EPREPR--SS--SLSL--STST--OxOx--II--primenprimenee u biolou biološškim sistemimakim sistemima--

Miloš Mojović

EElektronlektron PParamagnetnaaramagnetnaRRezonancijaezonancija

OSNOVNI PRINCIPIOSNOVNI PRINCIPI I NEKE I NEKE PRIMENEPRIMENE

EPR je rezonantna apsorpcija mikrotalasnog zračenja od strane nesparenog elektrona u prisustvu magnetnog polja

Terminologija

Electron Paramagnetic Resonance (EPR)Electron Spin Resonance (ESR)Electron Magnetic Resonance (EMR)

EPR = ESR = EMR

Ene

rgija

Ms

±½

B = 0 Magnetno polje (B)

ΔBpp

hν = gβBν= (gβ/h)B = 2.8024 x B MHz

za B = 3480 G ν = 9.75 GHz (X-band)za B = 420 G ν = 1.2 GHz (L-band)za B = 110 G ν = 300 MHz

(Radiofrekvencija)

EPREPR –– opopššti principti princip

Ms = +½

Ms = -½

h Plankova konstanta 6.626196 x 10-34 Jsν frekvencija (GHz)g g-faktor (približno 2.0)β Borov magneton (9.2741 x 10-24 J/T)B magnetno polje (Gauss ili T)

ΔE=hν=gβB

B > 0

Kako se moKako se možže dobiti EPR e dobiti EPR signal?signal?

DrDržži se konstantna mikrotalasna frekvencija a i se konstantna mikrotalasna frekvencija a kontinualno se menja magnetno polje (starije kontinualno se menja magnetno polje (starije CW CW mamaššine)ine)Na konstantnom magnetnom polju primeni se Na konstantnom magnetnom polju primeni se puls elektromagnetnih talasa (novije mapuls elektromagnetnih talasa (novije maššine) ine) –– analogno FT NMRanalogno FT NMR

Razvoj pulsnih EPR spektrometara je dugo bio ograniRazvoj pulsnih EPR spektrometara je dugo bio ograniččen en nepostojanjem elektronike koja radi u nanosekundnim renepostojanjem elektronike koja radi u nanosekundnim režžimima i imima i koja mokoja možže da registruje FID koji potie da registruje FID koji potičče od relaksacija elektrona e od relaksacija elektrona (mikrosekunde ili manje)(mikrosekunde ili manje)..

ShemaShema EPR EPR spektrometraspektrometra

EPR cavity (EPR cavity (rezonatorrezonator))

PrincipPrincip detekcijedetekcije signalasignala u EPR u EPR spektroskopijispektroskopijimodulacija magnetnog poljamodulacija magnetnog polja

ne

da

može

Modulacija magnetnog polja ‘skenira’ apsrorpcionu liniju i EPR spektar je prvi izvod apsorpcione linije

KlasiKlasiččnini EPR instrumentEPR instrument

Pulsni EPR

FID

Spektar

Pitanje:Pitanje:ČČemu snimati spektar nesparenog elektrona i za to emu snimati spektar nesparenog elektrona i za to koristiti instrumente koji su jako skupi, ako se dobije koristiti instrumente koji su jako skupi, ako se dobije samo ovo.. ?!samo ovo.. ?!

Odgovor:Odgovor:Pitanje ne uzima u obzir razliPitanje ne uzima u obzir različčite interakcije spinova u ite interakcije spinova u sistemu i mogusistemu i moguććnosti da se iz toga izvuku informacije o nosti da se iz toga izvuku informacije o sistemu koji se istrasistemu koji se istražžujeuje

EPR EPR HamiltonijanHamiltonijan

OpOpššti principti princip –– ččestice sa nesparenim spinovima rezonantno apsorbuju estice sa nesparenim spinovima rezonantno apsorbuju elektromagnetno zraelektromagnetno zraččenje kada se nalaze u magnetnom poljuenje kada se nalaze u magnetnom polju

Ukupni HamiltonijanUkupni HamiltonijanHHmm= H= HBSBS + H+ HBIBI + H+ HSSSS + H+ HISIS mmagnetnaagnetna spinskaspinska energijaenergija

HHee= H= HEe Ee + H+ HEkEk + H+ HQQ elektrostatielektrostatiččka energijaka energija

HHBSBS -- Zemanova energija elektronskih spinova Zemanova energija elektronskih spinova HHBI BI -- Zemanova energija nuZemanova energija nukklearnih spinovalearnih spinovaHHSSSS -- interakcija elektronskih spinova sa elektronskim spinovimainterakcija elektronskih spinova sa elektronskim spinovimaHHISIS -- interakcija elektronskih spinova sa nuklearnim spinovimainterakcija elektronskih spinova sa nuklearnim spinovimaHHEeEe -- interakcija elektrona sa spoljainterakcija elektrona sa spoljaššnjim elektrinjim električčnim poljemnim poljemHHEkEk -- interakcija jezgra sa spoljainterakcija jezgra sa spoljaššnjim elektrinjim električčnim poljem nim poljem HHQQ -- elektrielektriččna kvadrupolna interakcijana kvadrupolna interakcija

MS=±½

ElektronS (½)

JezgroI (½)

Izborna pravilaΔMS = ±1 (elektron)

ΔMI = 0 (jezgro)

B

“dublet”

a

HHiiperfinperfino sprezanjeo sprezanjeDodatno cepanje linija usled interakcija

elektronskih i nuklearnih spinova

E = gβBSz + (hA0)SzIzE = gβBSz + (a)SzIz(hA0 (Hz) -> a (G) g-faktor)

+½

-½

-½

+½

MI

ΔE1 = gβB + a/2

ΔE2 = gβB - a/2ΔE1 – ΔE2 = a

ΔE1 ΔE2

-½

+½

Ms

MS=±½

ElektronS (½)

JezgroI (1)

Izborna pravilaΔMS = ±1 (elektron)

ΔMI = 0 (jezgro)

B

“triplet”

a

HHiperfino sprezanjeiperfino sprezanje

E = gβBSz + (hA0)SzIzE = gβBSz + (a)SzIz(hA0 (Hz) -> a (G) g-faktor)

-½

+½

Ms

ΔE1 ΔE2 ΔE3

+1

-1

-1

+1

MI

+0

+0

ΔE1 = gβB + aΔE2 = gβBΔE3 = gβB - a

HiperfinoHiperfino cepanjecepanje EPR EPR linijalinija2I + 1 (2I + 1 (1414N, I=1)N, I=1)

EPR spektar Tempona (14N)

Strukturna formula molekula nitroksida= stabilni slobodni radikal

Tempon

Da utvrdimo ...Da utvrdimo ...

ŠŠta ta ćće se desiti ako e se desiti ako 1414N zamenimo sa N zamenimo sa 1515N ???N ???

15N-PDT

• 15N je I=1/2, tj. moguće vrednostimagnetnog momenta su -1/2 i 1/2). Postoje sada dva dozvoljana prelaza i samo 2 linije

• Zamenom običnog vodonika deuteronima, (manji gN -faktor) manje je super hiper finocepanje (dodatno se smanjuje širina linija)

EPR spektar

Možemo detektovati i meriti slobodne radikale i paramagnetne vrste

• Visoka osetljivost (nanomolarne koncentracije)• Nema "pozadinskih" mešajućih signala• Kvalitativna & kvantitativna tehnika

Zašto EPR?

Načini detekcije

Vrste koje imaju nesparen elektron same po sebiPrimer: semihinoni, nitroksidi, prelazni metali ...

Vrste koje se mogu detektovati tehnikom spin-trapingaVrste: superoksidni, hidroksilni, alkil, NO radikali ...Spin-trapovi: DMPO, DEPMPO, EMPO ...

• Pozicija pikova (g-faktor)• Multipletnost (hiperfina interakcija)• Oblik linije (širina linije, simetrija, itd.)• Intenzitet (amplituda/površina pika)

Sve ovo se koristi kao "otisak prsta" prilikom identifikacije vrste i količine ispitivane vrste

ŠŠta se meri pomota se meri pomoćću EPRu EPR--a?a?

ampl

ituda

širina linije cepanje linija

Primeri primene EPRPrimeri primene EPR

Prelazni metali (Mn, Fe, itd..)Delokalizovani elektroniSpinske probe i spinski obeleSpinske probe i spinski obeležživaivaččiiSlobodni radikaliSlobodni radikaliEPRI EPRI In vivo EPR spektroskopijaIn vivo EPR spektroskopija

ManganMangan55Mn (I =5/2)

2I+1 pravilo = 6 linijaMn+2/MgO (1:500)

Uklanjanje spin-spin interakcije

Spinske probe i spinski Spinske probe i spinski obeleobeležživaivaččii

Spinske probe – stabilni (dugoživeći) slobodni radikali (nitroksidi) koji se ubacuju u sistem da bi se ispitala neka osobina

Spinski obeleživači (spin labels) – nitroksidi vezani za druge molekule – praćenje ponašanja obeleženih molekula

Sterno zaklanjanje reaktivne grupe

Modifikacija osobina ‘ručka’

-½

+½

Spinske probe i obeleSpinske probe i obeležživaivaččii(EPR spektri)(EPR spektri)

TEMPONE

EPR spektar

• Paramagnetni elektron spin-labela se nalazi u sp3

orbitali između N i O. IN=1, a IO=0. • Jezgro sa spinom 1 ima 3 moguće vrednosti magnetnog

momenta (+1,0,-1) pa dolazi do cepanja oba energetska nivoa elektrona (mS =1/2 i mS =- 1/2) na po tri.

• Iz jednačine ∆E = gβeB, vidimo da razlike u energiji vode ka različitim rezonantnim uslovima.

• Na osnovu izbornog pravila ΔmS=±1 (spinski nivoi) i ΔmI=0 (Zemanovi nivoi) moguća su 3 prelaza, pa postoje i 3 linije.

* Svaka linija je i dodatno proširena usled interakcije sa protonima (I=1/2) iz susednih CH3 grupa (super hiper fina interakcija), vide se i 13C (I=1/2) sateliti ... ali, polako

MS=±½

B“triplet”

a

ΔE1 ΔE2 ΔE3

+1

-1

-1

+1

MI

+0

+0

MI

KretanjeKretanje lipidalipida u u membranimembrani

Termalni pokretihidrofobnog dela

Uređenost unutrašnjosti membrane

Transverzalno kretanjeflip-flop

Lateralno kretanje lipidadifuzija

Fosfolipidne membrane kao modeli za ispitivanje Fosfolipidne membrane kao modeli za ispitivanje osobina membranaosobina membrana. S. Spontano ili indukovano formiranje pontano ili indukovano formiranje

fosfolipidnogfosfolipidnog dvoslojadvosloja

Planarne membrane (Planarne membrane (black film)black film)

Problem je šta sa krajevima, pa se krajevi zakače za nešto

SUV (out-in 65-35%)

Liposomi (lipidne vezikule)spontano ili sonifikacija

LUV (out-in 50-50%)Small or large unilamellar vesicles

MLVMultilamellar vesicles

EM multilamelarne Goldžijeve strukture

LipozomiLipozomi -- uređenost i fazni prelazi uređenost i fazni prelaziEPR spinske probeEPR spinske probe

Selektivno obeležavanje pozicije duž lanca

Uticaj pokretljivosti spinske probe na izgled EPR spektra

DS u vodi

DS u membrani

Određivanje faktora uređenosti S fosfolipidnog dvosloja metodom EPR spinskih proba

Fazni prelaz = gel (uređeno) ↔ neuređeno (tečni kristal)

ŠŠta se deta se deššava sa EPR spektrima spinava sa EPR spektrima spin--labela labela kada se ugrade u membranu ???kada se ugrade u membranu ???

C

O OH

ON

O

++

++ HH22OOU vodenom rastvoru

7-DS

Integrisan u membranu

• Ukupan spektar 7DS-a ugradjenog u membranu potpuno odudara od onog iz rastvora. Do toga dolazi zbog anizotropije.

77--DS u membraniDS u membraniMembrana ima delimiMembrana ima delimiččno kristalni karakter pa utino kristalni karakter pa utičču i u i gg i i aa anizotropija. anizotropija. Molekul 7Molekul 7--DS pokazuje aksijalnu simetriju i pretpostavka je da moDS pokazuje aksijalnu simetriju i pretpostavka je da možže slobodno da rotira oko te ose pa e slobodno da rotira oko te ose pa se efekti anizotropije gube u xyse efekti anizotropije gube u xy--ravni, tj Bravni, tj Blocloc je ujednaje ujednaččeno u toj ravni pa se x i y osa eno u toj ravni pa se x i y osa ““izjednaizjednaččavajuavaju””..Bitno je u kakvom je poloBitno je u kakvom je položžaju u odnosu na spoljaaju u odnosu na spoljaššnje magnetno polje postavljena osa molekula nje magnetno polje postavljena osa molekula (paralelna sa z) u odnosu na vektor spolja(paralelna sa z) u odnosu na vektor spoljaššnjeg mag. polja. Za gnjeg mag. polja. Za g--anizotropiju vaanizotropiju važži da je i da je gg┴┴=1/2(g=1/2(gxx+g+gyy) ) ii ggzz=g=g||||, a za , a za aa anizotropijuanizotropiju aa┴┴=1/2(a=1/2(axx+a+ayy) ) ii aazz=a=a||||Zbog razliZbog različčitih itih gg┴┴ i i gg||||, i , i aa┴┴ i i aa|||| vrednosti dobijamo razlivrednosti dobijamo različčite spektre za dve idealne situacije: kada je ite spektre za dve idealne situacije: kada je osa molekula normalna u odnosu na B i kada je paralelna sa Bosa molekula normalna u odnosu na B i kada je paralelna sa B

Naravno, kada je spin-label u membrani mi u jednom uzorku imamo obe situacije pa dolazi do superponiranja spektara i dobija se dobro poznati spektar.

g⊥ = ½(gxx + gyy)

A⊥ = ½(Axx + Ayy)

34203400338033603340332033003280

0,003

0,002

0,001

0

-0,001

-0,002

||

3440342034003380336033403320

0,006

0,004

0,002

0

-0,002

-0,004

⊥

g// = gzz

A// = Azz

3 4 4 03 4 2 03 4 0 03 3 8 03 3 6 03 3 4 03 3 2 0

0 , 0 0 6

0 , 0 0 4

0 , 0 0 2

0

- 0 , 0 0 2

- 0 , 0 0 4

⊥3 4 2 03 4 0 03 3 8 03 3 6 03 3 4 03 3 2 03 3 0 03 2 8 0

0 , 0 0 3

0 , 0 0 2

0 , 0 0 1

0

- 0 , 0 0 1

- 0 , 0 0 2

| |

┴&||

2A||

2A┴

5,7,125,7,12--DS u membraniDS u membraniŠŠto je fluidnost veto je fluidnost većća, molekuli se slobodnije krea, molekuli se slobodnije krećću pa dolazi do postepenog gubitka anizotropije i spektar je sve u pa dolazi do postepenog gubitka anizotropije i spektar je sve slisliččniji onom iz rastvora. niji onom iz rastvora. SSpektri za dve ekstremne situacije postaju identipektri za dve ekstremne situacije postaju identiččni, a ukupni spektar uni, a ukupni spektar užžii ––zazaššto ???to ???

ŠŠirina spektralnih linija irina spektralnih linija = = (2(2ττ11))--11 + (1 + + (1 + γγee22BB11

22ττ11ττ22))1/21/2 ττ22--11 gde sugde su::

ττ11 i i ττ22 longitudinalno i transverzalno relaksaciono vreme,longitudinalno i transverzalno relaksaciono vreme, BB11 je magnetna komponenta ulaznog zraje magnetna komponenta ulaznog zraččenja)enja); ; γγee je je žžiromagnetni odnosiromagnetni odnos..

ττ11 opisuje gubitak magnetizacije, relaksaciju koja nastaje kroz opisuje gubitak magnetizacije, relaksaciju koja nastaje kroz proces gde proces gde apsorbovana energija prelazi u toplotu apsorbovana energija prelazi u toplotu ((spinspin--rereššetkaetka relaksacijarelaksacija)). . ττ22 opisuje gubitak magnetizacije kroz gubitak faze, energija opisuje gubitak magnetizacije kroz gubitak faze, energija se se prenosi sa elektrona na prenosi sa elektrona na elektron (spinelektron (spin--spin relaksacija) spin relaksacija)

ŠŠirina linije irina linije je uje u principu obrnuto proporcionalna brzini relaksacije.principu obrnuto proporcionalna brzini relaksacije.

Kada je membrana rigidnija, spinovi su bliKada je membrana rigidnija, spinovi su bližži jedan drugome takoi jedan drugome takoda lakda lakšše dolazi do spinske difuzije, a vee dolazi do spinske difuzije, a većći broj sudara doprinosii broj sudara doprinosispinspin--rereššetkaetka relaksaciji. Relaksacija je tada brrelaksaciji. Relaksacija je tada bržža, a linije a, a linije ššire. ire. Kada se poveKada se povećća mobilnost molekula (spina mobilnost molekula (spin--labellabel--a) u membrani a) u membrani relaksacija ide sporije, pa su i linije urelaksacija ide sporije, pa su i linije užže. Ovo je joe. Ovo je jošš jedan faktor, jedan faktor, osim anizotropije, koji daje direktnu vezu izmedju fluidnosti osim anizotropije, koji daje direktnu vezu izmedju fluidnosti membrane i membrane i šširine spektralnih linija.irine spektralnih linija.

Fluidnost membrane se poveFluidnost membrane se poveććava od povrava od površšine prema ine prema unutra. Polarne glave su relativno gusto spakovane na unutra. Polarne glave su relativno gusto spakovane na povrpovrššini, mini, međusobno se privlaeđusobno se privlačče ili odbijaju i interaguju e ili odbijaju i interaguju sa vodom u okolini. Od njih se prema sredini membrane sa vodom u okolini. Od njih se prema sredini membrane prupružža(ju) masnokiselinski lanac koji nepolaran. U blizini a(ju) masnokiselinski lanac koji nepolaran. U blizini glave on je slabo pokretan. Mglave on je slabo pokretan. Međutim eđutim ššto se ide dalje od to se ide dalje od polarnog dela, hidrofobni rep je sve slobodniji i tu se mopolarnog dela, hidrofobni rep je sve slobodniji i tu se možže e uouoččiti veiti većća fluidnost.a fluidnost.

OdređivanjeOdređivanje ffazniaznihh prelaza lipidnog dvoslojaprelaza lipidnog dvoslojametodom metodom EPR EPR spinspin obeleobeležžavanjaavanja

7-DS

T = 20 °C

T = 75 °C

Fosfolipidi

Spinska proba

temperatura

SGel – ispod faznog prelaza

Tečni kristal – iznad faznog prelaza

+

LipozomiLipozomilateralnalateralna difuzijadifuzija fosfolipidafosfolipida

Spin-spin širenje

Bliski kontakt spinova dovodi do širenja linije i indukuje da su obeleženi fosfolipidi u kontaktu

Pojavljivanje tri linije ukazujena ‘razblaživanje’ lateralnom difuzijom

LipozomiLipozomiflipflip--flopflop--

fosfolipidafosfolipida

vreme

1

0.5

Asc na 0oC

Asc na 30oC

Od svih proteina okoOd svih proteina oko 30%30% su membranski proteinisu membranski proteini

Do sada je poznata strukturaDo sada je poznata struktura ≈≈25,00025,000 proteina, ali samo proteina, ali samo ≈≈8080membranskih proteinamembranskih proteina

Primeri Primeri membranmembranskihskih proteinproteina poznate strukturea poznate strukture::

FFotosotosiintetntetski rski reaeakckcionioni centrii centri1988 Nobel Prize in Chemistry:1988 Nobel Prize in Chemistry: DeisenhoferDeisenhofer, Huber and Michel, Huber and Michel

RodopsinRodopsiniiββ--burebure mmembranembranskiski pproteinroteiniiMembranMembranskiski kanali kanali ((i.e.i.e. KcsAKcsA, AQP), AQP)

2003 Nobel Prize in Chemistry:2003 Nobel Prize in Chemistry: AgreAgre and MacKinnonand MacKinnonCCiitohrometohrome C C oksidazeoksidaze

Ili šta sve treba uraditi i koliko se namučiti da bi se dobila struktura proteina, naročito ako je to membranski protein?

EPR i EPR i strukturastruktura proteinaproteina

ŠŠta je problem u određivanju ta je problem u određivanju strukture membranskih proteinastrukture membranskih proteina??

ZaZašštoto??

XX--zracizraci: : ““nnemaema”” kristala membranskih proteina, jer jekristala membranskih proteina, jer je struktura struktura određena interakcijama u membrani određena interakcijama u membrani NMR: membrane NMR: membrane susu anizotropanizotropnini ssiistemstemii

-- NMR NMR spektrispektri visokevisoke rezolucijerezolucije se se mogumogu dobitidobiti samosamo za proteine u za proteine u micelama, ali ne i u lipozomimamicelama, ali ne i u lipozomima

-- ObogaObogaććivanje sa ivanje sa 1313C and C and 1515NN je neophodnoje neophodno ((komplikovano i komplikovano i izuzetno skupoizuzetno skupo))

••DDifrakcija ifrakcija XX--zrakazraka ii NMR NMR susu ““standardstandardnene metmetooddee”” u određivanju strukture u određivanju strukture proteinaproteina

••Ove tehnike nisu najbolje reOve tehnike nisu najbolje reššenje za određivanje strukture membranskih enje za određivanje strukture membranskih proteina.proteina.

SiteSite--Directed Directed sspepekktrostroskopijakopijaIspitivani Ispitivani protein: protein: M13 coat proteinM13 coat protein

50 amino 50 amino kiselinskih ostatakakiselinskih ostatakaTransmembranTransmembranskiski proteinprotein

SpeSpekktrostroskopija bazirana na kopija bazirana na sitesite--directed directed mutagenemutagenezzii-- Kao mesto obelezavanja koristi seKao mesto obelezavanja koristi se CysCys

-- PoPoččinje se sa proteinom bezinje se sa proteinom bez CysCys-- PrPripremi se mutant sa jednomipremi se mutant sa jednom CysCys (relativno bezbedne mutacije(relativno bezbedne mutacije CysCys

zamenjujezamenjuje AlaAla, , SerSer, , iliili ThrThr-- CysCys se obelese obeležži podobnim obelezivai podobnim obelezivaččem zaem za EEPPRR iliili fluorescenfluorescentnu tnu

spektroskopijuspektroskopiju-- Protein se ubaci u fosfolipidni dvoslojProtein se ubaci u fosfolipidni dvosloj

M13 M13 pproteinrotein sa prikasa prikaččenim spinskim enim spinskim obeleobeležživaivaččemem

Konsekutivnoobeležavanje i merenje na pojedinoj lokaciji

membrana-vodainterface

Pretpostavljena struktura

ObeleObeležžavanje spinskim obeleavanje spinskim obeležživaivaččemem1

50

ZNAČI:• Na Cys se nakači spin-label• Može se raditi i izmena Ala, Ser ili Thr sa Cys (pravljenje proteina-mutanata)

• Analiza EPR spektara dobijenih labela može nam pomoći da odredimo strukturu membranskih proteina.

• Evo kako se to radi ...

S

HN

NOO

O

•

+N

NOO

O

• S

5-maleimido-proxylspin label

Cys EPR aktivnaAK

Reakcija maleimido-proxyl spin labela sa proteinom koji ima cisteine

ŠŠtata se se događadogađa sasa EPR EPR spektrimaspektrima ??

Slobodna rotacija Ograničena ‘anizotropna’ rotacija

•• EPR informacijeEPR informacije u u zavisnodtizavisnodti odod ppokretljivostokretljivosti pi polarnost okolineolarnost okoline

S

HN

NOO

O

•

+N

NOO

O

• S

5-maleimido-proxylspin label

Cys EPR aktivnaAK

EPR spektar proteinaEPR spektar proteina--mutanatamutanata

16 19

2325

29

34

42

4649

2Azz

• Gustina pakovanja oko spin-labela kojije zakačen za protein, srazmerna je2AZZ u EPR spektru.

• Upotrebom mutant-proteina (zamenom određenih AK sa Cys i kačenjem spin-labela, može se dobiti korisna informacija o okruženju.

Polarni region

OksimetrijaOksimetrija

EPR oksimetrijaEPR oksimetrijaPrincipPrincip::-- Kiseonik je paramagnetik i menja (Kiseonik je paramagnetik i menja (šširi) EPR linijeiri) EPR linijeRedukcijaRedukcija nitroksidanitroksida jeje uspuspoorenarena u u prisustvuprisustvu kiseonikakiseonika

EPR senzoriEPR senzoriNitroksidi i partikule (ugalj, mastilo, LiPcNitroksidi i partikule (ugalj, mastilo, LiPc--kristalkristal litlitijumijum fftaloctalocijaninaijanina))

ZAŠTO MERITI KISEONIK U BIOLOŠKIM SISTEMIMA?In vitro – metabolizam, slobodni radikaliIn vivo - radioterapija tumora, ishemija, inflamacije, reperfuzije

Kako?Kako?Klasičan pristup su elektrode ili merenje proizvodnje (gubitka)Teško ili nemoguće je ovako meriti unutarćelijski kiseonik

Kalibraciona kriva litijum ftalocianina (LiPc) na PO2. (A) Primer kako se širina EPR linije LiPc menja sa pritiskom (0 mm Hg i 35.6 mm Hg O2). (B) Kalibraciona kriva LiPC za različite PO2 pokazuje linearnost.

EPR oksimetrijaEPR oksimetrija--biljkebiljke--

Kalibracija probe(širina linije vs. pO2)

Profil koncentracije kiseonika dužmembrane tilakoida

(selektivno obeležavanje pozicija u membrani)

N2

Princip: Vrši se merenje širine EPR linije neke spinske probe koja zavisi od pO2

EPR spinEPR spin--trappingtrapping

Metoda koja se koristi zaMetoda koja se koristi za““hvatanjehvatanje”” katkokatkožživeiveććihih radikalskih radikalskih vrsta.vrsta.Korste se substance koje zovemo Korste se substance koje zovemo spinspin--trapovi trapovi (hvata(hvatačči spinova)i spinova)S.T. u reakciji sa slobodnim S.T. u reakciji sa slobodnim radikalima prave stabilnije EPR radikalima prave stabilnije EPR aktivno jedinjenje koje se moaktivno jedinjenje koje se možže e detektovati standardnom EPR detektovati standardnom EPR metodom.metodom.

ŠŠta se mota se možže raditi metodome raditi metodom EPREPR kada su u kada su u pitanju kratkopitanju kratkožživeivećći (i (μμss) slobodni radikali) slobodni radikali??

Spin trap = zamka za kratko Spin trap = zamka za kratko žživeivećće radikalee radikale

EPR spinEPR spin--trapovitrapovi

Ima ih veliki broj i predstavljaju veoma unosan biznisCjena – sitnica ! (0.5g = 1000€) Npr.: 0.5g Au ≈ 10€Svake godine na tržištu se pojavi novi trap koji je neznatno bolji od prethodnog

N

O

CH3

CH3

HN

O

CH3

CH3

H

OH

Spin-trap(EPR neaktivna vrsta)

● OH+

Spin-adukt(EPR aktivna vrsta)

Radikal

Princip rada spinPrincip rada spin--trapovatrapova

Postoje razni spinPostoje razni spin--trapovitrapoviRazlikuju se: po hemijskoj strukturi bočne grupe, stabilnosti trapa i adukata, EPR spektru, rastvorljivosti, načinu čuvanja.

Neki su specifični za određene radikale, ali idealni trap bi trebalo da razlikuje više radikala koji se simultano proizvode u istom sistemu

Eksperimenti i kompjuterske simulacije su ukazale na postojanje reaktivnog vodonika (H-radikal) kod različitih

bioloških sistema (Mojović et.al.)

Postojanje reduktivne vrste u produkciji radikala ukazuje na moguće regulacione mehanizme u toku oksidatvnog stresa, ulogu radikala u nekim bolestima itd.

Primer: uloga slobodnih radikala kod amiotrofične lateralne skleroze (ALS)

Normalna osoba

ALS pacijent

Kompjuterska simulacija OH i H radikala

Kod ALS pacijenata postoji povećana produkcija ‘zlih’·OH radikala koja nije regulisana proizvodnjom ‘dobrih’ ·H radikala

EPR spin-trap spektri likvora

Prednosti i mane EPR Prednosti i mane EPR spinspin--trappingatrappinga

MoMožžemo detektovati emo detektovati veoma kratkoveoma kratkožživeivećće e radikalske vrsteradikalske vrsteMoMožžemo razlikovati viemo razlikovati višše e vrsta koje se prave u vrsta koje se prave u istom sistemuistom sistemuPotrebne male koliPotrebne male količčine ine uzorka (uzorka (μμl)l)Relativno jednostavna Relativno jednostavna eksperimentalna tehnikaeksperimentalna tehnika

Relativno su skupiRelativno su skupiVeVeććina se mora ina se mora naknadno prenaknadno preččistiti istiti ššto to dodatno povedodatno poveććava cenuava cenuSpektri razliSpektri različčitih adukata itih adukata se se ččesto delimiesto delimiččno no preklapajupreklapajuSimulacije EPR spektara Simulacije EPR spektara je dosta teje dosta tešško izvesti sa ko izvesti sa 100% ta100% taččnonostisti

PREDNOSTI MANE

IN VIVO EPRIN VIVO EPR

MRI EPR

Da! Ali postoji jedan "mali" problem!

Biološki uzorci su "vodeni" i zbog toga podležu nespecifičnoj (nerezonantnoj) apsorpciji mikrotalsne energije, zato je dubina prodiranja mikrotalasa u uzorak mala. Ako povećamo mikrotalasnu snagu, dubina prodiranja se povećava ali .......

Da li možemo koristiti EPR u biološkim sistemima"in vivo" ili "ex vivo" ?

FreFrekvencijakvencija ~300 MHz~300 MHz ~750 MHz~750 MHz 11--2 GHz2 GHz ~3 GHz~3 GHz 99--10 GHz10 GHz

Dubina Dubina prodiranjaprodiranja

> 10 cm> 10 cm 66--8 cm8 cm 11--1.5 cm1.5 cm 11--3 mm3 mm 1 mm1 mm

BioloBiološški uzorarki uzorar Ljudi, pacovLjudi, pacov Pacov, miPacov, mišš MiMišš, , srce pacovasrce pacova

MiMiššiji rep, iji rep, kokožžaa

Uzorci "Uzorci "in vitroin vitro""(~100 (~100 μμll))

Problem dubine prodiranja se može rešiti i smanjenjem frekvencije mikrotalasa.

Da, ali smanjenje frekvencije smanjuje vrednost B0 a time i osetljivostNema EPRI za ljude i verovatno ga nikada neće ni biti :(EM zračenje slabi zbog dielektričnih gubitaka (B prolazi ali ne E jer mi nismo čista voda)

hν = gβBo

EPRIEPRI((Electron ParamagneticElectron Paramagnetic RResonance esonance IImaging)maging)•• Dobijanje slika Dobijanje slika pomopomoććuu EPREPR--a ( Spectrala ( Spectral--spatial CWspatial CW--EPRI):EPRI):

Kako saznati prostorni polozaj pramagnetnih vrsta?Princip je menjati orjentaciju gradijenta magnetnog polja u odnosu na uzorak i zatim uraditi rekonstrukciju slike.

Zavisnost oblika EPR signala iz 2 rastvora nitroksida od smeragradijanta magnetnog polja B.

Kako napraviti sliku u više od1 dimenzije?Praviti gradijente B duž svihosa (X,Y,Z).Problemi?Uzorci često nemaju samo 1 pik (kao H u NMR-u) a i širinasignala utiče na preklapanjepikova.Sta je dobro?Može se praviti image biločega što utiče na EPR spektar (ne samo 3D image već + nova dimenzija kaoosobina sistema ). SpectralSpectral--spatial Xspatial X--band CWband CW--EPR imageEPR image

KakoKako to to stvarnostvarno izgledaizgleda??

MRI MRI v.sv.s. EPRI . EPRI PostojePostoje bitnebitne razlikerazlike u u osobinamaosobinama jezgarajezgara i i elektronaelektrona ((žžiromagnetniiromagnetni odnosiodnosi, , hiperfinehiperfinekonstantekonstante cepanjacepanja, , relaksacionarelaksaciona vremenavremena).).ZbogZbog toga se toga se MRI MRI uvekuvek izvodiizvodi u u pulsnompulsnom rerežžimuimu (RF(RF--pulspuls + + frekventnifrekventni, , faznifazni i "slice" i "slice" gradijentigradijenti magnetnogmagnetnog poljapolja, , uzuz raznerazne sekvencesekvence tipatipa spinspin--ehoeho.., 2D FT i .., 2D FT i rekonstrukcijerekonstrukcijeslikeslike iziz vokselavoksela..EPRI se EPRI se ččestoesto izvodiizvodi u CW u CW rerežžimuimu uzuz rotirajurotirajuććee magnetnemagnetne gradijentegradijente..MRI MRI imaima do 10do 1066 putaputa veveććuu koncentracijukoncentraciju spinovaspinova u u sistemusistemu, , kaokao i do 10i do 1066 dudužžeerelaksacionorelaksaciono vremevreme zaza tete isteiste spinovespinove..ProseProseččnana šširinairina EPR EPR pikovapikova jeje znatnoznatno veveććaa u u odnosuodnosu nana rarasspolopoložživiv opsegopsegmagnetnogmagnetnog poljapolja u u odnosuodnosu nana NMR signal H NMR signal H kojikoji se se posmatraposmatra u MRI.u MRI.PulsniPulsni EPRI EPRI zatozato zahtevazahteva vrlovrlo preciznupreciznu i i naprednunaprednu elektronikuelektroniku uzuz brzebrze raraččunareunare kojikojiććee zadavatizadavati sekvencesekvence i i dedeššifrovatiifrovati dobijenedobijene rezultaterezultate. .

EPR i tumoriEPR i tumori in vitroin vitro

Objekat:Sferoidi (model za solidne tumore)

Cilj:Ispitivanje viabilnosti tumora

Tehnika:X-band EPRI

Senzor: 15N-PDT (sve ćelije)‘Kontrastni agens’:Fe (‘mrtve’ ćelije)

EPRIprimena

200μm

15N-PDT ulazi svuda a Fe-kompleks ulazi samo u mrtve ćelije (a ne i u žive).

In vivoIn vivo spektroskopijaspektroskopija--ppovrovrššinska zavojnicainska zavojnica--

- Princip EPR snimanja putem korišćenjapovršinske zavojnice- Dubina prodiranja bitno zavisi od frenvencijemikrotalasa (dielektrične osobine i E vektor EM zračenja)- Koriste se manje frekvencije mikrotalasa (svesmo bliže RF oblasti) (L, S, X band).- Da se podsetimo:1-2 GHz (L-oblast), 2-4GHz (S-oblast), 8-10 GHz (X-oblast), 35 GHz (Q-oblast) i 95 GHz (W-oblast)

Surface-coil resonator

IN VIVOIN VIVO spektroskopijaspektroskopija--KOKOŽŽAA--

Slobodni radikal idukovan antralinom (lek za psorijazu)

- Psorijaza: Autoimuno oboljenjekože čili je uzrok nepoznat(veruje se da ima genetskukomponentu).- Jedan od načina tretmanaprotiv ove bolesti je tretmanpomadama koje sadržedithranol (anthralin).- Proučava se delovanjeAntralina koji u interakciji saodređenim supstancama u kožistvara slobodne radikale. Kakoih izmeriti?- Koristi se L-band EPR oblast i površinska zavojnica koja se stavlja direktno na kožu- Upotrebljava se eksperimentalni nude-mouse

Osoba obolela odpsorijaze

Nude mouse

EPR oksimetrijaEPR oksimetrijapOpO22 u srcuu srcu

Ex vivo EPRI merenja u uslovima perfuzije nitroksidima

- Zašto i kako meriti kisonik?- Ishemija, hiperoksija, reperfuzija i oksidativni stres su najvažnije stvari koje trebapratiti u živim sistemima. Uzročnici su i posledica velikog broja patoloških stanja.

- Moze li nam ovde MRI pomoći? Teško.- Langendorfova preparacija srca. U rastvor za preparaciju ubačen nitroksid.- Signal se razlikuje jer odr. delovi srca imaju razl. količinu O2 (paramagnetik)- Uraditi EPRI snimanje, a kao dimenziju uzeti širinu EPR linije

EPR oEPR oksimetrijaksimetrija. . LokalizovaneLokalizovane ((implantiraneimplantirane) ) EPR EPR oksimetrijskeoksimetrijske probe (pOprobe (pO22))

Simultano merenje pO2 na 2 mesta u mozgu korišćenjem LiPC kristala

T2* - nagnašena MRI slika mozga u koji su implantirani LiPC (po jedan u

stvaki rezanj mozga). Tamne regije su veće od veličine LiPC kristala(<100 μm) zbog namerno izazvanih artefakata susceptibilnosti

-Subjekat: Mongolski gerbils-Nekopletan Willisov krug dozvoljavaindukciju ishemije samo jedne strane mozgaunilateralnom karotidnom okluzijom-Metod za praćenje ishemije

EPR spektar dva LiPC kristala u dva režnja odražavarazliku pO2 nakon unilateralne karotidne okluzije.

Gradijant magnetnog polja

In vivoIn vivo EPR EPR oksimetrijaoksimetrija, , obeleobeležžavanjeavanje, , tumoritumori, , radioterapijaradioterapija

Tumori: Zračenjem izazvan fibrosarcoma RIF-1 i mammary adenocarcinomaMTG-B koji su zatim implanirani u miša.Površinske zavojnice EPRS na 1.2 GHz; Oksimetrijska proba: Fusinit Zračenje: jedna doza od 20 Gy

Količina kiseonika u tumoru je ključni faktor za uspešnu radioterapiju

Post-radijacionadeoksigenacija i reoksigenacija tumora zavisiod tipa tumora(prokrvljenosti?)

Personalizovana radioterapija?

20 Gy

Ali ...$$$$$$$ po pacijentu

Kombinovana MRI & EPRI tehnika za proučavanjeROS upotrebom hidroksilamina

- Oksidativni stres koji je izazvanreperfuzijom. - EPR signal dobija se tekoksidacijom hidroksilamina koji nijeEPR aktivna vrsta a koji se injektuje u miša pre ishemije.- Poređenjem MRI i EPRI slike možese lokalizovati ishemično mesto i izvršiti kiseonično mapiranje.

EPR i NMR slike mišakoji je doživeo šlog

NMR slika EPR slika

PreklopljenaEPR/NMR slika

Kisonično mapiranje mišjegmozga tokom ishemije