitrification en aquifère.

Le mémo rédigé à la suite de ce travail est présenté en annexe 1. Les principales conclusions de cette étude bibliographique préliminaire sont reprises ci-dessous.

D’un point de vue biologique, les processus de dénitrification ont été largement étudiés hors site, notamment dans le cadre des recherches sur le traitement des eaux. Ces études se sont surtout focalisées sur la dénitrification hétérotrophe. Beaucoup moins de données sont disponibles sur la dénitrification autotrophe. De plus, la plupart des études sur la dénitrification autotrophe et chimiolithotropbe concernent uniquement l’espèce Thiobacillus denitrijeans.

Au niveau d’un aquifère, cas qui concerne le projet BRGM, de nombreuses études hydrogéologiques ont été réalisées. Cependant, les mécanismes microbiologiques intervenants restent mal connus et ont été très peu étudiés. Dans la plupart des études, notamment Concernant la dénitrification autotrophe, la présence des bactéries dénitrifiantes est mise en évidence mais les mécanismes biologiques des phénomènes d’atténuation naturelle des nitrates ne sont pas réellement expliqués.

Lors des études BRGM sur le site de Coët Dan en Bretagne, cette approche préliminaires de mise en évidence de la microflore dénitrifiante a été réalisée. Cependant, les techniques de microbiologie employées, basées sur un enrichissement de la population bactérienne endogène sur des milieux standardisés, restent très approximatives et peu fiables pour une réelle identification des bactéries présentes dans l’aquifère. Ces techniques associent la croissance des bactéries sur un milieu de culture précis à une espèce bactérienne pré-définie comme pouvant se développer sur ce milieu. Elles ne donnent aucune information sur la réelle biodiversité du site. Il est important de rajouter également que ces études n’ont été réalisées que sur des prélèvements d’eau provenant de l’aquifère. Or, il est fort probable qu’une partie de la microflore active soit en partie fixée sur la matière minérale de l’aquifère.


Etude de le microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquif.ém schisteux - siie de Naizin (üretegne)

1.2 PERSPECTIVES DETUDE 2001

Compte tenu de l'analyse bibliographique préliminaire et du descriptif de la thématique BRGM, différents types de travaux ont été proposés et pour certains engages pour i'année 2001. Les différents travaux envisagés étaient les suivants. - Obtention de cultures bactériennes dénitrifiantes à partir d'échantillons (roche et

eau) provenant du site de Naizin, par réalisation d'expériences d'enrichissement micro biologique. Utilisation des techniques de biologie moléculaire disponible chez un partenaire du groupe Biotechnologie (Société Bio-ID, Narbonne) pour une première évaluation de la biodiversité bactériologique du site de Naizin (technique SSCP, cf. matériel et méthode). Identification phénotypique des bactéries s'il s'avère qu'un nombre restreint (< à 5) de souches interviennent dans les phénomènes de déniûification. Réalisation de cinétiques de dénitrification en fiole en cultures discontinues ("batch") à partir des populations isolées durant les travaux d'enrichissement pour une identification des paramètres chimiques et biologiques responsables de l'abattement des teneurs en nitrates. Réalisation de cinétiques de dénitrification en colonne à partir d'échantillons de sous-sol reconstitués et de carottes de roche de l'aquifère, avec définition des conditions de cultures, en fonction des résultats des études préliminaires.

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Il est important de noter ici, que cette approche phénoménologique du rôle des micro- organismes, afm de mieux comprendre un phénomène naturel identifié sur un site, est relativement nouvelle pour l'équipe biotechnologie. L'approche scientifique et technique SUT cette problématique nitrate pourra être transposée, à terme, sur des thèmes de type "géomicrobiologie" impliquant une approche d'écologie microbienne.

La réunion de lancement du module "Nitrate" du projet DR2001 sur les pollutions diffuses (n'OlEAUR03) s'est tenu le 18/01/2001 en présence d'Hélène Pauwels (EAU/GRI), Fabienne Battaglia (EPVBIO), Marie Chnstine Dictor (EPElIO) et Patrick d'Hugues (EPVBIO). Le compte rendu de cette réunion (CRR Nitrate 01-01 du 22/01/01) décrivant les travaux prévus et les moyens disponibles pour ce module a été diffusé aux participants, à Christophe Mouvet (chef de projet "pollutions diffuses") et à Dominique Morin (Responsable Unité Biotechnologie).

Les objectifs scientifiques des travaux entrepris en 2001 étaient : - d'évaluer la biodiversité des agents bactériens intervenant dans le processus de

dénitrification identifié sur site, d'obtenir une évaluation préliminaire du rôle de ces bactéries dans les cinétiques de dénitrification.

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10 Rapport BRGM RP 51532 - FR

Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - siie de Naizin (Bretagne)

Les objectifs techniques des travaux entrepris en 2001 étaient : - de définir les méthodologies permettant la mise en évidence de la biodiversité d'un

site naturel présentant des caractéristiques intéressantes, de préparer et valider les techniques de mise en culture anaérobie et de suivi analytique de la dénitrification.

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1.3 PRESENTATION DES TRAVAUX 2001

Le bassin versant du Coët-Dan en Bretagne a été choisi afin de foumir les échantillons d'eau souterraine et de roches, destinés aux études en laboratoire.

Le prélèvement d'échantillon d'eau a été réalisé le 22 mars 2001 sur le site de Naizin. Plusieurs piézomètres (puits) étaient déjà en place sur le site. Ils ont permis les travaux BRGM d'étude et de suivi de la dénitrification du site (Pauwels et al, 1998). Le puits DNS3 (7 - 15 m) a été choisi pour réaliser les prélèvements d'eau. Cette zone se situe juste en dessous de la zone de teneurs maximales en nitrate. Il s'agit donc d'une zone qui reçoit beaucoup de NO, par infiltration et dans laquelle leur élimination est très rapide.

Pour le prélèvement de la roche, un forage de 9 mètres de profondeur a été réalisé sur site à proximité du puits DNS3. Pour des raisons de disponibilité du foreur, ce travail n'a été réalisé qu'en juin 2001. Les 7 premiers mètres ont été traités en forage destructif. Seuls 2 mètres dans la zone d'étude ont été prélevés sous forme de carotte.

L'approche expérimentale s'est décomposée en 2 phases distinctes. La première phase avait pour objectif d'isoler au laboratoire des cultures déniûifiantes du site de Naizin et d'évaluer la biodiversité de l'écosystème. Elle s'est appuyée sur le soutien technique de notre partenaire BIO-ID qui a réalisé les travaux de biologie moléculaire permettant la mise en évidence des souches baciériennes dénitrifiantes présentes sur site. La deuxième phase devait permettre de tester les capacités dénitrifiantes de chaque culture obtenue et identifiée au laboratoire.

Phase 1 - Cultures d'enrichissement et Biodiversité Dans un premier temps, plusieurs milieux d'enrichissement favorisant la croissance des différents genres bactériens dénitrifiants susceptibles d'exister sur site ont été sélectionnés et utilisés pour la réalisation de cultures bactériennes. Le but de ces mises en culture était d'amplifier la présence des bactéries dénitrifiantes autotrophes mais également hétérotrophes contenues dans les échantillons provenant du site. Suite à ces travaux et à l'aide des techniques de biologie moléculaire, une analyse préliminaire de la "biodiversité" a été réalisée. Pour des raisons de planification pour la récupération des échantillons de roche, ce travail d'enrichissement n'a été réalisé qu'à partir des échantillons d'eau DNS3.

En complément à ce travail d'enrichissement et afin de tester les potentialités de la roche et de l'eau DNS3, une mise en culture des échantillons a été réalisée avec pour


Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - site de Naizin (ûrefagne)

unique complément la mise à disposition de nitrate exogène. Lorsqu'un développement bactérien a été observé, une analyse de la biodiversité a été réalisée. Une approche d'identification directe des micro-organismes présents dans l'aquifère, sans étape d'enrichissement préalable, a également été réalisée. Ce travail consistait à extraire directement l'ADN présent dans les échantillons d'eau.

Phase 2 - Cinétiques de dénitrification : Différentes cinétiques de dénitrification ont été réalisées à l'échelle du laboratoire à partir d'échantillons de roches et d'eau provenant de l'aquifère concerné. Ces cinétiques ont été établies après ensemencement par les cultures d'enrichissement obtenues lors de la première phase. Ces études réalisées "en batch" devaient permettre de tester différentes combinaisons de milieux réactionnels et d'évaluer l'influence sur la cinétique de dénitrification des apports respectifs en élément nutritif de l'eau DNS3 et de la roche de Naizin. Différents échantillons de roche (stérile) ont ainsi été mis en contact avec de l'eau déminéralisée, avec de l'eau provenant du site ou avec des milieux synthétiques contenant différent type d'éléments nutritifs. Ces différentes études préliminaires "en batch" veulent contribuer à une identification plus claire des paramètres chimiques et biologiques responsables de l'abattement des teneurs en nitrate observées au niveau de l'aquifère de Coët Dan.

Au niveau expérimental, les moyens à mettre en oeuvre étaient comparables pour les 2 phases. Les cultures ont été réalisées dans des fioles à plasma de 250 ml et 500 mi. Le suivi analytique comprenait le pH et les éléments suivants : NO3, NOz, SO4 (ponctuellement). Pour des raisons de coût et de rapidité d'obtention des résultats, le suivi des teneurs en nitrate, nitrite et sulfate a été réalisé dans les laboratoires du service EPI à l'aide de Kit Merck. La validation de ce suivi, par analyse comparative du NO3, du NO2 et des sulfates, devait être réalisée dans les laboratoires du Service ANA par chromatographie ionique. Pour des raisons de planification et de disponibilité du personnel, cette étape de validation n'a pu être réalisée en 2001. Pour les mêmes raisons, l'analyse des gaz (dont N2) et le suivi des formes "néo-précipitées" lors des expériences cinétiques n'ont pu être mis en oeuvre.


Etude de la microflore baciérienne ddnitrifiante d'un aquiidre schisteux - site de Naizin (üreiagne)

2. Mathriels et Méthodes

2.1 PRESENTATION GENERALE DES EXPERIMENTATIONS

L'objectif de la première phase de cette étude était d'obtenir au laboratoire des cultures, provenant de l'aquifère du bassin versant du Coët-Dan, capables de réaliser la dénitrification en anaérobiose. Cette première phase a été réalisée à partir d'un échantillon d'eau prélevé sur site, au niveau du puits DNS3. Elle n'a pu pour des raisons de planification être réalisée sur des échantillons de roche.

Différents milieux de culture susceptibles de permettre la multiplication des micro- organismes ont été sélectionnés. Ces milieux sont enrichis en nitrate el en différentes sources exogènes, d'énergie, de carbone, d'azote et de sels minéraux. Cette phase dite "d'enrichissement" doit permettre de favoriser le développement des micro-organismes dénitrifiants dont la teneur dans les échantillons provenant du site est trop faible pour la réalisation des études de biodiversité. Ce travail a également permis une première sélection des cultures en fonction de leurs caractéristiques trophiques (hétérotrophe ou autotrophe).

Les cultures obtenues au laboratoire ont été utilisées : - -

pour l'identification et l'évaluation de la biodiversité, pour la réalisation de la deuxième phase des travaux (études cinétiques).

L'objectif de la deuxième phase était d'évaluer les capacités dénitrifiantes des différentes cultures isolées selon leurs caractéristiques trophiques. Ces cinétiques ont été réalisées en présence de roche, prélevée sur site (et stérilisée), mise en contact, soit avec de Veau déminéralisée, soit avec de l'eau provenant du site ou bien avec des milieux synthétiques contenant différents éléments nutritifs. L'utilisation de ces différents milieux réactionnels devait permettre de déterminer l'influence respective des apports en éléments nutritifs de la roche sol et de l'eau DNS3 sur les cinétiques de dénitrification. Un suivi comparatif entre les populations microbiennes utilisées pour l'inoculation et les populations favorisées par les nouvelles conditions de culture devait permettre d'évaluer l'influence de la roche (et des composées "lixiviables") sur la dynamique des populations dénitrifiantes.

En parallèle à ces 2 phases de travail, les capacités dénitrifiantes respectives d'un échantillon d'eau DNS3 et de roche (non stérile) ont été étudiées avec du nitrate comme seul apport exogène. L'objectif était d'évaluer au laboratoire les apports en éléments nutritifs de l'eau et de la roche et de favoriser éventuellement le développement de la microflore dénitrifiante dans des conditions les plus proches de celles du site. Dans le cas ou un développement bactérien était observé, la composition de ces cultures a été comparée aux cultures d'enrichissement.

Une vue schématique des travaux des phases 1 et 2 sont présentés en Annexe 1

Rappoii BRGM RP 51532 - FR 13

Etude de /a microflore bactérianna dénitrifiante d'un aquifëre schisteux - site de Naizin (Bretagne)

2.2 PRELEVEMENTS SUR LE SITE DE NAlZlN

Le site sur lequel ont été réalisés les prélèvements se situe à 70 km au sud-ouest de Renne dans la commune de Naizin, en bordure de la rivière du Coët Dan. Des photos du site sont présentées en Annexe 3.

2.2.1 Prélèvement d'eau en profondeur

Les prélèvements d'échantillons d'eau ont été réalisés le 22/03/01 avec la participation de J.C. Foucher (ANAMSE).

Une purge de l'eau contenue dans le puits DNS3 (7-15 m) a été réalisée. Approximativement 170 litres d'eau ont été purgés. Après un temps de latence (2h30) permettant le remplissage du puits par les eaux d'infiltration, deux types de prélèvement ont été effectués.

Prélèvement de 5 litres d'eau dans des flacons stériles. Les flacons stériles ont été remplis à "ras bord" afin d'éviter de laisser de l'air en contact avec l'eau prélevée. - -

1 litre pour les expériences de screening. 1 litre devant permettre un test d'extraction d'ADN pour une analyse SSCP directe de l'échantillon d'eau DNS3. 1 litre pour les analyses chimiques de l'échantillon. Les éléments chimiques suivants seront analysés : Na, K, Ca, Mg, CI, NO3, Ni& SO4, Fe, Mn, C. Org. 2 litres supplémentaires pour stockage.

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Filtration en ligne sur filtre 0,22 pu. Une filtration en ligne de l'eau du puits DNS3 a été réalisée (en condition "stérile", sous la flamme). L'objectif était de concentrer la biomasse bactérienne sur un filtre 0,22 pm (diamètre 130 mm) pour permettre la réalisation d'une analyse directe de la biodiversité par SSCP. Trois filtres correspondant respectivement à 2, 4 et 8 litres filtrés ont été envoyés à Bio-ID.

Quelques paramètres physico-chimiques ont été mesurés sur site : - pH"eau"DNS3 = 6,53 - Eh=22mV - Température = 13,8'C

Avant utilisation au laboratoire, les échantillons d'eau sont stockés à +4"C.

2.2.2 Forage, récupération des carottes

Le 13 juin 2001 un forage a été réalisé sur site, à proximité du puit DNS3, en présence d'un représentant du SGR/BRGM de la région Bretagne. Une carotte a été extraite entre 7 et 9 mètres de profondeur.


Etude de la microflore bactérienne dénitmante d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne)

préparation de ce milieu ne comprend plus que le mélange de 2 solutions de base séparées, au lieu de 4 comme précédemment (cf. Annexe 4).

Le milieu Dénit A (bis) I/lOhe présente les caractéristiques suivantes : - La solution 1 du milieu Dénit A (bis) i/1Ohe contient les même éléments, aux

même concentrations que ceux présent dans le milieu Dénit A I/lO""'. La solution 1 du milieu Dénit A (bis) i/lOhe contient le NaHCO3 à une concentration identique à celle utilisée précédemment dans la solution 3 du milieu Dénit AT l/lOhe. La solution 2 du milieu Dénit A (bis) l/lOem' contient le Thiosulfate. Après mélange avec la solution 1, la concentration en thiosulfate du milieu reconstituée reste identique à celle du milieu d'origine Dénit A 1/10""', La solution 4 du milieu d'origine qui contenait du fer ferreux n'est plus utilisée.

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2.5.2 Préparation des échantillons de sol

Afin de disposer d'échantillons de roche homogènes pour chacune des cultures, une fraction de la carotte de sondage (4,2 kg) a été broyée et quartée en lot de 30 g. Les différentes étapes suivantes ont été réalisées par Gilbert Mery (EPVLab) sur la fraction de carotte (8.45 m - 8.75 m) : - Concassage à la masse (2 50 mm). - Concassage sur un concasseur à mâchoires (5 5 mm). - Concassage sur un concasseur à mâchoires "Henry" (5 2 mm). - Broyage sur le broyeur giratoire "Gondard" (grille 0,s mm - vitesse, indice 40 - (5

100 pm). Quartage 1/4 du lot (= 1050 g). Traitement de 960 g d'un des 4 lots par quartage. Préparation de 32 lots de 30 g. Détermination du pourcentage d'humidité ( 1 3 %).

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2.5.3 Préparation des milieux de culture de la phase 2

Les travaux de cinétique de dénitrification ont été réalisés en utilisant différentes phases liquides enrichies en nitrate (concentration = 270 mg/i) et mis en contact avec un échantillon de roche. La concentration en nitrate choisie pour ces expériences est proche de celle mesurée sur site. Les 4 différentes phases liquides utilisées sont les suivantes : - "eau déminéralisée + nitrate", - "eau DNS3 +nitrate", - -

Des solutions d'acétate et de thiosulfate sont également préparées. Elles remplaceront le sol pour certaines des cultures réalisées avec SNDH et SNDA. Ces cultures seront des témoins permettant d'évaluer les capacités dénitrifiantes des cultures utilisées pour l'inoculation, indépendamment de I'influence éventuelle du sol.

"solution nutritive pour dénitrification autotrophe (SNDA)", et "solution nutritive pour dénitrification hétérotrophe (SNDH)".


Etude de la microflore bactérienne dénitrifanle d'un aquiïém schisteux. site de Naizin (Sretagne)

Un prélèvement de 4 ml a été effectué sur chaque fiole à l'aide d'une seringue purgée à l'azote. Les paramètres suivants sont suivis : pH, Nitrates, Nitrites et bactéries. La fréquence d'analyse dépendait de l'évolution des cultures.

Le pH est mesuré à l'aide d'une micro-sonde pH. . Le nombre de bactéries est déterminé sur cellule de Thoma (dilution dans l'eau déminéralisée).

9 Les dosages "nitrate" et "niûite" sont réalisés par colorimétrie avec des kits Merck. La procédure a été mise au point à partir des indications du fournisseur.

En fin de culture, les cultures positives ont été envoyées à la société Bio-ID.

2.6 SUIVI DE LA BlODlVERSlTE PAR LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECUWRE

2.6.1 Description générale

Ces travaux ont été réalisés par la société Bio-ID. Cette société, crée par M. Clarens, propose la valorisation du savoir-faire de l'INRA, sous forme de prestation de service, dans le domaine de la biologie moléculaire appliquée à l'étude des écosystèmes. Bio-ID est installée dans le laboratoire de Biotechnologie de l'Environnement (LBE) de l'INRA de Narbonne.

La technique proposée dans le cadre des travaux BRGM est la SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) qui permet d'obtenir une image de la diversité d'un consortium microbien et d'enregistrer rapidement son évolution par rapport à sa composition d'origine.

Contrairement aux techniques de microbiologie classique, cette technique, basée sur l'extraction de l'ADN 16s des bactéries, permet leur détection, sans avoir à mettre en oeuvre les étapes aléatoires d'isolement sur "milieu solide". Cette méthode rapide, directe et exhaustive permet de s'afianchir des problèmes liés au caractère "non cultivable" de nombreuses bactéries du sol sur milieu solide.

2.6.2 Principe de l'analyse SSCP

La technique SSCP est basée sur la conformation secondaire qu'adopte un fragment d'ADN simple brin en conditions non-dénaturantes (grâce principalement à des attractions de type Van der Waals). Cette conformation est dépendante de sa structure primaire (séquence). Une région particulière de I'ADNr 16s (région V3 située environ entre la position 300 et 500) des micro-organismes présents est extraite, amplifiée, puis dénahirée pour séparer les brins d'ADN puis analysée par électrophorèse en conditions non- dénaturantes. Le profil d'analyse SSCP de la population globale permettra de déterminer sa complexité et de différencier chaque micro-organisme présent grâce à la vitesse migratoire de son fragment d'ADNr 16s.


Etude de la microflore bactérienne dénitf5anle d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne)

L'ADNr 16s est un acide nucléique contenu dans la plus petite des sous-unités des ribosomes (30s) chez les procaryotes. Ces ribosomes sont impliqués dans la phase de traduction des ARNm et la synthèse des protéines. Cette séquence nucléotidique, qui contient des zones très conservées et des zones beaucoup plus variables, est propre à chaque microorganisme.

Avant l'utilisation de la technique SSCP, il faut tout d'abord extraire l'ADN présent dans un écosystème. Une étape d'amplification des fragments d'ADNr 16S, spécifique à la technique SSCP, est alors mise en oeuvre par PCR (Polymerase Chain Reaction). Grâce à une étape de dénaturation, les ADNr 16s marqués (fluorescents) se trouvent sous forme simple brin et s'arrangent sous forme de shucture secondaire en fonction de la séquence d'origine. Une étape de migration (sur gel non dénaturant), fonction de la conformation des structures secondaires, permet d'obtenir une "population de pics" sur un électrophorégramme. Chaque pic sera représentatif d'une séquence d'ADNr 16s et donc d'une "espèce" de micro-organismes.

Cette approche est une estimation semi-quantitative de la diversité de la composition d'un mélange bactérien. En effet, la hauteur des pics permet d'estimer l'importance de la présence de chaque micro-organisme de la population. II est néanmoins important de noter que seul les micro-organismes "dominants" (>l% de la population totale) pourront être mis en évidence.

La SSCP est une technique rapide qui permet également de suivre l'évolution de la présence de chaque micro-organisme en fonction des changements dans les conditions de culture. Ainsi, certaines "espèces" minoritaires en début de culture peuvent apparaîtrent sur I'électrophorégramme, alors que d'autres dominantes à l'origine peuvent disparaîtrent. Utilisée seule, la SSCP ne permet pas d'identifier les micro- organismes. Cependant afin de décrire une communauté en terme de diversité et d'identification, la SSCP peut être combinée à une approche de type inventaire moléculaire permettant l'identification des pics.

Des descriptions détaillées de la PCR et de la technique SSCP sont disponibles dans un ouvrage publié par l'INRA (Tagu, 1999) et dans le 1- rapport d'étude remis par Bio-ID (Clarens, 2000) sur une autre thématique que celle des nitrates.

2.6.3 Préparation des échantillons pour l'analyse SSCP

La méthode d'extraction d'ADN dite "PVPP" (Clarens, 2000) faisant intervenir une lyse en présence de détergent N-Lauroyl sarcosine et de Polyvinyl-polypyrrolidone suivi d'une purification à l'aide d'une colonne (QIAamp DNA Mini kit) a été effectuée pour tous les échantillons (50 p1 de volume d'extrait). Le protocole expérimental se décompose en 2 grandes étapes "extraction" et purification (cf. Annexe 4).


Etude de la microflore bactérienne dénitriliante d'un aquifère schisteux - sife de Naizin (Sretagne)


Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Brelagne)

- Pour l'ensemble des cultures hétérotrophes, une augmentation du pH de l'ordre de 1,2 à 2 unités est mesurée.

- Dans tous les cas de figure, la production de sulfate sur le milieu hétérotrophe n'est pas significative.

- Quels que soient les paramètres suivis, aucune différence significative de comportement n'a été observée en fonction de la température d'incubation.

- La concentration finale en bactérie est de l'ordre de 10' /ml pour l'ensemble des cultures hétérotrophes.

3.2.3 Biodiversité des cultures d'enrichissement

La phase 1 a permis d'obtenir différentes cultures bactériennes "dénitrifiantes" (réductrice des nitrates) provenant de prélèvements d'eau réalisés sur le puits DNS3. Les différentes cultures d'enrichissement dénitrifiantes à disposition sont les suivantes :

Cultures autotrophes sur Thiosulfate - 2 cultures sur milieu "riche" (15T et 25°C) - 2 cultures sur milieu "pauvre" (15T et 24°C).

- 2 cultures sur milieu "riche" (14°C et 25°C) - 2 cultures sur milieu "pauvre" (14°C et 24°C).

- 2 cultures sur milieu "riche" (14°C et 25°C) - 2 cultures témoins sur milieu "riche" (14°C et 25°C) - 2 cultures sur milieu "pauvre" (14°C et 24°C). - 2 cultures témoins sur milieu "pauvre" (14°C et 24"C),

Cultures hétérotrophes sur Acetate

Cultures autotrophes sur Pyrite

Les cultures d'enrichissement obtenues lors de cette première phase d'étude ont été analysées par la technique de biologie moléculaire SSCP. Cette technique est basée sur l'extraction de I'ADNr 16s total contenu dans l'échantillon. Par éléctrophorèse, il est ensuite possible d'obtenir une série de pics représentatifs d'une séquence d'ADN1 16s et donc d'une "souche" bactérienne présente dans l'échantillon. Chaque "souche bactérienne" présente est donc identifiée par sa mobilité éléctrophorétique. En fonction de la hauteur de chaque pic, il est également possible d'obtenir une approximation du pourcentage relatif de présence de chaque "souche bactérienne" présente dans l'échantillon d'origine.

Un profil caractéristique obtenu lors de l'analyse SSCP des 4 échantillons "Dénit A" est présentée figure 3. L'ensemble des résultats détaillés de l'étude SSCP des cultures d'enrichissement est disponible dans le rapport Bio-ID "Analyse SSCP de flores bactériennes dénitrifiantes" du 28/05/01. L'alignement des profils des 16 échantillons traités par SSCP a fait apparaître 32 pics significatifs. Les cultures obtenues sur substrat pyrite ayant montré la présence de bactéries contaminantes exogènes ne seront pas utilisées pour l'interprétation des résultats. Les principaux résultats de l'étude de biodiversité des cultures d'enrichissement sont résumés dans le tableau 16 et font apparaître 23 pics significatifs sur 8 cultures d'enrichissement.


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Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - sile de Naizin (Bretagne)

D'un point de vue microbiologique, 2 souches bactériennes (2 pics) représentent plus de 80% de la population contenue dans la culture obtenue à partir de la roche. Ces 2 pics sont le pic 15' (proche du pic 15 de laphase 1) et le pic 19. Le pic 15' peut être relié au pic 15 de la phase 1. II a été mis en évidence dans les 2 types de culture (hétérotrophe et autotrophe), mais n'était majoritaire que pour la culture autotrophe. Le pic 19 correspond à un pic obtenu en minorité sur une seule des cultures hétérotrophe de la phase 1.

Les 2 autres pics présents en minorité dans la culture de la roche sont les pics 8 et 28. Le pic 8 a été trouvé en majorité dans 2 cultures autotrophes de la phase 1 et en minorité dans une des cultures hétérotrophes. Le pic 28 correspond à un pic identifié comme minoritaire dans 2 cultures autotrophes de la phase 1.

La comparaison entre les résultats obtenus lors de cette étude directe de la roche (avec du nitrate comme seul apport exogène) et les cultures d'enrichissement de la phase 1 permettent de faire différents commentaires.

Tout d'abord, les bactéries favorisées par l'étape d'enrichissement ne sont pas forcément celles qui sont les plus actives sur site. Du fait de la pression de sélection, liée aux conditions de culture des expériences d'enrichissement, les micro- organismes se développant en majorité ne sont pas forcément ceux dont la croissance est également favorisée sur le site étudié. Compte tenu de la biodiversité naturelle, il est vraisemblable que malgré les conditions spécifiques de mise en culture, les micro-organismes présents ne soient pas tous adaptés aux conditions sélectives mises en œuvre dans la première phase d'enrichissement. Ainsi, la pression sélective de la première étape d'enrichissement n'est pas forcément sufisante pour faire disparaître des micro-organismes n'étant pas adaptés aux conditions de culture testées. Les bactéries obtenues lors de la phase 1 dans les 2 types de milieu (autotrophe ou hétérotrophe) ne sont pas forcément des bactéries présentant un caractère trophique mixte; II peut s'agir de bactéries autotrophes strictes ou hétérotrophes strictes en quantité importante dans l'échantillon d'origine et donc toujours détectable dans la culture sans pour autant s'y être développé. Ce raisonnement est également applicable sur l'absence de garantie du caractère dénitrifiant des différentes souches mise en évidence lors de la phase 1.

Les expériences de cinétique de dénitrification réalisées sur le troisième repiquage en milieu sélectif pour le type trophique et la capacité dénitrifiante apportera des compléments de réponses aux commentaires ci-dessus.

Au regard du comportement pH, il semble possible de relier la réduction des nitrates obtenue dans la mise en culture de la roche de Naizin à un processus de type hétérotrophe. Cependant, la microflore identifiée par analyse SSCP n'est globalement pas clairement identifiable comme hétérotrophe en comparaison des résultats obtenus lors de la phase 1 sur les milieux d'enrichissement de type hétérotrophe. 11 sera néanmoins démontré après la 3eme phase d'enrichissement que les 2 souches majoritaires (n"19 et 15') sont de type hétérotrophe.


Etude de la microllore bactérienne dénitrifiante d'un aquifëre schisteux -site de Naizin (Bretagne)

3.4 RESULTATS DES ETUDES CINETIQUES (PHASE 2)

3.4.1 Cinétiques de réduction des nitrates

Les résultats des cinétiques de dénitrification obtenues par ensemencement de différents types de milieu, spécifiques du caractère trophique, par des cultures sélectionnées vis à vis de ce type trophique sont présentés tableau 20. Quel que soit le type trophique étudié, les milieux "non complémentés" par une source d'énergie exogène (acétate ou thiosulfate) n'ont pas permis le développement significatif de la biomasse dénitrifiante. Dès les premiers jours de culture, un démarrage de la dénitrification (réduction des nitrates) et une production de nitrite a été mesurée mais "l'activité dénitrifiante" s'est très rapidement arrêtée.

Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ce résultat : Tout d'abord, le faible apport en substrat par la composante roche ne permet que le démarrage de la dénitrification biologique (réduction des nitrates) qui ne peut se poursuivre par carence en substrat énergétique notamment. Ce résultat peut s'avérer contradictoire avec la réduction des nitrates significative observée par mise en solution de la roche en simple présence de nitrate exogène. Compte tenu du commentaire précédent, il est possible d'expliquer la carence en substrat énergétique apporté par la roche dans le cadre de cette étude, soit par un effet négatif de l'étape de stérilisation sur la source d'énergie intrinsèque de la roche, soit par des besoins supérieurs de la biomasse sélectionnée en présence de substrat énergétique exogène en comparaison à celle habituellement la plus active sur site. Enfin, il est connu que la dénitrification est un processus impliquant plusieurs étapes successives de réduction permettant la transformation du nitrate en azote moléculaire. Peu de bactéries possèdent les enzymes permettant de réaliser l'ensemble des réactions de dénitrification. Il est donc possible que l'effet synergique de la population sélectionnée, comprenant des bactéries intervenant sur chaque étape de la réaction, ait été bloqué par inhibition de l'un des composants biologiques de la première étape de réduction. Ce blocage peut avoir comme origine une carence en substrat énergétique eVou une sensibilité accrue aux nitrites, premier produit de cette chaîne de réduction et qui peut s'avérer, pour certaines souches, très toxique (inhibition enzymatique).

Les 2 cultures "complémentées" par une source d'énergie exogène ont permis la réalisation d'une réduction des nitrates significative et mesurable du milieu (Figure 4). Dans les 2 cas, contrairement aux résultats obtenus dans les cultures de la phase 1, la réaction de réduction des nitrates n'était pas complète. La carence en élément nutritif, l'effet inhibiteur de certains produits de réaction sur une partie de la microflore sont des hypothèses pouvant expliquer ce résultat. II est également possible qu'entre la première culture d'enrichissement à partir de l'eau DNS3 contenant probablement l'ensemble des souches permettant la dénitrification complète et l'étude cinétique, le développement des bactéries capables de réaliser uniquement la transformation des nitrates en nitrite ait été favorisé. En conséquence, certaines souches utiles au caractère synergique de la dénitrification peuvent avoir été plus ou moins exclue de la culture par inhibition de leur action liée à un déséquilibre dans l'enchaînement des réactions de réduction des nitrates.


Etude de la microflore bactérienne dénitriliante d'un aquifdre schisteux -site de Naizin (Bretagne)

d'enrichissement sur milieu autotrophe. Cependant, leur présence avec 2 autres souches (dont l'une seulement est détectable dans l'eau DNS3) ne permet pas la dénitrification efficace du milieu.

La roche contient des bactéries hétérotrophes présentes également de façon significative dans l'eau et des bactéries autotrophes non détectables dans l'eau. Elle contient également des éléments nutritifs permettant leur développement. Néanmoins, la biodiversité initiale et/ou la composition chimique de la roche favorisent le développement de la microflore hétérotrophe. Lorsque la roche est broyée, stérilisée et ensemencée par une culture de laboratoire, elle semble perdre la capacité à fournir suffisamment d'éléments nutritifs carboné et énergétique pour favoriser le développement des cultures. Deux hypothèses peuvent être proposées pour expliquer ce résultat : la destruction des éléments nutritifs suite à la stérilisation ou bien, la sélection au laboratoire de souches ne pouvant se développer qu'avec des teneurs en éléments nutritifs supérieures à celles fournies naturellement par la roche.

La comparaison des profils SSCP de la première phase d'enrichissement et de la 3ème phase d'enrichissement montre tout d'abord l'évolution des cultures vers une "spécificité" en fonction du type trophique. Après 3 étapes d'enrichissement, 11 souches sont mises en évidence comme particulièrement adaptées à une pression de sélection basée sur la capacité dénitrifiante. Sur les 11 souches mise en évidence dans la 3eme culture d'enrichissement, aucune n'est présente à la fois sur le milieu hétérotrophe et sur le milieu autotrophe. Sept étaient présentes dans l'échantillon d'eau d'origine et 5 d'entre elles présentent les caractéristiques d'un métabolisme de type hétérotrophe. Cinq souches non détectables dans l'échantillon d'origine sont apparues comme minoritaires dans les processus de dénitrification, hétérotrophe et autotrophe, observés dans les conditions de culture du laboratoire.

Les cultures d'enrichissement de la première phase font apparaître 10 souches présentes dans les 2 types de milieux sélectifs. Il est très probable que 8 d'entre elles ne doivent leur présence non pas par le caractère mixte de leur métabolisme carboné mais par leur présence initiale dans l'eau DNS3. II semble néanmoins que l'on puisse leur reconnaître un rôle dans le processus de dénitrification. En effet, les milieux d'enrichissement semblent suffisamment sélectif pour faire disparaître des souches détectables dans l'eau et semble-t-il inadaptées à la dénitrification (souches 4 et 9). Trois de ces 8 souches sont sans aucun doute impliquées dans le processus de dénitrification car elles sont toujours présentes après 3 étapes d'enrichissement. Par contre, elles sont spécifiquement reliées à un type trophique (2 hétérotrophes et 1 autotrophe). Deux souches non détectables dans l'eau apparaissent dans les 2 types de milieu de la phase d'enrichissement n"1. Il est possible de penser qu'elles possèdent un métabolisme mixte permettant leur émergence sur 2 types de sources de carbone. Néanmoins, une seule se maintiendra, en culture, après 3 étapes d'enrichissement sur milieu autotrophe.


Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un equifére schisteux - site de Naizin (Bretagne)

Les différentes conclusions des études SUT les cultures bactériennes issues de l'aquifère du site de Naizin sont présentées ci-dessous.

L'eau prélevée dans le puits DNS3 (7-15 m) présente une relativement grande biodiversité bactérienne détectable par "analyse moléculaire'' directe (1 5 souches). Les micro-organismes qu'elle contient présentent en grande majorité la capacité à se développer en présence de nitrate (13 souches). Sept souches semblent très actives dans le processus de dénitrification car toujours présentes sur un milieu sélectif de dénitrification après le 3"me repiquage. Cinq souches présentent clairement un métabolisme hétérotrophe.

L'eau DNS3 contient égaiement de nombreuses souches bactériennes (10) capables de se développer en présence de nitrate mais non détectable car en proportion très faible (< à 1%). Quatre de ces souches sont clairement impliquées dans le processus de dénitrification et sont toujours présentes après 3 étapes d'enrichissement.

La mise en culture de la roche, en présence de nitrate, montre qu'elle contient suffisamment d'éléments nutritifs pour permettre le développement d'une microflore dénitrifiante. Cependant, la biodiversité de cette culture est relativement restreinte (4 souches).

La roche contient des bactéries dénitrifiantes impliquées dans les 2 voies connues du processus de dénitrification, hétérotrophe et autotrophe. Les conditions de culture laboratoire semblent néanmoins favoriser essentiellement le développement de la microflore hétérotrophe.

Les profils SSCP des cultures d'enrichissement montrent que les micro-organismes dont le développement est favorisé au laboratoire ne sont pas forcément les plus présents dans l'environnement d'origine.

Les cultures de types hétérotrophes sont plus faciles à obtenir et à maintenir actives au laboratoire. Les cinétiques de dénitrification obtenues après plusieurs étapes d'enrichissement sur milieu hétérotrophe sont rapides et complètes. Ce n'est pas le cas des cultures autotrophes.

Le maintien d'une diversité importante sur les cultures hétérotrophes permet probablement de conserver le caractère synergique du processus de dénitrification impliquant plusieurs souches. Ainsi, il n'y a pas accumulation d'intermédiaires de la réaction susceptibles d'avoir un effet inhibiteur sur les bactéries impliquées dans la première étape (transformation des nitrates en nitrites). Le raisonnement inverse s'applique aux cultures autotrophes.

11 est également possible d'expliquer les meilleures cinétiques hétérotrophes, soit par une moins grande sensibilité des micro-organismes hétérohophes de la première étape vis à vis de l'accumulation de produits intermédiaires, soit par la présence dans la population hétérotrophe sélectionnée de micro-organismes actifs sur l'ensemble des étapes de la dénitrification.

42 Rappofi BRGM RP 51532 - FR

Eiude de la microflore bactérienne déniinfianle d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne)

Conclusion et Perspectives

Différentes conclusions peuvent être mises en avant suite à l'étude de la microflore bactérienne dénitrifiante du site de Naizin à l'aide de la technique SSCP. Cette étude s'est volontairement focalisée sur la zone comprise entre 7 et 15 mètres de profondeur.

Les études sur l'eau du puits DNS3 permettent de montrer que celle ci contient plus de 25 souches bactériennes différentes dont certaines représentent moins de 1% de la biomasse globale. En grande majorité, elles ont la capacité à se développer en présence de nitrate. Cependant, l'eau DNS3 ne contient pas les éléments nutritifs (source de carbone et d'énergie) suffisant pour le développement de cette biomasse. Ces bactéries dénitrifiantes sont en majorité typiques d'un métabolisme hétérotrophe. Quelques souches sont néanmoins impliquées dans la voie de dénitrification de type autotrophe.

L'étude de la roche montre qu'elle contient des bactéries dénitrifiantes hétérotrophes et autotrophes. Elle contient également les éléments nutritifs permettant leur développement. Les bactéries dénitrifiantes hétérotrophes semblent se développer plus rapidement dans les conditions du laboratoire. Les bactéries autotrophes mises en évidence semblent liées au "micro-environnement'' de la roche et sont très peu représentées (non détectable) dans l'eau DNS3. Par contre la microflore hétérotrophe semble plus largement répandue (dans l'eau et dans la roche).

Pour les cultures d'enrichissement, la pression de sélection appliquée au laboratoire, par ajout de nitrate et de différentes sources de carbone et d'énergie, favorise le développement d'une microflore dénitrifiante présente sur site. Pour autant, cette microflore n'est pas forcément représentative de la microflore active dans les équilibres biogéochimiques de l'environnement naturel. Ainsi, les cultures d'enrichissement permettent notamment de mettre en évidence des bactéries dont la présence n'est pas toujours détectable dans les échantillons provenant du site. Après trois étapes d'enrichissement, certaines souches particulièrement adaptées aux conditions de culture du laboratoire peuvent jouer un rôle prépondérant qui ne correspond pas à leur rôle dans le milieu naturel plus complexe.

II est important de souligner que dans les conditions naturelles, le développement de la biomasse présente toujours une variabilité spatiale et temporelle. Cette variabilité est fonction des apports saisonniers et de la localisation des éléments nutritifs indispensables à la microflore. Dans le cas de la dénitrification, la variabilité des apports en termes de nitrates, de sources d'énergie et de carbone entraîne vraisemblablement une grande variabilité de composition de la microflore naturelle en fonction des saisons et des zones de l'aquifère.

Pour l'étude exhaustive d'un processus naturel il semble donc indispensable d'intégrer la variabilité spatiale et temporelle dans le nombre d'échantillons à prélever sur un même site et dans la définition des conditions de culture du laboratoire.


Etude de la microflore baclérienne dénitrifiente d'un aquifere schisleux - site de Naizin (Sretaane)

Pour la dénitrification, la difficulté de l'étude laboratoire repose essentiellement sur la complexité du processus de réduction des nitrates en azote. En effet, cette réaction intègre plusieurs étapes intermédiaires et fait donc intervenir le plus souvent différentes souches bactériennes spécialisées pour chacune des étapes de la réduction. Le rôle potentiellement inhibiteur de certains produits de ces réactions intermédiaires est connu mais difficile à maîtriser au laboratoire. Le caractère synergique de la dénitrification biologique rend son étude en laboratoire très complexe. Cette complexité est accentuée par l'implication possible de 2 grandes familles de bactéries dans la dénitrification : des bactéries autotrophes et chimiolithotrophes ou des bactéries hétérotrophes et chimioorganotrophes. Enfin, la dénitrification naturelle est égaiement difficile à étudier d'un point de vue biologique car elle apparaît dans des environnements naturels très peu sélectifs en terme de pH, de température et de substrat disponible.

Les travau présentés dans ce rapport ont permis de répondre, en grande partie, aux objectifs fixés au démamage du projet. - La biodiversité de la microflore impliquée dans le processus de dénitrification SUT

l'aquifère du site de Naizin a été étudiée. Il a été démontré que des bactéries intervenant selon les 2 voies biologiques de dénitrification (hétérotrophe et autotrophe) sont présentes sur site. Il a été montré que la dénitrification hétérotrophe était probablement largement répandue dans l'écosystème, alors que la dénitrification autotrophe est vraisemblablement plus localisée dans des "microniches". L'efficacité du potentiel dénitrifiant de la microflore hétérotrophe a été démontrée. Pour la microflore autotrophe, il a été montré que l'efficacité de la dénitrification est beaucoup plus dépendante des équilibres biochimiques du milieu. Au niveau technique, les méthodologies d'étude de la biodiversité d'un écosystème ont été mises en place. Les techniques d'enrichissement et de cultures en "batch" sont des étapes indispensables à l'étude laboratoire d'un écosystème. Cependant, elle présuppose une pression de sélection risquant d'introduire une différence entre les processus biologiques naturels à étudier et ceux réellement étudiés au laboratoire. La définition des conditions de culture est donc fondamentale. Il a été démontré que la biologie moléculaire et la technique SSCP sont parfaitement adaptées à l'étude de la biodiversité. Ces techniques sont indispensables pour un travail rigoureux d'étude d'un écosystème impliquant une microflore diverse soumise à une grande variabilité fonction des conditions de cultures laboratoire et naturelle. L'utilisation de la dénitrification, comme support à la mise au point de technique permettant l'étude d'un écosystème et des interactions biogéochimiques, s'est avérée intéressante. Cependant, le processus de dénitrification, de part sa complexité biologique et biochimique et son existence dans des écosystèmes peu sélectifs, nécessite des moyens d'investigation beaucoup plus importants.

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Etude de la microflore bactèrienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - site de Neizin (Bretagne)

En 2002, la thématique "nitrate et étude de l'écosystème bactérien" a été intégrée dans le nouveau programme de recherche BRGM intitulé "Biogéochimie". Les moyens prévus pour la poursuite des travaux SUT ce thème sont limités faibles et une réflexion sera menée afin de définir les priorités. Les possibilités de poursuite des travaux ont été discutées en Janvier 2002, avec H. Pauwels (EAU / GRI), M.C. Dictor (EPVBio) et F. Ganido (EPVBio).

Au-delà des questions budgétaires, la principale difficulté pour la poursuite des travaux provient de la présence sur site des 2 types de dénitrification autotrophe et hétérotrophe. Le rôle prépondérant de la dénitrification autotrophe a été identifié dans l'aquifère, et elle représente la cible principale des études sur cette thématique. Cependant, au laboratoire, la microflore hétérotrophe est plus facile à cultiver. Elle prend le pas, SUT la microflore autotrophe, en l'absence de pression de sélection. Si la culture autotrophe est artificiellement favorisée par ajouts de substrat exogène, la population sélectionnée n'est pas forcément comparable à celle d'origine. Cette différence se traduit par une perte d'efficacité du processus de dénitrification autotrophe au niveau du laboratoire (perte de la synergie entre les différentes espèces). Le deuxième facteur limitant majeur pour l'activité 2002 est l'arrêt de l'activité de la société Bio-Id qui réalisait le suivi de biologie moléculaire des cultures obtenues au laboratoire.

Au regard des résultats 2001, il est néanmoins possible de présenter certaines orientations expérimentales qui pourraient être mise en œuvre. - Etudes cinétiques en "batch" à partir d'échantillons de roche "non stérilisés" et dans

des milieux complémentés par différents types de catalyseurs potentiels. L'absence de l'outil SSCP serait une limitation majeure pour le suivi de ce type de travaux. Travaux en colonne sur de la roche non stérile avec ou sans percolation de solution cornplémentées par différents types de catalyseurs potentiels. L'absence de l'outil SSCP serait également une limitation majeure pour le suivi de ce type de travaux.

- Poursuite des travaux d'enrichissement / sélection des micro-organismes dénitrifiants. Cette option permettrait vraisemblablement d'obtenir une culture hétérotrophe très efficace pour ces caractéristiques dénitrifiantes. Cependant, ce type de travaux serait un changement total de stratégie et d'objectif du projet. Etudes de répartition spatio-temporelle de la microflore du site de Naizin et comparaison de la biodiversité du site de Naizin avec d'autres sites ou la dénitrification autotrophe a été étudiée. Ce type d'étude présuppose la possibilité d'un suivi par SSCP afin d'identifier le rôle d'agents biologiques spécifiquement responsables des différentes cinétiques d'abattement des nitrates en milieu naturel.

Compte tenu de l'impossibilité de disposer du suivi moléculaire en 2002 et de la complexité du processus de dénitrification in-situ, une réflexion devra être menée sur l'orientation à donner aux futurs travaux. En effet, le peu de moyens disponibles à l'heure actuelle, pour les études biologiques de l'écosystème, rend difficile l'aboutissement, à court terme, sur le principal enjeux de cette thématique de recherche : l'identification des facteurs susceptibles de stimuler le phénomène d'atténuation naturel.

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Rappolt BRGM RP 51532 - F R 45

Elude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne)


Etude de la microflore bactérienne dénifrifianfe d'un aquifere schisteux - sife de Naizin (Bretagne)

Bibliographie

Clarens, M., (2000). Etude de suivi par analyse SSCP de l'évolution d'une flore bactérienne biolixiviante dans un réacteur colonne, Rapport d'Etude Bio-ID (29/02/00), 13 p.

Clarens, M (2001). Analyse SSCP de flores bactériennes dénitrifiantes, Rapport d'étude BioID (28/05/01), 14 p.

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Tagu, D., (1999). Principes des techniques de biologie moléculaire, Editions INRA, 132 P.

Rappori BRGM RP 51532 - FR 47

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Etude de /a microflore baclérienne dénitrifiante d'un aquifëre schisteux - sife de Piaiin (Bretagne)

RapRofi BRGM RP 51532 - FR

Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux . siie de Naizin (üreiagne)

Liste des figures

Figure 1 . Alignement des profils SSCP des échantillons de culture dénitrifiantes Autotrophes (sur milieu au thiosulfate) .......................................................................... 32 Figure 2 . Cinétique de dénitrification à partir des cultures sélectionnées sur milieux complémentés en substrat énergétique (autotrophe ou hétérotrophe) ............................ 38

Liste des tableaux

Tableau 1 . Milieux d'enrichissement pour sélection de la population bactérienne

Tableau 2 . Milieux d'enrichissement pour sélection de la population bactérienne

Tableau 3 . Ensemencement des milieux d'enrichissement liquide ................................. 17 Tableau 4 . Ensemencement des milieux d'enrichissement solide .................................. 18 Tableau 5 . Préparation des inocula de la phase 2 ........................................................... 19 Tableau 6 . Solution de nitrate - eau déminéralisée - phase 2 ......................................... 21 Tableau 7 . Solution de nitrate - eau DNS3 - phase 2 ..................................................... 21 Tableau 8 . Milieu de culture pour bactéries dénitrifiantes autotrophes -Phase 2 ......... 21 Tableau 9 . Solution de thiosulfate - Phase 2 .................................................................. 21 Tableau 10 . Milieu de culture pour bactéries dénitrifiantes hétérotrophes - Phase 2 .... 22 Tableau I l . Solution d'acétate - Phase 2 ....................................................................... 22 Tableau 12 . Ensemencement et caractéristique des cultures pour la réalisation des tests cinetiques" - Phase 2 ..................................................................................................... 23

Tableau 13 . Données physico-chimiques de l'eau DNS3 ............................................... 27 Tableau 14 . Résultats de dénitrification des cultures d'enrichissement ........................ 28 Tableau 15 . Résultats complémentaires des cultures d'enrichissement .......................... 29 Tableau 16 . Résultats des analyses SSCP des cultures d'enrichissement ....................... 33 Tableau 17 . Résultats des analyses SSCP directes de l'eau DNS3 ................................. 34

Tableau 19 . Résultats des analyses SSCP de la culture obtenue à partir de la roche ..... 35

. . . denitnfiante autotrophe ................................................................................................... 15

denitnfiante heterotrophe ............................................................................................... 16 . . . . .

1, ' . .

Tableau 18 . Mise en culture de la roche de Naizin en présence de nitrate exogène ...... 35

Tableau 20 . Résultats des cinétiques de réduction des nitrates obtenues avec des populations bactériennes sélectionnées en fonction de leur type trophique ................... 38 Tableau 21 . Résultats SSCP des cultures H4 et A4 ........................................................ 39 Tableau 22 . Bilan des analyses SSCP ............................................................................ 40

Rapport BRGM RP 51532 . FR 49

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Etude de la microflore bactérienne denitrifiante d'un aquirere schisteux - siie de Neizin (Bretagne)


Etude de la microflore bacterienne denilrifiante d'un aquifère schisteux - sile de NaiUn (ùretegne)

Annexe 1 - Analyse Bibliographique

(Mémo du 2711 0/2000)


Etude de le microflore bad4rienne denitrifiante d‘un aquifëre schisteux ~ site de Naizin (Bretagne)

DESTINATAIRE : DM, FBB, MCD EXPEDITEUR : D’HUGUES PATRICK (EPIIBIO ) ~.BRG“& COPIES : Hp

FAX : 33 (0)2.38.64.36.80 e-mail : [email protected]

4 : 33 (0)2.38.64.35.96

LES POLLUTIONS DIFFUSES - DEVENIR DES NITATES DANS LES EAUX SOUTERRAINES - LA DENITRIFICATION

Sujet :

Orléans. le 27/10/2000

Le but de ce mémo est de faire une rapide synthèse sur la thématique (( dénitrification ». Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un projet de recherche 2000 du BRGM sur l’étude du transfert et du devenir des pollutions diffuses dans les eaux souterraines (projet EAUR03/1 Nitrates). II est demandé, à terme, à l’équipe biotechnologie du BRGM d’apporter un soutien scientifique sur la compréhension du rôle des agents microbiologiques dans les processus de dénitrification identifiés dans les sols et les aquifères. Avant de rentrer dans le détail des objectifs de ce projet de recherche et de sa composante biologique, il est apparu nécessaire à l’équipe biotechnologie de pouvoir se mettre à jour sur le sujet dénitrification biologique d’un point de vue plus général.

Cette étude bibliographique est basée sur la consultation de documents (articles et thèses) provenant de la responsable du module nitrate (H. Pauwels), d’une recherche bibliographique sur les bases de données (&‘ascal» et INIST (thématique dénitrification autotrophe, 1999 ~ 2000) et d’une consultation des sites (( intemet )) liés à la thématique nitrate et dénitrification.

1. La problématique u Nitrate B et cycle de l’azote

1.1 La pollution nitrate Dans la nature, le cycle de l’azote repose sur un principe d’équilibre bien souvent perturbé du fait de l’activité humaine et notamment de l’industrie et de l’agriculture. L’agriculture génère plus de 70% de la pollution azotée, notamment à cause de l’utilisation intensive d’engrais azotés (Trouve, 1998). Ceux-ci sont assimilés en partie par les plantes, mais la sur-fertilisation des grandes cultures céréalières par des engrais azotés a pour conséquence une pollution des eaux par les nitrates. En effet, très soluble dans l’eau, les nitrates sont souvent lessivés et transférés depuis les sols cultivés vers les nappes phréatiques. Cette eau est ensuite utilisée pour la production d’eau alimentaire ou une teneur trop importante en nitrate pourrait représenter un risque sanitaire majeur pour les consommateurs. Ainsi, la législation européenne a déterminé une valeur maximale en nitrate de 50 mg/l dans les eaux destinées à la consommation humaine. Elle est de 45 mg/l aux Etats-Unis (Pauwels, 1998). Au niveau toxicologique, l’ingestion de forte teneur en nitrate peut provoquer la formation de nitrosamines


Etude de la microflore bactérienne dénitrifiente d‘un aquifere schisteux - site de Naizin (ûretagne)

cancérigènes ou bien faire apparaître des problèmes de méthémoglobinémie chez les jeunes enfants. Dans les pays ou se sont développés l’agriculture et l’élevage intensifs (Europe, USA, Canada), de nombreux programmes de lutte contre la pollution par les nitrates ont été mis en place. Certains ont pour objectif de lutter contre les causes par une meilleure gestion des flux d’entrée et de sortie de l’azote. D’autres, consistent à mettre en place des techniques de dénitrification permettant de lutter contre les conséquences de la pollution. Ses solutions curatives sont essentiellement du domaine du traitement de des eaux. Deux grandes voies d’élimination des nitrates sont utilisées: les méthodes physico-chimiques ~ dénitratation (résine, osmose inverse, électrodyalise,. . .) et les méthodes biologiques - dénitrification (Trouve, 1998). Les méthodes d’élimination biologiques des nitrates ne sont que la transposition et l’optimisation des phénomènes d’auto-épuration réalisés naturellement dans les sols et sous-sols. L’amplification in-situ de la dénitrification naturelle est également une voie d’étude privilégiée. Les procédés qui en découlent, dits ((rustiques », sont ceux demandant des coûts d’investissement et d’exploitation les plus faibles.

1.2 La dénitrification dans le cycle de l’azote (Pelmont, 1993) Dans la nature, le nitrate est la forme la plus oxydée du cycle de l’azote. Il est réduit dans l’environnement par 2 voies biologiques bien distinctes qui se déroulent en anoxie ou en anaérobiose. La première voie, dite assimilatrice, conduit à la formation d’ammonium qui représente la principale forme chimique d’azote directement assimilable par les organismes vivant. La deuxième voie, dite dissimilatrice, se sert du nitrate comme oxydant respiratoire et produit de l’énergie sous forme d’un potentiel membranaire convertible en ATP. Dans les 2 cas, l’étape clé du processus est la réduction du nitrate (NO3‘) en nitrite (NOY) catalysé par une enzyme connue sous le nom de nitrate réductase. La voie assimilahice est surtout connue chez les plantes, les algues et les champignons. Au niveau bactérien, elle a été mise en évidence chez les cyanobactéries. Pour la voie dissimilatrice, la réduction du nitrate en nitrite est l’étape commune de 2 processus différents. Dans son sens le plus restreint, la dénitrification désigne la disparition du nitrate par respiration. Le produit final de la réduction est l’azote moléculaire N2. Deux produits intermédiaires réduits gazeux sont également présents dans le cycle de réduction du nitrite en azote moléculaire : l’oxyde nitrique (NO) et l’oxyde nitreux (ou protoxyde d’azote, NzO). Toutes les étapes de la réduction du nitrate en azote moléculaire sont productrices d’énergie. Le deuxième processus est connu sous le nom d’ammonification dissimilatrice du nitrate en ammonium @ N U , Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonia). Ce dernier n’est pas nécessairement assimilé et peut être libéré sous forme de gaz NH3.

Dans les chapitres suivants, nous nous intéresserons essentiellement à la dénitrification dissimilatrice dans laquelle les bactéries du sol et du sous-sol sont particulièrement impliquées.


Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d‘un aquifdre schisteux -site de Naizin (Bretagne)

2. Généralités sur la Dénitrification Biologique

2.1 La microflore dénitrifiante Dans le milieu naturel, lorsque l’oxygène se trouve en concentration limitante, le nitrate peut devenir en élément minéral accepteur final des électrons impliqués dans le métabolisme énergétique des micro-organismes. La microflore dénitrifiante est en général anaérobie facultative. Elle est très répandue dans l’environnement ; des concentrations jusqu’à 106 bactériedg de sol sont fréquentes (Germon, 99).

Parmi les bactéries capables de réduire le nitrate en anaérobiose, toutes ne sont pas capables de réaliser l’ensemble des transformations mises en jeu lors du processus de dénitrification. Différentes classes sont ainsi identifiées (Dupain, 1992) : - - -

Bactéries réalisant uniquement la transformation des nitrates en nitrite. Bactéries capables de réduire les nitrates en ammonium par la voie DNRA. Bacléries dénitrifiantes vraies, capables de réaliser la réduction des nitrates (ou uniquement des nitrites) jusqu’aux stades protoxyde d’azote ou azote moléculaire.

Les bactéries dénitrifiantes appartiennent à des genres très divers et présentent des groupes trophiques très variés. En fonction de leur source d’énergie, elles peuvent se classer dans 3 groupes distincts : - Les bactéries chimioorganotrophes utilisent des réactions chimiques comme source

d’énergie et un composé organique comme donneur d’électron. Les bactéries chimiolithotrophes utilisent des réactions chimiques comme source d’énergie et un composé minéral comme donneur d’électron. Les bactéries phototrophes utilisent l’énergie lumineuse.

-

-

Cette microflore, très diverse, peut être également classée en 2 grands groupes en fonction de leur métabolisme carboné : - Les bactéries dénitrifiantes hétérotrophes (utilisation de matière organique comme

source de carbone). Elles sont souvent également chimioorganotrophes. Les bactéries dénitrifiantes autotrophes (utilisation de gaz carbonique comme source de carbone). Elles sont souvent également chimioorganotrophes.

-

Une liste non exhaustive des micro-organismes impliqués dans la dénitrification peut être établie. Au niveau des bactéries dénitrifiantes vraies hétérotrophes, Dupain (1992) fait état de 23 genres recensés. Les plus abondants au niveau de la rhizosphère sont les Bacillus, les Pseudomonas et les Alcaligenes. Pour les bactéries autotrophes dénitrifiantes, l’espèce la plus étudiée est Thiobacillus denitrficans. Paracoccus (Micrococcus) dentrficans, est une bactérie chimiolithotrophe facultative dénitrifiante qui a été largement utilisée pour l’étude des mécanismes de régulation enzymatiques de la dénitrification biologique (Trouve 1998). Parmi les différents genres présentant des capacités dénitrifiantes, il est possible de citer également à partir des études bibliographiques de Knowles (1982) et Tiedje (1988) : Achromobacter, Hyphomicrobium, Halobacierium, Chromobacierium, Vibrio, Thiomicrospira, Thiospaera. Coiynebacterium, Spirillum. Xanihomonas, Aeromonas, Flavobacterium _ _ _


Etude de la microflore bactérianne d6nitrifiante d‘un aquifèm schisleux - sife de Naizin (Bretagne)

2.2 Les processus et les procédés de dénitrification Basée sur l’étude des processus de dénitrification naturels, de nombreuses équipes ont développé des procédés biologiques a-s i tu destinées au traitement des eaux. Ces études permettent également de faciliter hors de l’écosystème l’étude détaillée des processus biologiques impliqués dans la dénitrification, Selon que la réduction des nitrates est couplée à l’oxydation de composés carbonés organiques ou celle de composés minéraux avec du carbone minéral comme source carbonée, on distinguera les procédés hétérotrophes ou autotrophes.

La dénitrification hktkrotrophe La dénitrification hétérotrophe peut être globalement assimilée à une réaction redox dont l’équation bilan peut s’écrire :

4H’ + 5 (CH,0)+4 NO,- - 2 N, + 5 CO, + 7 H,O

L’utilisation de la dénitrification biologique hétérotrophe pour la production d’eau potable est autorisée depuis juillet 1982 dans des réacteurs hors-sol. De nombreux genres bactériens composent les cultures mixtes utilisées pour les procédés de dénitrification. Ces bactéries sont capables de réduire les nitrates jusqu’à l’azote moléculaire. Il a également été montré qu’une partie de l’azote pouvait être éliminé par assimilation bactérienne. Les bactéries dénitrifiantes utilisent le carbone organique comme source de carbone cellulaire et source d’énergie. En traitement des eaux potables, seuls l’acide acétique et l’éthanol sont autorisés en tant que source de carbone exogène. Les 2 principaux procédés actuellement en activité sont : le procédé Nitrazur (Société Degrémont) et le procédé Biodenit. Ces technologies utilisent le principe du biofiltre (bactéries fixées sur un support inerte). De nombreuses recherches sont également en cours dans le but d’améliorer les techniques existantes ou en découvrir de nouvelles (Trouve, 1998, Dupain, 1992).

La déniîrification autotrophe Dans ce processus, les bactéries utilisent du carbone minéral comme source de carbone et tirent leur énergie de l’oxydation de l’hydrogène ou d’un composé réduit du soufre. La mise en œuvre de ce processus à l’échelle industrielle n’est pas appliqué en France, malgré l’existence d’un procédé de la société OTV dont l’utilisation a reçu l’agrément des autorités compétentes en 1985. Ce procédé fait appel à des bactéries fixées sur un substrat maërl/soufie. Le maërl (essentiellement du carbonate de calcium) agit en tant que support, tampon pH et apporte des éléments nutritifs minéraux et le carbone aux bactéries (Martin, Intemet 2000). En Allemagne, la société Sulzer exploite son procédé Denitropur à l’échelle industrielle depuis 1986. Basé sur le principe du lit fixe, ce procédé utilise l’hydrogène comme source d’énergie des bactéries et la présence d’ions bicarbonates dans l’eau comme source de carbone (Trouve, 1998). Toujours au stade de la recherche et du développement, des tests de dénitrification à partir de soufre, d’hydrogène sulfuré ou de pyrite ont été réalisés. - Depuis de nombreuses années, des études sur différents types de procédés

(( wetlands N ont été réalisées pour la (( soufrekarbonate )) en réacteurs ou en


Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d‘un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne)

dénitrification en anaérobiose par des cultures autotrophes et cbimiolithotrophes (Zhang et Lampe, 1999, Flere et Zhang, Internet 2000). Ce procédé est connu sous l’abréviation SLAD (Sulfur Limestone Autotropbic Denitrification). Une équipe de recherche de l’université de Tulsa (Oklahoma, USA) a publié de nombreux papier sur des travaux mettant en jeu Thiobacillus denitrifcans en présence de nitrate et d’hydrogène sulfuré (Ongcharit et al, 1991, Sublette et al, 1994). En 1988, une étude sur un réacteur de dénitrification autotrophe garni de carbonate et de pyrite a permis de démontrer les capacités de dénitrification d’un consortium de Thiobacillus en utilisant la pyrite comme source d’énergie. La possibilité de l’existence d’un phénomène comparable dans les nappes des sous-sols riches en sulfure de fer a été émise par ces chercheurs (Dupain, 1992).

-

-

Les réactions bilans de l’oxydation de l’hydrogène, du soufre ou de la pyrite en présence de nitrate sont les suivantes (Dupain, 1992, Le Bideau, 1996) :

2 N 0 , +5H, + N 2 + 4 H 2 0 + 2 0 H -

6N0,- + 2 H 2 0 + 5 S” + 3N, + 4 H’ + 5 S 0 4 2 -

14N0,- + 4 H + +5 FeS, + 7 N, + 5 Fe2+ +10SO4*- + 2 H 2 0

La dénitrification in-situ II a été montré que la dénitrification peut avoir lieu naturellement dans les sols et sous- sols en présence de nitrate, de substrats carbonés et énergétiques et en absence d’oxygène. Dans la plupart des cas, elle met en jeu des bactéries hétérotrophes et chimioorganotrophes. Cependant, les vitesses de dénihification naturelles sont souvent très faibles, notamment dans les nappes d’eau profonde, en raison d’une limitation du métabolisme bactérien par manque de substrat carboné. C’est pourquoi, différents essais de stimulation de la dénitrification naturelle des aquifêres par injection de substrat carboné soluble ont été réalisés. Toutes les méthodes mettent en jeu des techniques d’injection et de pompage des eaux dans l’aquifère. Le problème majeur de ce genre de technique et la difficulté de maîtriser le développement de la microflore dans le sous-sol et les risques d’altération durable des aquiferes traités. En effet, les produits de la réaction de dénitrification sont susceptibles de provoquer le colmatage de I’aquifêre ou d’entraîner des modifications durables des équilibres physico-chimiques (Germon, 1999). Il a été également démontré que dans certains aquifères contenant des composés soufrés et/ou ferreux réduits, les bactéries dénitrifiantes cbimiolithotrophes sont capables de réaliser des dénitrifications très efficaces (Abdi-Haider, 1986). Cependant, cette potentialité n’a jamais était exploitée et relativement peut d’information sont disponibles sur les mécanismes mis en jeu d’un point de vue biologique.

2.3 Facteurs influençant la dénitrification Dans le milieu naturel ou en traitement des eaux, les 3 principaux facteurs influençant les cinétiques de dénitrification sont la teneur en nitrate et en forme oxydée de l’azote, la teneur en oxygène et la concentration en substrat carboné et énergétique pour les


Etude de la microiiore baclérienne dénifnfiante d‘un aquirere schisteux - site de Naizin (ürefagne)

bactéries. Le pH, la température et la présence d‘inhibiteurs spécifiques sont également des facteurs importants pouvant jouer un rôle majeur sur les cinétiques de dénitrification. Une description détaillée de ces facteurs est disponible dans les thèses de Trouve (1998) et Dupain (1992).

Les oxydes d’azote Les teneurs en oxyde d’azote, nitrate, nitite, oxyde nitrique et oxyde nitreux vont influencer la synthèse ou l’inhibition de la synthèse des enzymes clés de la dénitrification. Pour mémoire, il est bon de rappeler ces différentes enzymes. La nitrate réductase (NaR), la nitrite réductase (NiR), l’oxyde nitrique réductase (NOR) et l’oxyde nitreux réductase (NzOR). II est bon de rappeler que la présence de certains cofacteurs métalliques dans le milieu est nécessaire pour le bon fonctionnement de ces enzymes. C’est le cas notamment de la nitrate reductase qui nécessite l’incorporation de molybdène pour être active. De nombreuses inconnues demeurent néanmoins. L’étude de ces enzymes n’étant était réalisée que sur quelques espèces bactériennes dénitrifiantes.

L’oxygène La pression partielle en oxygène est un facteur fondamental sur la synthèse et la régulation de la dénitrification. Il est cependant difficile d’établir une valeur seuil absolue en deçà de laquelle la dénétrification pourra se mettre en place. La sensibilité vis à vis de l’oxygène dépend à la fois de l’enzyme concernée et de l’espèce bactérienne. Chez Thiobacillus denihificans , l’activité de la NaR est négligeable dès 127 pM d’oxygène. Pour d’autres genres bactériens, des teneurs jusqu’à 0.2 mp/i d’oxygène peuvent néanmoins permettre une activité dénitrifiante. Dans les sols, le fonctionnement de la dénitification dépend du niveau d’humidité qui conditionne l’aération et le niveau d’anoxie. L‘activité dénitrifiante du sol croit avec la part de porosité occupée par l’eau. Les variations d’humidité des sols liées à la pluviométrie induisent un fonctionnement par ((pulses )) (à coups) (Germon, 1999).

La Source de carbone et d’énergie Le carbone organique est l’un des facteurs les plus important de la dénitrification hétérotrophe. II joue un rôle direct en tant que substrat (source d’énergie et source de carbone) des bactéries et indirectement (dans les sols) en permettant par sa consommation par des micro-organismes aérobies de diminuer la teneur en oxygène du milieu. Un rapport pondéral C/N entre 2 et 3 est généralement admis comme optimal pour la dénitrification.

Des études sur des pilotes de déniidkation ont montré que Thiobacillus denitrificans pouvait utiliser comme source d’énergie les différents composés soufrés suivants : Soufre, sulfures, pyrites, sulfure de fer et thiosulfate. Il est néanmoins difficile d’établir une réelle hiérarchie de l’affinité des bactéries chimiolithotrophes pour ces différentes sources d’énergie. Dans l’environnement naturel, leur accessibilité et leur facilité d’assimilation gouvernent probablement leur utilisation.


Etude de la microflore bact4rienne dénitrifiante d‘un aquifère schisteux - site de Nainn (Bretagne)

PH Le pH optimal de dénitrification dépendra essentiellement des bactéries impliquées dans le phénomène. Elle a été observée à des pH très acide (33) ou très alcalins (11). Néanmoins, il semble que d’une manière générale les pH compris entre 7 et 8 sont optimaux pour l’efficacité de la dénitrification. Des pH inférieurs à 6 semblent inhibiteurs pour l’espèce Thiobacillus denitrijeans. Le pH a un rôle très important sur la nahire des produits gazeux produits lors de la dénitrification. Ainsi, des pH neutres ou légèrement alcalins permettent de favoriser la production d’azote moléculaire alors que des pH légèrement acides favoriseraient l’accumulation d’oxydes nitriques et nitreux.

La température La dénitrification est possible entre 5°C et 60°C. Cependant, une augmentation exponentielle de la cinétique de dénitrification est généralement observée entre 5°C et 30T. Au-delà, peu de variations sont observées. L’influence de ce paramètre est bien évidemment également fonction des bactéries mises en jeu. De plus, il a été observé que selon les conditions de culture (bactéries fixées ou non), l’influence de la température pouvait également varier.

Les inhibiteurs spécifiques Des teneurs anormalement hautes en insecticides et herbicides peuvent réduire temporairement l’efficacité de la dénitrification. Les azides, les cyanures, le dinitrophénol, les ions sulfures sont des toxiques majeurs de l’activités des bactéries dénitrifiantes. Pour des teneurs supérieures à 2 ppm, l’ion nitrite est susceptible de bloquer la dernière réaction de dénitrification permettant la production d’azote moléculaire.


Eiude de la rnicrollore bactdrienne dén~Mante d'un aquiïdre schisteux - sita de Naizin (Bretagne)

3. La dénitrification dans les aquifères - Problématique BRGM

3.1 Projet de recherche BRGM a Pollutions Diffuses B Depuis de nombreuses années, une équipe de recherche du BRGM s'est intéressée au devenir des nitrates dans les eaux souterraines. Dans le cadre du programme de recherche 2000, l'équipe Biotechnologie a été contactée afin d'intégrer une composante microbiologique à cette étude. Le bilan des acquis antérieurs (en terme d'hydrogéologie) et les perspectives ont été présentés par H. Pauwels dans un e-mail du 911 2/99.

«Les travaux menés ces dernières années en contexte aficole où les apports nitratés sont sous forme de déjections animales et d'engrais chimiques ont montrés des variations spatiales et temporelles importantes des teneurs en NO] dans les eaux souterraines. Des mélanges entre des eaux souterraines nitratées et des eaux exemptes de NO3, ainsi que des dilutions par les précipitations, dans des zones fracturées où les circulations peuvent être rapides expliquent en partie les variations observées. Néanmoins, la dénitrification, réduction des nitrates en une espèce gazeuse, est un processus primo dia1 Nous avons mis en évidence par ce processus, un abattement jusqu'à 80 mg.1 des teneurs en NO3 dans les eaux souterraines.' La dénitrification peut alors se faire à travers l'oxydation de matière organique ou de pyrite. Dans les contextes étudiés, ce dernier processus semble être de loin le plus important, le premier étant sujet aux variations climatiques et d'apport de matière organique. Par ailleurs, nous avons également montré qu'il était particulièremeni rapide : dans le bassin versant du Coët-Dan (bassin sur schistes), la dénitrification (lorsqu'elle fait intervenir exclusivement de la pyrite) permet de diviser la teneur en NO3 par 2 au cours d'un temps compris entre 2 et 8 jours. Sur le bassin de Lamballe (sur granite), le coefficient d'enrichissement appliqué aux isotopes de l'azote et permettant d'expliquer la variabilité des teneurs en NO] par dénitrification est identique à celui utilisé sur le Coët Dan, il montre donc que dans ce contexte également le processus est très rapide. Par ailleurs, la littérature fait état de cinétiques de dénitrification par oxydation des pyrites dans d'autres contextes (Poitou-Charente, Allemagne) plutôt lentes, voire extrêmement lentes. Si la dénitrification permet une disparition des teneurs en NO3 et engendre une consommation accrue de la pyrite, la pollution nitratée entraîne d'autres réactions chimiques. En effet, les variations spatiales de la composition chimique des eaux souterraines ont conduit à émettre les hypothèses suivantes pour expliquer le devenir de certains éléments :

les ions sulfates libérés au cours de la dénitrification doivent être repris dans une phase solide. En effet, les teneurs en SO, restent relativement basses, malgré l'importance de la dénitrification. L'abattement en Mg (apporté avec les NO3) avec la profondeur s'expliquerait par une précipitation accrue des smectites

L'abattement en métaux (également présents dans les déjections animales) traduirait une adsorpiion sur ou une Co-précipitation dans une phase secondaire (oxydes de fer, par exemple)

-f .


Elude de la microflore bactérienne dénitrifiante d‘un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne)

Ces réactions peuvent avoir un effet direct sur la cinétique de dénitrification (les espèces immobilisées étant des catalyseurs ou inhibiteurs potentiels), mais également sur les propriétés du réservoir.

Le principal enjeu du module sur la pollution nitratée est d’éclaircir les mécanismes fixant le devenir des nitrates dans les eaux souterraines et notamment la cinétique de dénitrification par oxydation des pyrites. Plusieurs facteurs peuvent alors être en cause, notamment la nature des apports nitratés (plus ou moins riches en métaux) ou la composition intrinsèques du milieu (pyrite et roche encaissante). Nous proposons donc de mener des travaux afin de mieux identifier l’effet de catalyseurs ou d’inhibiteurs du processus de dénitrification. Nous mènerons alors des travaux à diverses échelles (laboratoire, forage ou groupe de forages et petit bassin versant). Des bactéries intervenant dans la réaction de dénitrification, un aspect novateur du module sera de joindre une étude microbiologique aux études géochimiques, isotopiques, hydrogéologiques.. .

La cinétique de dénitrification est un paramètre important fixant les teneurs en NO3 d’un aquifère. A terme, le principal résultat du module est donc de définir les conditions favorables à un abattement des teneurs en NO]. Ces conditions pourront être définies de manière qualitative. Néanmoins, la cinétique entre en compétition directe avec les vitesses de transfert. Le développement d’un modèle couplé transfert/vitesse de dénitrification permettra de se doter d’un outil plus quantitatif. Les données recueillies dans ce module permettront la validation du modèle. ))

3.2 Bilan bibliographique De l’étude bibliographique préliminaire4 entreprise sur la thématique (( denitrification )) à partir des documents disponibles et des données intemet, il est possible de tirer les conclusions suivantes. D’un point de vue biologique, les processus de dénitrification ont été largement étudiés hors site, notamment dans le cadre des recherches sur le traitement des eaux. Ces études se sont surtout focalisés sur la dénitrification hétérotrophe. Beaucoup moins de données sont disponibles sur la dénitrification autotrophe. De plus, la plupart des études sur la dénitrification autotrophe et chimiolithotrophe concernent uniquement l’espèce Thiobacillus denitr$cams. Au niveau des aquifères et des sols, cas qui concerne le projet BRGM, de nombreuses études hydrogéologiques ont été réalisées. Cependant, les mécanismes microbiologiques intervenants restent mal connus et ont été très peu étudiés. Dans la plupart des études, notamment concernant la dénitrification autotrophe, seule la présence des bactéries dénitrifiantes est mise en évidence sans que les mécanismes biologiques des phénomènes d’atténuation naturelle des nitrates ne soient réellement expliqués. Lors des études BRGM sur le site de Coët Dan en Bretagne, cette approche préliminaires de mise en évidence de la microflore dénitrifiante a été réalisée. Cependant, les techniques microbiologiques employées basées sur un enrichissement de la population bactérienne d’origine sur des milieux standardisés restent très

‘ Les réCkenees bibliopphiques citées dans cc document sont disponibles chez P. d’Hugues.

60 Rappofl BRGM RP 51532 - FR

Etude de la microflore bactérienne d8nitririante d’un aquif6re schisteux - sife de Naizin (Bretagne)

approximatives et peu fiables pour une réelle identification des bactéries présentes dans l’aquifère, Ces techniques ne permettent pas d’identification précises des germes mais associent leur croissance sur un milieu de culture précis à une espèce bactérienne pré- définie comme pouvant se développer sur ce milieu. Il est important de rajouter également que ces études n’ont été réalisées que sur des prélèvements d’eau provenant de l’aquifère, Or, il est fort probable qu’une partie de la microflore active soit en partie fixée sur la matière minérale de l’aquifère.

La recherche bibliographique des articles concernant la dénitrification autotrophe a été réalisée a partir des bases de donnée ((Pascal )) et (( INSIST )) sur la période 1999 - 2000. Sur les 24 articles référencés sur cette thématique dans les 2 bases, aucun n’aborde le problème de la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dénitrification in-situ.

3.3 Perspectives d’étude Compte tenu de l’analyse bibliographique préliminaire et du descriptif de la thématique BRGM, il est possible de proposer différents types d’étude qui pourraient être entreprises.

1. Cultures d’enrichissement et biodiversité de l’écosystème Dans un premier temps, il semble intéressant d’essayer de définir les micro-organismes impliqués dans les différents phénomènes physico-chimiques observés. Pour cela, il faudrait définir plusieurs milieux d’enrichissement permettant la croissance des différents genres bactériens susceptibles d’exister sur site. En priorité, il faudra chercher à amplifier la présence des bactéries dénitrifiantes autotrophes. Cependant, il semble également utile de rechercher la présence éventuelle de bactéries dénitrifiantes hétérotrophes, voir même la présence éventuelle de bactéries sulfato-réductrices. En effet, compte tenu de l’écosystème riche en sulfate et du comportement de ces sulfates dans l’aquifère, les BSR pourraient jouer un rôle non négligeable dans les réactions biochimiques intervenant sur site. Ces études devront être réalisées sur des prélèvements d’eau souterraine mais également sur différents prélèvements de sol à différentes hauteurs. Suite à ces travaux et à l’aide des techniques de biologie moléculaire, une analyse de la biodiversité et l’identification éventuelle des germes pourra être réalisée. Une approche d’identification directe des micro-organismes présents dans l’aquifère, sans étape d’enrichissement préalable, pourra être entreprise avec notre partenaire Bio- ID. Ce travail a pour but l’extraction directe de l’ADN présent dans les échantillons de sol et d’eau. Compte tenu de la probable faible quantité de micro-organismes présents a l’origine, il n’y a aucune garantie de réussite de cette approche.

2. Cinétique de dénitrification en fiole Différentes cinétiques de dénitrification pourraient être réalisées a l’échelle du laboratoire à partir d’échantillons de sols euou d’échantillons d’eau provenant de l’aquifère concerné. Ces études réalisées en batch devraient permettre de tester différentes combinaisons de milieux réactionnels. Différents échantillons de sols (stérilisés ou non) pourraient être


Etude de la rnicrotïore bactérienne dhnitriiiante d‘un aquiière schisteux -site de Naizn (ûretegne)

mis en contact avec de l’eau provenant du site, des milieux ((nitrates N synthétiques et des milieux synthétiques ensemencés par les cultures d’enrichissement. Avec les solutions synthétiques, l’influence de paramètres tels que le pH, les éléments dissous (métaux, oxygène, sources de carbone) et les éléments soufrés source d’énergie pourront être étudiés au regard de leur rôle dans l’efficacité de la dénitrification. Ces différentes études préliminaires en batch devraient permettre d’identifier plus clairement les paramètres chimiques et biologiques responsables de l’abattement des teneurs en nitrate observées au niveau de l’aquifère de Coët Dan en Bretagne. Un suivi attentif des formes (( néo-précipitées )) lors du processus de dénitrification sera nécessaire pour valider les observations réalisées jusqu’à ce jour par les équipes BRGM en charge de l’étude de ce site.

3. Cinétique de dénitrification en colonne Après l’approche préliminaire du laboratoire, des travaux en continu en colonne pourraient être mis en œuvre à partir d’échantillons de sol reconstitués et de carottes de roche de l’aquifère. En fonction des résultats des études préliminaires, les conditions de culture seront définies. Un suivi analytique plus rigoureux pourra être mis en place à ce niveau. C’est notamment le cas pour l’analyse des différentes formes d’azote intervenant dans le cycle de réduction des nitrates en azote moléculaire.

3.4 Mise en oeuvre des études Compte tenu du caractère nouveau de cette thématique pour l’équipe biotechnologie, différents contacts seront nécessaires avant la mise en place d‘un programme de travail plus détaillé.

Equipe H. Pauwels. Il sera utile de définir avec les spécialistes BRGM du site les différents modes de prélèvement et la localisation de ses prélèvements. Une mission sur site devra être prévue. La collecte des données physico-chimiques du site et les paramètres jugés important à suivre seront définis en commun. Les méthodes de suivi analytique déjà utilisées par cette équipe seront discutées et mis en place. Equipes Scientifiques. Deux équipes impliquées dans l’étude de la dénitrification sont connues, l’une à l’INRA de Dijon, l’autre à l’université de Poitiers. Des contacts avec ses équipes pourront être établis afin d’enrichir notre programme expérimental. Bio-ID. La société Bio-ID établie dans les laboratoires de l’INRA de Narbonne est un pertenaire privilégié de l’équipe Biotechnologie du BRGM pour toutes les études de type identification par biologie moléculaire de la biodiversité des ecosystèmes. Il est prévu de travailler avec cette société pour l’identification de la microflore dénitrifiante. Des charges externes seront générées par cette collaboration (un minimum de 50 kF est nécessaire).

A ce stade du projet, il est difficile de définir précisément les temps nécessaires à la mise en place de ce projet. Il est évident qu’une phase de mise au point technique et analytique pour la réalisation des expériences sera nécessaire. Les phases 1 et 2 pourront être lancées en parallèles. La définition des temps nécessaires à la mise en place des travaux en 2001 dépendra du budget prévisionnel de l’équipe d’H. Pauwels et de la


Elude de la microflore baciérienne déniinfiante d‘un aquifdre schisleux - site de Piaiin (Bretagne)

disponibilité des agents de l’équipe biotechnologie en 2001. Il devra être défini en commun par les différentes parties concernées. Néanmoins, un minimum de 90 jours d’UO semble nécessaire pour conduire des travaux de qualité. La phase 3 pourrait n’être réalisée que dans la mesure ou le projet serait reconduit en 2002.

A partir à ce mémo, il apparaît évident que la thématique nitrate, notamment au niveau des aquifères est une thématique dans laquelle beaucoup de choses restent à faire, notamment au niveau de sa composante biologique. Cependant, la mise en place d’un suivi scientifique rigoureux au niveau d‘un écosystème tel qu’un aquifere demande beaucoup de temps. Ce projet devra donc s’inscrire dans la durée afin de pouvoir aboutir à des résultats intéressants et fiables.


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Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - siie de Naizin (Bretagne)


Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux -site de Naizin (Bretagne)

Annexe 2 - Organigramme technique des travaux


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Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne)

Rappori BRGM RP 51532 - FR

Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Bretagne)

Annexe 3 - Présentation du site de Naizin


Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifere schisteux - site de Naizin (Bretagne)

Annexe 4 - Procédure de préparation des milieux de culture


Etude de la microflore becidrienne dénitrifiante d'un aquiière schisteux - sife de NaiUn (Bretagne)

NaZSZ03, 5H20

3. Préparation de la solution 1 au l/lOhe (Dénit A - solution 1 (MO)) Transférer 200 ml de la solution 1 dans une fiole jaugée de 2000 ml. Rajouter 4.3 ml de solution d'oligoéléments. Compléter à 2000 ml par de l'eau déminéralisée. Contrôler et ajuster le pH à 7.

4. Préparation de la solution 1 pour milieu solide 1/lOhe (Dénit A - solution 1 (1110) + Agar).Transférer 188 ml de la solution 1 (1/10) dans un flacon stérilisable (Schott à bagues).Rajouter 3 g d'agar.

5. Préparation des fioles à plasma 9 Transférer 141 ml/fiole de la solution 1 dans 4 fioles à plasma. . Transférer 141 mUfiole de la solution 1 (l/lOhq dans 4 fioles àplasma. ' Transférer 141 ml/fiole de solution 1 dans 4 fioles à plasma. Rajouter 225 mg de

pyrite (Stock Chessy) et 6 ml d'eau déminéralisée par fiole. . Transférer 141 ml/fiole de la solution1 (l/lOeme) dans 4 fioles à plasma. Rajouter 23 mg de pyrite (Stock Chessy) et 6 ml d'eau déminéralisée par fiole. . Faire "buller" de l'azote dans chaque fiole (10 minutes).

6. Stérilisation Stériliser à 120°C pour 15 minutes les fioles et les flacons suivants: . 4 fioles à plasma Dénit AT (Solutol) - 5x141 rnl . 4 fioles à plasma Dénit AT (Solut01 - 1/10""3 ~ 5x141 ml. . 4 fioles à plasma Dénit AP (Solut0 1) - 5x147 ml . 4 fioles à plasma Dénit AP (Solutol - 1/lOeme) ~ 5x147 ml . 1 flacon Dénit AT - Agar - 188 ml . 1 flacon Dénit AT (l/lOkm7 -Agar - 188 rnl

15 9

Dénit AT (1/10) liquide et solide.

Milieu Dénit A - Solution 2 (Thiosulfate) La solution 2 sera utilisée pour le milieu Dénit AT liquide et solide et pour le milieu

1. Préparation de la solution 2 (fiole jaugée 200 mi)

Transfert en flacon stérilisable. Faire buller de l'azote, IO minutes.

2. Préparation de la solution 2 (l/lOhq - (Fiole jaugée 100 mi) Transférer 10 ml de la solution 2 dans une fiole jaugée del00 ml. Transfert dans un flacon stérilisable. Faire "buller" de l'azote 10 minutes.

3. Stérilisation 12OOC - 15 mn. 1 Dénit A - SolutO 2 (flacon 200 mi)

Dénit A - Solut' 2 (1/10h4 - (flacon 100 mi)


Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un aquifère schisteux - site de Naizin (Eretagne)

NaHC03

0

La solution 3 sera utilisée pour le milieu Dénit AT liquide et solide, pour le milieu Dénit AT (100) liquide et solide et pour le milieu AP liquide.

1. Préparation de la solution 3 (fiole jaugée 200 mi).

Milieu Dénit A- Solution 3 (Carbonate)

10 9

Ajouter 1.1 ml d'acide sulfurique dans approximativement 50 ml d'eau déminéralisée dans une fiole jaugée de 100 mi. Rajouter 200 mg de FeS04. Compléter à 100 ml avec de l'eau déminéralisée. La stérilisation sera effectuée par filtration 0.22 prn lors du rajout de cette solution avec les autres solutions composant le milieu Dénit A.

Pour le milieu Dénit A, dilué au 1Ohe, ajouter 1.1 ml d'acide suIfunque dans approximativement 50 ml d'eau déminéralisée dans une fiole jaugée de 100 ml. Rajouter 20 mg de FeS04. Compléter à 100 ml avec de l'eau déminéralisée. La stérilisation sera effectuée par filtration 0.22 pm lors du rajout de cette solution avec les autres solutions composant le milieu Dénit A (1/10""~.

1.3 Reconstitution du milieu Dénit A Le milieu Dénit AT (dilué ou non) est composé d'un mélange de 4 solutions dans les proportions suivantes: Solution 1 (94 %); Solution 2 (4 %); Solution 3 (2 %) ; Solution 4 (1/1000)

Le milieu Dénit AP (dilué ou non) est composé d'un mélange dans les proportions suivantes : Solution1 +Pyrite + Eau (98%) ; Solution 3 (2%) ; Solution 4 (l/lOOO).

Le rajout des solutions 2, 3 et 4 au milieu de base (Solution 1) se fera sous la hotte à flux laminaire avec des seringues stériles purgées à l'azote.

Milieu Dénit A - Solution 4 (Fer ferreux) dans acide sulfurique 0.1 N

74 R a p p o ~ BRGM RP 51532 - FR

Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d‘un aquifère schisteux - site de Naizin (üretagne)

7. Vortexer 8. 9. Récupérer surnageant 10. Ajouter au culot de 500 p1 de Solution Tris-EDTA-NaCl-PVPP 11. Vortexer 12. Centrifuger 12 O00 rpm 3 minutes 13. Pooler le surnageant avec le premier 14. Répéter les étapes 10 à 13 15. Ajouter un volume d’isopropanol au pool 16. Laisser 10 minutes à température ambiante 17. Centrifuger 15 O00 rpm 15 minutes 18. Reprendre le culot dans 450 pl tampon phosphate 0,IM pH 8,0 et 50 pi Acétate de

19. Laisser lh30 dans glace 20. Centrifuger 16 O00 rpm 30 minutes 21. Récupérer le surnageant

Purification de l’ADN total 1. Ajouter 20 pl RNase lmg4 et incuber 30 minutes à 37°C 2. Ajouter 50 pI Acetate de Sodium 3M pH $2 puis 1 ml éthanol 100% 3. Mélanger par retournement 4. Transférer pelote d’ADN dans 600 pl éthanol et 20 pl Acetate de Sodium 3M 5 . Vortexer et laisser 10 minutes à Température ambiante 6. Centrifuger 15 O00 rpm 15 minutes 7. Laver à l’éthanol 70% et centrifuger 5 minutes 8. Sécher le culot et reprendre le culot dans 50 p1 d’eau nanopure stérile 9. Congeler à -20°C jusqu’à la procédure d’amplification

Centrifuger 12 O00 rpm 3 minutes

Potassium 5M

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BRGM Service Reprographie Impression et façonnage

Documents

Etude de la microflore bactérienne dénitrifiante d'un ...infoterre.brgm.fr/rapports/RP-51532-FR.pdf · Cette approche "écologie microbienne" était relativement nouvelle pour l'équipe