Vytauto Didžiojo universitetas

Europos Impatiens rūšių lyginamoji charakteristika pagal branduolio

DNR žymenis

Bakalauro baigiamasis darbas

Gamtos mokslų fakultetasBiologijos katedra

Darbą atliko: Edita Ramonienė, GMF, biologija IV kursasDarbo vadovas: prof. habil. dr. Eugenija Kupčinskienė

Kaunas, 20161

ĮVADAS• Dėl žmogaus veiklos, sparčiai plinta invazinės smulkiažiedė ir bitinė

sprigės, taip mažindamos biologinę įvairovę.

• Jos užgožia vietinės paprastosios sprigės ir kitų natūraliai augančių rūšių populiacijas, nes sugeba greičiau įsitvirtinti pažeistuose plotuose.

1 pav. Smulkiažiedės sprigės sąžalynas(aut. nuotrauka)

2 pav. Bitinės sprigės sąžalynas(aut. nuotrauka) 2

ĮVADAS• Nors APPD (angl. RAPD) ir PKSI (angl. ISSR) žymenys jau naudoti

tiriant atskiras Impatiens rūšis, tačiau neatlikta jų bendra lyginamoji genetinė charakteristika.

• Pasigendama rūšių genetinio kintamumo lyginamosios charakteristikos platesniame geografiniame areale.

3 pav. Paprastoji sprigė (aut. nuotrauka)

4 pav. Bitinė sprigė(aut. nuotrauka)

5 pav. Smulkiažiedė sprigė(aut. nuotrauka)

3

Tyrimai

1 lentelė. Atlikti tyrimai paprastosios, smulkiažiedės ir bitinės sprigių Lietuvos ir Čekijos populiacijoms APPD ir PKSI žymenimis ( + pažymėti laukeliai – tyrimai, atlikti kitų VDU Biologijos katedroje; – pažymėti laukeliai – trūkstami tyrimai).

Rūšis Žymuo Lietuva Čekija

Paprastoji sprigė APPD + –

PKSI + +

Smulkiažiedė

sprigė

APPD + –

PKSI + +

Bitinė sprigė APPD – –

PKSI – +4

Darbo tikslas − palyginti Lietuvoje ir Čekijoje augančių invazinių bitinės (Impatiens glandulifera Royle) ir smulkiažiedės (Impatiens parviflora DC.) sprigių bei vietinės paprastosios sprigės (Impatiens noli-tangere L.) populiacijų genetinę įvairovę APPD ir PKSI žymenimis.

Darbo uždaviniai:•Palyginti Impatiens rūšis tarpusavyje, įvertinti panašumus ir skirtumus tarp invazinių ir neinvazinių sprigių.•Įvertinti 3 rūšių populiacijų polimorfinius lokusus, Šanono ir Nei genetinės įvairovės indeksus.•Apskaičiuoti 3 rūšių populiacijų genetinę diferenciaciją ir genų srautą tarp populiacijų.•Sudaryti 3 rūšių populiacijų genetinio giminingumo medžius pagal Nei genetinius atstumus. •Atlikti 3 rūšių molekulinės įvairovės (AMOVA) analizę.

5

METODINĖ DALIS

6 pav. Sprigių rinkimo vietos Lietuvoje ir Čekijoje. 1 − Anykščiai (Any), 2 − Varėna (Var), 3 − Kaunas (Kau), 4 − Juodkrantė (Juo), 5 − Potštejn (Pot), 6 − Velký Osek (Pol), 7 − Čelina (Cel), 8 − Volyně (Vol).

Ištirtos 24 populiacijos po 15 individų (išskyrus Juo populiacijas − po 10 individų), tai yra po 8 populiacijas kiekvienos Impatiens rūšies.

6

Darbo eiga1. DNR išskyrimas iš sprigių (a);2. Gautos DNR koncentracijos ir švarumo nustatymas (b);3. APPD žymenų pritaikymas sprigėms (c);4. PKSI žymenų pritaikymas sprigėms (c);5. PGR (angl. PCR) produktų atskyrimas

elektroforezės būdu (d ir e);6. Elektroforezės nuotraukų analizė (f).

e) Elektroforezėd) Agarozės gelio ruošimas f) Elektroforezės nuotrauka 7

a) DNR išskyrimas

b) Spektro-fotometras

c) Termocikleris

REZULTATAI IR JŲ ANALIZĖ

Polimorfizmas

8

7 pav. 3

Sprigių genetinė įvairovė pagal Nei ir Šanono indeksus

3 lentelė. Lietuvos ir Čekijos paprastosios, smulkiažiedės ir bitinės sprigių populiacijų genetinio kintamumo parametrai pagal APPD ir PKSI žymenis (h − Nei genetinės įvairovės indeksas; I − Šanono informacinis indeksas).Populiacija

APPD PKSI APPD PKSI APPD PKSI

Paprastoji sprigė Smulkiažiedė sprigė Bitinė sprigė  h I h I h I h I h I h I

Any 0,062 0,091 0,083 0,128 0,094 0,139 0,033 0,050 0,137 0,211 0,041 0,063Var 0,049 0,070 0,074 0,119 0,081 0,122 0,063 0,098 0,115 0,177 0,066 0,100Kau 0,054 0,079 0,079 0,123 0,078 0,116 0,029 0,047 0,112 0,175 0,058 0,088Juo 0,048 0,070 0,098 0,148 0,088 0,135 0,037 0,056 0,128 0,198 0,041 0,064Pot 0,054 0,079 0,156 0,253 0,022 0,036 0,139 0,219 0,074 0,113 0,112 0,172Pol 0,052 0,079 0,139 0,229 0,022 0,035 0,100 0,157 0,104 0,161 0,078 0,119Cel 0,041 0,063 0,187 0,298 0,029 0,045 0,104 0,163 0,093 0,144 0,107 0,163Vol 0,069 0,101 0,180 0,286 0,017 0,029 0,093 0,145 0,080 0,124 0,082 0,126Vidurkis

0,054 0,08 0,125 0,199 0,050 0,08 0,075 0,117 0,106 0,163 0,074 0,112

9

Koreliacija tarp sprigių rūšiųNei genetinio atstumo

• Pagal APPD žymenis reikšminga koreliacija stebima tarp paprastosios ir smulkiažiedės sprigių (r = 0,79; p < 0,01) bei tarp smulkiažiedės ir bitinės sprigių (r = 0,76; p < 0,01).

• Pagal PKSI žymenis, reikšminga koreliacija stebima tik tarp smulkiažiedės ir bitinės sprigių (r = 0,89; p < 0,01). Reikšmingos koreliacijos tarp bitinės ir paprastosios sprigių nei vienu atveju nebuvo nustatyta.

10

Impatiens rūšių genetinė diferenciacija irgenų srautas tarp populiacijų

DNR žymuo Genetinė diferenciacija GST

Genų srautas tarp populiacijų Nm

  Paprastoji sprigėAPPD 0,79 0,13PKSI 0,36 0,89

  Smulkiažiedė sprigė

APPD 0,81 0,12PKSI 0,68 0,23

  Bitinė sprigė

APPD 0,61 0,32PKSI 0,73 0,18

11

Sprigių rūšių populiacijų klasterizacija

12

6 lentelė. Paprastosios, smulkiažiedės ir bitinės sprigių molekulinės įvairovės (AMOVA) analizės rezultatai tarp regionų (Lietuvos ir Čekijos), tarp populiacijų regionuose ir tarp populiacijų pagal APPD ir PKSI žymenis.

DNR žymuo APPD PKSI  LL SK VK % P LL SK VK % P

  Paprastoji sprigėTarp regionų 1 1064 12,6 30,0 0,03 1 144 1,1 7,3 0,03

Tarp populiacijų regionuose 6 2011 23,0 54,6 0,01 6 471 4,8 31,1 0,01

Tarp populiacijų 107 689 6,4 15,3 0,01 107 1024 9,6 61,7 0,01

Bendras 114 3764 42,0     114 1639 15,1    

  Smulkiažiedė sprigėTarp regionų 1 1285 16,0 36,4 0,03 1 838 12,3 49,7 0,03

Tarp populiacijų regionuose 6 1970 21,5 48,9 0,01 6 596 6,2 25,0 0,01

Tarp populiacijų 112 724 6,5 14,8 0,01 112 702 6,3 25,3 0,01

Bendras 119 3980 43,9     119 2136 24,8    

  Bitinė sprigėTarp regionų 1 853 10,4 27,5 0,03 1 632 8,9 45,6 0,03

Tarp populiacijų regionuose 6 1374 14,4 38,0 0,01 6 583 6,2 31,6 0,01

Tarp populiacijų 112 1466 13,1 34,6 0,01 112 501 4,5 22,9 0,01

Bendras 119 3693 37,9     119 1717 19,6    13

IŠVADOS• Pagal APPD žymenis paprastoji ir smulkiažiedė sprigės buvo panašios pagal Nei

genetinės įvairovės (h) ir Šanono informacinį (I) indeksus bei polimorfinių lokusų (P%) rodiklius.

• Pagal genetinę diferenciaciją (GST) ir genų srautą tarp populiacijų (Nm) artimiausios rūšys buvo paprastoji ir smulkiažiedė sprigės pagal APPD žymenis bei smulkiažiedė ir bitinė sprigės pagal PKSI žymenis.

• Paprastoji ir bitinė sprigės beveik pagal visus rodiklius APPD ir PKSI lokusuose labiausiai skyrėsi viena nuo kitos.

• Pagal molekulinės įvairovės analizę (AMOVA) pagal APPD žymenis įvairovė tarp populiacijų buvo panašiausia tarp paprastosios ir smulkiažiedės sprigių, o pagal PKSI žymenis − tarp smulkiažiedės ir bitinės sprigių.

• Daugelis APPD ir PKSI rodiklių rodo, kad lyginant tris Impatiens rūšis panašiausios rūšys pagal APPD žymenis buvo paprastoji ir smulkiažiedė sprigės, pagal PKSI žymenis − smulkiažiedė ir bitinė sprigės, o labiausiai skyrėsi paprastoji ir bitinė sprigės.

14

PADĖKA• Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovei prof. habil. dr. Eugenijai

Kupčinskienei už pagalbą ir patarimus ruošiant baigiamąjį darbą.

• Ačiū dr. Linai Jocienei už kantrybę, pamokymus ir pagalbą atliekant metodinę dalį ir ruošiant straipsnį.

• Labai dėkoju Ramūnui Vilčinskui už pamokymus atliekant statistinę duomenų analizę.

• Esu dėkinga ir Čekijos mokslininkams dr. Hana Skalova ir prof. Petr Pyšek už augalinę tyrimų medžiagą.

15

MOKSLINĖ PUBLIKACIJA

Straipsnis žurnaleRamonienė E., Jocienė L., Paulauskas A., Kupčinskienė E. 2016. European Impatiens species differences at RAPD and ISSR loci, Biologija, 62 (1): 25–34.

Konferencijos (pristatyti stendiniai pranešimai)Jociene L., Vilcinskas R., Ramoniene E., Paulauskas A., Kupcinskiene E. 2015. Molecular diversity comparisons between three Impatiens species growing besides. In: VI Baltic Genetics Congress. Tartu (Estija). (Spaudoje).

Ramonienė E, Jocienė L, Paulauskas A, Kupčinskienė E. 2016. Comparison of three Impatiens species by nuclear DNA markers. In: 10th The Vital Nature Sign. Vilnius (Lietuva). (Spaudoje).

16

Vytauto Didžiojo universitetas

Europos Impatiens rūšių lyginamoji charakteristika pagal branduolio

DNR žymenis

Bakalauro baigiamasis darbas

Gamtos mokslų fakultetasBiologijos katedra

Darbą atliko: Edita Ramonienė, GMF, biologija IV kursasDarbo vadovas: prof. habil. dr. Eugenija Kupčinskienė

Kaunas, 201617

1 Priedas

  Any Var Kau Juo Pot Pol Cel

Any –            

Var 151 –          

Kau 104 90 –        

Juo 254 270 193 –      

Pot 843 728 744 688 –    

Pol 900 785 798 724 80 –  

Cel 973 859 872 788 146 74 –

Vol 1046 927 935 862 202 141 72

1 lentelė. Geografiniai atstumai (km) tarp Lietuvos ir Čekijos paprastosios, smulkiažiedės ir bitinės sprigių populiacijų.

18

2 Priedas

2 lentelė. APPD tyrimui pasirinkti pradmenys pagal atliktus darbus Vytauto Didžiojo universitete.

Pradmuo Pradmens seka Temperatūra* DNR atkarpų dydis, bp

OP-A20 5‘ – GTTGCGATCC – 3‘ 32 °C 450–270OP-D20 5‘ – GTTGCGATCC – 3‘ 32 °C 150–2100222 5‘– AAGCCTCCC – 3‘ 34 °C 150–2500250 5‘– CGACAGTCCC – 3‘ 34 °C 150–2050269 5‘ – CCAGTTCGCC – 3‘ 34 °C 150–1800340 5‘– GAGAGGCACC – 3‘ 34 °C 150–2100474 5‘ – AGGCGGGAAC – 3‘ 34 °C 150–2100516 5‘ – AGCGCCGACC – 3‘ 36 °C 200–1800

Pradmuo Pradmens seka Temperatūra*ISSR2 5‘– GGCCACACACACACACACAC – 3‘ 60 °CISSR3 5‘– CCGGAGAGAGAGAGAGAGAG –3‘ 60 °CISSR4 5‘– CCGGACACACACACACACAC – 3‘ 60 °CISSR5 5‘– GCGCAGAGAGAGAGAGAGAG – 3‘ 60 °CISSR6 5‘–GCGCACACACACACACACAC – 3‘ 60 °C

3 lentelė. PKSI tyrimui pasirinkti pradmenys.

19

3 Priedas

20

4 lentelė. Sprigių populiacijų Nei genetinis atstumas pagal PKSI (viršutinis trikampis) ir APPD (apatinis trikampis) lokusus.

21

5 Priedas

22

6 Priedas

4 lentelė. Paprastosios, smulkiažiedės ir bitinės sprigių populiacijų vietos ir klimato parametrai medžiagos rinkimo metais (2011 metais Lietuvoje ir 2010 metais Čekijoje).

Popu-

liacija

Platu-

ma

(N)

Ilguma

(E)

Auk-

štis,

m

Vidutinė

metinė

temperatūra

T, °C

Vidutinė

temperatūra

T vegetacijos

laikotarpiu, °C

Vidutinis

metinis

kritulių

kiekis, mm

Vidutinis

kritulių kiekis

vegetacijos

laikotarpiu, mm

Any 55°30’ 24°44’ 90 6,3 13,6 847 657

Var 54°23’ 24°00’ 63 6,5 13,6 833 657

Kau 54°53’ 23°50’ 55 6,5 13,7 847 696

Juo 55°32’ 21°06’ 40 6,8 13,6 928 685

Pot 50°07’ 16°32’ 330 7,5 12,1 750 510

Pol 50°12’ 15°15’ 190 9,5 14,1 575 395

Cel 49°73’ 14°34’ 290 8,5 13,1 575 395

Vol 49°14’ 13°89’ 470 7,5 12,1 600 430 23