19

PTE TTK Biolgus MSc zrvizsga ttelsor 2011. Vntus V., Marczi A.

19. ssejtek az elmletben s a gyakorlatban a humn genom elemzseAz ismeretanyag fontosabb cmszavai: Totipotens, pluripotens, multipotens, unipotens sejtek. Sejt s szveti differencilds. Az ssejtek specilis genetikai programja, az ssejtek elmleti alkalmazsi lehetsgei, gyakorlati nehzsgek s az alkalmazs etikai krdsei. A Human Genom Program clja s jelentsge, a humn genom szervezdsnek fontosabb jellemzi.1. Bevezets

Az ssejtek olyan sejtek, amelyek nem specializlta, s kt meghatroz tulajdonsguk van: a kpessg, hogy ms sejtekk differencildjanak, s az nmegjts/regenerci kpessge. A totipotens ssejtekbl (pl. a megtermkenytett petesejt) fejldik minden sejttpus, belertve az embrionlis membrnt is. A pluripotens ssejtekbl kifejldhet mind a hrom magzati rteg (pl. bels sejttmeg ICM=Inner Cell Mass). Ms sejtek lehetnek oligopotensek, bipotensek vagy unipotensek attl fggen, hogy ezekbl egy-, kett-, vagy nhny sejttpus fejldhet. Az ssejtek nregenerl kpessge: osztdnak, s ezzel tbb j ssejt keletkezik. A korai fejlds sorn, a sejtosztds szimmetrikus, azaz minden osztds utn a keletkez lenysejtek ugyanazzal a potencillal rendelkeznek. Ksbb, aszimmetrikusan osztdik a sejt: az egyik lenysejt szintn ssejt, a msik pedig egy differencilt sejt.Differencicis potencilKialaktand sejttpusok szmaIlyen ssejtre pldaA differencilds eredmnyekpp ltrejv sejttpus

TotipotensSSZESzigta, blasztomerSSZES

Pluripotenssszes, kivve az embrionlis hrtykathumn ES kultraa hrom csralemez sejtjei

MultipotensSokvrkpz ssejtvzizom, szvizom, mjsejt, vrsejtek

OligopotensNhnymyeloid prekurzoormonocita, makrofg, eozinofil-, neutrofil-, bazofil granulocita

Quadripotens4mesenchymlis progenitor sejtporcsejtek, zsrsejtek, stroma sejtek, csontkpz sejtek

Tripotens3glia-prekurzorastrocytk, oligondendrocytk

Bipotens2rgcsl magzati mj prekurzorB sejtek, makrofgok

Unipotens1hzsejt prekurzorhzsejtek

Nullipotens0terminlis differencicin tment sejtek pl.vvtnincs sejtosztds

1. bra: Humn szvetek differencildsa

Az ssejtek (Stem cells) azt a figyelemremlt lehetsget rejtik magukban, hogy az let korai szakaszban s a nvekeds sorn, a test klnbz pontjain ms-ms tpus sejtekk fejldjenek/differencildjanak. Ezen tlmenen szmos szvetben egyfajta bels javt rendszerknt szolglnak korltlan osztdsi kpessgk ltal be tudnak plni ms sejtek helyre, mindaddig, amg az egyed letben van. Amikor egy ssejt osztdik, minden lenysejt rendelkezik azzal a lehetsggel/potencillal, hogy ssejt maradjon, vagy egy specilis funkcit betlt sejttpus kpzdjn, mint pl. izomsejt, vrs vrsejt, vagy agysejt (2. bra).

Az ssejteket kt alapvet tulajdonsg klnbzteti meg ms sejttpusoktl:

1. Nem specializldott sejtek, amelyek kpesek osztdni, ezzel megjulni akr hossz nyugalmi peridust kveten is.

2. Bizonyos lettani vagy ksrleti krlmnyek kztt induklhatak, hogy szvet- vagy szerv-specifikus sejtekknt funkcionljanak, specilis feladatokat elltva.

2. bra: Az ssejtek kt alapvet tulajdonsgaEgyes szervekben, mint pldul a blben s a csontvelben az ssejtek osztdsa szablyozott, n. repair funkcit tltenek be az elhalt vagy srlt sejtek ptlsval. Ms szervekben hasnylmirigy, szv - csupn bizonyos felttelek mellett kpesek osztdni.

Egszen a kzelmltig a tudsok ktfle llatokra s emberre jellemz ssejt tpussal foglalkoztak: embrionlis ssejtek (ES Embryonic Stem cells) s nem embrionlis - szomatikus vagy felntt - ssejtek. A kutatk 1981-ben jttek r, hogyan lehet levezetni az embrionlis ssejteket (tovbbiakba ES) korai egr embrikbl. Az ssejtek megismersbl kszlt rszletes tanulmny vezetett az elszr 1998-ban alkalmazott technolgihoz, amely sorn humn embrikbl kiemelnek ES-ket s laboratriumi krlmnyek kztt tartjk fenn azokat. Ezek a sejtek az n. humn embrionlis ssejtek. A ksrletben szerepl embrikat in vitro fertilizcis eljrssal hoztk ltre. Amikor mr nem volt szksg rjuk ebbl a clbl, kutatsi clokra adomnyoztk ket a donorok szemlyes beleegyezsvel. 2006-ban a kutatk jabb ttrse az volt, hogy meg tudtk hatrozni azokat a feltteleket, amelyek lehetv tettk bizonyos specilis felntt ssejtek genetikai jraprogramozst, gy ismt ssejt szer llapotba kerlnek. Ez az j tpus ssejt az n. induklt pluripotens ssejt (iPSCs = induced pluripotent stem cells).

Az ssejtek tbb okbl is jelentsek az l szervezetekben. A 3-5 napos embrik, n. hlyagcsra llapotak melynek bels sejtjeibl szrmaztathat az llny egsz teste, belertve a mindenfle specializlt sejttpust s a szerveket: pldul szv, td, br, spermium, petesejt s ms szvetek. Egyes felntt szvetekben, mint pldul a csontvel-, izom-, s az agy, megtallhatak a felntt ssejtek, diszkrt populcikban - kicserldhetnek a norml kops, srls, vagy betegsg miatt krosodott sejtekkel. A klnleges regeneratv kpessgeik ltal, az ssejtek, j lehetsgeket jelenthetnek bizonyos betegsgek kezelsre, mint a cukorbetegsg, s a szvbetegsg. Ugyanakkor sok laboratriumi s a klinikai munka szksges mg, hogy megrtsk, hogyan kell hasznlni ezeket a sejteket a sejt-alap terpikban egyes betegsgek gygytsra, amelyet neveznek regeneratv vagy reparatv medicinnak is. Az ssejtekkel vgzett kutatsok clja, hogy megismerjk a sejtek alapvet tulajdonsgait, s hogy miben klnbznek a specializldott sejtektl. A tudsok mr hasznljk az ssejteket laboratriumi vizsglatokban: j gygyszerek tesztelsre s olyan modell rendszerek vizsglatban, amelyekkel a normlis nvekedst s a szletsi rendellenessgek okait kutatjk. Az ssejtekkel foglakoz kutatsok egyik tmja, hogy mikpp alakul ki egy szervezet egyetlen sejtbl, s hogyan kerlnek egszsges sejtek krosodott sejteket helyre a felntt szervezetben. Az ssejt-kutats egyik legrdekesebb terlet a kortrs biolginak, de mint sok terleten bvl tudomnyos kutats, az j felfedezsek jabb krdseket generlnak.

2. Az ssejtek meghatroz, egyedi tulajdonsgaiAz ssejtek klnbznek a szervezet ms sejttpusaitl. Minden ssejt - fggetlenl azok forrstl - hrom ltalnos tulajdonsggal br: kpese osztdni s megjulni hossz idn keresztl; nem specializlt, specializlt-sejttpusok alakulhatnak ki belle. Az ssejtek hossz idn keresztl kpesek osztdni s megjulni; ellenttben az izomsejtekkel, vrsejtekkel, vagy idegsejtekkel, amelyek ltalban nem kpesek nreplikcira. Egy kezd ssejt populci, ami proliferldik a laborban akr tbb hnapon keresztl, millis sejtszmot is elrhet. Ha a ltrejv sejtek tovbbra sem specilaizltak, mint a szli ssejtek, akkor hossz idn keresztl kpesek a megjulsra.

A kutatk clja megrteni az ssejtek kt tulajdonsgt, melyek a hossz tv megjul kpessggel kapcsolatba hozhatak: 1. Hogy lehetsges, hogy az ES-ek akr egy vig is proliferldnak laborban anlkl, hogy differencildnnak, hiszen a legtbb nem embrionlis ssejt nem kpes erre?

2. melyek azok a tnyezk, az l szervezetekben, amelyek rendszerint szablyozzk az ssejt prolifercit s az nmegjulst? Ha megkapjuk a vlaszt ezekre a krdsekre, azt is megrthetjk, hogyan szablyozdik a sejtosztds a norml embrionlis fejlds sorn; vagy a rk kialakulshoz vezet kros sejtosztdst. Ezek az informcik lehetv teszik a tudsok szmra, hogy hatkonyabban tenysszk az embrionlis, s a nem-embrionlis ssejteket laboratriumi krlmnyek kztt. Az egyedi tnyezk s felttelek, amelyek lehetv teszik, hogy az ssejtek ebben a specializlatlan llapotban maradhassanak nagy rdekldst vltanak ki a tudsok krben. Ekzben a kutatk sokves prblkozs s a hiba sorn tanultk meg, hogyan lehet fenntartani ssejteket a laboratriumban anlkl, hogy azok spontn diferrencildjanak. Pldul, kt vtizedbe kerlt, hogy megtanuljk, hogyan nveszthetk az emberi embrionlis ssejtek laboratriumban, miutn kialaktottk az egr ssejtekhez szksges feltteleket. Ezrt van szksg azon jelek megrtsre az rett szervezetben, amelyek ssejt prolifercit okozhatnak, s tovbbra is specializlatlan llapotot tartanak fenn, amg ilyen sejtekre van szksg. Az ilyen informci kritikus tudsok szmra, hogy kpesek legyenek nagyszm specializlatlan ssejtet nveszteni laboratriumban a tovbbi ksrletezshez.Az ssejtek nem specializldtak, de specializlt sejtekhez vezethetnek differencici. A differencici, egy sok lpsbl ll folyamat, melynek sorn a sejt egyre inkbb specializldik. Az irnytst bels s kls szignlok vgzik. Bels szignlknt foghatk fel a gnek, amelyek kdoljk a cellulris struktrkat s funkcikat is. A differencicit irnyt kls szignlok lehetnek ms sejtek ltal kivlasztott kmiai jelek, fizikai kapcsolat a szomszdos sejtekkel s bizonyos molekulk a mikrokrnyezetben. Klcsnhats a szignlokkal a gnexpresszi epigenetikai mdostsa sejtosztds. Felmerl a krds, hogy a szignlok ltalnosak vagy egyediek a klnbz tpus specializlds esetben ez jabb lehetsget vet fel a terpis alkalmazs esetn.

A felntt ssejtek azokban a szvetekben specializldnak, differencildnak, amelyekben jelen vannak (az ES-ek cirkullnak). Pldul egy haemopoetikus (vrkpz) felntt ssejt a csontvelben klnbz vrsejtek keletkeznek.

Felmerlt az a lehetsg, hogy a felntt ssejtek ms szvetekben esetleg ms sejttpusokk differencildhatnak, ez a jelen kutatsok s tudomnyos vitk trgya.1. Embrionlis ssejtek:Az els felmerl krds, hogy a korai embrionlis fejlds mely szakasza fontos az ssejtek kialakulsa szempontjbl/melyik szakaszban alakulnak ki. (Fontos megjegyezni, hogy in vitro fertilizcibl szrmaz embrik kpezik a kutats trgyt, ezekbl szrmaz ES-et vizsglnak). Laboratriumban, sejtkultrkban tartjk fenn az ssejteket. Az emberi embrionlis ssejtek (hESCs - Human embryonic stem cells) manyag tenyszt ednyben, ismert tptalajon tenysztett preimplantcis llapot embrikbl szrmaznak.

A sejtek az osztds sorn bevonjk a tenyszt edny fellett. Korbban szksg volt egy n. feeder rtegre, ami egr brsejtekbl ll, s megtapadsra, tpanyagknt szolgl. Mra a kutatk kifejlesztettk a feeder nlkli tenysztst, ami jelents tudomnyos eredmny, mert az egr sejtekben elfordulhatnak nem kvnatos vrusok, makromolekulk. Ez egy kis hatkonysg eljrs, de ha sikerl fenntartani, a tll sejtvonalat egy j kultrban nvesztik tovbb sorozatos passzls, akr hnapokig.

Azok az embrionlis ssejtek, amelyek proliferldak sejttenyszetben hosszabb ideig, differencilds nlkl, pluripotensek, s ha nem alakulnak ki genetikai rendellenessgek, embrionlis ssejt vonalnak nevezik. A folyamat brmely szakaszban, a sejteket le lehet fagyasztani, s elszllthatk ms laboratriumoknak tovbbi kultrk tenysztshez s ksrletezshez. A folyamat klnbz pontjain a kutatk tesztelik az ES vonalakat, hogy megtartottk e a rjuk jellemz kritikus tulajdonsgokat, ezt nevezzk karakterizcinak. Br nem ltezik erre mg standard, de minden laborban elvgzik.

2. Hogyan lehet az ES differencildst stimullni?

Mindaddig, amg az embrionlis ssejt-kultrt megfelel felttelek mellett tenysztik, differencilatlan (unspecialized) llapotban maradnak. De ha a sejteket fejld embrikkal egy tptalajon nvesztik tovbb, a differencilds spontn beindul. Kpzdhetnek izomsejtek, idegsejtek, s sok ms sejttpus. Br a spontn differencilds jl jelzi, hogy az embrionlis ssejt kultra egszsges, ez nem hatkony mdja, klnleges sejttpus kultrk ellltsnak. Bizonyos tpus differencilt sejtek ellltshoz - szvizom sejtek, vrtestek, vagy idegsejtek - a tudsok megprbljk irnytani az embrionlis ssejtek differencildst. Lehetsgek: a tptalaj a kmiai sszettelnek vltoztatsa, a tenyszt edny felletnek vltoztatsa, vagy specifikus gnek inszertlsval. Sok ves ksrletezs sorn, a tudsok megllaptottak, nhny alapvet protokollt vagy "receptet" az embrionlis ssejtek irnytott differencilsra bizonyos tpus sejtekk (3. bra).Ha a tudsok kpesek megbzhatan irnytani az embrionlis ssejtek differencildst konkrt sejttpuss, az ebbl szrmaz, differencilt sejtek esetleg alkalmasak lehetnek egyes betegsgek gygytsra a jvben. Ilyen betegsgek, amelyeket humn embrionlis ssejtek tltetsvel kezelhetnek majd: a Parkinson-kr, a cukorbetegsg, a traums gerincvel-srls, a Duchenne izomsorvads, a szvbetegsgek, valamint lts-s hallskrosods.3. Felntt ssejtek:A felntt ssejt, egy differencilatlan sejt a differencilt sejtek kztt egy bizonyos szvetben vagy szervben, amely ez ltal kpes megjtani magt, s kpes az adott szvet vagy szerv f tpus specializlt sejtjeiv differencildni. Az elsdleges szerepe a felntt ssejteknek egy l organizmus szveteinek fenntartsa s javtsa. A tudsok szomatikus ssejt kifejezs helyett hasznljk a felntt ssejt kifejezst, ahol a szomatikus sejt arra utal, hogy testi sejt (nem a csrasejt, spermium, vagy petesejt). Ellenttben az embrionlis ssejtekkel, amelyek elnevezst a szrmazs hatrozza meg (sejtek a preimplantcis fzis embribl), a felntt ssejtek szrmazst bizonyos rett szvetekben mg vizsgljk.A tudsok megllaptottk felntt ssejtek sokkal tbb szvetben elfordulnak, mint egykor gondoltk. Ez a megllapts vezetett kutatk s klinikusok felvetshez, hogy felntt ssejteket lehetne felhasznlni a transzplantci cljbl. Felntt vrkpz (haemopoetikus) ssejteket a csontvelbl mr negyven ve hasznlnak transzplantcira. A tudsok most mr bizonytottk, hogy ssejtek lteznek az agyban s a szvben is. Ha a felntt ssejtek differencildst lehet szablyozni a laboratriumban, ezek a sejtek vlhatnak a transzplantci-alap terpik alapjv.A felntt ssejtek kutatsa 50 vvel ezeltt kezddtt. Az 1950-es vekben a kutatk felfedeztk, hogy a csontvel legalbb ktfle ssejtet tartalmaz. Egyik populci, az gynevezett vrkpz ssejtek az alapjai minden tpus vrsejtnek a szervezetben. A msodik populcit, az gynevezett csontveli stroma ssejteket (ms nven mesenchymalis ssejtek, vagy skeletlis ssejtek), nhny vvel ksbb fedeztk fel. Ezek a nem haemopoetikus ssejtek egy kis rszt alkotjk a csontveli stroma sejteknek, s csont, porc-, zsr-, sejtek kpzdhetnek bellk; hozzjrulnak a vr, s a rostos ktszvet kialaktshoz.Az 1960-as vekben, patknyokkal dolgoz tudsok fedeztek fel az agy kt rgijban osztd sejteket, melyekbl vgl idegsejtek lesznek. Mindezek ellenre, a legtbb tuds gy vlte, hogy a felntt agy nem tud ltrehozni j idegsejteket; egszen az 1990-es vekig. Jelenleg a tudsok egyetrtenek abban, hogy a felntt agy tartalmaz ssejteket, amelyek kpesek generlni az agy hrom f sejttpust - asztrocitkat s oligodendrocitkat, amelyek nem-neuronlis sejtek, s neuronokat/idegsejteket.Felntt ssejteket azonostottak szmos szervben s szvetben, kztk az agyban, a csontvelben, a perifris vrben, az erekben, a vzizomzatban, brben, fogakban, a szvben, a belekben, a mj-, petefszek - epitheliumban, s a herben. gy gondoljk, hogy az egyes szvetekben egy adott terleten tartzkodnak (gynevezett "ssejt niche"). Szmos szvetben, a jelenlegi bizonytkok arra utalnak, hogy bizonyos tpus ssejtek pericitk, alkotjk a kis erek a legkls sejtrtegt. ssejtek maradhat nyugalmi (nem osztd) fzisban hossz ideig, amg nem aktivldnak. Ez akkor kvetkezikbe, ha tbb sejt szksges az adott szvet fenntartshoz, vagy betegsg, szveti srls esetn.ltalban kis szmban tallhatak ssejtek minden szvetben, s a szervezetbl val eltvolts utn, osztdsi kapacitsuk korltozott, gy nagy mennyisg ssejtet tenyszteni igen nehz. A tudsok szmos laboratriumban prbljk megtallni, hogyan lehet nagy mennyisg felntt ssejtet ellltani sejttenyszetben s manipullni azokat, hogy klnleges, specializlt sejttpus keletkezzen bellk, hogy azok alkalmazhatak legyenek srls vagy betegsg kezelsre. Nhny plda a lehetsges kezelsek kzl: csontvelbl izollt stroma sejtek segtsgvel csont-regenerci, a fejld inzulin-termel sejtekkel 1-es tpus cukorbetegsg esetn, s szvrohamot kvet srlt szvizom helyrelltsa szvizom sejtekkel.

A felntt ssejtek azonostsa bizonyos markerek segtsgvel, eltvoltst kvet ms egyedbe trtn transzplantcival lehetsges. Fontos, hogy bizonytani kell, hogy egy felntt ssejt vonal genetikailag azonos sejteket tartalmaz, hogy gy minden keletkez sejt, a megfelel differencilt sejttpus legyen majd.4. Felntt ssejtek differencildsa:A felntt ssejtek szmos szvetben elfordulnak, ahol az arra jellemz norml differencicis utakon mennek keresztl. Egy l llatban, a felntt ssejtek osztdhatnak, ha szksges, s differencildhatnak rett sejttpusokk, amelyek jellegzetesek s specilis funkcikat tltenek be egy adott szvetben. Az albbi pldk a felntt ssejtek lehetsges differencils tjai (4. bra), in vitro s in vivo.

4. bra: Differencildsi utak

Transzdifferencilds: bizonyos felntt ssejtek ms szvetekre jellemz sejttpusokk differencildhatnak emberben val lehetsge vitatott.Elkpzelhet, hogy ms szervekbl beltetett ssejteknek olyan jelentsge lehet, hogy a fogad szvetben aktivljk annak sajt felntt ssejtjeit, gy azok rszt vehetnek a javt mechanizmusokban. Ismt ms lehetsg a sejtek t/jraprogramozsa pl.: hasnylmirigyben az elvesztett inzulin-termel kpessg bta-sejtek ptlsra ms hasnylmirigy-sejtek tprogramozsa.

Amellett, hogy jraprogramozssal lltanak el egy adott sejttpust, most mr lehetsges, hogy tprogramozzanak felntt szomatikus sejteket, amelyek embrionlis ssejtekk vlhatnak (induklt pluripotens ssejt, iPSCs) embrionlis gnek bevezetse rvn. gy a donor, a sejtek forrsa lehet maga a recipiens - elkerlve ez ltal hisztokompatibilitsi problmkat - ha ilyen sejteket hasznlunk szveti regenercira. Azonban, mint az embrionlis ssejtek esetben is, a mdszerek meghatrozsa mg folyik, amellyel teljes s reproduklhat iPSCs-t lehet elrni, amely elktelezett s megfelel sejtvonalakat biztost.5. Humn embrionlis- s felntt-ssejtek sszehasonltsa:Humn embrionlis s felntt ssejteknek megvannak a maguk elnyei s htrnyai a potencilis hasznlat szempontjbl a sejt-alap regeneratv terpiban. Az egyik f klnbsg a felntt s az embrionlis ssejtek kztt az eltr differencildsi kpessgk a differencilt sejttpusok szmt s tpust tekintve, amelyekk kpesek vlni. Az embrionlis ssejtekbl a test brmely sejttpusa kpzdhet, mert pluripotensek. A felntt ssejtekbl csak klnbz tpus sejtek differencildhatnak, azok szveti szrmazsa szerint.

Az embrionlis ssejtekkel viszonylag knnyen lehet tenyszteni sejtkultrban, a felntt ssejtek azonban ritkk az rett szvetekben, gy nehz elklnteni ezeket a sejteket, s a sejttenyszetben val nagymennyisg elllts mdszere mg nem kidolgozott. Ez egy fontos klnbsg, mivel a nagyszm sejtre van szksg ssejt terpikhoz.A tudsok gy vlik, hogy embrionlis s felntt szvetekbl szrmaz ssejtek esetn eltr lehet annak a valsznsge, hogy kilkdnek a transzplantci utn. Mg nem lehet tudni, hogy embrionlis szvetekbl szrmaz ssejtek transzplantcija okozna-e kilkdst, mivel a klinikai vizsglatok az els szakaszban vannak, az izollt sejtekkel - hESCS - val munkt csak a kzelmltban hagyta jv az Egyeslt llamok lelmiszer-s Gygyszerellenrz Hivatala (FDA) NIH kutats.

Felntt szvetekbl szrmaz ssejtek esetn vlheten kevsb valszn, hogy kilkdnek a transzplantci utn. Ez azrt van, mert a beteg sajt sejtjeit lehetne tenyszteni sejtkultrban, induklni a differencildst adott sejttpuss, majd beltetni a betegbe. A beteg sajt felntt ssejtjeinek hasznlata (5. bra) azrt biztonsgosabb, mert kevsb valszn, hogy elutastja ket az immunrendszer. Ez jelents elny, mert ezt egybknt immunszupresszv szereket adsval lehet csupn elkerlni, amelyek maguk is okozhatnak kros mellkhatsokat.

6. A humn ssejtek lehetsges felhasznlsi lehetsgei s az akadlyok, amelyeket mg le kell kzdeni, mieltt ezek megvalsulhatnak:Nagyon sok lehetsg felmerlhet, a humn ssejtek felhasznlsra kutatsi clokra s a klinikumban. Az humn embrionlis ssejtek tanulmnyozsval informcik nyerhetk az emberi fejlds sorn felmerl sszetett esemnyekrl.Az elsdleges cl felderteni, hogyan vlnak specializlt, differencilt szerveket, szveteket felpt sejtekk a difrrerencilatlan ssejtek. A folyamat irnytja bizonyos gnek be ill. kikapcsolsa, a differencilt gnexpresszi. Nhny igen slyos betegsgben jtszik szerepet a kros sejtosztds s differencilds, mint a rk s a szletsi rendellenessgek. A genetikai s molekulris folyamatok teljesebb megrtsvel nyerhetnk informcit, hogyan alakulnak ki az ilyen betegsgek, valamint ez j kezelsi stratgik kidolgozsban is meghatroz lehet. A sejtproliferci s differencilds ma mg kiszmthatatlan, nem kontrolllhat, ezrt is ignyel tovbbi alapkutatst, hogy feldertsk a molekulris s genetikai szignlokat, amelyek szablyozzk a sejtosztdst s a specializcit. Az iPS (induklt pluripotens ssejtek) sejtekkel vgzett kutatsok legjabb fejlemnyei fnyt dertettek egyes specilis faktorokra, amelyek rszt vehetnek a folyamatban, azonban biztonsgos technikkat kell kidolgozni, ezek sejtekbe juttatsra, s rszletesen ellenrizni a folyamatokat, amelyeket az egyes faktorok induklnak a sejtben.A humn ssejtek fel lehetne hasznlni, az j gygyszerek tesztelsre. gy biztonsgosan tesztelhetek lennnek a gygyszerek pluripotens vonalakbl ellltott differencilt sejteken. Ms tpus sejtvonalakat mr hasznlnak ilyen clra: pldul rk sejtvonalakat, hasznlnak lehetsges daganatellenes gygyszerek tesztelsre. A rendelkezsre ll pluripotens ssejtek lehetv tennk, hogy a hatanyagok tesztelst tbbfle sejttpuson, azonban a hatkony tesztelshez, egyenl feltteleknek szksgesek, hogy sszehasonlthatak legyenek a klnbz hatanyagok. Ezrt fontos, hogy a tudsok pontosan szablyozhassk az ssejtek differencildst a klnleges sejttpusokk, a hatanyagok tesztelshez. A jelenlegi ismeretek a jelek kontrolling megklnbztetse elmarad, hogy kpes utnozni ezeket a feltteleket pontosan generlni tiszta populcii differencilt sejtek esetben egyes gygyszerek tesztelnek.Taln a legfontosabb potencilis alkalmazsa az emberi ssejteknek, a sejtek s szvetek kpzse, amelyek felhasznlhatk a sejt-alap terpiban. Ma beteg vagy elhalt szvetek s szervek cserje transzplantcival oldhat meg, a transzplantlt szvetek/szervek donoroktl szrmaznak, de sajnos a kereslet meghaladja a knlatot. Az ssejtek, irnytott differencicival konkrt sejttpusokk vlhatnak, ez lehetsget nyjt a beteg sejtek s szvetek megjtsra, cserjre = kezelsre: Alzheimer-kr, gerincsrls, stroke, gs, szvbetegsg, a cukorbetegsg, osteoarthritis (degeneratv zleti betegsg), s rheumatoid arthritis (reums zleti gyullads).Pldul lehetsgess vlhat egszsges szvizom sejtek ellltsa laboratriumi krlmnyek kztt, majd ezek beltetse krnikus szvelgtelensgben szenved pciensbe. Egereken vgzett elzetes kutatsok szerint eredmnyes lehet csontveli stroma sejtek beltetse krosodott szvizomba kivlthatjk j szvizomsejtek keletkezst, j vrerekkel val ellts kialakulst vagy esetleg egy ms, eddig mg nem ismert mechanizmuson keresztl fejtik ki jtkony hatsukat. A hats gy is elkpzelhet, hogy a beltetett sejtek nvekedsi faktorok termelnek, amelyek javulst eredmnyeznek. gretes eredmnyek szrmaznak llatksrletekbl, amelyek alapjul szolglhatnak embereken vgzett vizsglatoknak. A legfrissebb tanulmnyok azt jelzik, hogy sejtkultrban lehetsges, az embrionlis ssejtek vagy felntt csontveli sejtek kzvetlenl szvizomsejtekk differencildsa (6. bra).

1-es tpus cukorbetegsgben szenved emberek esetben hasnylmirigy inzulint termel sejtjeit rendszerint a beteg sajt immunrendszere puszttja el. A legjabb vizsglatok azt mutatjk, hogy lehetsges, hogy sejttenyszetben kzvetlenl inzulint termel sejtekk differencildjanak az emberi embrionlis ssejtek, amelyeket gy felhasznlhatnnak a cukorbeteg transzplantcis terpijban.Ahhoz azonban, hogy a kifejlesztett technikkat terpisan tudjk alkalmazni nagyon fontos kritrium a reproduklhatsg, valamint az albbiak:

kiterjedt proliferci s elegend mennyisg szvet kpzse

irnytott differencici a kvnt sejttpuss

beltetst kvet tlls s mkds

a krnyez szvetekbe trtn integrci a beltetst kveten

megfelel funkci betltse a pciens egsz letn t

a recipiens brmilyen nem krostsnak elkerlseAz elutast immunvlasz/kilkds elkerlsnek lehetsgeit szleskren kutatjk. sszefoglalva, az ssejtek izgalmas gretes lehetsgei a jvbeni terpiknak, de a jelents technikai akadlyok lekzdse hossz veken keresztli intenzv kutatst sejtet.

7. bra: ssejt transzplantcis kutats Parkinzon kr terpiban

3. a humn genom szervezdseEgy haploid vagy diploid sejtben tallhat teljes rktanyag, azaz DNS mennyisget nevezzk genomnak. Ez eukarita llati illetve emberi sejtekben kt rszbl tevdik ssze: a sejtmag DNS-bl = nukleris genom s a mitokondriumok DNS-bl = mitokondrilis genom.A kt genom elssorban mretben klnbzik. Mg egy haploid sejtmagban 3000 Mb DNS s kb. 30 000 - 40 000 gn van, addig az emberi mitokondrium mindssze 16,6 kb DNS-sel s 37 gnnel rendelkezik. Ma a genomika tudomnyterlete foglalkozik a klnbz llnyek teljes genomjnak komplex szekvencilis s funkcionlis vizsglatval.

1. A nukleris genom:Az emberben a sejtmag DNS-e a genetikai anyag 99 %-t alkotja, s a klnbz becslsek szerint 30 000 - 40 000 gnt tartalmaz. Ez a 22 fle autoszma s ktfle nemi kromoszma kztt oszlik meg. Az tlagos kromoszma 130 Mb (50-250 Mb kromoszma mrettl fggen) DNS-t tartalmaz. A specilis citogenetikai festsi eljrsokkal (Giemsa, FISH) lthatv tett svok, nemcsak bzissszettelkben s a kromatin szervezdsi mdjban klnbznek, hanem az egyes svok gntartalmban is. A gndenzitsnemcsak az egyes kromoszmk kztt vltozik, pl. a 19-es s a 22-es kromoszmk gnsrsge igen nagy, mg a 4-es s a 18-as gnben szegnyek, hanem az egyes kromoszma terletek s a stt, illetve a vilgos svok kztt is eltrhet. A telomra alatti - szubtelomrikus rgik gnben gazdagok, a centromra, azaz az elsdleges befzds s az Y kromoszma hossz karjnak jelents rsze gyakorlatilag gnmentes. A heterokromatin s az 1-es, a 9-es, a 16-os kromoszmkon tallhat msodlagos befzds (konstrikci) fleg nemkdol, repetitv DNS-t tartalmaz.A stt svok gnben szegnyek, pl. az Xp21 sv csak egyetlen egy risi 2,4 Mb hossz gnt, a disztrofin (messze a legnagyobb ismert humn gn, 79 exonjavan, az izomsejtekben tallhat disztrofin fehrjt kdolja) gnjt tartalmazza. Ezzel szemben a 6p21.3 vilgos sv, ahol az MHC I gnkomplex van, kzel 200 gnt (170 mr azonostott) tartalmaz!

A genomot alkot gnek legnagyobb rsze klnbz funkcij - strukturlis, receptor, hormon, transzkripcis faktor stb.- fehrjket (a gn eredeti defincija is ez: egy fehrje molekult kdol DNS szakasz), kisebb hnyaduk RNS-t (pl. rRNS, tRNS, kis nukleris = snRNS s kis citoplazmatikus RNS) kdol. Nemcsak a fehrje, hanem az RNS termkek funkcija is jelentsen eltr egymstl, hiszen nemcsak a fehrjeszintzisben, hanem a splicingban illetve az X inaktivcibanis szerepet jtszhatnak.Az emlsknl az X-kromoszma dziskompenzcija azt jelenti, hogy az X kt pldnyn lv gnek kifejezdse kiegyenltdik a hmek X-n lv gnek dzisval. A dziskompenzci a nstnyek egyik X-kromoszmjnak inaktivcijval valsul meg. Minden egyes sejtben a fejlds egy korai szakaszn egyik X-kromoszma inaktivldik, s ezt az llapott aztn minden utdsejtben tovbbrkti.

Sok gn klnbz gncsaldok tagja. A gncsaldok, pl. hiszton-, globin-, immunglobulin-, MHC I - csald stb. tagjai vagy azonos, vagy nagyon hasonl funkcival brnak, s vagy azonos kromoszmn csoportosulnak (pl. hiszton) vagy a genomban sztszrva (pl. immunglobulinok) helyezkednek el. A gncsaldok az evolci sorn rendszerint egy egyedi gn egymst kvet duplikciival s mutciival alakultak ki. E folyamatok azonban nemcsak normlis gncsaldokat, hanem nem kdolpszeudogneket, csonkolt gneket s gn fragmentumokat is ltrehozhatnak. A konvencionlis pszeugognek, amelyek gyakran csak egy korai stop kodonban klnbznek az eredeti gntl, gyakoriak az egy-egy kromoszmn csoportosul gncsaldokban, ugyanakkor az n. feldolgozott (processzlt) pszeudognekintronmentesek s fleg a tbb kromoszmn sztszrt gncsaldokban fordulnak el. A csonkolt gneknek valamelyik, vagy az 5 vagy a 3 vge hinyzik, mg a gn fragmentum egy nagyobb gn valamelyik exonjbl ll.

Persze, a gnek kztt szmos klnbz funkcionlis kapcsolat is kialakulhat, pl. ugyanannak a komplexnek klnbz alegysgeit kdoljk, vagy ugyanannak az anyagcsere tnak klnbz enzimjeit hatrozzk meg. Sok esetben ez a fajta funkcionlis kapcsolat - gninterakci ll a vrttl eltr szegregcis arnyok, pl. az episztzis (a nem alll gnek kztt fellp olyan klcsnhats, amelyben az egyik gn (episztatikus gn) nem engedi rvnyre jutni ms gn (hiposztatikus gn) hatst a fenotpusban) kialakulsa mgtt. Az emberi gnek mretkben (nhny szz nukleotidtl tbb megabzisig (Mb = 106 bzispr( terjed hossz) s bels szervezdskben is jelentsen eltrnek egymstl. Mivel a prokarita gneknl jval hosszabbak, transzkripcijuk is sokkaltovbb tart. ltalnossgban ugyan igaz, hogy a hosszabb gn hosszabb fehrjt kdol, azrt vannak meglep kivtelek. Pldul az apolipoprotein B (ApoB, az LDL fehrje komponense) gn krlbell 50-ed rsze a legnagyobb ismert, 2,4 Mb hossz disztrofin gnnek, de termke 4563 aminosavbl ll, s ez sokkal hosszabb a disztrofinnl!

A gnek bels eltrsei az intronok szmban s hosszban vannak, az exonok hossza fggetlen a gnek mrettl. rdekes mdon a nagy gnekben kevesebb exon s sok igen nagy intron tallhat. Pl. a disztrofin gn 99,4 %-aintron s csak 0,6 %-a exon, mg az Apo B-ben csak 77 % az intron. Termszetesen itt is vannak kivtelek, pldul az egyik tpus kollagn gnje ugyan kzepes mret, de 118 !exont (a legtbbet az eddig azonostott gnek kzl) s igen rvid intronokat tartalmaz.

Ritka kivtelknt a nukleris genomban is vannak intron nlkli gnek pldul a hisztonok, a legtbb tRNS, klnbz hormonreceptorok (dopamin, D1, szerotonin, angiotenzin II, (2adrenerg receptor) gnjei, vagy az SRY (a hm jellegek kifejldsrt felel) s a SOX csald nhny gnje.

A prokaritktl s az alacsonyabb rend eukaritktl eltren, ahol a gnek igen kzel (1 - 5 kb-ra) vannak egymshoz, az emberi gnek kztt kb. 30 kb DNS van. Mg az elbbi csoportban nem ritkn tfed gnek is vannak, addig emberben ez ritkasg, s csak a nagy gnsrsg rszekre korltozdik. Pldul az MHC I gnkomplexbentudunk nhny tfed emberi gnrl.

jabban arra is talltak bizonytkot, hogy nmely nagy gn nagy intronja ms kis gneket tartalmaz! Ezek, ltalban, az eredeti gntl eltren, a szenz DNS szlrl rdnak t. Ilyen a VIII. vralvadsi faktor (F8) gnjnek (ennek mutcii okozzk a hemoflia A-t) 22-es intronja, amely 2 kis gnt (F8A s B); vagy a neurofibromatzis (NF) gn 40 kb hossz 27-es intronja, amely 3 kt-kt exonnal rendelkez kis gnt tartalmaz. (A neurofibromatzis egy autoszmlis dominns rklds, tbbnyire jindulat, tbbszrs neurofibroma kpzdssel jr krkp.) Az emberi gneknek nemcsak a szerkezete vltozatos, hanem expresszijuk szablyozsa is. Az emberi gnmkds transzkripcis szablyozsban is szerepet jtszanak a gnkzeli vagy gnnel kapcsolt, ppen ezrt cisz-hats szekvencik (promoter, enhancer, silencer s hormon reszponzv elemek). Ezekhez kapcsoldnak a tvoli, s ezrt transz-hats, gnek ltal termelt, klnbz transzkripcis faktorok, hormonok stb. Az ezek ltal biztostott klasszikus transzkripcis szablyozs mellett az alternatv promoter(ms-ms promoterrl indul ugyanannak a gnnek az trsa) hasznlatra is van emberi plda: a citoszkeletlisdisztrofin fehrje szvetspecifikus formi keletkeznek gy. A poszt-transzkripcis (trs utni) szablyozs mechanizmusai, az alternatv splicing s poliadenilci gyakoribb, mg az RNS szerkeszts (editing) igen ritka. Hasonlkppen a poszt-transzlcis, teht a fehrje szintzist kvet hasts szintn nem tl gyakori, de pldul az emberi inzulin ilyen mechanizmussal keletkezik (pre-pro-inzulin( pro-inzulin ( inzulin + C-peptid).

Ezek mellett ltezik egy a kromatin szerkezet ltali n. hossz tv gnexpresszi szablyozs is. A legismertebb plda Drosophilban megfigyelt n. pozci effektus, amikor a centromra, a telomra vagy ms heterokromatikus rszek azltal gtoljk a gnexpresszit, hogy nagyobb kromatindomnek szerkezett megvltoztatjk. Nhny emberi betegsg kialakulsa annak ksznhet, hogy klnbz mutcik, pl. delcik kvetkeztben az rintett gnek pl. a telomra kzelbe helyezdnek, s ez a kzelsg gtolja a gn transzkripcijt, mintegy silencer-szer hatst fejtve ki.

Egy msik szokatlan szablyozsi lehetsg az, amikor a gncsaldok tagjainak trsa ugyanattl a promotertl fgg, gy a tagok vetlkednek a promoterrt.

A gnexpresszi szablyozsnak specilis esete az egyik X kromoszma XIST ltali inaktivcija (Egy specilis RNS, a Xist nem kdol fehrjt, s az inaktv X-en szintetizldik, egy inaktivcis centrumbl kiindulva burkolja be az inaktv X-et.), illetve a genomilisimprinting - az apai, illetve anyai DNS eltr metilltsga ltali regulci (az epigenetikus rklds klnleges pldja, az egyik szltl rklt alll inaktv,metillt, a msik szltl szrmaz alll mutcija dominnsnak tnik, holott az egyed funkcionlis rtelemben hemizigta a gnre nzve. A vizsglatok arra utalnak, hogy az imprintinget szenved gnek szma szz krli az emberi genomban. Pl. Prader-Willi szindrma (PWS)). A specilis szablyozshoz tartozik az immunglobulinok s a T sejt receptorok expresszijnak az immunolgiban trgyalt szablyozsa is. Valsznleg a gnexpresszi szablyozsval lehetnek kapcsolatosak az n.CpG(cytosine-phosphate-guanine) szigetek is. Ezek tlagosan 1 kb hossz nem metillt, ismtld CG bzisokbl ll szakaszok a gnek 5 vgn. Br a genomilis CG nagy rsze ersen metillt, ezek a terletek csak az t nem rd gnekben azok. Felttelezik, hogy a szvetspecifikustrs szablyozsval lehetnek kapcsolatban. A mindentt folyton trd housekeeping = hztartsbeli gnek promoterben ezek mindig metillatlanok, mg a szvetspecifikusexpresszit mutat gnek esetben csak abban a szvetben maradnak ilyenek, ahol a gn kifejezdik, a tbbi szvetben ersen metilltak. Az emberi genomban kb. 30 000 CpG sziget van, azaz kevesebb, mint a gnek felttelezett szma, s ezek sem egyenletesen oszlanak meg a kromoszmkon. Az 1-es, a 9-es, a 13-as, a 14-es, a 15-s, a 17-es, a 19-es s a 20-as kromoszmk klnsen gazdagok ilyen szakaszokban. Teht ezek semmikppen sem jelenthetik a gnexpresszi szablyozsnak kizrlagos mdjt. Ugyanakkor a tumorszupresszor gnek CpG szigeteinek hipermetilcija gyakori, s ez a tumorkpzds egyik epigenetikus(rkld, br nem a gnt magt, vagyis nem a DNS szekvencit, hanem annak szablyozst rint)tnyezje lehet.

Br az eukarita, gy az emberi gnek is egyedileg rdnak t, azaz egy gnnek egy traszkriptuma van, azaz a rgi terminolgia szerint monocisztronosak, vannak policisztronos, vagyis tbb gnes transzkriptumok is. Ilyenek a riboszmlis gnek, ahol egy nagy transzkriptum daraboldik fel a 18 S, 28 S, 5,8 S RNS-re.

A kdol szekvencik, vagyis a gnek az emberi genomnak csak kevesebb, mint 10 %-t teszik ki, teht a zm nem kdol (pszeudogn, gn fragmentum, intron s le-nem-fordtd), illetve gnen kvli, gnek kztti n. extragnikus szekvencia. Az extragnikusszakaszok 80 %-a egyedi vagy kis kpiaszmban elfordul, kisebb hnyada ersen ismtld, repetitv. Az ersen ismtld szakaszok ktflk lehetnek:

I/ tandem ismtld szakaszok

II/ sztszrt repetitv szekvencik

I/ Tandem ismtld szakaszok

Ezek olyan meghatrozott szm ismtld bzisbl ll blokkok, amelyek csak bizonyos kromoszma rgikban fordulnak el. 3 alosztlyuk van:

a/ szatellita DNS

b/ miniszatellitaDNS

c/ mikroszatellita DNS

a/ A szatellita DNS onnan nyerte a nevt, hogy eltr bzissszettele miatt a teljes DNS czium-klorid grdiens centrifuglsakor a DNS zmtl eltr, ms srsg, kis, azaz szatellita svban jelent meg. A genomban a szatellita DNS alkotja a nem kdol heterokromatikus rgik zmt. Br az ismtldsi egysgek hossza 5-171 bzispr, a teljes blokkok 100 kb-tl nhny Mb-ig terjedek. A szatellita DNS alkotja a centrikus (centromra krli)heterokromatin legnagyobb rszt.

b/ A miniszatellita szekvencik sem rdnak t, s tbbnyire a genomban sztszrva tallhatk. Az ismtld szakasz hossza csak 6 -25 bp, mg az ezekbl felpl blokkok 0,1-20 kb lehet. A telomrkban s a telomra kzeli rszeken fordulnak el elssorban.

c/ A mikroszatellita DNS 1-4 bp hossz ismtld egysgei (ismtldsi egysg = repeat) gyakran150 bp-nl is rvidebb elrendezseket alkotnak, s a genomban sztszrtan helyezkednek el. A mono- illetve a dinukleotid ismtldsi egysgek gyakoriak, a mononukleotid ismtld szakaszok a genom 0,3 %-t, a dinukleotidok 0,5 %-t alkotjk. A tri- s tetranukleotid ismtldsi egysgek ritkk, de klnsen az elbbiek ersen polimorfak s orvosi jelentsegk igen nagy (trinukleotidrepeat mutcik s betegsgek). Mg a mononukleotid ismtld sorok fleg A vagy T bzisbl llnak, s hosszuk akr 10 Mb is lehet, addig a dinukleotidok CT/AG felptsek. Egyik mikroszatellita DNS funkcijt sem ismerjk, de sok molekulris biolgiai mdszer alapszik felhasznlsukon,pl. a DNS ujjlenyomat, azaz a DNS fingerprinting s a VNTR (VariableNumber Tandem Repeats=vltoz szm tandem ismtldsek).

II/ Szrszrt ismtld szekvencik

A sztszrt ismtld szekvencikat az ismtldsi egysgek hossza alapjn osztlyozzk. A SINE (shortinterspersednuclearelement = rvid kzbeiktatott szakasz) jellemzje az ismtldsi egysgek igen nagy szma. Az Alu szekvencia (nevt a feldertsre hasznlt Alu I restrikcis enzimrl kapta) kb. 280 bp hossz, de 700 000 - 1 000 000 kpiban fordul el a humn genomban!

A LINE (longinterspersednuclearelement = hossz kzbeiktatott szakasz) 1,4 - 6,1 kb hossz, s 60 000 - 100 000 a kpiaszma.

Mindkt tpus valsznleg thelyezdsre kpes elem, azaz olyan instabil DNS szakasz, transzpozon, amely kpes a genomon belli helyvltoztatsra. Ennek mdja retrotranszpozci, vagyis elszr egy RNS kszl az ugrl elemrl, amelyrl reverz transzkripcival DNS kszl, s ez pl be valahova a genomilis DNS-be, akr mutcit is okozva ezzel. Sem a SINE, sem a LINE funkcija nem ismert, ltalban nem kdol DNS szakaszokban fordulnak el, a LINE fleg intronokban. Kromoszmn belli megoszlsuk is eltr, a SINE a vilgos, a LINE a stt svokban gyakoribb.

A spacer DNS az a nem kdol DNS, aminek legvalsznbb funkcija pusztn strukturlis, a gnek elklntse egymstl. Ide azokat a DNS szekvencikat soroljk, amelyek nem illenek a korbban emltett egyik kategriba sem.

2. A mitokondrilis genom:Egy sejtben tbb ezer mitokondrium van, amelyek a sejtosztdsok sorn vletlenszeren oszlanak meg az utdsejtek kztt. Egy mitokondriumban is tbb, kzel 100 DNS molekula tallhat. A mitokondriumbanprokarita tpus cirkulris DNS van, melynek szmos klnlegessge van.

Az egyik, hogy kt eltr bzissszettel szlbl pl fel. A nehz szl (H =heavy) guaninban, a knny szl (L = light)citozinban gazdag. A replikcisorigo szlanknt eltr helyen van, s az egyikrl (L szl) az ramutat jrsval egyez, a msikrl azzal ellenttes irnyban trtnik a DNS szintzis. A mitokondrilis DNS mutcis rtja 10 nagyobb a nukleris DNS-nl, mivel nincs hibajavt mechanizmusa. A leggyakoribbak a pontmutcis s a delcis mutnsok.

A mitokondrlis DNS kdjai eltrnek a nukleris DNS-tl, de mg a klnbz llatfajok is egymstl! Pldul:

kodon Sejtmag Mitokondrium

(emls)

UGA

Stop

Trp

AUA IleMet

AGA

Arg

Stop

AGG

Arg

StopA H szlon 2 tfed gn is van, vagyis majdnem ugyanaz a DNS szakasz kt eltr fehrjt kdol!

A mitokondrilis DNS sszesen 2 rRNS, 22 tRNS s 13 polipeptid molekult kdol gnt tartalmaz. gy a gnsrsge jval nagyobb a magi DNS-nl, radsul repetitv szekvencik sincsenek benne. Az emberi mitokondrium gnjeiben nincsenek intronok sem. Ez azonban ms fajok, pl. szmos nvny mitokondriumra nem igaz, ahol ennek is ksznheten, a mitokondrilis genom is jval nagyobb.

11. bra: A mitokondrilis genom szerkezete

Az ND a NADH dehidrogenz komplex elemeit, a CO a citokrm-oxidz komplex alegysgeit jelenti. Az ATP-z 6 s ATP-z 8 tfed gnek. Az O a replikcis orig jele, mg a P a transzkripcis kezdpontra utal.

A 13 fehrje a mitokondrium f funkcijval kapcsolatos: a lgzsi lnc citokrmjai, illetve az ATP szintzis komplexe s a NADH dehidrogenz itt kdolt, s itt is szintetizldik.

A mitokondriumban zajl transzkripci is specilis: a kt szlon eltr irnyban s eltr promoterrl trtnik egy-egy risi mRNS molekula szintzise, ezek utbb a fehrjknek megfelel rszekre daraboldnak, vagyis azmRNSpolicisztronos.

A H szl fleg fehrjt s rRNS-t kdol, az L pedig tRNS-t.

Br csak 22 tRNS van a mitokondriumban, ezek sajtos kodon felismersk miatt kpesek mind a 60 fle kodonhoz (a kd itt is degenerlt) kapcsoldni.

A fehrjk a prokaritkhoz hasonl 70 S mitoriboszmkon szintetizldnak.

Br a mitokondrium kpes DNS, RNS s fehrje szintzisre is, a mitokondrium felptshez s mkdshez elengedhetetlen tbbi fehrje, pl. a DNS polimerz is, a sejtmagban lokalizlt gnek informcija alapjn, a citoplazmban szintetizldik.

Nemcsak a mitokondrilis genom felptse, de rkldse is klnleges, mivel valamennyi mitokondriumunk anyai eredet. A petesejtben tbb szzezer mitokondrium van, a spermiumban azonban csak alig nhny szz. A megtermkenyts utn ezek elpusztulnak, gy a zigtban egyedl az anytl, a petesejtbl szrmaz mitokondriumok maradnak meg. A mitokondrilis gneket teht kizrlag az anytl kapja az utd, az ezek ltal meghatrozott tulajdonsgok csak anyai ton rkldnek.

A mitokondrilis DNS-ben a rekombinci ismeretlen fogalom. A kt klnbz DNS-molekulban megjelen mutci nem kerlhettkeresztezds rvn egyetlen molekulba.

A mitokondrilis DNS mutcis rtja (gyakorisga) krlbell egy nagysgrenddel nagyobb, mint a kromoszomlis DNS-. Ennek a jelensgnek a feltevsek szerint tbb oka lehet, a DNS-t krost oxidcis termkek, szabad gykk kzvetlen kzelsge, a vdfehrjk (hisztonok) hinya, a helyrellt (repair) mechanizmusok hinya, illetve tkletlensge.

A kromoszomlis DNS (genom) az ivarsejtekben egy, a testi sejtekben kt pldnyban tallhat. Ezzel szemben egy tlagos sejtben tbb szz mitokondrium van, mindegyikben 5-10 DNS-molekulval, teht a sejtenknti pldnyszm ezres nagysgrend. Ennek az a kvetkezmnye, hogy ha a mitokondrilis DNS replikcija, megkettzdse sorn mutci lp fel, ez nem jr semmifle kzvetlen kvetkezmnnyel, hiszen a sejtben lv tbb ezer DNS-molekula mellett csak egy lesz mutns. Hosszabb tvon azonban mr van eslye a mutns felhalmozdsnak, hiszen a sejtosztdsok sorn a vletlen eloszls jelentsen megvltoztathatja a mutns s norml DNS-molekulk arnyt. A mitokondrilis genetikban ezrt beszlnk heteroplazmirl, azaz arrl, hogy egy sejtben vagy organizmusban egyms mellett klnbz arnyokbanelfordulhatnak vad-tpus s mutns, stklnbz mutns DNS-ek. Ha a mutci a petesejt rsnek (oogenezis) korai szakaszn kvetkezett be, akkor a vletlen szegregci, esetleg valamilyen szelekcis mechanizmussal is megerstve, elvezethet ahhoz, hogy a mutns jelenlte kizrlagoss vlik egy sejtben. Ha ez megtrtnik, akkor termszetesen ez jellemezni fogja e sejt valamennyi utdjt is. Ilyenkor homoplazmirl beszlnk.

Amennyiben egy mutcinak a fenotpusban is megnyilvnul kros hatsa van (ez tbbnyire az oxidci, illetve az energiatermels valamilyen zavart jelenti), e hats rvnyeslse nyilvnvalan attl fgg, hogy a mutci az adott sejt, vagy szerv mitokondrilis DNS-molekulinak mekkora hnyadban van jelen, azaz milyen fok a heteroplazmia. Ez az arny az elbbiek rtelmben sejtenknt, illetve szervenknt ms lehet ugyanazon egyedben is. Az is vltozhat, szervtlfggen, hogy az adott mrtkheteroplazmia mennyiben okozszlelhetfenotipikus hatst. Nyilvnval, hogy a krosodsra legrzkenyebbek a legintenzvebben energiafogyaszt sejtek (pl. ltideg, szvizom stb.). Ezrt mutcinknt, illetve szervenknt s szvetenknt ms s ms rtke lehet annak, hogy a mutci kros hatsa megnyilvnul-e vagy sem.

A kromoszomlis DNS-molekulk linerisak, a mitokondrilis DNS-ek viszont krkrsek (cirkulrisak).

A ma egyrtelmenmitokondrilisDNS-eredetnek tartott betegsgek szerencsre elg ritkk s a laikus kzvlemny ltal kevss ismertek. Ilyen pldul a Leber-fle optikai neuroptia mellett a Leigh-szindrma, a Kearns-Sayre-szindrma, a rojtos-vrs-rostosmioklnusosepilepszia,s a Pearson-szindrma. Tbb, a felsoroltaknl jval gyakoribb s fontosabb betegsg esetben bizonyos mitokondrilis mutciknak az egszsges kontrollokhoz kpest magasabb arny elfordulst mutattk ki, de ezekben az esetekben az ok-okozati sszefggs vitatott. Ilyen a cukorbaj (diabetes), a siketsg egyes formi, egyes kardiomioptik(szvizomelfajuls), az Alzheimer-kr vagy a Parkinson-kr. Vgl felttlenl rdemes megemlteni, hogy a kutatk egy rsze a mitokondrilis DNS-mutcik felhalmozdsra vezeti vissza az emberisg legfontosabb, mindenkit rint betegsgt az regedst. Ez az elmlet pillanatnyilag sem nem igazolhat, sem nem cfolhat. Ktsgtelen tny, hogy a mitokondrilis DNS-mutcik szma az regedssel n. Az azonban nem bizonythat, hogy ez a jelensg okozja-e vagy csak kvetkezmnye az regedsnek.

A mitokondrilis DNS-re visszavezethet betegsgek termszetesen ugyangy nem gygythatk jelenleg, ahogy ms rkletes betegsgek sem. A gntechnolgia nagy grete, a gnterpia azonban elvileg lehetsgeket knl itt is az orvostudomny szmra. A mitokondrilis gnterpia bizonyos szempontbl knnyebb is lehet a kromoszomlis gneknl. Elkpzelhet pldul az, hogy szintetikus nukleotidanalgokkal specifikusan gtolhat egy mutns mitokondrilis DNS megkettzdse, replikcija, gy, hogy a normlis vad-tpus molekula replikcija nincs gtolva. Ilyen mdon gyakorlatilag kivdhet volna a betegsgokoz mutci hatsa. Nemrgiben hoztk ltre az els llati modellrendszert, amellyel ezek a lehetsgek tanulmnyozhatk s az els bztat ksrletekrl mr beszmoltak. A gyakorlati megvalsts termszetesen mg igen messze van.

Az emberi mitokondrilis DNS vizsglatnak azonban nem csak az orvostudomny szempontjbl van jelentsge. Mint korbban emltettk, a 37 gn jformn hzagmentesen fedi le a mitokondrilis DNS nagy rszt. Van azonban egy mintegy ezer nukleotid hosszsg szakasz, amelyen nincsenek gnek, ezt szoks olykor varibilis rginak nevezni. Az ezen a szakaszon bekvetkez mutciknak ugyanis ltalban nincs fenotipikus kvetkezmnye, teht evolcis rtelemben semlegesek. Mivel pedig a mutcis rta magasabb a magi DNS-nl, ezrt ennek a rginak a szerkezete valban igen vltozkony. Kt egymssal anyai gon nem rokon egyed kztt biztosan szmos ponton klnbzik e szakasz nukleotidsorrendje. A mitokondrilis DNS egszre vonatkozan elmondhat, hogy kt nem rokon egyed kztt legalbb 70 helyen van klnbsg, az emberisg egymstl legtvolabb ll egyedei kztt pedig akr 500 nukleotidban. Ezek tbbsge a varibilis rgira koncentrldik. Ennek a rginak a nukleotidsorrendjt a jelenlegi technikkkal arnylag knnyen s teljes egszben meg lehet hatrozni. Az eddig elmondottakbl az kvetkezik, hogy a trtneti antropolgia, az emberi npessgek leszrmazsnak, rokonsgnak, trtneti keveredsnek kutatsban, de az igazsggyi orvostani vizsglatokban is felbecslhetetlen rtk eszkz a mitokondrilis DNS elemzse.

Klnsen nveli a mitokondrilis DNS-vizsglatok ilyen felhasznlhatsgt az a tny, hogy pldnyszma sejtenknt tbb ezer, ezrt pldul fosszilis maradvnyok vizsglata esetn lnyegesen nagyobb eslyt knl a hasznlhat szekvenciaelemzsre, mint a magi DNS. A kzelmlt legszenzcisabb ilyen tpus eredmnye a Neander-vlgyi sembermitokondrilisDNS-nek az elemzse. Ebben az esetben magi DNS-t nem sikerlt (nem sikerlhetett) hasznlhat formban felszaportani, a mitokondrilis DNS vizsglata azonban eredmnyes volt s fontos tanulsggal szolglt. A kutatk az si csontmaradvnybl a mitokondrilis DNS varibilis rgijnak mintegy 300 nukleotid hosszsg szakasznak szekvencijt hatroztk meg s hasonltottk ssze kzel ezer, a legklnbzbb npcsoportokhoz tartoz mai ember mitokondrilis DNS-vel. Mg a mai embereknl ezen a szakaszon tlagosan nyolc nukleotidnyi klnbsget talltak kt egyed kztt, a Neander-vlgyi ember szekvencija 20 helyen klnbztt a hozz legkzelebb ll mai embertl, az tlagos klnbsg 25 nukleotid volt. Ennek alapjn ki lehetett mondani, hogy a Neander-vlgyi sember minden bizonnyal nem tekinthet a mai ember eldjnek, a kt faj sztvlsa krlbell 600 000 vvel ezeltt kvetkezett be.

Egy msik rdekes plda a kzelmltbl: II. Mikls orosz cr maradvnyainak azonostsa. A crnak tulajdontott csontokbl izollt mitokondrilis DNS-ben a kutatk egy jellegzetes heteroplazmis mutcit talltak. Ez volt az azonosts vgs bizonytka, mert a cr testvrnek, Gyrgy nagyhercegnek mitokondrilis DNS-ben ugyanezt a heteroplazmis mutcit talltk meg.

3. A humn genom projekt:

A XX sz. utols vtizednek legnagyobb vllalkozsa. A program kezdemnyezi nagy fba vgtk a fejszjket. A terv 15 vesnek indult, br 1992-es becslsek szerint az akkori 1 USD/bp s 100.000 bp/v adatok alapjn 30.000 vre s 3 millird dollrra volt szksg a teljes genom feltrshoz.

A humn genom projekt f tmogatja az USA kt hatalmas intzmnye: Department Of Energy, National Institutes of Health (NIH), de rszt vett ebben a programban szmos orszg intzmnye is: Pl.: WelcomeTrust + francia, nmet, japn s knai kutatintzetek is. A program 1. igazgatja Watson volt, a DNS ketts spirl megfejtje.

A program clja: Ki kell derteni annak a kb. 3 millird bp-nak a sorrendjt, amely az emberi genomot alkotja. Az 1. kromszma rvid karjnak telomerjtl az Y kromoszma hossz karjnak legvgig.1990-ben indult a projekt, amelyet tbb llam tmogatott (nemzetkzi konzorcium), s egy 1998-ban alakult magnvllalkozs (CeleraGenomics) is beszllt az zletbe, s az esetkben ez sz szerint rtend, hiszen ket a pnz mozgatta. A nemzetkzi konzorcium az elejn deklarlta a profitorientltsg kizrst s az eredmnyek kzkincs ttelt. Ezzel szemben a Celera, ha elbb elkszl a teljes genom feltrsval, akkor a megfejtett szekvencikat kommercializln. Bill Clintonnak kellett beavatkoznia abba a krdsbe, hogy mi piacosthat az elrt eredmnyekbl, s mi nem. A szekvencia semmikppen nem volt az, hiszen az kztulajdon vagy szemlyekre bontva kinek-kinek a sajtja.

Sok embert foglalkoztatott a kezdetektl fogva, hogy vajon Ki a megszekvenlt DNS? A HGP 9 ember mintjt szekvenlta le, amelyek kzl 8-at biztosan frfiakbl izolltak. Azrt dntttek frfiak mellett, mert a nknek a genomi knyvtruk kt kpit is tartalmazna az X kromoszmn hordozott informcibl, az Y kromoszmrl azonban semmit nem mondana.Felmerlt, hogy a kutatsban rszt vevk kzl kerlnnek ki a donorok. Ezt azonban etikai okokbl kifolylag elvetettk. A Celera vezetje: Craig Venter 2002-ben mgis azt fedte fel, hogy a leszekvenlt DNS-ek egyike az v volt. Vgl kiderlt, hogy ez a DNS az sszesnek mintegy 3/5-t tette ki.Eredeti stratgia: a genom hierarchikus lebontsa mind kisebb szerkezeti egysgekre. Majd a humn DNS jl azonosthat szakaszait kellett elsdlegesen elegend mennyisgben felsorakoztatni, ksbb a nukleotid sorrendjnek megllaptsa kvetkezett. Az gy nyert szekvencikat kellett ezutn sszeilleszteni egymssal. Ez a stratgia a technikai lehetsgek rohamos fejldst kvetelte: Pl.: ma mr automata szekvenlk dolgoznak (1998-ban kszlt az 1. nagy teljestmny szekvenl ABI PRISM 3700) a rgen kzzel szekvenlt DNS-en, amely nagysgrendekkel megsokszorozza a munka sebessgt.Az HGP els clkitzsei kz tartozott, hogy kb 150 ezer bp-onknt meghatrozzunk egy jelet markert ami ezt a darab informcit a kromoszma egy adott helyhez kti. A markerek 100-200 bp-bl ll egyedi szekvenciasorozatok, amelyek csak egyszer fordulnak el a genomban.

Ezt kvette a genom feldarabolsa 150 ezer bp-bl ll, rszekben tfed darabokra. Ezek a szakaszok mestersges kromoszmaknt bekerltek egy-egy baktrium-klnba. Ezeket BAC-knyvtrnak (bacterialartificialchromosome) nevezzk, melyeket sorba kellett ezutn rendezni s kiszelektlni a redundns klnokat. Minden kromoszmhoz tartozik egy olyan BAC-kln-sorozat, amely ismert sorrendben tartalmazza a kromoszma darabjait. A hierarchikus mdszer elvt alkalmazva BAC-knyvtr ltrehozst egy-egy BAC-kln tovbbi darabolsa kvette. Az gy keletkezett kisebb, tfed szakaszokat mr kzvetlenl szekvenltk.A munka felgyorsult: 2001 februrjban 2 vezet termszettudomnyi folyirat is lekzlte, az akkor mintegy 95 %-ban meglv adatokat.

Nature: A nemzetkzi konzorciumt

Science:A CeleraGenomics-t

A kt szekvencia kztt nincs nagy eltrs. Br tkletes azonossg nem lehet, hiszen a DNS mintk klnbz forrsokbl szrmaznak. Az eredmnyeket a HGP mindenki szmra elrhetv tette az interneten keresztl, ezzel szemben a Celera elfizetsekhez kttte.Hogyan trtnhetett meg, hogy ami a HGP-nek 11 ves munkjba kerlt, azt a Celera 3 v alatt ksztette el (1998-2001). DNS szekvenlsi technolgik risi fejldse. Celera projekt stratgija is nagyban befolysolta ezt: k ugyanis elhagytk a rendkvl idignyes hierarchikus rendszer kiptst. Helyette a shotgun klnozs mdszert alkalmaztk: vagyis a genomot egybl apr darabokra vgtk fel, majd mindkt vgt szekvenltk. A kapott szekvencia sszerakshoz nagy teljestmny bioinformatikai eszkzket hasznltak fel.

Eredmnyek:Sokakat meglepett, hogy csak kb. 30.000 gn van a humn genomban. Ma mr ez a szm 40-60.000 fl duzzadt. Hisz a korbbi becslsek mindegyike 50.000 fl helyezte a szmukat. Van aki 100.000-re becslte. A gnek szma mindssze ktszerese a Drosophilban meghatrozottaknak. A komplexits titka nem a gnek szmban, hanem a gnek ltal meghatrozott fehrjk sszeraksi mdjban van rejtve. Fontos szerepet jtszik az alternatv splicing mechanizmusa, amely kvetkeztben egy gn tbbfle fehrjt is meghatrozhat.A varilhat komplexits msik aspektusa a fehrjk domnszerkezete: egy adott domn tbbfle fehrjben is elfordulhat. Nyers szekvencia adatok alapjn megllapthat hogy az exonok tlagos hossza: 100-200 bp, az intronok: 1000-4000 bp, 1 gn pedig tlagosan 7-9 exonbl ll.A kapott eredmny hasznos rsze a humn genom mintegy 10 %-a, de a fehrjekdot tnylegesen hordoz exonok a teljes szekvencinak a 1,5 %-t adjk. A hasznos informci tartalmazza az exonokat, a t-s rRNS gnjeit, tovbb a gn kifejezdst szablyoz DNS szakaszokat (promoter, enhancer rgi). A maradk 90 %-ban nem haszontalan informci van, sok fontos funkcit betlt szekvencit a program nem azonostott. Pl.: a kromatinllomny sejtmagban trtn elrendezsben is specifikus DNS szakaszok jtszanak szerepet.A nyers szekvencik alapjn 2 embernek is nagyfok eltrst mutatott a szekvencija (0,1 %), teht az egyezs 99,9 %-os volt. Azaz 1.000.000 bp kzl tlagosan 800 klnbzik. Ezekbl vezethetk le pl. a nagyrasszok kztti klnbsgek.Lezrult a pregenomilis idszak a humn genom teljes szekvencijnak megismersvel. Most kezddik a postgenomilis idszak, amelyben a genetikai informci rtelmezse s a gnek funkcijnak megismerse mellett nagy hangslyt kap az emberek kztti genetikai variabilits feltrkpezse. A technikai fejlds, a szekvencia homolgik kre jelentsen felgyorstotta egyb fajok, fleg emlsk genomjnak trkpezst. A DNS bzissorrendjnek meghatrozsa nem jelenti a Humn Genom Program vgt, st most kezddika gnek jelentsnek megfejtse, a 21. szzad biolgija. A gnek mkdsnek feltrsa utn a kvetkez lps az egyes mkdsek sorrendjnek, kapcsolati hljnak megismerse.A gnkszlet megismersbl fakad j orvoslsrl, az egynre szabott gygyszeres kezelsrl, a genetikai kd s a szemlyisgi jogok kapcsolatrl, rkld gnhibk lakossgi szrsrl, gnterpikrl, mestersges kromoszmkrl, genetikailag talaktott disznkrl (amelyek szve, vesje, hasnylmirigye alkalmas lesz emberek gygytsra szervtltetssel), gygyszert tejel birkkrl gyakran esik sz mostanban. A muslica s egy talajban l 1 mm-es fonalfreg, a C. elegans gnjeirl kiderlt, nagyon hasonlatosak emberi gnjeinkhez. A 289 gnbl (amelyek hibja betegsget okoz az emberben) 177 a muslicban is megtallhat, a rkrt felels gnek 68%-a a muslicban, 50%-a fonlfregben is ott van. A rkgygyszerek kifejlesztsnl nagy szolglatot tehetnek mindketten. Ktszz gnbetegsgnk a macskban is megtallhat. A Humn Genom Programban felfedezett gneket nem kell jra felfedezni az llatokban, s az llatokban felfedezett gneket egyszer megtallni az emberben. Gnjeink igen hasonlak, lnyegket megrzi az evolci. Legfontosabb gabonink, s olyan veszlyes mikrbk, mint a malria krokoz vagy a kolerabaktrium, genomprogramjai is soron vannak.

Felhasznlt irodalomhttp://stemcells.nih.gov/info/basics/defaultpage.asp

http://www.matud.iif.hu/04mar/03.html

http://www.odec.ca/projects/2004/mcgo4s0/public_html/t5/cellrepair.html

http://www.csa.com/discoveryguides/stemcell/overview.phpfhttp://www.scq.ubc.ca/stem-cell-bioengineering/

http://stemcell2u.wordpress.com/2008/01/19/cardiac-stem-cell-therapy-closer-to-reality/

http://stemcellupdate.net/

http://www.ca-medicalnews.com/tag/stem-cell-therapy

http://genetics.aok.pte.hu/download.php?view.27

http://genetics.aok.pte.hu/download.php?view.2http://www.ttk.pte.hu/biologia/genetika/atg/genfog.pdfhttp://www.ttk.pte.hu/biologia/genetika/atg/chap22/ch22a.htmhttp://www.ttk.pte.hu/biologia/genetika/atg/chap18/ch18d.htmhttp://www.ttk.pte.hu/biologia/genetika/libr_gen/MolBiol_PP2.pdfhttp://www.termeszetvilaga.hu/tv98/tv9811/genetika.html3. bra: ES irnytott differencildsa

5. bra: Sajt ssejtek hasznlata

6. bra: Szvizom krosods javtsa ssejtekkel

PAGE 2