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JÉRÉMIE POULIOT
BIODIVERSITÉ MICROBIENNE DES ~ . " "-
ECOSYSTEMES EXTREME.S Analyse moléculaire de la diversité des Archaea dans deux lacs
méromictiques arctiques
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en biologie pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
© Jérémie Pouliot, 2008
DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE FACULTÉ DE SCIENCES ET DE GÉNIE
UNIVERSITÉ LA V AL QUÉBEC
2008
RéSUIné
Une série de lacs méromictiques existent le long de la côte nord de l'île d'Ellesmere au
Nunavut (Canada). Ces lacs hautement stratifiés possèdent un couvert de glace p~rmanent
qui contribue à maintenir la stabilité de gradients de salinité et de température dans ces
écosystèmes. La limnologie physique et chimique de ces lacs polaires est bien connue.
Cependant, nous en savons très peu sur les populations microbiennes qu'ils abritent.
L' objectif pr~ncipal de ce travail est de décrire la diversité microbienne et les conditions
environnementales dans les lacs de façon à relier la composition et la fonction des
communautés aux propriétés physico-chimiques. Le profil de l'oxygène dissous divise ces
écosystèmes aquatiques en trois couches d'eau distinctes: une zone riche en oxygène dans
la partie supérieure du lac, suivie d'une zone de transition et d'une zone anoxique en
profondeur. Nous avons échantillonné chacune de ces trois couches afin de prélever des
échantillons d'ADN dans le but de décrire, à l'aide d'outils moléculaires (clonage
moléculaire, PCR quantitative) la diversité et la fonction des communautés d'Archaea dans
deux lacs méromictiques arctiques (A et Cl). Nos résultats révèlent la présence de diverses
communautés d'Archaea dans les lacs et une différence prononcée de cette diversité entre
les profondeurs échantillonnées. De plus, la présence d'un gène associé à la nitrification, le
gène amoA, a pour la première fois été détectée dans un environnement lacustre. Cette
découverte nous permet de supposer la présence d'Archaea nitrifiantes dans les lacs A et
Cl.
Abstract
A series of perenniall y ice-covered lakes occur along the northern coast of Ellesmere
Island, Nunavut (Canada). These lakes are highly stratified and show unusual salinity and
temperature profiles. The physical and chemical limnology of these north polar lakes has
been weIl described, however their microbial communities remain unknown. The main
objective of this study was to describe their diversity, specifically the phylogenetic
composition of Archaea, and environmental conditions in order to link community
composition and function to physico-chemical properties. The dissolved oxygen profile in
two of the lakes (Lake A and Lake Cl) divided the water column into three distinct water
layers: an oxygenated zone in the upper part of the lake, followed by a transition zone and a
deeper anoxic zone. We sampled water from each of these layers and described the
diversity and function of Archaea with molecular tools (cloning, quantitative PCR). Our
results revealed diverse archaeal communities in the lakes, with clear differences among
layers. Also, the presence of archaeal amoA gene, a gene involved in the nitrification
process, was detected for the first time in a lake, indicating the presence of nitrifying
Archaea in Lake A and 'Lake Cl.
11
A vant-Propos
Ce mémoire se divise en trois chapitres. Le premier consiste en une introduction générale
présentant les différents éléments nécessaires à la compréhension de mon projet. Le
deuxième présente les résultats obtenus durant ma maîtrise. Cette section a été rédigée en
anglais sous forme d'article scientifique. Finalement, le troisième chapitre consiste en .une
conclusion générale de mon projet.
Les résultats du deuxième chapitre ont été acceptés pour publication dans un journal
scientifique sous le titre « Vertical structure of archaeal communities and the distribution of
ammonium monooxygenase A ge~e variants in two meromictic High Arctic lakes ». J ' ai
écrit cet article en étroite collaboration avec trois coauteurs. D'abord, j'ai eu l ' appui de
Monsieur Pierre Galand, stagiaire au postdoctorat au · département de biologie de
l'Université Laval et ancien membre de Québec-Océan (Québec, Canada) entre 2005 et
2007. De plus, j'ai eu la chance de bénéficier des précieux conseils de ma codirectrice de
maîtrise, Madame Connie Lovejoy, ainsi que de mon directeur, Monsieur Warwick
Vincent.
Les données recueillies lors d'un séjour sur l'île d'Ellesmere (Nunavut, Canada) au
printemps 2006 et les résultats de leurs ana~yses ont .été présentés sous forme d'affiche
scientifique dans le cadre de la rencontre annuelle de la Société canadienne des
microbiologistes (SC~) à Québec en juin 2007. Ces. résultats ont également été présentés
oralement lors de la rencontre de la Société internationale de limnologie (SIL) en août 2007
à Montréal et lors de l'International Conference on Polar and Alpine Microbiology à Banff
en mai 2008.
Je tiens à témoigner ma gratitude à tous les organismes et à toutes les personnes qui ont
permis la concrétisation de ce projet de maîtrise en le soutenant financièrement,
logistiquement et moralement. Grâce à eux, j'ai pu acquérir, au cours des deux dernières
années, une précieuse expérience, tant sur le plan scientifique qu 'humain.
Pour cOmlnencer, je tiens à remercier mon directeur de maîtrise, Monsieur Warwick
Vincent, pour la chance qu'il m'a donnée de faire partie de sa merveilleuse équipe ainsi que
pour son soutien et ses encouragements tout au long de mon projet. Son professionnalisme
et la passion qu'il dégage m'ont permis d'apprendre beaucoup à ses côtés. Merci également
à ma codirectrice, Madame Connie Lovejoy, pour ses précieux conseils et sa grande
implication dans mon projet. Merci aussi aux membres de mon comité pour leurs conseils
et commentaires.
Merci à l'appui financier du programme ArcticNet (un réseau de centres d'excellence), du
Conseil de recherche en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), de Québec
Océan, du Programme de formation pour scientifiques dans le nord (PFSN) et du
département de biologie de l'Université Laval. Merci au soutien logistique du programme
d'Étude du plateau continental polaire (ÉPCP / PCSP) qui a assuré la bonne coordination
de notre présence sur le terrain.
Merci aux membres des laboratoires Vincent et Lovejoy pour leurs conseils et leur soutien.
Un merci spécial à Julie Veillette, Anne Jungblut, Dermot Antoniades, Denis Sarrazin et
Jessica Tomkins pour leur aide à la coordination de l'échantillonnage sur le terrain. Merci
également à Marie-Ève Garneau, Marianne Potvin et Pierre Galand pour leur grande
disponibilité et leurs conseils techniques en laboratoire. Merci aussi à tous ceux qui ont fait
partie de ma vie quotidienne à l'université.
Finalement, merci à ma famille et à mes amis pour votre soutien moral, évidemment, mais
pour tout le reste également. Un merci spécial à ceux et celles qui ont su me motiver aux
moments où j'en avais vraiment besoin ... il Y a un peu de vous dans ce travail!
Gâtez-vous!
IV
Peu importe le critère considéré -la biomasse ou le nombre d'individus -
la vie sur terre est microscopique. Nee (2004)
. Earth' s real biodiversity is invisible, whether we like if or note
Nature
Table des ntatières
Résumé ..................................................................................................................................... i Abstract .................................................................................................................................. ii Avant-Propos ........................................................................................................................ iii Table des matières ................................................................................................................. vi Liste des tableaux ................................................................................................................. vii Liste des figures .................................................................................................................. viii Chapitre 1 - Introduction générale ......................................................................................... 1
1.1 La biodiversité et la biogéographie microbienne ..................................................... 1 1.2 Biodiversité moléculaire microbienne .................................................................... 4
1.2.1 Les domaines de la vie .................................................................................... 4 1.2.2 Le concept « d'espèce microbienne» ............................................................. 5 1.2.3 La biologie moléculaire et ses limites ............................................ · ................. 7
1.3 Les Archaebactéries ................................................................................................ 9 1.3.1 La phylogénie ................................................................................................. 9 1.3.2 L'écologie des Archaea ................................................................................ 10 1.3.3 Les Archaea nitrifiantes ...................................................... ~ ......................... 11
1.4 Les régions polaires ............................................................................................... 13 1.5 Site d'étude ........................................................................................................... 14 1. 6 Hypothèses de recherche et objectifs .................................................................... 16 Organisation du mémoire .................................................................................................. 18
Chapitre 2 - Niche separation of Archaea and amoA in two High Arctic lakes .................. ·.26 Résumé .............................................................................................................................. 26 Surnrnary ........................................................................................................................... 27 2.1 Introduction ........................................................................................................... 28 2.2 Experimental procedures ...................................................................................... 29
2.2.1 Sampling ....................................................................................................... 29 2.2.2 Cell counts and chlorophyll analysis ............................................................ 30 2.2.3 Chemical analyses ......................................................................................... 31 2.2.4 DNA sampling and extraction ...................................................................... 31 2.2.5 PCR and cloning ........................................................................................... 32
. 2.2.6 Diversity and phylogenetic analysis ............................................................. 32 2.2.7 Quantitative PCR (qPCR) analysis .................... ~ .......................................... 33
2.3 Results ................................................................................................................... 34 2.3.1 Physico-chemical characteristics of the lakes ............................................... 34 2.3.2 Quantification of archaeal amoA and 16S rDNA genes ............................... 34 2.3.3 Diversity of the amoA gene .......................................................................... 35 2.3.4 Diversity of archaeal cornrnunities in Lake A .............................................. 36
2.4 Discussion ............................................................................................................. 37 2.5 Conclusions ........................................................................................................... 42 Acknowledgements ........................................................................................................... 42
Chapitre 3 - Conclusion générale ......................................................................................... 57 Bibliographie ......................... ~ .............................................................................................. 61 Annexes ................................................................................................................................ 71
Liste des tableaux
Chapitre 2
Table 2.1. Environmental characteristics of Lake A and Lake Cl. Temp: temperature; DO: dissblved oxygen; Cond: conductivity; TP: total phosphorus; DOC: dissolved organic carbon; ChI a: chlorophyll a; < / >: data under / over detection limits ........................ . 43
Table 2.2. Characteristics of the PCR primers and annealing conditions used in this study 44 Table 2.3. Diversity of clone libraries for archaeal 16S rDNA in Lake A and the amoA
gene in the oxycline of Lake A and Lake Cl (B). Enumeration of phylotypes and caIcuIation of diversity estimators (Shannon and Chao) were done at a 3 % distance level between sequences ................................................................................................ 45
Table 2.4. Replicability of the molecular analysis. Means and standard deviation (SD) are for duplicate samples from each depth in Lake A, expressed as number of copies of gene mL-le Coefficient of variation (CV) is SD as a percentage of the mean ............... 46
Liste des figures
Chapitre 1
Figure 1.1 Schématisation simplifiée de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). La PCR permet d'amplifier un gène ciblé dans un échantillon environnemental. Traduit et adapté de Albert et al. (2002) ........................................................................................ 19
Figure 1.2 L'arbre de la vie. Tiré de Woese et al. (1990) ..................................................... 19 Figure 1.3 Le clonage moléculaire à partir d'un échantillon environnemental. Après avoir
amplifié un gène d'intérêt par PCR, les fragments amplifiés sont insérés dans des plasmides. Les plasmides sont à leur tour insérés dans des bactéries qui 'seront ensuite étalées sur un milieu . de culture. Chaque bactérie se répliquera par clonage et répliquera du même coup le plasmide et le fragment inséré. Après incubation, les colonies isolées sont prélevées. Ces colonies contiennent des milliers de copies du fragment . et ce . dernier est maintenant isolé de notre échantillon de départ. Pour simplifier le schéma, seuls quelques fragments (en couleur) ont été sélectionnés. En réalité, tous les fragments gris auraient pu être clonés. Tiré et traduit de Albert et al. (2002) ............................................................................................................................. 20
Figure 1.4 La PCR quantitative. Comme pour la PCR classique (Fig. 1.1), cette technique se déroule sur plusieurs cycles quise divisent chacun en trois étapes (dénaturation, hybridation, élongation). La PCR quantitative comporte cependant une quatrième étape qui consiste en une lecture de la fluorescence émise par un fluorochrome, le SYBR Green. Le SYBR Green a la propriété de se lier à l'ADN double brin lors de l'étape d'élongation (image de droite). L'intensité de la fluorescence mesurée à la fin de chaque cycle sera donc proportionnelle au nombre de copies d'ADN double brin dans l'échantillon. Ce nombre de copies est très faible au début et devient exponentiellement plus important à chacun des cycles de l'amplification par PCR. Tiré du site Internet www.strath.ac.uk/ ................................................................................. 21
Figure 1.5 Un échantillon environnemental regrouperait deux types de communauté microbienne. La première est constituée des espèces dominantes qui sont actives et qui régulent le dynamisme de leur environnement. La deuxième est désignée comme étant la biosphère rare (rare biosphere) et est formée des microorganismes qui ne sont pas significativement actifs pour influencer l'environnement dans lequel ils évoluent. Tiré et traduit de Pedros-Alio (2006) .................................................................................... 22
Figure 1.6 Le cycle aquatique de l'azote (N). La nitrification est présentée dans l'encadré noir. Le site d'action de l'enzyme ammonium oxygénase et de sa sous-unité A (amoA) est représenté par la flèche noire. Tiré et adapté de Arrigo (2005) ............................... 23
Figure 1.7 Profil caractéristique d'un lac méromictique de la région du haut Arctique canadien. Les lacs méromictiques renferment généralement des gradients de salinité (rouge) et des profils de température (noir) qui sont comparables à ceux observés au lac A (83°00' N, 75°30' 0) en mai 2006 ..... ~ ................................................................. 24
Figure 1.8 Profil du lac Vanda (Antarctique) pour la conductivité (cercles blancs) et l'oxyde nitreux (N20; cercles noirs) en fonction de la profondeur. Données tirées et adaptées de Vincent et al. (1981) ................................................................................... 24
Figure 1.9 Carte du site d'étude. (A) La région du haut Arctique canadien et la côte nord de l'île d'Ellesmere. (B) Localisation du lac A et du lac Cl .............................................. 25
--------- ------ -- - - - -
Figure 1.10 Le lac A (83°00' N, 75°30' 0) en juillet 2007. À noter, la présence du couvert de glace durant l'été et le désert polaire qui domine le bassin versant du lac ............... 25
Chapitre 2
Figure 2.1 Map of the sampling sites. (A) Canadian High Arctic and northern coast of Ellesmere Island. (B) Location of Lake A and Lake Cl. .............................................. 47
Figure 2.2 Depth profiles for conductivity (A), temperature (B), dissolved oxygen (C) .and pH (D) for Lake A (filled circles) and Lake Cl (open circles). The dark and light shadings indicate the oxycline of lakes A and Cl respectively. Note that conductivity profiles are almost identical in both lakes ..................................................................... 48
Figure 2.3 Abundance of 16S rDNA and amoA genes in the water column of Lake A (A) and Lac Cl (B) in relation to dissolved oxygen profile (filled circles). The shading indicates the oxycline of Lake A and Lake Cl respectively. *: 0 amoA copies rnL-1
;
**: 0 amoA and Crenarchaeota copies mL- l . . . . .... .... ..................................................... 49
Figure 2.4 Replicability of the molecular analysis. QPCR results for Lake A samples from 2 m, 12 m and 32 m taken at the main site and at a duplicate site 500 m away. (A) archaeal, (B) crenarchaeotal and (C) amoA genes expressed as number of copies of gene mL-le *: 0 copies rnL- l for main site; **: 0 copies mL- l for main and duplicate . ................................................................................................................................. 50-51
Figure 2.5 Phylogenetic (A) and community (B) composition of amoA clone libraries from the oxyclines of Lake A and Lake Cl. Only representative DSCs «99% sequence identity) are shown (in bold) .......................................................................................... 52
Figure 2.6 Composition of archaeal clone libraries at five depths of Lake A. Communities are represented by relative abundances of clones belonging to different DSCs (1 to Il) .................................................................................................................................. 53
Figure 2.7 Distance tree representing the position of Crenarchaeota (A) and Euryarchaeota LDS (B) and RC-V clusters (C) from Lake A. Analyses are inferred from 800-base-pair-Iong 16S ribosomal RNA sequences using FITCH distance matrix analysis (from the program PHYLIP). Sequences from this study are shown in bold, with depth of origin indicated (LAa[depth].[clone]). Bootstrap values> 50 are shown. Scale bar: 10% sequence divergence ....................................................................... 54-56
IX
Chapitre 1 - Introduction générale
Les techniques de culture développées par Pasteur et Koch ont grandement contribué au
développement de la microbiologie. Cependant, plusieurs études démontrent que les
analyses de cultures ne prennent pas en considération la majeure partie de la diversité
microbienne (Ward et al., 1990; Martiny et al., 2006; Pedros-Alio, 2006). · Pourtant, la
biodiversité microbienne domine la biodiversité de la biosphère. Le récent développ~ment
des outils moléculaires permet d'entrevoir, pour la première fois, toute l'étendue de cette
diversité. L'approfondissement du nouveau domaine d'étude qu'est l'écologie microbienne
moléculaire a d'ailleurs été identifié par le United States National Research Council (NRC)
comme la clé pour repousser les limites les plus importantes dans l'étude des régions
polaires (NRC, 2004). Cette thèse consiste en l'application des méthodes moléculaires pour
mieux comprendre la structure et le fonctionnement des écosystèmes lacustres dans le haut
Arctique canadien. Dans ce chapitre, j'introduirai les concepts de base sur la biodi versité et
la biogéographie microbienne, sur l'approche moléculaire, sur l'écologie des Archaea,
surtout en relation avec la nitrification, et sur l'écologie microbienne des zones polaires,
incluant mon site d'étude. Par la suite, je présenterai mes hypothèses de recherche et les
objectifs ciblés dans cette étude.
1.1 La biodiversité et la biogéographie microbienne Les communautés microbiennes dominent la biodiversité et souvent la biomasse de
l'écosystème dans toutes les régions du monde, incluant les environnements extrêmes. Le
sommet des montagnes, le fond des océans et les déserts sont des exemples de milieux
extrêmes où le développement de la vie est souvent poussé à ses limites. Bien souvent, une
température très élevée ou très froide, une salinité excessive ou un pH très faible ne
permettront pas la survie de la plupart des microorganismes. Cependant, certains d'entre
eux sont dits extrêmophiles et sont adaptés à ce type d'environnement (Cavicchioli and
Thomas, 2002). L'étude de , la diversité dans les milieux extrêmes permet de mieux
comprendre le rôle des microorganismes dans les autres écosystèmes de la planète. En
effet, les conditions spécifiques de ces milieux extrêmes nous aident à expliquer la fonction
des microorganismes qui en font partie. De plus, la prospection de la biodiversité
(bioprospection : recherche de ressources génétiques et biochimiques pouvant avoir une
valeur commerciale pour des applications pharmacologiques ou biotechnologiques) dans
ces régions hostiles a permis de faire des découvertes importantes. C'est le cas de celle de
Thomas Brock qui, dans les années 60, a déniché une espèce thermophile importante dans
l'avancement de la biologie moléculaire: Thermus aquaticus. Cette espèce a été découverte
dans les sources thermales du Parc de Yellowstone aux États-Unis. Ce microorganisme est
la source de la célèbre enzyme TAQ polymérase, utilisée pour l'élongation des brins
d'ADN à haute température au cours de la Polymerase Chain Reaction (PCR ; Fig. 1.1)
(Mullis and Faloona, 1987; Saiki et al., 1988). C'est également dans les environnements
extrêmes qu'un nouveau grotipe . de microorganismes a été découvert, celui des
archaebactéries (W oese et al., 1978). Les exobiologistes (ou astrobiologistes) s ' intéressent
aussi aux habitats extrêmes puisque ceux -ci sont sans doute les environnements se
rapprochant le plus de ceux retrouvés sur la planète Mars ou sur certaines lunes de Jupiter
ou de Saturne" L'étude des milieux extrêmes sur Terre permet de mieux comprendre
l ' origine et l'évolution de la vie sur notre planète et de mieux cerner comment et à quel
endroit la vie pourrait s'être développée sur les autres planètes (Cavicchioli, 2002).
Les régions polaires sont des environnements aux conditions extrêmes. TI s' agit d'endroits
où la lumière disparaît tout près de trois mois par année, où les ressources nutritives ne sont
présentes qu'en faible quantité et où la température descend parfois à des niveaux
incroyablement bas. Malgré tout, une biodiversité surprenante est parvenue à s ' y
développer. Évidemment, on pense tout de suite aux mammifères, aux oiseaux et aux
insectes qui parvienn~nt à survivre clans ces régions hostiles. Cependant, on oublie souvent
que les régions polaires abritent également une biodiversité beaucoup plus importante, mais
la majeure partie de celle-ci n'est pas visible à l' œil nu. La vie microscopique est
omniprésente dans les régions polaires (Vincent, 1988) incluant dans le pergélisol (Steven
et al., 2007), les roches (Cockell and Stokes, 2004), les lacs (Van Hov.e et al., 2001; 2008),
les rivières (Galand et al., 2006) et même dans la glace (Vincent et al., 2004a). Certains
2
microorganismes ont différents métabolismes adaptés aux conditions difficiles de
l'Arctique et de l' Antarctique. D~ plus, comme dans les autres écosystèmes de la planète,
ils occupent une place importante dans les cycles biogéochimiques et dans l'équilibre de
leur environnement.
Pendant que plusieurs scientifiques se questionnent sur la niche écologique qu'occupent les
différents microorganismes dans les environnements extrêmes, plusieurs s'interrogent
simplement sur la façon grâce à laquelle ils sont parvenus dans ces endroits. TI existe
d'ailleurs une vive controverse sur la distribution uniforme des microorganismes sur Terre
(Martiny et al., 2006). D'un côté, certains chercheurs suggèrent que la dispersion des
microorganismes à t~avers le globe fait en sorte que toutes les espèces bactériennes sont
cosmopolites, c'est-à-dire qu'on les retrouve dans toutes les régions d~ monde. Ce sont les
conditions du milieu qui favorisent l'émergence des espèces dominantes. Cette hypothèse
est appuyée par la célèbre citation prononcée au début du 20e siècle par Beijerinck et
reprise par Bass-Becking à propos des bactéries: « Tout est partout, c'est l'environnement
qui sélectionne» (Baas Becking, 1934; de Wit and Bouvier, 2006). Plus récemment, elle a
été appuyée par Finlay et par d'autres chercheurs qui l'ont étendue à tous les
microorganismes « 1 mm) sur Terre (Lawton, 1998; Finlay and Esteban, 2004; Finlay and
Fenchel, 2004). De l'autre côté, des chercheurs prônent plutôt une théorie sur la
biogéographie des microorganismes et estiment que les espèces microbiennes sont
endémiques à certaines régions du globe. Cette répartition serait à l'image de celle des
macroorganismes dont le mode de vie influence ou est influencé par les microorganismes
(Hedlund and .Staley, 2004). D'autres chercheurs prennent les deux théories en
considération et proposent plutôt la présence de microorganismes cosmopolites et
endémiques dans une même région (Vincent, 2000).
3
1.2 Biodiversité moléculaire microbienne
1.2.1 Les domaines de la vie
Le monde microbien est extrêmement vaste et plusieurs taxonomistes ont tenté de le classer
selon divers critères. Au début des années 90, Woese et ses collaborateurs ont proposé un
nouveau système de classification en divisant les organismes vivants en trois domaines
(Fig. 1.2) : Archaea, Bacteria et Eucarya (W oese et al., 1990). Plusieurs caractéristiques
ont permis de faire cette distinction chez les organismes vivants. Entre autres, les
Eucaryotes (Eucarya) possèdent un noyau bien défini qui contient leur matériel génétique.
Ce n'est pas le cas des Procaryotes (Archaea et Bacteria) qui possèdent généralement un
matériel génétique regroupé dans une,région de la cellule, mais sans membrane délimitant
clairement l'ADN du cytoplasme. Les archaebactéries (Archaea) et les eubactéries
(Bacteria) sont de tailles et de formes comparables ; c'est ce qui a compliqué leur
distinction dans le passé. Les lipides polaires, comme les phospholipides et les glycolipides
sont présents chez tous les procaryotes, mais certains genres et espèces possèdent une
composition en lipides polaires bien particulière. Deux classes de lipides polaires divisent
les procaryotes: ceux étant caractérisés par les liens ester (eubactéries) et ceux possédant
des liaisons éther (archaebactéries). Ce critère en est un de toute première importance, car il
divise les Archaea et les Bacteria. Ce sont d'ailleurs les liaisons de type éther qui
permettent aux archaebactéries d'être mieux adaptées aux environnements extrêmes, où
elles forment, bien souvent, des communautés dominantes.
La biodiversité microbienne se reflète par la variété de métabolismes différents qui existent
dans la nature. Par exemple, les bactéries peuvent utiliser différents substrats pour générer
l'énergie dont elles ont besoin pour croître et pour se reproduire. Ainsi, les bactéries
phototrophes se servent de l'énergie lumineuse, les chimioorganotrophes oxydent des
composés organiques et les chimiolithotrophes exploitent la matière inorganique. Ces
réactions pour générer de l'énergie peuvent se produire sous différentes conditions. Par
exemple, les cyanobactéries et les bactéries photosynthétiques sont deux types de
4
phototrophes, mais les premières ont besoin d'oxygène pour leur respiration, ce qui n'est
pas les cas des secondes (Prescott et al., 2003).
Un ~cosystème renferme plusieurs microenvironnements aux conditions différentes. TI peut
donc accueillir une variété importante d'espèces microbiennes. Dans un lac par exemple,
certaines zones peuvent être anoxiques tandis que d' autres sont saturées en oxygène. TI
existe aussi une zone de transition entre les deux où l'on peut retrouver des
microorganismes microaérophiles. Pendant que la zone oxique et la zone anoxique offrent
un contraste par la présence et l'absence d 'oxygène, cette région transitoire est propice au
développement d'une importante biodiversité. En effet, en plus des microorganismes
microaérophiles, cette zone peut aussi être favorable au développement de certaines
bactéries de la zone anoxique qui tolèrent la présence d'oxygène même si elles ne l'utilisent
pas (anaérobies aérotolérants). De plus, des bactéries de la zone oxique peuvent
probablement survivre dans cette zone malgré une éoncentration d'oxygène plus faible que
celle dont elles ont besoin (anaérobies facultatives) (Prescott et al., 2003). D ' autres
paramètres peuvent également varier dans la colonne d'eau et influencer la biodiversité
(conductivité, température, pH). La présence de particules de matière organique en
suspension est aussi un facteur jouant sur la biodiversité. En effet, la population attachée
aux particules est parfois différente de celle en suspension (Galand et al., 2006; Garneau et
al., 2006).
1.2.2 Le concept « d'espèce microbienne» Le nombre d'espèces microbiennes sur la Terre est estimé entre 106 et 109 (Dykhuizen,
1998; Curtis et al., 2002). Contrairement aux macroorganismes, la notion d'espèce chez les
microorganismes est un concept qui reste difficile à définir. En effet, certaines
caractéristiques propres aux microorganismes compliquent le travail concernant leur
classification. Ces contraintes sont principalement dues au nombre limité de caractères
morphologiques, à l'absence de stade embryonnaire, à leur mode de reproduction souvent
5
asexué (par clonage) et à la cap<;lcité qu'ont certains microorganismes d'échanger du
matériel génétique avec d'autres espèces (Prescott et al., 2003).
L'avènement de la biologie moléculaire a permis d'établir une définition génomique de
l'espèce microbienne. En 1987, un comité d'experts nommé par l'International Committee
on Systematic Bacteriology (ICSB) a statué sur une première définition phylogénique de
l'espèce bactérienne (Wayne et al., 1987). Cette définition s'est basée ·sur les résultats
obtenus avec plus de 10 000 souches associées à 2000 espèces différentes déjà
caractérisées. À la lumière de leurs résultats, le comité a retenu l'hybridation ADN - ADN
comme la méthode de référence pour déterminer si deux microorganismes sont de la même
espèce. Avec cette technique, 70 % de l'ADN total des deux individus doit pouvoir
s'hybrider et l'écart entre les températures de fusion de l'ADN doit être en deçà de 5 oc. TI
s'agit cependant d'une technique difficile à réaliser. TI existe toutefois des alternatives plus
simples, mais, dans tous les cas, la description de nouvelles espèces microbiennes doit
s'appuyer sur l'hybridation ADN - ADN pour être officiellement acceptée.
La comparaison des séquences de l'ADN codant pour les ARNr 16S (Procaryotes) et 18S
(Eucaryotes) présente une option intéressante pour identifier rapidement des isolats en
comparant avec les bases de données de gènes codant pour les ARN ribosomaux (Wayne et
al., 1987). Le gène de l'ARNr 16S ou 18S est considéré ~omme un marqueur universel,
c'est-à-dire comme un gène qui serait présent chez tous les êtres vivants (Bacteria, Archaea
et Eucarya). En effet, l'ARNr 16S ou 18S assure, à l'image d'un squelette, une partie de la
structure de la petite sous-unité du ribosome. Les ribosomes sont responsables de la
traduction des ARN messagers en protéines et cette fonction est considérée comme étant
commune à tous les êtres vivants puisque leur survie dépend de la production de protéines.
Le séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S ou 18S permet de définir les espèces selon
le pourcentage de similarité de ce gène entre elles. Avec cette technique, au moins 97 % de
la portion de génome analysée doit être similaire pour considérer les microorganismes
comme étant « théoriquement » de la même espèce. Cependant, la comparaison de la
6
séquence de l'ARNr 16S ou 18S ne permet pas de distinguer des espèces très proches les
unes des autres.
D'autres moyens peuvent aussi être utilisés pour départager les microorganismes comme
l'analyse électrophorétique des protéines et la détermination du pourcentage en paires de
bases G+C (Stackebrandt et al., 2002). Toutefois, la notion d'espèce reste mal définie pour
. de nombreux microorganismes non cultivés.
1.2.3 La biologie moléculaire et ses limites
TI est important de faire la distinction entre diversité et biodiversité en biologie moléculaire.
La biodiversité 'représente l'ensemble de l'information génétique (connue et inconnue) sur
la Terre entière ou dans une région de celle-ci alors que la diversité représente plutôt les
composantes «actives» que l'on peut retrouver à un endroit et à un moment précis.
Autrèment dit, la diversité représente ce qui est détectable par les techniques de biologie )
moléculaire actuelles (Pedr6s-Ali6, 2006). Plusieurs outils moléculaires permettent
d'évaluer la diversité d'un échantillon environnemental telle clonage moléculaire (Fig. 1.3)
et la PCR quantitative (Fig. 1.4). Dans les deux cas, l'utilisation d'amorces spécifiques
permet de cibler certaines espèces ou certains groupes microbiens qui constituent cette
diversité. Toutefois, il existe une distinction importante entre les deux méthodes. Le
clonage moléculaire permet de révéler la présence de certaines espèces qui n'ont pas été
spécifiquement recherchées, mais qui font partie du groupe ciblé alors que la PCR
quantitative ne permet pas l'identification de nouvelles espèces. Cette dernière permet
cependant de détecter et de quantifier l'espèce ou le groupe visé.
Un échantillon environnemental renfermerait deux types de population microbienne (Fig.
1.5). La première serait formée des espèces dominantes, celles qui assurent le bon
fonctionnement de l'écosystème et qui influencent leur environnement. Ces espèces
peuvent également souffrir de parasitisme (e.g. virus) ou de prédation. Ces individus sont
7
détectables à l'aide des méthodes de biologie moléculaire, mais il est souvent difficile de
les faire croître en culture. La deuxième population serait formée des taxons les plus rares,
ceux qui ne sont probablement pas dans le bon environnement pour assurer leur croissance.
Ces microorganismes constituent la biosphère rare (Sogin et al., 2006; Pedros-Alio, 2007).
Leur nombre serait si faible qu'ils seraient épargnés par la prédation et le parasitisme. Leur
proportion est trop faible par rapport à l'ensemble de la communauté pour pouvoir être
détectée par les techniques de biologie moléculaire. Cependant, plusieurs de ces espèces
pourraient croître en culture une fois les conditions optimales réunies (Pedros-Alio, 2006).
Selon la revue scientifique de Pedros-Alio (2006) sur la biodiversité microbienne, dans un
échantillon environnemental, les espèces formant plus de 1 % de la population microbienne
sont facilement détectables par PCR. Les espèces constituant entre 1 % et 0,1 % de la
communauté sont également identifiables, mais leur détection est plus difficile et nécessite
une plus grande investigation de l'échantillon. Les espèces formant moins de 0,1 % de la
population microbienne seraient très difficiles à identifier principalement à cause de la
compétition pour les sondes et les amorces · qui sont présentes en quantité abondante, mais
limitée. La PCR introduit donc une for~e de biais que l'on peut comparer à une lotterie :
l'ADN des espèces les plus abondantes aura plus de chance d'être amplifié que celui des
espèces sous représentées dans un échantillon environnemental (Pedros-Alio, 2007).
L'amplification par PCR à partir d'amorces spécifiques permettra de détecter seulement les
espèces du groupe ciblé. Cette approche ne permettra pas l'identification de nouvelles
séquences de la biosphère rare (Pedros-Alio, 2007). Pour ce faire, il est possible de cloner
et de séquencer tous les gènes (shotgun sequencing) contenus dans un échantillon
environnemental comme Venter et al. (2004) l'ont fait dans la mer des Sargasse. Cette
approche métagénomique est cependant plus complexe et surtout beaucoup plus
dispendieuse que les méthodes retenues dans le cadre de ce projet. En effet, le clonage /
séquençage du gène codant pour l' ARNr 16S permet la caractérisation de la diversité et est
beaucoup moins coûteuse et complexe que les approches de métagénomique.
8
À partir des séquences codant pour l'ARNr 16S identifiées dans un échantillon
environnemental, il est possible de concevoir des arbres phylogénétiques permettant
d'évaluer la diversité de l'échantillon. Les séquences répertoriées sorit alignées selon leurs
régions de similarité à l'aide de programmes spécialisés tel Clustal W (Thompson et al.,
1994) afin de faciliter leur comparaison et de s'assurer qu'elles ont toutes une longueur
équivalente. Par la suite, à l'aide de programmes tel Phylip (Felsenstein, 2004), il est
possible de concevoir des arbres phylogénétiques qui permettront de regrouper les
séquences similaires entre elles et de distinguer les différents groupes de microorganismes
constituants la diversité de notre échantîllon.
1.3 Les Archaebactéries
1.3.1 La phylogénie Comme mentionné ci-haut, les méthodes moléculaires ont démontré l'existence d'un
troisième domaine de la vie: les Archaea (Woese et al., 1990). Le domaine des Archaea se
divise principalement en deux grands groupes (Fig. 1.2) : le groupe des Euryarchaeota (qui
regroupe, entre autres, les archaebactéries méthanogènes) et celui des Crenarchaeota (qui
est constitué, entre autres, d'archaebactéries thermophiles extrêmes) (Woese et al., 1990).
D'autres auteurs ont également démontré, par leurs recherches, que certaines différences
phylogénétiques permettraient de distinguer d'autres groupes d' Archaea : les Korarchaeota
(Barns et al., 1996), les Nanoarchaeota (Huber et al., 2002) et les Thaumarchaeota
(Brochier-Armanet et al., 2008). Quoi qu'il en soit, la littérature scientifique s'attarde
principalement aux Euryarchaeota et aux Crenarchaeota, mais ces nouveaux groupes sont
de plus en plus cités. Ils ne seront cependant pas abordés dans le cadre de ce mémoire.
9
1.3.2 L'écologie des Archaea
Les Archaea ont d'abord été identifiées dans les environnements extrêmes, surtout
associées à des sources thermales (W oese et al., 1978). À ce moment, plusieurs chercheurs
croyaient que celles-ci étaient d'ailleurs confinées à ce genre d'écosystème aux conditions
en apparenc.e hostiles. Elles étaient même parfois considérées comme étant les seuls
organismes vivants pouvant survivre dans ce genre d'endroit. Cependant, il a été démontré
qu'il existe, dans les autres domaines de la vie (Bacteria et Eukaya) , des microorganismes
qualifiés d'extrêmophiles et qui sont également aptes à survivre dans les environnements
extrêmes (Nealson and Conrad, 1999; Weber et al., 2004). De plus, de nombreuses études
ont permis de démontrer que les Archaea sont probablement présentes dans tous les
écosystèmes de notre planète tels les lacs (Keough et al., 2003; Coolen et al., 2007; Auguet
and Casamayor, 2008) et les rivières (Abreu et al., 2001) des régions tempérées, les océans
(Massana et al., 2000), le sol (Midgley et aL, 2007) et même l'estomac des runiinants
(Chaban et al., 2006).
De plus en plus d'études tendent à démontrer que les archaebactéries forment une fraction
importante de la diversité microbienne des régions polaires.. En effet, de nombreuses
recherches traitent de leur distribution dans les lacs (Bowman et al., 2000; Karr et al., 2006;
Galand et al., 2008), les rivières (Galand et al., 2006; Galand et al., 2008) et les mers
(DeLong et al., 1994; Massana' et al., 2000; Galand et al., 2006; Garneau et al., 2006;
Galand et al., 2008) de l'Arctique et de l'Antarctique. Ainsi, les communautés d'Archaea
représenteraient jusqu'à 34 % de la biomasse microbienne dans les eaux côtières de
l'Antarctique (DeLong et al., 1994). De plus, il a été démontré que la structure de, ces
communautés serait grandement influencée par la présence d'un gradient de salinité. Cette
transformation de la diversité des Archaea est notamment observable dans les estuaires de
l'Arctique comme celui de la rivière Mackenzie dans la mer de Beaufort (Canada) (Galand
et al., 2006; Galand et al., 2008). D'autres études vont plus loin dans la caractérisation de
cette diversité en présentant des différences dans la structure des communautés d'Archaea
planctoniques et attachées aux particules. En effet, il semble que , certains groupes
10
d'Archaea aient une affinité .pour la matière en suspension dans les lacs, les rivières ou
dans les mers de l'Arctique ,(Wells and Deming, 2003; Garneau et al., 2006).
Même si certaines études s'y attardent (Humayoun et al., 2003; Keough et al., 2003;
Lehours et al. , , 2005; Lehours et al., 2007), il Y a trè.s peu de données concernant la
diversité des Archaea dans les environnements lacustres. Cette lacune en information est
encore plus grande lorsqu 'on se concentre sur la diversité des Archaea dans les lacs
polaires (Karr et al., 2006). En fait, jusqu'à ce jour, aucune étude ne s'est attardée à décrire
les communautés d'Archaea dans un lac polaire de l'Arctique.
1.3.3 Les Archaea nitrifiantes
La nitrification est l'un des nombreux processus impliqués dans le' cycle biogéochimique de
l'azote (Fig. 1.6). Elle consiste en l'oxydation de l'ammonium (NH4 +) en nitrite (N02-) ,
puis en nitrate (N03-). Cette oxydation est normalement assurée par des bactéries
nitrifiantes associées aux Béta-protéobactéries (e.g. Nitrosomonas; Beaumont et al., 2004)
et aux Gamma-protéobactéries (e.g. Nitrosococcus; Ward et D'Mullan, 2002).
La présence de deux éléments clés est essentielle pour assurer la nitrification: l' oxygène,
comme agent oxydant, et l'ammonium, comme agent réducteur., Les principaux sites de
nitrification se retrouvent donc à l'interface entre la zone oxique et anoxique dans les
sédiments ou dans la colonne d'eau des écosystèmes aquatiques très profonds. En effet,
dans la zone oxique, riche en oxygène', l'ammonium ne peut s'accumuler, car il est
rapidement oxydé en nitrate. Les concentrations en ammonium sont souvent très
importantes dans la zone anoxique, mais l'absence d'oxygène ne permet pas l'oxydation de
. ce substrat selon le processus de nitrification. La zone de transition entre les milieux oxique
et anoxique, l' oxycline, constitue l'endroit idéal où les conditions nécessaires à la
nitrification sont réunies. À cette profondeur, l'oxygène provenant de la zone oxique peut
Il
être utilisé p~ les microorganismes nitrifiants pour oxyder l'ammonium provenant de la
zone anoxique (Kalff, 2002).
Lorsque les concentrations d'oxygène dissous dans la colonne d'eau sont très faibles
(moins de 0,2 mg L-1), il est possible d'observer un phénomène de nitrification partielle
(Kalff, 2002). Dans ce cas, le processus de nitrification pourra s'interrompre sous forme
d'hydroxylamine (NH20H) ou de nitrite (N02-). L'hydroxylamine est un composé instable
en phase aqueuse qui se dégrade rapidement en azote (N2), en ammonium ou en oxyde
nitreux (N20). L'accumulation de ces composés sous l'oxycline peut donc s'expliquer par
une trop faible concentration d'oxygène qui affecte le bon déroulement du processus de
nitrification (Kalff, 2002).
Comme mentionné plus haut, la nitrification est normalement attribuée à des bactéries
nitrifiantes (Béta- et Gamma-protéobactéries). Cependant, des recherches ont soulevé un
problème de sous représentation de ces groupes bactériens dans certaines régions des
océans sans que le processus de nitrification en soit affecté. En effet, à certains endroits, ces
bactéries .nitrifiantes représenteraient près de 0,1% de la communauté microbienne (Au guet
and Casamayor, 2008). On peut difficilement imaginer comment une si faible concentration
bactérienne peut assurer un processus vital aussi important que la nitrification.
Ce phénomène pourrait s'expliquer par la découverte d' Archaea nitrifiantes (Konneke et
al., 2005; W uchter et al., 2006; Cool en et al., 2007). Ces Archaea, qui font partie des
Crenarchaeota (Konneke et al., 2005), sont associées à la présence du gène amoA des
Archaea, un gène codant pour la sous unité A de l'ammonium monooxygenase (amoA).
Cette enzyme, qui est également présente chez les bactéries, assure la première étape de la
nitrification, soit l'oxydation de l'ammonium (NH4+) en hydroxylamine (NH20H). Le gène
amoA bactérien est suffisamment différent du gène amoA des Archaea pour permettre de
les distinguer par PCR à l'aide de deux jeux d'amorces différents (Leininger et al., 2006).
12
L'importante distribution des Crenarchaeota dans les océans (Karner et al., 2001) et la
détection du gène amoA des Archaea dans plusieurs écosystèmes marins (Francis et al.,
. 2005; Hallam et al., 2006; Wuchter et al., 2006; Mincer et al., 2007) permettent de
supposer qu'un rôle de premier plan serait joué par les Archaea nitrifiantes dans le cycle
aquatique de l'azote. Les Crenarchaeota ont été récemment détectées dans un lac de
l'Antarctique (Karr et al., 2006) et dans des lacs alpins (Auguet and Casamayor, 2008).
Toutefois, l'évaluation de la présence d'Archaea nitrifiantes (présence du gène amoA) dans
. les lacs n'a fait l'objet d'aucune étude jusqu'à maintenant.
1.4 Les régions polaires Au moment où la population commence à s'éveiller à la problématique des changements
climatiques, l'environnement, lui, a déjà évolué. En effet, des modifications évidentes sont
perceptibles et les régions polaires ont été identifiées comme étant plus sensibles au
réchauffement planétaire que les autres régions du globe (ACIA, 2004). Les
microorganismes sont impliqués à plusieurs niveaux dans les cycles biogéochimiques
(carbone, azote, phosphore, souffre et oxygène)' comme dans la séquestration du gaz
carbonique (C02) dans le sol et dans les océans. De plus, certaines espèces d'Archaea sont
méthanogènes : des productrices de méthane (CH4). Le CO2 et le CH4 sont des gaz à effet
de serre reconnus et les microorganismes sont directement reliés à leur assimilation ou à
leur production. Par conséquent, il est probable que des bouleversements dans la
biodiversité microbienne aient une influence positive ou négative sur les changements
climatiques.
Les régions polaires semblent être des endroits idéaux pour examiner la question de la
biogéographie microbienne. Il s'agit de deux zones aux conditions semblables, situées de
part et d'autre du globe (distantes de 15000 km) et séparées par des zones tempérées et une
zone tropicale. Si des microorganismes sont endémiques à l'Arctique, c'est-à-dire
circonscrits dans cette région, ils ne devraient pas se retrouver en Antarctique, même si les
conditions sont similaires. Par contre, si les microorganismes sont cosmopolites (tout est
13
partout), on devrait retrouver les mêmes espèces dans les deux régions. Cette dissémination
microbienne pourrait s'expliquer par la présence de divers mécanismes de dispersion.
Parmi ceux -ci, on peut considérer la migration de certaines espèces d'oiseaux entre les deux
pôles (comme la sterne arctique [Sterna paradisaea] et le skua [Stercorarius skua]) ,
l' homme, qui est présent dans les deux régions, la migration des mammifères marins, ain.si
que la circulation à grande échelle dans l'océan (courants) et dans l'atmosphère (vents).
Mais ces mécanismes de dispersion sont-ils vraiment efficaces sur une si grande distance?
La petite taille des microorganismes, leur grande population ainsi que la longue période de
temps dont ils ont disposé pour assurer leur dispersion ont probablement compensé pour
l'énorme distance qu'ils ont eu à parcourir entre les deux pôles (Vincent, 2000).
1.5 Site d'étude Les écosystèmes aquatiques polaires sont des systèmes intéressants pour évaluer
l'hypothèse de la dispersion des organismes microscopiques d'un pôle à l'autre. Bien qu 'ils
ne soient pas exclusivement présents dans les environnements polaires (Humayoun et al. , .
2003; Lehours et al., 2005), les lacs méromictiques constituent un bon exemple
d'écosystèmes se retrouvant dans les deux régions (Priscu, 1997; Bowman et al. , 2000; Van
Hove et al., 2006). Les lacs méromictiques (Fig. 1.7) sont des écosystèmes hautement
stratifiés qui peuvent fournir un environnement propice au développement d'une grande
biodiversité. En effet, ils renferment plusieurs gradients physico-chimiques (salinité,
oxygène dissous, éclairement, pH, température) qUI forment plusieurs
microenvironnements dans la colonne d'eau (Vincent and Laybourn-Parry, 2008). Cette
particularité leur permettrait d'héberger plusieurs espèces microbiennes ayant des
exigences nutritionnelles différentes.
Ces microenvironnements sont bien représentés par des pics d'oxyde nitreux qui ont été
détectés dans les profondeurs d,e lacs méromictiques en Antarctique. C'est le cas, entre
autres, du lac Vanda (Vincent et al., 1981) ainsi que d'autres lacs de la région des Vallées
sèches (McMurdo, Antarctique) (Priscu, 1997). Ces concentrations importantes d'oxyde
14
nitreux (Fig. -1.8) sont probablement expliquées par la présence d'une activité microbienne
particulière. Bien que quelques études aient été réalisées sur les lacs méromictiques de
l'Arctique (Lyons and Mielke, 1973; Jeffries et al., 1984; Jeffries and Krouse, 1985;
Ludlam, 1996a; Gibson et al., 2002; Van Hove et al., 2006), ces écosystèmes nordiques
sont beaucoup moins documentés que leurs équivalents de l'Antarctique. Présentement,
dans la littérature, il n'existe pas de données suffisamment complètes concernant les
concentrations d'oxyde nitreux, de nitrate, de nitrite, d'ammonium et d'hydroxylamine
pour les lacs méromictiques de l'Arctique.
Une série de lacs méromictiques se retrouvent le long de la côte de l'île d'Ellesmere
localisée à la limite nord du Nunavut (Fig. 1.9A). Ces lacs auraient été isolés de l'océan
Arctique au cours des derniers millénaires en raison du relèvement isostatique qui a suivi la
fonte des glaces dans le nord du continent américain (Jeffries and Krouse, 1985). Ce rebond
isostatique et l'ajustement du niveau de la mer auraient entraîné une élévation de la terre
estimée entre 80 à 150 mètres (Lemmen, 1989; England, 1999) et les lacs se seraient
formés par l'emprisonnement de l'eau de mer sur le continent. Les lacs méromictiques,
parmi lesquels nous retrouvons les lacs A et Cl (Fig. 1.9B, Fig. 1.10), sont fortement
stratifiés à cause de la couche de glace multiannuelle qui les recouvre. La limnologie
physique et chimique de ces écosystèmes est bien connue et nous savons qu'il existe un
important gradient de salinité et d'oxygène dissous entre la surface et le fond des lacs A et
Cl (Belzile et al., 2001; Van Hove et al., 2001; Gibson et al., 2002; Van Hove et al., 2006;
Van Hove et al., 2008). De plus, certaines études ont permis de reconstituer le passé
climatique de la région du lac A (Tomkins et al. (non publié); Vincent et al., 2008) .. Par
contre, nous en savons très peu sur les populations microbiennes réparties dans la colonne
d'eau de ces lacs. En 2001, une équipe de chercheurs a constaté des modifications dans les
strates du lac A. Ils ont noté une augmentation de la salinité dans les couches supérieures
du lac. Cette augmentation serait due à lafonte du couvert de glace qui, normalement, reste
en place tout l'été limitant ainsi les phénomènes de brassage des eaux du lac (Vincent et al.,
2004b). Des modifications -permanentes de la salinité dans ce genre d'écosystème
15
pourraient entraîner la disparition des espèces microbiennes associées à l'eau douce au
profit des espèces présentes dans les couches d'eau salée.
La régi<?n du nord de l'île d'Ellesmere a été identifiée comme un site important pour
évaluer l'impact des changements climatiques (Vincent et al., 2004b). La présente étude
contribuera à établir une base de connaissances sur la biodiversité microbienne dans les lacs
méromictiques du nord de l'île d'Ellesmere. Ce projet permettra de mieux suivre
l'évolution des régions polaires et d'identifier les éléments plus sensibles au réchauffement
planétaire.
1.6 Hypothèses de recherche et objectifs La géochimie et l'environnement physique des lacs A et Cl montrent une forte variabilité
verticale. L'hypothèse centrale de cette recherche est que ces divers microenvironnements
favorisent le développement d'une riche diversité microbienne. Cette diversité potentielle
d'habitats nous conduit à la première hypothèse:
Hl: Les lacs méromictiques arctiques possèdent une grande diversité d'espèces
d'Archaea en comparaison aux autres environnements lacustres.
La présence, dans ces écosystèmes, de forts gradients verticaux en oxygène, métaux, sels
nutritifs et matière organique (Van Hove et al., 2006) suggèrent la possibilité d'une forte
répartition de niches microbiennes et nous mène à la deuxième hypothèse:
H2: La variabilité de la structure de la communauté des Archaea est plus importante en
fonction de la profondeur qu'entre les sites d'échantillonnage (réplicats).
Spécifiquement en relation avec les archaebactéries nitrifiantes, notre hypothèse est que:
H3: Les Archaea nitrifiantes se retrouvent là où il y a suffisamment d'oxygène pour
l'oxydation et suffisamment d'ammonium comme substrat, c'est-à-dire aux
profondeurs intermédiaires entre les zones oxique et anoxique (l'oxycline).
16
En ce qui concerne l'aspect de la biogéographie, nous posons les hypothèses suivantes:
H4: La phylogénie des gènes amoA sera similaire entre les deux lacs arctiques.
H5: Étant donné que ces lacs méromictiques originent de l'Océan Arctique, la
phylogénie des communautés d'Archaea ressemblera à celle de l'Océan Arctique.
H6: Malgré les ressemblances physico-chimiques entre les systèmes aquatiques de
l'Arctique et de l'Antarctique, les gènes amoA seront différents d'une zone polaire à
l'autre à cause de la biogéographie des espèces microbiennes.
Pour adresser ces questions, nous avons:
1- fait le profilage de deux lacs méromictiques (lacs A et C 1) de la région du haut
Arctique canadien ;
2- prélevé des échantillons d'eau à des profondeurs ciblées et filtré ces échantillons
dans le but de concentrer l'ADN;
3- extrait l'ADN des échantillons;
4- analysé la diversité des Archaea et du gène amoA par clonage moléculaire;
5- quantifié les Archaea, les Crenarchaeota et le gène amoA par PCR quantitative;
6- procédé à la conception d'arbres phylogénétiques afin d'estimer la diversité des
communautés d'Archaea dans nos échantillons;
7 - comparé nos données avec les données publiées. Ces données ont été obtenues
pendant l'année polaire internationale dans le cadre du programme MERGE
(Microbial and ecological responses to the global environment in the polar
regions). Elles serviront de base de données pour des comparaisons futures avec des
informations semblables présentement recueillies en Antarctique.
17
Organisation du mémoire Dans le chapitre qui suit, je présente les résultats des analyses moléculaires effectuées dans
le cadre de mon projet de maîtrise pour les échantillons d'ADN prélevés dans les eaux des
lacs méromictiques A et Cl. Par la suite, dans le troisième chapitre de ce mémoire, je
présente les conclusions générales de mon projet et des pistes de recherche qui seraient
éventuellement intéressantes à explorer. Finalement, les données brutes pour les paramètres
physico-chimiques mesurés pour les lacs A et Cl sont présentée~ en annexe.
18
,. .FOMWd
.-ADN
environnemental .. === priner BectMwd
7 -. ---Dénaturation Hybridation Élongation ~ \.... /
1 er cycle
2e cycle
,.-Amplification
exponentionnelle
Environ ...........• 35 cycles
3e cycle
Figure 1.1 Schématisation simplifiée de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). La PCR permet d'amplifier un gène ciblé dans un échantillon environnemental. Traduit et adapté de Albert et al. (2002).
Bacteria Archaea Eucarya 14
17 ~ __ ..... _18
~ ____ ~----------19
2
Figure 1.2 L'arbre de la vie. Tiré de Woese et al. (1990).
19
--- -----------------------~
Les fragments d'ADN
amplifiés par PCR sont
insérés dans les plasmides
Introduction des '
plasmides Étaler les
bactéries sur un milieu de culture
Figure 1.3 Le clonage moléculaire à partir d'un échantillon environnemental. Après avoir amplifié un gène d'intérêt par PCR, les fragments amplifiés sont insérés dans des plasmides. Les plasmides sont à leur tour insérés dans des bactéries qui seront ensuite étalées sur un milieu de culture. Chaque bactérie se répliquera par clonage et répliquera du même coup le plasmide et le fragment inséré. Après incubation, les colonies isolées sont prélevées. Ces colonies contiennent des milliers de copies du fragment et ce dernier est maintenant isolé de notre échantillon de départ. Pour simplifier le schéma, seuls quelques fragments (en couleur) ont été sélectionnés. En réalité, tous les fragments gris auraient pu être clonés. Tiré et traduit de Albert et al. (2002).
20
Figure 1.4 La PCR quantitative. Comme pour la PCR classique (Fig. 1.1), cette technique se déroule sur plusieurs cycles qui se divisent chacun en trois étapes (dénaturation, hybridation, élongation). La PCR quantitative comporte cependant une quatrième étape qui consiste en une lecture de la fluorescence émise par un fluorochrome, le SYBR Green. Le SYBR Green a la propriété de se lier à l'ADN double brin lors de l'étape d'élongation (image de droite). L'intensité de la fluorescence mesurée à la fin de chaque cycle sera donc proportionnelle au nombre de copies d'ADN double brin dans l'échantillon. Ce nombre de copies est très faible au début et devient exponentiellement plus important à chacun des cycles de l'amplification par PCR. Tiré du site Internet www.strath.ac.uk/
21
-z -.--
Croissance active
Abondants
Prédation
Parasitisme
Extinction
Mortalité
Dispersion globale
Immigration
Rangs taxonomiques ------..... Rares
Figure 1.5 Un échantillon environnemental regrouperait deux types de communauté micro~ienne. La première est constituée des espèces dominantes qui sont actives et qui régulent le dynamisme de leur environnement. La deuxième est désignée comme étant la biosphère rare (rare biosphere) et est formée des microorganismes qui ne sont pas significativement actifs pour influencer l'environnement dans lequel ils évoluent. Tiré et traduit de Pedr6s-Ali6 (2006).
22
Figure 1.6 Le cycle aquatique de l'azote (N). La nitrification est présentée dans l'encadré noir. Le site d'action de l'enzyme ammonium oxygénase et de sa sous-unité A (amoA) est représenté par la flèche noire. Tiré et adapté de Arrigo (2005).
23
20
Ê40 "-'" ... :::J Cl) 60
"'C C o .... o 80 ... a.
100
120
Salinité (psu) o 5 10 15 20 25 30 35
o 2 4 6 8 10 Température (OC)
Figure 1.7 Profil caractéristique d'un lac méromictique de la région du haut Arctique canadien. Les lacs méromictiques renferment généralement des gradients de salinité (rouge) et des profils de température (noir) qui sont comparables à ceux observés au lac A (83 °00' N; 75°30' 0) en mai 2006.
- 20 S ... :::l CI)
"C
~ 40 -o ... Q.
60
o
Conductivité (mS cm-1)
20 40 60 80 100
2 3 4 5
Figure 1.8 Profil du lac Vanda (Antarctique) pour la salinité, mesurée en tenue de conductivité spécifique (cercles blancs), et l'oxyde nitreux (N20; cercles noirs) en fonction de la profondeur. Données tirées et adaptées de Vinc~nt et al. (1981).
24
7S-vi
z ~'-----T---~~~~--~--~~--~~~~~~
CIO
76-vi 74°W
Figure 1.9 Carte du site d'étude. (A) La région du haut An~tique canadien et la côte nord de l'île d'Ellesmere. (B) Localisation du lac A et du lac Cl.
Figure 1.10 Le lac A (83°00' N, 75°30' 0) en juillet 2007. À noter, la présence du couvert de glace durant l' été et le désert polaire qui domine la région du bassin versant entourant le lac.
25
Chapitre 2 - Niche separation of Archaea and amoA in two High Arctic lakes
Résumé
26
La présence du gène amoA des Archaea est largement répandue dans les milieux aquatiques
marins, ce qui suggère que les Archaea nitrifiantes jouent un rôle important dans le cycle
aquatiq~e de l'azote. Toutefois, l'évaluation de la présence d'Archaea nitrifiantes dans les
lacs n'a fait l'objet d'aucune étude jusqu'à maintenant. Dans cette étude, nous avons
appliqué la peR quantitative pour déterminer la distribution verticale et l'abondance du
gène amoA dans les eaux de deux lacs méromictiques (hautement stratifiés) de l' Île
d'Ellesmere dans le Haut Arctique canadien. Le gène amoA a été identifié dans les deux
lacs (lac A et lac Cl) avec le nombre le plus élevé de copies dans l'oxycline, à l'interface
entre les zones oxique et anoxique. L'analyse des séquences identifiées démontre que les
gènes amoA présents dans les deux lacs ne partagent que 94% d'identité. Le gène amoA du
lac Cl montre 98% de similarité avec des séquences identifiées dans les sédiments marins
alors que le gène amoA du lac A est distant de 92 à 94% avec les séquences déjà identifiées.
L'analyse de banques de clones réalisées à partir d'échantillons d'ADN dû lac A a révélé
une forte diversité et des variations verticales importantes dans la composition des
communautés d'Archaea. La zone oxique contenait 20 phylotypes différents dominés par
un groupe d'Euryarchaeota (affilié au cluster LDS). Ce groupe était absent de l'oxycline
où seulement deux phylotypes (associés aux Crenarchaeota) ont été identifiés. La zone
anoxique possèdait 20 phylotypes et les plus dominants étaient associés aux clusters LDS et
RC-V. Ces résultats impliquent que la nitrification par les Archaea se produit également
dans les lacs salins et qu'il y a une forte séparation de niches écologiques da~s les
communautés d'Archaea présentes dans les lacs stratifiés du Haut Arctique canadien.
27
Summary The widespread distribution of the archaeal ammonium monooxygenase A gene (amoA) in
the ocean suggests that Archaea play a major role in marine nitrification, but little is known
about archaeal nitrifiers in lakes. In the present study, we described and quantified th~
distribution of archaeal amoA and 16S rRNA genes in two marine-derived, meromictic
lakes in the Canadian High Arctic: Lake A and Lake Cl on the northern coast of Ellesmere r
Island. The amoA gene was recorded in both lakes, with highest copy numbers in the
oxycline. Sequence analysis showed that amoA from the two lakes shared only 94% l
similarity, indicating at least two phylogenetically distinct 1 clusters. Clone libraries of
archaeal 16S rRN A genes from Lake A revealed strong vertical differences in archaeal
community diversity and composition down the water column. The oxic layer was
dominated by one group of Euryarchaeota affiliated to the LDS cluster. This group was
absent from the oxycline, which had ' an extremely low archaeal diversity of two
phylotypes; both belonged to the Crenarchaeota MG l, the marine group which has been
linked to the amoA gene. The anoxic zone contained representatives of the RC-V and LDS
clusters of Euryarchaeota. These results show the strong vertical differentiation of archaeal
communities in polar meromictic lakes, and they suggest archaeal nitrification within the
oxycline of these highly stratified waters.
28
2.1 . Introduction Ammonium oxidation is a key process in the biogeochemicai nitrogen cycle and until
recently was attributed to Bacteria, specifically members of Betaproteobacteria and
Gammaproteobacteria. Past studies in the ocean have drawn attention to the often sparse
concentrations of nitrifying Bacteria (0.1 % of bacterial assemblages; Bothe et al. 2000),
despite the evident oxidation of ammonium to nitrate. This apparent anomaly has been
resoived with the discovery of widespread ammonium-oxidizing Archaea that contain the
archaeai ammoni.um monooxygenase A enzyme involved in the first step of nitrification
(Konneke et al., 2005; Wuchter et al., 2006; Coolen et al., 2007). Archaeai ammonia
oxidizers are believed to belong to the Marine Group l (MGI) Crenarchaeota (Konneke et
al., 2005). The widespread distribution of Crenarchaeota (Karner et al., 2001) and the
detection of the archaeal ammonium monoxygenase gene amoA in various marine systems
(Francis et al., 2005; Hallam et al., 2006; Wuchter et al., 2006; Mincer et al., 2007) suggest
that Crenarchaeota play a major role in the marine nitrogen cycle. Despite the newly
discovered global relevance of arch ae al ammonia-oxidisers, they have recei ved little
attention to date in lakes, and few studies have considered Crenarchaeota in lake
ecosystems (Au guet and Casamayor, 200~).
Meromictic (permanently stratified) lakes are found in both the north and south polar
regions, and are characterised by vertical gradients in their physicai and chemicai properties
(Priscu, 1997; Van Hove et al., 2006), providing diverse potentiai habitats for microbiai
growth and niche differentiation. There is evidence of nitrous oxide maxima in Antarctic
meromictic Lake Vanda (Vincent et al., 1981) and in other lakes of the McMurdo Dry
Valleys (Priscu, 1997). The presence of ammonium-oxidizing bacteria has already been
described in these lakes (Voytek and Ward, 1995), consistent with the accumulation of
nitrous oxide as a nitrification product in their saline waters. To date however, the archaeal
amoA gehe and nitrifying Archaea have not been investigated. Analogous meromictic lakes
occur aiong the northern coastline of Ellesmere Island in the Canadian High Arctic, but
comparatively little is known about their aquatic nitrogen cycle.
29
The first objective of this study was to determine whether the archaeal amoA gene could be
detected in saline lakes, given the importance of archaeal nitrifiers in marine waters. Firstly
we used amoA specific primers to test whether the gene was present in DNA collected from
two meromictic lakes that were cut off from the Arctic Ocean several thousand years ago
(Jeffries et al., 1984). We then quantified the abundance of this gene within the different
density stratified layers of the water column in both lakes using quantitative PCR (qPCR).
We assessed the diversity of the amoA gene by constructing amoA gene clone libraries and
sequencing the resulting clones. We then addressed the local biogeography of amoA
containing organisms by comparing two libraries from these lakes, which lie 40 km apart
and have separate catchments. Finally, we constructed archaeal 16S rDNA gene libraries to
estimate archaeal diversity in these high latitude lakes and to test for ecological or niche
separation by comparing communities from different depths. These highly stratified
meromictic lakes with distinct physical and chemical structure are attractive systems to test
whether diverse habitats allow · the development of niche-specialized microbial
communities.
2.2 Experimental procedures
2.2.1 Sampling We sampled two permanently stratified (meromictic) lakes of the northern coast of
Ellesmere Island (latitude 83°N, Nunavut, Canada). These lakes result from isostatic
rebound and trapping of seawater be~ween 2500 to 4000 years ago (Lyons and Mielke,
1973; Jeffries and Krouse, 1985; Ludlam, 1996a). Since that time, they have been
completely closed off from exchange with the sea. Because of extreme cold temperatures in
this region (average annual air temperature of -20 oC; Vincent et al., 2008), they have an
ice cover that persists through most or aIl of the year and preventing wind-induced mixing
of the water. The waters are further stabilized by strong salinity gradients, from recent snow
and ice meltwater at the surface over relict seawater at the bottom.
30
We sampled Lake A and Lake Cl between 29 May and 3 June 2006. Both lakes are along
the northem coastline of Ellesmere Island, Canadian High Arctic (Fig. 2.1). Lake A (83 °00 ,.
N, 75°30' W) has a maximum depth of 128 m, a surface area of 5 km2 and a catchment area
of 37 km2 (Van Hove et al., 2006). Background limnological infor~ation for Lake A is
given in Hattersley-Smith et al. (1970), Jeffries et al. (1984), Ludlam et al. (1996a), Gibson
et al. (2002) and Van Hove et al. (2006). Lake Cl is 40 km to the west of Lake A (82°51'
N, 78°12' W), and has a surface area of 1.1 km2, a catchment area of 3.3 km2 and maximum
depth of 65 m. Previous limnological studies on Lake Clare reported in Ludlam et al.
(1996a) and Van Hove et al. (2006).
At the time of sampling, both lakes were covered by a layer of ice (1.25 m for Lake A and .
1.07m for Lake Cl). Profiling and sampling was conducted from a mid-Iake site through a
22 cm diameter hole drilled with a battery-powered auger (Strikemaster). Profiles for
temperature, specific conductivity, pH, and dissolved oxygen were measured with a
Surveyor 3 profiler (Hydrolab Corporation). Sampling depths were selected in relation to
the dissolved oxygen gradient (Table 2.1) to target the upper oxic zone, the lower anoxic
zone and the oxycline, the transition between the two first zones containing a gradient of
dissolved oxygen concentrations over the range 0.5 to 5.5 mg L-1• Water was sampled with
a 6.6 L Kemmerer bottle and transferred to an acid-washed opaque 20 L plastic container
and stored in the dark at 4 oC until processing. Five depths were sampled in Lake A and
four depths in Lake CI (Table 2.1). Three additional depths were sampled from a second
site in Lake A to evaluate the extent spatial heterogeneity across the lake. These duplicate
samples· were at a site 500 m away from the original station, from the oxic zone (2 m), the
oxycline (12 m) and the anoxic zone (32 m).
2.2.2 Cell connts and chlorophyll analysis
Total bacteria and archaea were enumerated from 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
stained cells (Porter and Feig, 1980). Microscope slides were prepared in the field by
31
filtering 1 0 ~ of water that had been fixed with glutaraldehyde (1 % final conc.) in the
dark for 6 hours, through a 0.2 ~m black 25-mm-diameter polycarbonate filter (Poretics)
and the filters were stained with DAPI (5 mg mL-1 final concentration, Sigma) for 5 min.
Filters were mounted onto slides with nonfluorescent mounting oil (Immersol 518 M).
Slides were stored in the dark at 4 oC and subsequently transferred to a -20°C freezer until
epifluoresence microscopy counting at X 1000 magnification with an Olympus BX51
epifluorescence microscope. Samples for pigment analysis were filtered onto GFIF glass
fibre filters that were stored frozen until analysis. The chlorophylls were extracted and then
analysed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), as described in Bonilla et
al. (2005).
2.2.3 Chemical analyses Samples for chemical analysis of dissolved organic carbon (DOC), total phosphorus (TP)
and soluble reactive phosphorus (SRP) were filtered through 0.2 ~m membrane filters and
stored in the dark at 4 oC until analysis. The analyses were performed by the Institut
national de la recherche scientifique (Quebec City, QC, Canada) according to standard
protocols. DOC was analyzed by a Shimadzu TOC-5000A carbon analyzer calibrated with
potassium biphthalate. TP was determined after perchlorate digestion and manual
spectrophotometric measurement as in Stainton et al. (1977).
2.2.4 DNA sampling and extraction Microbial biomass was collected by filtering 3-6 L of water through 0.2~~m pore-size
Sterivex filter unit (Millipore) after prefiltration through a 47-mm diameter, 3-~ni pore-size
polycarbonate filter. Filters were stored in buffer (50 mmol L-1 tris, 40 mmol L-1 EDTA,
and 0.75 mol L-1 sucrose) and frozen immediately. These filters were subsequently
transferred to a -80 oC freezer until nucleic acid was extracted as described in Lovejoy et
al. (2006).
32
2.2.5 peR and cloning
Part of the 16S rDNA and amoA genes were amplified by PCR with the archaeal specific
primers and conditions described in Table 2.2. After validation by gel electrophoresis, PCR
products were purified with Quiaquick PCR Purification Kit (Quiagen) and cloned u~ing
TOPO cloning kits (Invitrogen) following the manufacturer' s instructions. A total of five
16S rDNA gene clone libraries were constructed from five depths of Lake A (2, 10, 12,29,
and 32 m) and two amoA gene clone libraries were constructed from the oxycline of Lake
A and Lake Cl (12 m and 18 m respectively). For 16S rD NA libraries, positive colonies
were screened by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) following digestion
by Taq l restriction enzyme (Invitrogen). Clones with the same RFLP pattern were grouped
and considered as members of the same phylotype (Diez et al., 2001), and representatives
were sequenced using the vectors' T7p univers al primers. Several representatives of the
most numerous RFLP groups from each sample were sequenced to verify that the single
patterns were closely related sequences. The similarity between sequences from the same
pattern was always > 99 %. For the amoA gene, between 25 and 30 clones were picked
randomly from each library and sequenced directly without RFLP step. Sequencing was
done by the Sequencing Center of Laval University Hospital Center (CHUL; Quebec City,
QC, Canada). The 16S rRNA and amoA gene sequence data obtained in this study have
been archived in the GenBank database under accession numbers EU750834 to EU750894
and EU781996-EU782024 (16S rRNA) and EU667426 to EU667431 (amoA).
2.2.6 Diversity and phylogenetic analysis
A total of 231 16S rRNA and 50 amoA clones were used for diversity and phylogenetic
analysis (Table 2.3). The coverage of the clone libraries was calculated as (1-(n/N))* 100,
where n is the number of unique clones detected in the library of size N (Good, 1953;
Mullins et al., 1995). Diversity calculations (Shannon and Chao) were made with the
DOTUR package (Schloss and Handelsman, 2005) based on 3 % difference between
sequences. Sequence and phylogenetic analysis was do ne as describe in Galand et al.
(2006). In brief, the approximately 800 bp sequences were aligned using the CLUSTAL W
33
package (Thompson et al., 1994) and checked manuaIly.Sequences were compared to
those in the GenBank database using BLAST at the National Center for Biotechnology
Information (NCBI). Phylogenetic distances were compiled with the Kimura-2 model and
trees built with Fitch from the Phylip software (Felsenstein, 2004).
2.2.7 Quantitative PCR (qPCR) analysis
qPCR was performed on a Dyad Disciple thermal cycler with Chromo 4 Real-Time
Detector (Bio-Rad, Hercules, CA) using primers and conditions listed in~ Table 2.2. AlI
reactions were performed in 96 weIl white qPCR plates with adhesive seals (Bio-rad).
Reaction mixtures (20 JlL) contained 10 JlL of iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 100
mmol L-1 KCI, 40 mmol L-1 Tris-HCI, 0.4 mmol L-1 of each dNTP, iTaq DNA
polymerase 50 units/mL, 6 mmol L-1 MgCI2, SYBR Green l, 20 nmol L-1 fluoresein),
5 JlL of template (2 ng), 0.2 mmol L-1 of primers and ultra pure sterile water. The reactions
had an initial denaturing step for 5 min at 95 oC, foIlowed by 45 cycles including 30 s
denaturing at 94 oC, 40 s of primer annealing and 40s of primer extension at 72 oC. The
fluorescence signal was read in each cycle at 78 oC for 25 s to ensure stringent product
quantification. Reactions were mn in triplicate with 2 ng of template DNA from each
sample. Quantification standards consisting of 10-fold dilutions ranging from 102 to 108
copies of DNA of a PCR amplicon of a kllown clone of the gene of interest. AlI PCR
products were purified with a Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen) and were then
analysed by qPCR along with standards. Overal~, average efficiencies for aIl quantification
reactions ranged from 44% for Marine Group 1 Crenarchaeota 16S rRNA gene to 65% for
kchaea. R2 values were always >0.99. Control reactions included 3 reactions without DNA
as control for contamination and 3 reactions containing 2 ng of non-target DNA as a control
for the specificity of the primers. Primer specificity was also confirmed by running
amplicons on agarose gel electrophoresis and by melting curve analyses.
34
2.3 Results
2.3.1 Physico-chemical characteristics of the lakes
Lake A and Lake Cl, situated along the northern coast of Arctic Canada (Fig. 2.1), had
similar conductivity profiles with freshwater in the upper water column, and increasing
salinity with depth reaching sea water values below the oxic zone (Fig. 2.2A). Temperature
(Fig. 2.2B) and pH (Fig. 2.2D) profiles were also similar in both lakes with lowest pH and
highest temperature recorded in the oxycline (Table 2.1). Total phosphorus (TP) and
dissolved organic carbon (DOC) concentrations increased with depth in both lakes.
Chlorophyll a (Chl a) profiles were also similar in the two lakes, with high concentrations
beneath the ice, lower concentrations at mid-depths and higher concentrations in the deep
waters (Table 2.1).
Despite the similarities of many features, there were also pronounced differences between
the two lakes. Temperature rose to a higher maximum in Lake Cl (Fig. 2.2B) and there
were pronounced differences in oxygen profiles. The oxycline (0.5 to 5.5 mg O2 L-1)
, extended over 5 m, from Il m to 16 m, in Lake A, but over only 3 m, from 17 m to 20 m,
in Lake Cl. Unlike Lake A, Lake Cl had a sharp peak in oxygen concentrations that
exceeded the range of the oxygen profiler (Fig. 2.2C, > 20 mg L-1). The concentration of
total phosphorus (TP) was an order of magnitude higher in the anoxic waters of Lake A
compared to Cl (Table 2.1). The vertical distribution of prokaryotes (DAPI stained cells)
differed between the two lakes, but both had lowest cell concentrations in the oxycline
(Table 2.1).
2.3.2 Quantification of archaeal amoA and 16S rDNA genes
Following initial tests using standard PCR we applied quantitative PCR analysis (qPCR)
with specific primers (Table 2.2). We found archaeal amoA genes in both Lake A and Lake
Cl. The quantitative distribution . of amoA genes varied with depth for both lakes, with
highest gene copy numbers in the oxycline (12m and 18 m for Lake A and Lake Cl
35
respectively) (Fig. 2.3). The gene· was less abundant or absent in the surface and anoxic
layers of the lakes (Fig. 2.3). Depths with highest copy number of amoA genes
corresponded to highest l6S rDNA copies of Marine Group I (MG!) Crenarchaeota (Fig.
2.3). Archaeal l6S rDNA genes were present throughout the water column of Lake A (Fig.
2.3A) and Lake Cl (Fig. 2.3B) with highest gene copy numbers in the oxic layers of the
lakes. The abundance of archaeal, MGI and amoA genes differed between duplicate
samples taken 500 m away from the main sampling site, however the duplicate values at
specific depths were generally of the same order of magnitude and the duplicate profiles
gave the same pattern with depth (Table 2.4, Fig. 2.4A, B, C). A one-way ANDV A showed
that the Archaeal copy number in the bottom waters was significantly higher than in the
surface waters (Holm-Sidak t = 5.95, P = 0.017), but other differences were not significant.
The same anal ysis for the Crenarchaeota showed that the variability was too large to show
significant differences with depth (F = 8.97, P = 0.054). For amoA copy numbers, the
oxycline was significantly higher than the surface waters (Holm-Sidak t = 30.2, P < 0.001)
and the deep anoxic waters (t = 33.4, P < 0.001). Obviously, the low level of replication
limits the power of these analyses, but the results underscore the pronounced amoA peak in
the oxycline.
2.3.3 Diversity of the amoA gene
The composition of the amoA gene libraries differed between Lake A and Lake Cl. The
Lake A library was dominated by the phylotype LA_amo.14 (>77 % of the sequences)
while Lake Cl was dominated by LClamo.16 (>85 % of the sequences) (Fig. 2.5). The
Lake A phylotype was only distantly related to previously published amoA sequences with
94% identity to sequences from the Black Sea and 92% identity to the amoA gene of the
marine isolate Nitrosopumilus maritimus (Fig. 2.5). In Lake Cl, the dominant amoA cluster
was related to sequences from marine sediment (98% identity) and had only 88% identity
to N. maritimus (Fig. 2.5). We tentatively named those two oxyclinic clusters the LA and
LCI clusters (standing for Lake A and Lake Cl clusters respectively) (Fig. 2.5), and
defined them as clusters containing meromictic lake amoA genes. There was only 94%
36
sequence similarity between LA and LCI clusters. In both Lake A and Lake Cl, the amoA
gene diversity was very low with only 2 or 3 different phylotypes detected. The coverage
percentage was higher than 95 % (Table 2.3A) indicating that Lake A and Lake Cl libraries
covered weIl the natural diversity of amoA genes.
2.3.4 Diversity of archaeal communities in Lake A
There were pronounced differences in archaeal community composition between depths in
Lake A. The oxic layer (2 and 10 m) contained 10 to 20 phylotypes (Table 2.3B) and was
dominated by one group of sequences belonging to DTU 6 (Fig. 2.6). DTU 6 sequences
belonged to the Euryarchaeota and were affiliated to the LDS cluster (Lake Dagow
Sediment) (Glissmann et al., 2004) (Fig. 2.7B). They were absent from oxycline and rare (1
sequence) in the anoxie waters. The LDS sequences were related to clones previously
retrieved from the Mackenzie River, Canadian Arctic (Fig. 2.7B). The 2 m and 10 m
samples each contained a site specific group of euryarchaeotal sequences (DTU 4 and
DTU 2 respectively, Fig. 2.6) affiliated ta the RC-V cluster (Rice Cluster-V) (Grosskopf et
al., 1998b) and related to clone sequences from Arctic peat and river samples (Fig. 2.7C).
Sorne Crenarchaeota were also detected in the oxic layer (DTU Il); they belonged to the
(Marine Group I (MGI, Delong, 1998) and were related to clones from salt marsh sediments
(Fig.2.7 A).
The oxycline at 12 m had a strikingly low archaeal diversity with only 2 phylotypes
-detected (Table 2.3B), both belonging to DTU 10 (Fig. 2.6). DTU 10 belonged to
crenarchaeotal MGI and clustered separately from the upper oxic layer Crenarchaeota. The
oxycline sequences had a 96% similarity to Nitrosopumilus maritimus, the only marine
mesophilic Crenarchaeota isolated to date, but were most similar to clones from the marine
influenced arctic Lake Mackenzie and to deep groundwater (Fig. 2.7 A).
37
In the anoxic layers, from samples taken at 29 and 32 m, we recovered 20 and 17 different
phylotypes respectively (Table 2.3B) and two predominant groups of sequences (OTUs 1
and 7, Fig. 2.6) that fell within the RC-V and LDS clusters of Euryarchaeota respectively.
Representatives of OTU 1 and 7 were also found in the oxic zone but the sequences were
distinct from the anoxic layer sequences (Fig. 2.7B, C). RC-V and LDS sequences were
related to clones from diverse environments su ch as the coastal Beaufort Sea and
hydrothermal vents. Two less abundant clusters were detected exclusively in the anoxic
layers: OTU 3, which belonged to Euryarchaeota, and OTU 9 related to crenarchaeotal
sequences from marine sediments (Fig. 2.7 A, C).
Diversity was highest in samples from the upper oxic layer (2 m) and from the anoxic layer
(29 and 32 m), as shown by the estimated number of phylotypes (Chao1, Table 2.3B) and
diversity indices (Shannon, Table 2.3B). At 10 m, the diversity was lower than at 2, 29 and
32 m, but much higher than in the oxycline (12 m).
2.4 Discussion Our analyses revealed the presence of the archaeal amoA gene in both Lake A and Lake CI,
and thereby extend the records of putative archaeal ammonium oxidation to arctic saline
lakes. The presence of the amoA gene has been recorded in a number of marine waters, and
both marine and freshwater sediments indiçating a major role for Archaea in the
biogeochemical cycle of nitrogen (Francis et al., 2007). This first evidence of planktonic
archaeal amoA genes in these unusual lakes ~urther highlights the likely importance of
archaeal mediated nitrification in diverse environments. In both lakes, the highest amoA
copy numbers were detected in the microaerophilic layers (oxycline). Similar results have
been reported for the Black Sea where quantification of the amoA gene revealed highest
abundance in the suboxic zone (Coolen et al., 2007). The Black Sea and our High Arctic
meromictic lakes have similar physico-cheinical stratification, with an upper oxic layer
separated from a deeper anoxic layer by a marked chemocline, consistent with the similar
38
distribution of the amoA gene in both systems. The presence of the amoA genes in the two
Arctic lakes suggests that, as in the Black Sea, Archaea are likely involved in ammonium
oxidation at the oxycline where the combined suppl Y of ammonium from below and
oxygen from above provide the optimal conditions for nitrification. Evidence to date
strongly supports the notion that archaeal ammonia-oxidation is carried out by
Crenarchaeota belonging to the Marine Group I (MGI) (Konneke et al., 2005; Wuchter et
al., 2006). The depths where the amoA gene was most abundant in lakes A and Cl
corresponded to the depths of highest copy number of crenarchaeotal MGI 16S rDNA
genes, suggesting th~t at least sorne of the MGI Crenarchaeota contain the amoA gene, as
reported from marine systems.
The ratio amoA to 16S rRNA was always very low in our analyses (ranging from 0.0001 to
0.045), and much lower than the ratio of 1 reported elsewhere (Wuchter et al., 2006;
Mincer et al., 2007). This conspicuously low ratio may be because the amoA primers were
not able to amplify aIl amoA genes present in the lakes. The primers we used were initiaIly
designed from marine sequences (Coolen et al., 2007) and thus may contain mismatches to
more brackish or freshwater amoA genes. There are few reports of amoA genes in these
latter systems, which may be a result of undersampling, or poor recovery by the marine
primers. Possible PCR bias for amoA genes may be frequent since earlier studies have
reported amoA: 16S rRNA ratios varying from 0.01 to 2.8 in the Black Sea (Lam et al.,
2007) and from 0.18 to 5.22 in the Atlantic Ocean (Wuchter et al., 2006). The low ratio we
observed could also imply that not aIl of the Crenarchaeota quantified by qPCR contained
the amoA gene, and that Crenarchaeota encompass a broad range of taxa and trop hic
characteristics, as expected.
Archaea were found at aIl depths in the two lakes, and the lake communities included both
Crenarchaeota and Euryarchaeota. However, our phylogenetic analysis of 16S rDNA
sequences revealed that the Archaea present in the oxycline were exclusively restricted to
39
the Marine Group l (MGI) Crenarchaeota. The limited diversity of Crenarchaeota in this
layer provides little ambiguitY ,for the conclusion that the archaeal amoA genes belonged to
MGI Crenarchaeota. We found that amoA genes were present at only low concentrations in
the anoxic zone of Lake CI and were non-detectable in the anoxic zone of Lake A. In these
deeper layers, the aerobic archaeal nitrifiers would likely be replaced by anaerobic
ammonium oxidation (anammox) bacteria, su ch as those detected in deep anaerobic waters
of the Black Sea (Kuypers et al., 2003). Further molecular analysis targeting nitrifying,
denitrifying and anammox bacteria are needed to resolve the community of nitrogen
cycling microoganisms in these and other lakes.
The phylogenetic analysis of amoA genes revealed differences between the Lake A and
Lake CI clone libraries. Each lake was characterised by specific sequence clusters (LA and
LCl) only distantly related to each other (94% similarity) , indicating a clear divergence
between archaeal amoA containing communities of the two lakes that were only a few tens
of km apart and that shared many limnological features. The extent of divergence may
indicate niche separation between two phylotypes of ammonia oxidizers where physical or
chemical factors were sufficiently different between lakes to select for the different
phylotypes. Altematively, it may reflect differences in founder populations. Our sequences
in the LA and LC 1 clusters were only distantly related to amoA sequences retrieved earlier
from marine environments and the two novel clusters may be uniquely lacustrine
microorganisms. Additional sampling over different seasons and times and in similar lakes
would be valuable in determining the role of ecology versus evolution on this genetic
variability.
The .results from Lake A 16S rRNA gene analysis provide compelling evidence of vertical
structure in archaeal community composition. There were large differences among strata of
the lake, with disparate pl)ylogenetic groups dominating the different depths. Depth
stratification of archaeal communities has also been found in meromictic Lake Pavin
40
(Lehours et al., 2005; Lehours et al., 2007) and perenniall y ice-covered Lake Fryxell in
Antarctica (Karr et al., 2006). In those two studies, as weIl as the archaeal community of
the anoxie layers of Mono Lake (Scholten et al., 2005), many of the Archaea detected
belonged to methanogenic Euryarchaeota. In contras t, we did not recover methanogenic
sequences, which suggests that methane-related biogeochemical pathways may be little
used in these saline Arctic lakes. This observation is consistent with the absence of methane
accumulation in many Antarctic saline lakes where sulphate-reducing bacteria likely
outcompete methanogens for acetate and hydrogen (Vincent, 1988), and is consistent with
the high H2S concentrations in the anoxic zone of these lakes (up to 48 mmol m-3 in Lake
A; Gibson et al. 2002). Rather than methanogens, we found that bo"th the oxic and anoxic
layers of Lake A were dominated by the euryarchaeotal LDS and RC-V clusters, whose
functions remain unknown. Both LDS and RC-V are phylogenetically diverse and reported
from a large variety of environments (Galand et al., 2006), suggesting diverse metabolic
characteristics and physiologies. Sequences belonging to those clusters have previously
been reported from freshwater systems such as an Arctic river (Galand et al., 2008) and a
temperate lake (Glissmann et al., 2004),. RC-V has also been reported from Mono Lake
(Scholten et al., 2005), an alkaline lake that occasionally is meromictic. The presence of
LDS sequences in High Arctic lakes extends the record of this group to saline and anoxic
waters. RCV and LDS sequences in the deep layers were different from those higher in the
water column, suggesting that the deep Euryarchaeota were specifically adapted to saline,
anoxic waters. Sinking phytoplankton may have provided a transport mechanism to
introduce particle-attached Archaea from surface to bottom waters. However HPLC
pigment analysis showed that most of the chiorophyllous pigments in the deep layers was
associated with photosynthetic sulphur bacteria, which were confined to the anoxic zone
(D. Antoniades et al. unpublished). The pigment data also indicated a highly stratified
microbial community structure in these lakes.
The oxycline of Lake A was the most phylogenetically distinct, with a low diversity
community of only a few crenarchaeotal sequences. These sequences belonged to a cluster
41
related to the only cultivated Crenarchaeota capable of ammonia-oxidation (Konneke et al.,
2005). The combined presence of Crenarchaeota and amoA genes is a strong indication for
putative ammonia-oxidation by Crenarchaeota in the microaerophilic (hypoxic) layer of
these far northern lakes. Nutrient profiles for these lakes show that the location of the amoA
maximum was between the upper zone of high oxygen and the deep zone of high
ammonium, which in Lake Arises from undetectable in the surface (sub-ice) waters to 650
mmol m-3 at depth (Gibson et al. 2002). This intersection of gradients would provide
optimal conditions for nitrification, as observed elsewhere (e.g., Lake Vanda, Antarctica;
Vincent et al. 1981)
Lake A is a highly stratified ecosystem as a result of strong salinity gradients and perennial
ice-cover that prevents wind-induced mixing. This stratification results in a great variety of
physico-chemical conditions within the water column, which in turn would favour diverse
microbial niches. C ommu nit y stratification of Bacteria was earlier reported during a period
of meromixis in highly saline, alkaline Mono Lake, California (Humayoun et al., 2003),
and for Archaea in Lake Pavin (Lehours " et al., 2005), and was attributed to niche
differentiation across REDOX gradients in these waters. In polar meromictic lakes, the
perennial ice-cover reduces exchange of gases such as oxygen with the atmosphere and also
results in greenhouse conditions that heat the water column (Spigel and Priscu, 1998).
Annual loss o"f ice-cover during summer as a result of climatic variability or global
warming (ACIA, 2004) would radically alter the stratification regime of these lakes
(Vincent et al., 2008) and would likely cause a massive disruptionof "microbial habitats.
The localized and likely specialized archaeal communities in the oxycline would be
especially vulnerable to this "disruption.
42
2.5 Conclusions The presence of archaeal amoA genes in Arctic meromictic lakes provides further support
for the global role of Archaea in the ' nitrogen cycle. The concomitant presence of MGI
crenarchaeotal and amoA genes implies the presence of crenarchaeotal ammonia-oxidisers
in these lakes, however, further activity and expression measurements will be necessary to
consolidate those observations. The spatial concordance of highest copy number of amoA
genes, unique crenarchaeotal sequences and conditions conducive to nitrification in the
oxycline indicate a niche specific occurrence of ammonia-oxidisers. Our results also show
the presence of distinct amoA gene clusters in different lakes, indicating amoA diversity in
lacustrine and brackish systems. Analysis of the amoA and 16S rRNA genes provided
evidence of vertical niche separation within the water column, as weIl as potential
geographical separation of archaeal niches between lakes.
Acknowledgements We acknowledge the financial assistance from ArcticNet (a Canadian Network of Centres
of Excellence), the Canada Research Chair in Aquatic Ecosystem Studies, and the N atural
Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Polar Shelf Canada
provided logistical support for fieldwork. Our ongoing field studies in the region are
supported by Quttinirpaaq National Park and the Canadian Foundation for Innovation. We
also thank Denis Sarrazin, Dermot Antoniades, Jessica Tomkins and Julie Veillette for
assistance in the field; Marianne Potvin and Estelle Pedneault who provided valuable
discussions and technical assistance in the laboratory; and Caroline Duchaine and two
anonymous reviewers for their insightful comments and suggestions.
Table 2.1 Environrnental characteristics of Lake A and Lake Cl. Temp: temperature; DO: dissolved oxygen; Cond: conductivity; TP: total phosphorus; DOC: dissolved organic carbon; ChI a: chlorophyll a; < / >: data under / over detection limits.
Depth Temp DO pH Cond TP DOC Prokaryotes ChI a
(m) (OC) (mg L-1) (mS cm-1
) (Jlg P L-1) (mg C L-1
) (106 cells mL-1) (Jlg L-1
)
Lake A
2 1.11 18.46 8.15 0.39 < 0.5 0.83 1.69 0.23
10 5.72 14.70 7.92 0.91 < 0.5 0.71 0.65 0.12
12 7.01 5.38 7.34 5.07 2.6 0.81 1.51 ' 0.18
29 6.40 0.56 7.93 ' 29.08 15.1 3.20 2.39 0.16
32 5.89 0.57 7.91 29.87 63.8 5.70 2.52 0.23
Lake Cl
2 2.44 20.42 8.43 0.40 < 0.5 1.21 2.57 0.18
9 8.97 > 25.00 7.67 0.62 < 0.5 1.37 1.80 0.09
18 12.64 1.62 7.27 19.69 2.6 1.48 1.00 0.03
32 7.49 0.58 7.79 29.99 3.2 3.00 1.68 0.16
~ w
Table 2.2 Characteristics of the PCR primers and annealing conditions used in this study.
Application Primers Primer sequences Annealing. Targeted
temperature group
Cloning Arch109f 5'-ACK GCT CAG TAA CAC GT-3' 52 oC Archaea
Arch915r a 5'-GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT-3'
Arch-amoAf b 5'-ST AAT GGT CTG GCT TAG ACG-3' Archaeal 53 oC
Arch-amoAr 5'-GC GGC CAT CCA TCT GTA TGT-3' amoA gene
QPCR Parch519f 5'-CAG CMG CCG CGC TAA-3' 63 oC Archaea
Arch915r a 5'-GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT-3'
AOA-amoAf 5'-CTG A YT GGG CYT GGA CA T C-3' . -Archaeal 58.5 oC
AOA-amoAr 5'-TTC TTC TTT GTT GCC CAG TA-3' amoA gene
MCGI-391f 5'-AAG GTT ART CCG AGT GRT TTC-3' 61°C Marine
MCGI-554r 5'-TGA CCA CTT GAG GTG CTG-J' Groupe 1
a also refered as 934 r (ref); b amplify essentially the entire gene
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~ .+::>.
45
Table 2.3 Diversity of clone libraries Jor the amoA gene in the oxycline of Lake A and Lake Cl (A) and archaeal 16S rDNA in Lake A (B). Enumeration of phylotypes and calculation of diversity estimators (Shannon and Chao) were done at a 3 % distance level between sequences.
A. amoA gene
Depth (m) No. of No. of Shannon
Chao index Coverage of Evenness
clones phylotypes index libraries (%) index Lake A 22 3 0.61 2.67 95 1.00 Lake Cl 28 2 0.14 1.90 96 1.27
B. Archaeall6S rDNA
Depth (m) No. Of No. of Shannon
Chao index Coverage of Evenness
clones ph)::lot~pes index libraries (%) index
2 49 20 2.69 23.60 84 1.00 10 41 10 1.99 Il.33 93 0.84 12 63 2 0.03 1.40 98 1.29 29 43 20 2.66 27.40 77 0.88 32 35 17 2.54 28.25 71 0.71
46
Table 2.4 Replicability of the molecular analysis. Means and standard deviation (SD) are for duplicate samples from each depth in Lake· A, expressed as number of copies of gene mL- I
. Coefficient of variation (CV) is SD as a percentage of the mean.
Depth (m) Archaea Crenarchaeota amoA gene
Means SD CV Means SD CV Means SD CV
2 32736 2075.4 6.3 569 288.5 50.7 0 0 0
12 1014412 118078.4 11.6 644 2.8 0.4 6574 252.4 3.8
32 1 907 874 533424.4 28.0 0 0 0 154 217.1 141.4
----~----------------------- ----- - --- --------------------------------------------------------~
47
Figure 2.1 Map of the sampling sites. (A) Canadian High Arctic and northem coast of Ellesmere Island. (B) Location of Lake-A and Lake Cl.
48
Conductivity (mS cm-1) Temperature (OC) Dissolved oxygen (mg L-1
) pH
o 10 20 30 o 2 4 6 8 10 12 14 0 5 10 15 20 25 7,0 7,5 8,0 8,5
10
g .c 20 D-G)
c
30
40 '----------u----'
Figure 2.2 Depth profiles for conductivity (A), temperature (B), dissolved oxygen (C) and pH (D) for Lake A (filled circules) and Lake Cl (open circles). The dark and light shadings indicate the oxycline of lakes A and Cl respectively. Note that conductivity profiles are almost identical in both lakes.
Dissolved oxygen (rrg L-1)
5 10 15 20 25
10
-E -;;20 0-0)
C
30~* Il **
4O+1 •• --------~--------~--------~--------~~ o 5x1OS 10S 2x1 OS 2x1OS
Itlchaea (copies nt..-1)
o 5x1 (}1 1 Q4 2x1 Q4 2x1 Q4
CrenarchaeotaI and ann4 (copies nt..-1)
Dissolwd oxygen (rrg L-1)
5 10 15 20 25
10
-~ 2O = lIiii 0-0)
C
30 I!!!IQ= ........ =~-' _ kd1aea (~ffi ni .. :' )
fi?&tN&li.! Q-en (~es m.."1)
c:=:J arro4 (ropes rre ') 4O +1·-~ --------~--------~--~----~--------~~
o 10S 2x1 OS 3x1OS 4x1OS Itlchaea (copies rrL-1
)
o 2x1Q4 4x1Q4 6x1()4
CreanaJ chaeotal and ~ (copies rrt:1)
Figure 2.3 Abundance of 16S rDNA and amoA genes in the water cofumn of Lake A (A) and Lake Cl (B) in relation to dissolved pxygen profile (filled circles). The shading indicates the oxycline of Lake A and Lake Cl respectively. *: 0 amoA copies mL- l; **: 0 amo~ and Crenarchaeota copies mL- l
.
~ \0
50
A Archaea (copies mL-1)
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000
3 ~
5
7
9
11
13
g 15
17 o Main site
J: D. 19
• Duplicate site
~ 21
23
25
27
29
31
33
35
B Crenarchaeota (copies mL-1
)
o 100 200 300 400 500 600 700 800 900
4
7
10
13
I 16 .c: o Main site ...
19 c. CI) • Duplicate site C
22
25
28
31
** 34
c
4
7
10
13
E 16 "-" .r:. a. 19
~ 22
25
28
31
34
o
**
... *
51
amoA (copies mL-1)
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
o Main site
• Duplicate site
1
Figure 2.4 Replicability of the molecular analysis. QPCR results for Lake A samples from 2 m, 12 m and 32 m taken at the main site and at a duplicate site 500 m away. (A) archaeal, (B) crenarchaeotal and (C) amoA genes expressed as number of copies of gene mL-J
• *: 0 copies mL-1 for main site; **: 0 copies mL- · for main and duplicate.
A
Nitrosopumilus maritimus SCM1 (EU239959)
LC1amo.61
'------ LA_amo.14
..
1
Lake A (LA) cluster ..
'---___ 13lack Sea clone BS 1 00mB4 (EF414231)
0.01
LA amo.17
- LA_amo.34 1 Lake C1 (LC1) LC1amo.43 cluster
LC1amo.16 "
sediment from San Francisco Bay clone SouthBay-CR-6 (OQ278585)
100
80
60
40
20
0 ,
B
Lake A Lake C 1
IJJ LA_amo.34
• LC1amo.61
[] LA_amo.17
ru LC1amo.43
[l] LC1amo.16
~ LA_amo.14
Figure 2.5 Phylogenetic (A) and community (B) composition of amoA clone libraries from the oxyclines of Lake A and Lake Cl. Only representative DSCs «990/0 sequence identity) are shown (in bold).
V'l N
2m
10m
UJ .J: c.. 12 m Cl)
C
29 m
32 m
o 20 40 60 80 100
Relative abundance of clones in the libraries (°/0)
&-,. 1 ~
HBffil 2 I f%~\21 3 = ~ ~ Euryarchaeota H@;iC(,1 6 _7 ~~'iJ 8 b2S2SCl 9 :: ~~ J Crenarchaeota
Figure 2.6 Composition of archaeal clone libraries at five depths of Lake A. Communities are represented by relative 'abundances of clones belonging to different DSCs (1 to Il).
VI W
A
,----------------- Thermoplasma acidophilum, M38637
Marine sediments clone OOP1230A33.24, AB177120
~---------~ 100
LAa32.22
i-ELAa10.41
100 .
Salt marsh sediments clone COSAS-B3, EU284599
- Nitrosopumilus mafitimus, D0085097 ~------~ 83
,------- 94 LAa12.36
100
Lake Mackenzie clone CaS1s.37, EF014568
r- Mponeng gold mine water clone MP1 Q4-SW-a5, 00088780 '
'---- 100
0.1 LAa12.42
54
MGI
OSC 10
B
r------------------------ Nitrosopumilus maritimus, 00D85097
59
Mackenzie River clone mrR2.21, 00310445 100 LAa02.01
'-8-4 -- Mackenzie River clone mrR1.31, 00310380 L--___ LAal0.26
.---------- LAa02.11 ,------ LAa02.18 ,---- Mackenzie River clone mrR1.14, 00310415
1----- LAa02.22 L--__ LAao2.10
,----- LAa29.75 L.:9--=-9 ____ LAal0.37
LAa32.32 LAa32.31
84 90 LAa32.29 LAa32.27
77 LAa10.39 80 79 LAa32.13
99 LAa32.11 LAa32.07
.--------- LAa02.31 72 LAa29.78
LAa32.06 99 Beaufort Sea clone oBS65f.24, 00146748
88 LAa32.19 100 Beaufort Sea clone iBSZ2f.09, 00146729
--9- 2ÎL---- LAa10.35
LAa29.63 LLI..L1.L--_ LAa29.59
,--------- LAa02.28 98 Mackenzie River clone mrR2.54, 00310443
LAa02.12
99
100
~-- Lake Mackenzie clone CaS1s.33, EF014564 ..J,---- LAa02.04
LAa32.05 100 LAa32.1 0
LAa29.51 L--___ LAa32.15
.---------- LAa29.48 '------- LAa02.03
L--___ Mackenzie River clone CaR3s.21 , EF014516 0.1
OSC6
LOS
OSC7
55
.--- ---- ~-- -
c .----------------- Nitrosopumilus maritimus, 00.085097 f---___________ --.:...10~0 Beaufort Sea clone Ca303s.37, EF014624 Iose 8
~:'~3 ±
88
0.1
,----------1L--1_00 ___ ~10~0 Marine sediments clone TN-2, AB107815 ose 5 LAa02.05
~6-4 ---- Mackenzie River clone mrR1.28, 00310384 ose 3 l..-.--_______ LAa32.25
99 100 LAa 1 0.40 Iose 2 Lake Mackenzie clone CaS1b.B06, EU244258
100,----- LAa02.26 .----------'~ LAa02.14
65 100
Arctic peat clone Sv-08, AM712497 LAa02.19
100 Mackenzie River clone CaR3s.02, EF014527 LAa02.34
LAa02.17 Mackenzie River clone mrR1.57, 00310389
LAa29.60 LAa32.09
,---- LAa29.71 81 LAa29.47
100 LAa32.20 ,-----Beaufort Sea clone iBSZ2p.47, 00146754
l..-.--_--I LAa29.62 L-6_8 ___ LAa29.68
,-------- LAa29.61 r-------- LAa29.79 l..-.--____ Hydrothermal field clone pCIRA-P, AB095126
,------ Beaufort Sea clone oBS65f.29, ooj46744 L..:....::...-___ LAa10.34
.------- LAa 1 0.27 '----- LAa32.16
,------- - LAa29.69 LAa32.21
100 LAa29.53
ose 4
ose 1
56
l Group Iloa
RC-V
Figure 2.7 Distance tree representing the position of Crenarchaeota (A) and Euryarchaeota LDS (B) and RC-V clusters (C) from Lake A. Analyses are inferred from 800-base-pairlong 16S ribosomal RNA sequences using FITCH distance matrix analysis (from the program PHYLIP). Sequences from this study are shown in bold, with depth of origin indicated (LAa[depth].[clone]). Bootstrap values> 50 are shown. Scale bar: 10% sequence di vergence.
Chapitre 3 - Conclusion générale
Les résultats exposés dans le deuxième chapitre démontrent la présence d'une importante
diversité des communautés d'Archaea dans le lac A et une distribution distincte de cette
diversité en fonction de la profondeur. Cette distribution est caractérisée par la présence de
différents groupes d'Archaea dominants les différentes profondeurs échantillonnées. Cette
stratification en profondeur des communautés d'Archaea a été précédemment observée
pour d' autres environnements méromictiques tels le lac Pavin (France) (Lehours et al.,
2005; Lehours et al., 2007) et le lac Fryxell (Antarctique) (Karr et al., 2006) de même que
pour les communautés de bactéries du lac Mono (États-Unis) qui est méromictique pendant
certaines années (Humayoun et al., 2003).
L'interprétation des indices de diversité démontre la très grande variabilité des
communautés d'Archaea présentes dans le lac A. En effet, les indices de diversité (Shannon
et Chao) p0l:lr le lac A sont plus importants que pour des environnements lacustres
stratifiés, mais moins extrêmes que les lacs méromictiques du Haut Arctique canadien. Par
exemple, au lac Pavin (France), les indices de Shannon sont presque deux fois plus faibles
(1,4) dans la zone anoxique que ce qui a été calculé pour le lac A (2,6). Les indices Chao
sont également plus faibles au lac Pavin (Lehours et al., 2007).
La stratification des lacs A et Cl semblent jouer un rôle important dans la distribution de la
diversité microbienne en fonction de la profondeur. Dans les régions tempérées ou
tropicales, l'absence d'un couvert de glace permanent à la surface des systèmes aquatiques
permet le brassage des eaux par le vent, ce qui contribue à minimiser les différences dans la
diversité entre l'épi- et l'hypolimnion (Keough et al., 2003). Les données concernant la
diversité des Archaea dans les environnements lacustres des régions tempérées sont
cependant limitées pour permettre une comparaison efficace de la diversité avec les lacs
polaires.
58
Comme il a été présenté dans le chapitre 2 de ce mémoire, une série de réplicats a été
prélevée dans un deuxième site d 'échantillonnage au lac A. Le coefficient de variation entre
les sites a été calculé pour les différentes profondeurs. Les résultats nous permettent
d'affirmer que la variation entre les sites (horizontale) est faible comparativement à la
variation en fonction de la profondeur (verticale).
Les résultats présentés dans le même chapitre de ce mémoire indiquent la présence
d'espèces d'Archaea hautement spécialisées selon les conditions physico-chimiques
présentes dans la colonne d'eau. En effet, la présence d'un groupe unique de
Crenarchaeota dans l ' oxycline du lac A et la détection du gène amoA dans l' oxycline des
lacs A et Cl permettent de supposer la présence d'Archaea nitrifiantes. En ce sens, une
étude a démontré le même genre de séparation de niche écologique pour le gène amoA des
Archaea dans le sol (Hansel et al., 2008). De plus, le gradient d'oxygène de ces lacs a été
identifié comme un site propice pour l'oxydation de l'ammonium, la première étape de la
nitrification. TI serait cependant intéressant de pouvoir obtenir un plus grand nombre de
données concernant les différents éléments du cycle de l'azote (NH4+, N02-, N03-, N20 ,
NH20H) pour ces profondeurs dans les lacs arctiques.
TI a été mentionné, dans le premier chapitre, que les lacs méromictiques de la région du
Haut Arctique canadien originent de l'Océan Arctique. De plus, le gène amoA chez les
Archaea est principalement connu dans les systèmes marins (Francis et al., 2005; Hallam et
al., 2006; Wuchter et al., 2006; Mincer et al., 2007). La diversité des lacs méromictiques de
l'Arctique est donc probablement liée à l'origine marine des eaux des lacs A et Cl. La
grande similarité entre les séquences d'Archaea spécialisées identifiées dans le gradient
d'oxygène du lac A (12 m) et l'espèce Nitrosopumilus maritimus, une Archaea nitrifiante
caractérisée (Konneke et al., 2005), permet de supposer la présence d'une espèce
phylogénétiquement très proche de N. maritimus dans les eaux du ~ac A. De plus, des liens
phylogénétiques étroits entre des séquences identifiées au lac A et des séquences
.------- - - - --_._- -------- -
59
précédemment décrites dans les eaux de la mer de Beaufort et dans la rivière Mackenzie
permettent également de supposer un lien entre la diversité microbienne du lac A et
l'origine marine de ses eaux.
Même s'il existe déjà certaines données concernant la biogéographie, il semble trop tôt
pour évaluer l'hypothèse H6 concernant la distribution des Archaea entre les régions
polaires. En effet, le manque d' informations à propos de la diversité des Archaea dans les
systèmes aquatiques de l'Antarctique ne nous permet pas de comparer efficacement nos
résultats de l'Arctique avec ceux obtenus de travaux similaires réalisés en Antarctique.
Cependant, l'effort scientifique présentement en cours, dans le cadre de l ' année polaire
internationale, apportera vraisemblablement une quantité importante de données provenant
des écosystèmes aquatiques de l'Antarctique. Ces données pourront servir à des fins de
comparaison avec les résultats que nous avons obtenus aux lacs A et Cl.
Pour l'instant, il est néanmoins possible de cibler certains écosystèmes de l'Antarctique qui
seraient propices à l'évaluation des différentes hypothèses concernant la biogéographie
microbienne. C'est le cas, notamment, des pics d'oxyde nitreux détectés dans les eaux de
lacs méromictiques en Antarctique (Priscu, 1997), dont le lac Vanda (Vincent et al. , 1981).
Comme il a été mentionné dans le chapitre 1 (section 1.3.3 Les Archaea nitrifiantes), la
présence d'une concentration importante d'oxyde nitreux peut être imputable à une
nitrification partielle qui elle, serait attribuable à une concentration trop faible en oxygène
dissous. Des microorganismes nitrifiants sont probablement présents dans ces pics d'oxyde
nitreux. TI est donc possible de supposer que ces profondeurs abritent des espèces
d'Archaea nitrifiantes qui pourraient être plus ou moins similaires à celles identifiées dans
l' oxycline au lac A. De plus, il serait possible de détecter la présence de gènes amoA codant
pour des protéines semblables à celles identifiées dans les eaux du lac A et du lac Cl.
60
En attendant les données provenant des écosystèmes de l'Antarctique, il reste toutefois
certains éléments à approfondir pour mieux comprendre la diversité des Archaea des lacs A
et Cl. En effet, il serait intéressant d'obtenir une meilleure résolution de la diversité en
fonction de la profondeur pour les lacs A et Cl ainsi qu 'une distribution plus complète des
gradients chimiques de la colonne d'eau de ces lacs. L'analyse de l'expression du gène
amoA des Archaea serait également un élément à vérifier pour mieux documenter la
présence d'Archaea nitrifiantes dans les eaux des lacs A et Cl. D'autres techniques, comme
la Denaturating Gel Gradient Electrophoresis (DGGE), pourraient être appliquées pour
permettre d'évaluer rapidement la diversité d'un plus grand nombre de lacs dans la région
du Haut Arctique canadien.
À l'image de plusieurs régions du monde, l'Arctique est présentement en mutation. En
effet, le réchauffement climatique s'installe graduellement dans plusieurs écosystèmes de la
planète et ses effets sont ressentis de façon importante dans les régions polaires, dont
l'Arctique (ACIA, 2004). Ce changement à l'échelle planétaire aura inévitablement un
impact important sur la diversité des habitats microbiens. La biologie moléculaire nous
permet de mieux comprendre la biodiversité microbienne. Cependant, il y a urgence
d'appliquer ces outils moléculaires avant la perte d'écosystèmes tels les lacs méromictiques
canadiens. L'intégrité de ces environnements stratifiés dépend directement de la présence
d'un couvert de glace. La perte de ce couvert de glace, causée par le réchauffement
climatique, perturbera certainement la structure des communautés microbiennes présentes
dans les lacs méromictiques canadiens.
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Annexes
Annexe 1. Données brutes du lac A (83°00' N, 75°30' 0) pour la température, l'oxygène
dissous (DO), la conductiyité spécifique et le pH. Le profilage du lac a été effectué le 29
mai 2006 à l'aide d'un profileur Surveyor 3 (Hydrolab Corporation). Pour la conductivité,
la limite de détection maximale de l'appareil était de 10 000 ~S cm- l.
Profondeur Température DO Conductivité pH (m) (OC) (mg L-1
) (llS cm-1)
0,2 0,13 19,28. 681 8,15 1 -0,11 19,03 685 8,15 2 1,11 18,46 686 8,15 3 3,29 17,65 685 8,14 4 3,69 17,49 685 8,14 5 3,81 17,54 686 8,14
6 4,22 17,31 730 8,15 7 4,58 16,86 790 8,15 8 4,83 16,90 876 8,13 9 5,04 16,30 954 8,12 10 5,72 14,70 1433 7,92
11 6,43 13,34 3074 7,63 12 7,01 5,38 6901 7,34 13 7,46 2,34 >10000 7,24 14 7,77 1,46 >10000 7,27 15 8,12 1,18 >10000 7,33
16 8,39 0,63 >10000 7,42 17 8,41 0,62 >10000 7,45 18 8,39 0,61 >1D 000 7,48 19 8,31 0,59 >10000 7,52 20 8,15 0,58 >10000 7,57
21 8,05 0,60 >10000 7,59 22 7,82 0,58 >10000 7,64 23 7,64 0,61 >10000 7,69 24 7,42 0,58 >10000 7,73 25 7,23 0,59 >10000 7,77
26 7,01 0,60 >10000 7,81 27 6,78 0,57 >10000 7,88 28 6,58 0,56 >10000 7,93 29 6,40 0,56 >10000 7,93 30 6,22 0,56 >10000 7,93
72
Annexe 1 (suite). Données brutes du lac A (83°00' N, 75°30' 0) pour la température,
l'oxygène dissous (DO), la conductivité spécifique et le pH. Le profilage du lac a été
effectué le 29 mai 2006 à l'aide d'un profileur Surveyor 3 (Hydrolab Corporation). Pour la
conductivité, la limite de détection maximale de l'appareil était de 10 000 ~S cm-1•
Profondeur Température DO Conductivité pH (m) (OC) (mg L-1
) (~S cm-1) .
31 6,04 0,56 >10000 7,92 32 5,89 0,57 >10000 7,91 33 5,74 0,56 >10000 7,91 34 5,57 0,56 >10000 7,91
35 5,44 0,56 >10000 7,91
36 5,32 0,56 >10000 7,91 37 5,17 0,56 >10 000 7,90 38 5,04 0,56 >10000 7,89 39 4,96 0,57 >10000 7,89 40 4,83 0,57 >10000 7,88
41 4,76 0,56 >10000 7,87 42 4,63 0,55 >10000 7,87 43 4,56 0,56 >10000 7,88 44 4,46 0,56 >10000 7,90 45 4,39 0,57 >10000 7,93
73
Annexe 2. Données brutes du lac Cl (82°51' N, 78°12' 0) pour la température, l'oxygène
dissous (DO), la conductivité spécifique et le pH. Le profilage du lac a été effectué le 3 juin
2006 à l'aide d'un profileur Surveyor 3 (Hydrolab Corporation). Pour l'oxygène dissous et
la conductivité, les limites de détection maximale de l'appareil étaient respectivement de 25
mg O2 L- 1 et de 10 000 ~S cm-l.
Profondeur Température DO Conductivité pH {m} {OC} {mg L-1
} {l:!S cm-1}
0,1 -0,15 21,30 1299 8,29 1 0,03 21,77 1330 8,30 2 2,44 20,42 1722 8,43 3 3,55 18,59 1747 8,48 4 3,72 18,54 1777 8,49 5 3,91 18,15 1785 8,51
6 3,92 18,32 1774 8,52 6,5 4,86 21,46 2334 8,39 7 5,67 23,45 3357 8,23 8 7,39 > 25,00 5374 7,88 9 8,97 > 25,00 8340 7,67 10 9,94 > 25,00 >10000 7,58
11 10,72 > 25,00 >10000 7,52 12 11,30 .> 25,00 >10000 7,48 13 11,91 > 25,00 >10000 7,44 14 12,30 18,00 >10000 7,41 15 12,56 13,75 >10000 7,37
16 12,72 10,39 >10000 7,31 17 12,77 7,06 >10000 7,28 18 12,64 1,62 >10000 7,27 19 12,49 1,12 >10000 7,30 20 12,26 0,88 >10000 7,34
21 11,96 0,73 >10000 7,37 22 11,60 0,71 >10000 7,40 23 11,39 0,66 >10000 7,43 24 10,92 0,67 >10000 7,47 25 10,79 0,67 >10000 7,50
26 10,40 0,66 >10000 7,52 27 9,53 0,59 >10000 7,60 28 9,10 0,57 >10000 7,62 29 8,79 0,58 >10000 7,64
30 8,36 0,57 >10000 7,67
74
Annexe 2 (suite). Données brutes du lac Cl (82°51' N, 78°12' 0) pour la température,
l'oxygène dissous (DO), la conductivité spécifique et le pH. Le profilage du lac a été
effectué le 3 juin 2006 à l'aide d'un profileur Surveyor 3 (Hydrolab Corporation). Pour
l'oxygène dissous et la conductivité, les limites de détection maximale de l'appareil étaient
respectivement de 25 mg O2 L-1 et de 10 000 ~S cm- l.
Profondeur Température DO Conductivité . pH (m) (OC) (mg L-1
) (llS cm-1)
31 7,84 0,57 >10000 7,71 32 7,49 0,58 >10000 7,79 33 7,36 0,56 >10000 7,80 34 6,68 0,57 >10000 7,82 35 6,43 0,60 >10 000 7,83
36 6,07 0,60 >10000 7,84 37 5,79 0,56 >10000 7,85 38 5,54 0,55 >10000 7,86 39 5,34 0,53 >10000 7,87
Annexe 3. Alignement des séquences protéiques pour les gènes amoA identifiés dans le lac A et dans le lac Cl. Les positions où les
acides aminés varient expliquent les regroupements de séquences présentées à la figure 2.7. Les lettres surlignées en noir
correspondent aux acides aminés communs aux six séquences comparées . Les lettres surlignées en gris correspondent aux acides
aminés communs à la majorité des séquences comparées alors que les lettres blanches correspondent aux acides aminés propres à une
seule ou à une minorité de séquences.
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