Enzimska kinetika

Enzimska aktivnost, kinetika

• Pod enzimskom aktivnošdu se podrazumeva osobina enzima da određenom brzinom katalizuje transformaciju supstrata u proizvod.

• Brzina kojom određeni enzim katalizuje transformaciju supstrata je karakteristična za određeni sistem enzim-supstrat ali zavisi od više različitih faktora.

• Enzimska kinetika se bavi proučavanjem brzine kojima se odigravaju enzimski katalizovane reakcije.

Enzimska kinetika

• Daje uvid u :

1. Koncentraciju enzima u nekoj smeši (npr. homogenat tkiva)

2. Čistodu enzima (Specifična aktivnost)

3. Efikasnost katalize i specifičnost za različite supstrate

4. Razlike u aktivnosti izoformi jednog enzima

5. Efekte koje različiti inhibitori ispoljavaju na enzim..

• Proučavanje brzine enzimski katalizovane reakcije najčešde se sastoji u tome da se u reakcionoj smeši u kojoj se nalaze enzim i supstrat pod odgovarajudim uslovima (pH, temperatura), nekom za to podesnom metodom prati promena koncentracije proizvoda ili supstrata

• Pri ovim merenjima se često zapaža da kako protiče vreme trajanja reakcije to se u toku jedne vremenske jedinice dobija sve manje i manje proizvoda odnosno troši se sve manje supstrata, pa dijagram reakcije izgleda ovako.

• Metoda za određivanje brzine na osnovu ovog dijagrama (diferencijalna metoda), sastoji se zapravo u povlačenju tangente na krivu toka reakcije u određenom vremenu.

• Iz krive toka reakcije vidi se da je brzina najveda na samom početku reakcije u vremenu t0 (za svako drugo vreme tangens ugla je manji).

Određivanje inicijalne brzine V0

• Zašto određujemo inicijalnu brzinu V0 ?

• Problem: Kako se S prevodi u P, koncentracija S se smanjuje pa se brzina reakcije se smanjuje, uz to kako se koncentracija P povedava brzina povratne reakcije se povečava sve do trenutka kada Vf = Vr tj reakcija je u ravnoteži d[P]/dt = 0.

• Rešenje: Merimo brzinu reakcije u početnom delu reakcije, tj kada se koncentracija supstrata jos uvek nije značajno promenila , [P] = ~0

• Dakle inicijalna brzina V0 predstavlja brzinu izmerenu odmah po mešanju supstrata i enzima

Određivanje inicijalne brzine V0

• Određivanje početne brzine ima sledede prednosti:

1. Enzim i supstrat se nalaze u svojim maksimalnim koncentracijama

2. Čitava količina enzima se nalazi u nativnom stanju, nema uticaja koji bi dovodili do denaturacije enzima

3. Koncentracije proizvoda su male i ne mogu uticati na tok reakcije (izbegava se inhibicija proizvodom i reverzibilne reakcije)

Treba imati u vidu da kriva toka reakcije praktično predstavlja pravu liniju sve dok transformacija ne prelazi 20% ukupne količine supstrata !!!!

• Početne brzine neke enzimski katalizovane reakcije obično se određuju za više različitih koncentracija supstrata uz konstantnu koncentraciju enzima, isti pH i temperaturu, da bi se dobio kvantitativni izraz za konstantu brzine reakcije

• Grafička analiza odnosa bzine i koncentracije supstrata veoma je korisna za određivanje parametara koji karakterišu enzimski katalizovanu reakciju

Hiperbolična zavisnost

Kinetički parametri

1. Km – Mihaelis-Mentenova konstanta povezuje koncentraciju supstrata i brzinu enzimski katalizovane reakcije

2. kcat -katalitička konstanta povezuje maksimalnu brzinu enzimski katalizovane reakcije Vmax i koncentraciju totalnih aktivnih mesta Et

3. kcat /Km – katalitička efikasnost

Kinetički parametri se određuju grafičkim metodama putem merenja brzina enzimski katalizovanih reakcija pri različitim koncentracijama supstrata

Jedinice i načini izražavanja enzimske aktivnosti

• IU (International Unit) ,IUB 1961 – označava količinu enzima koja katalizuje transformaciju jednog mikromola supstrata u minutu po standardnim uslovima.

• Katal – količina aktivnosti koja katalizuje transformaciju jednog mola supstrata u sekundi i podesna je za karakterizaciju enzimskih preparata

• Molekulska aktivnost enzima – definiše se kao broj molekula supstrata koji se transformiše u toku jednog minuta po jednom molekulu enzima, često se srede i kao pojam “turnover number”

• Kcat - Katalitička konstanta – broj molekula supstrata koji u jednom minutu reaguje s jednim aktivnim centrom

• Specifična aktivnost (IU/mg)– je aktivnost koji ispoljava količina nekog enzimskog preparata (broj mikromolova supstrata u minutu po miligramu enzimskog preparata), može se izražavati i kao Kat/kg. U praksi ima značajnu primenu u određivanju čistode enzimskog preparata.

• Koncentracija enzimske aktivnosti IU/ml ili Kat/ml – aktivnost koju pokazuje ml enzimskog preparata. Ima značajnu primenu u biologiji i medicini.

Metode za određivanje enzimske aktivnosti

• Klasifikuju se na osnovu poluvremena trajanja reakcije:

1. Metode stacionarnog stanja t1/2 > 10s

2. Protočne (flow) tehnike t1/2 ~ 10-3s

3. Relaksacione metode t1/2 < 10s

Nalčešde se primenjuju tehnike stacionarnog stanja. Poluvreme reakcije od par sekundi do nekoliko dana omogudava primenu proste laboratorijske tehnike. U praksi kada se govori o određivanju aktivnosti enzima najčešde se misli na metodu stacionarnog stanja “enzyme assay” – enzimski test

Zavisnost početne brzine od koncentracije supstrata kinetika stacionarnog stanja

U toku stacionarnog stanja po definiciji, koncentracija kompleksa enzim supstrat jeste konstantna.

K1 · E · S – brzina nastajanja kompleksa K-1 · ES – brzina disocijacije kompleksa K2 · ES – brzina razlaganja kompleksa

Anri - Michaelis - Mentenova hipoteza Brigs-Haldejnova hipoteza - u vremenu dovoljnom za određivanje brzine reakcije nema promene koncentracije intermedijera ES.

• Km i V (odnosno V po jediničnoj koncentraciji enzima, V/Et) su fundamentalne karakteristike enzima koje se eksperimentalno određuju. Km je prividna konstanta disocijacije za ES kompleks ,što treba imati u vidu pri ispitivanju uticaja raznih faktora na njenu vrednost, jer promena u Km ne mora da znači promenu u vezivanju supstrata za enzim nego promenu u nekoj od konstanti brzina koje učestvuju u Km.

• Michelis-Menten krivulja nije najprecizniji način za izračunavanje tih konstanti, pa su za tu svrhu osmišljeni prikladniji linearni prikazi dobijeni transformacijama Michaelis-Menten jednačine.

Lineweaver-Burk prikaz - predstavlja recipročni oblik Michaelis-Menten jednačine i glasi:

1/v0 = Km /V[S] + 1/Vm

Eadie-Hofstee prikaz - jednačina izvedena množenjem Lineweaver-Burk jednčine s v0Vm i glasi:

v0 = -Kmv0/[S] + Vm

Hanes-Woolf prikaz Množenjem Lineweaver-Burk jednačine sa [S] :

[S]/v0 = Km/Vm + [S]Vm

Enzimski test

• Sastoji se od inkubiranja enzima i supstrata u optimalnim uslovima i određivanja početne brzine počev od nultog vremena.

• Kriva toka reakcije se može eksperimentalno određivati:

1. Kontinualna metoda – merenja se vrše u samom reakcionom sudu počev od trenutka mešanja reakcionih komponenata. Meri se neka od promena fizičkih osobina supstrata ili proizvoda u vremenu (promena ekstinkcionog koeficijenta, fluorescencije, luminiscencije, koncentracije vodonikovih jona, optičke rotacije itd.) Ova metoda daje dobru aproksimaciju toka reakcije pošto se kriva gradi na osnovu velikog broja tačaka.

2. Diskontinualna metoda - u određenim vremenskim razmacima iz reakcione smese se uzimaju alikvoti u kojima se reakcija smesta zaustavlja nekom podesnom metodom i zatim određuje koncentracija proizvoda.

Metode za pradenje promena koncentracije supstrata ili proizvoda reakcije

Spektroskopske metode:

• Vidljiva i ultraljubičasta spektrofotometrija

• Fluorescentna spektroskopija

Luminometrijske metode

Elektrohemijske metode

Vidljiva i UV spektrofotometrija

• Za pradenje promena koncentracije proizvoda/supstrata potrebno je da proizvod sadrži hromoforu što često nije slučaj (umesto prirodnih se često koriste sintetički supstrati sa hromoforama)

Fluorescentna spektroskopija

• Pojedini molekuli prilikom ozračivanja ultraljubičastom ili vidljivom svetlošdu određenih talasnih dužina emituju zračenje vedih talasnih dužina – Fluorescencija

• Intenzitet ovog zračenja zavisi od količine molekula koji emituje zračenje

• Ako se supstrat i proizvod razlikuju po talasnim dužinama njihove emisione energije, može se primeniti fluorimetrija za određivanje brzine reakcije

• Visoka osetljivost • Problem – ne postoji direktan

odnos između očitane fluorescencije i koncentracije, pa je obavezna konstrukcija standardne krive

• Fluorescencija osetljiva na temperaturne promene i raspršivanje svetlosti u uzorku

Luminometrijske metode

• Visoka osetljivost • Iziskuju konstrukciju

kalibracione krive • Polako ulaze u sve

širu primenu

Elektrohemijske metode

• Ciklična voltametrija

• Potenciometrija

• Polarografija

Merenja pomodu elektroda omogudavaju neposredno i kontinuirano očitavanje određenih promena u reakcionoj smeši pH-stat metode za određivanje aktivnosti

esteraza – hodrolitičko odvajanje kiselina iz estara, otpuštanje vodonikovih jona. Količina baze koju pH-stat titruje u jed. Vremena stehiometrijski odgovara utrošku supstrata

Dizajn enzimskog testa

• Pri postavljanju eksperimenta za enzimski test treba voditi računa o slededem:

• Temperatura, pH i jonska jačina pufera su od odlučujudeg značaja za test i moraju se održavati konstantnim. Trojak uticaj temperature:

1. Promena konstante brzine u skladu sa arenijusovim zakonom

2. Inaktivacija i denaturacija enzima

3. Konformacione promene u enzimu i promene mehanizma

Praktično izvođenje enzimskog testa

• Enzimska aktivnost se izračunava iz izraza izvedenog na slededi način:

𝑨 =𝒏𝒑

𝒕

• gde je 𝑨 aktivnost enzima, np količina nastalog proizvoda do određenog trenutka trajanja reakcije 𝒕.

• Količina nastalog produkta jednaka je proizvodu koncentracije proizvoda reakcije 𝒄 i ukupne zapremine rastvora u kome se odvija reakcija 𝑽𝒖

𝑨 = 𝒄 ∙ 𝑽𝒖

𝒕

𝑨 = 𝒄 ∙ 𝑽𝒖

𝒕

• Pomodu ove formule možemo izračunati ukupnu količinu enzima koju smo dodali u reakcionu smešu.

• Da bismo izrazili aktivnost enzima po jedinici zapremine (koncentracija enzimske aktivnosti) 𝑪 moramo dobijenu vrednost podeliti sa zapreminom alikvota enzima 𝑽𝒂 koji smo dodali iz nekog enzimskog stoka, i pomnožiti je sa razblaženjem 𝑹 (samo ukoliko smo uzimali alikvot iz prethodno razblaženog stoka enzima)

𝑪 =𝑨∙𝑹

𝑽𝒂 =

𝒄∙𝑽𝒖∙𝑹

𝒕∙𝑽𝒂

• Koncentracija proizvoda reakcije se određuje pomodu sledede formule:

𝒄 =𝑨𝝀

𝜺

• gde je 𝑨𝝀 apsorbanca proizvoda na određenoj talasnoj dužini, a 𝜺 je molarni ekstinkcioni koeficijent (spektrofotometrijski esej). Finalni oblik jednačine:

𝑪 =𝑨𝝀 ∙ 𝑽𝒖 ∙ 𝑹

𝜺 ∙ 𝒕 ∙ 𝑽𝒂

Određivanje enzimske aktivnosti – praktični primer

Kvarcne kivete Polistirenske ili akrilne kivete

Ekstrakt enzima snažno apsorbuje na istoj talasnoj dužini kao i supstrat koji se

koristi za određivanje enzmske aktivnosti

𝑪 =𝑨𝝀 ∙ 𝑽𝒖 ∙ 𝑹

𝜺 ∙ 𝒕 ∙ 𝑽𝒂

Izolacija sojeva roda Lactobacillus sa tanaznom i

galat dekarboksilaznom aktivnošću iz silaže

Taninska kiselina

Galna kiselina Glukoza

Pirogalol Tanaza (tanin acil hidrolaza, E.C. 3.1.1.20) pripada serinskim esterazama i

katalizuje hidrolizu estarskih i depsidnih veza u hidrolizabilnim taninima

kompleksnim taninima i estrima galne kiseline

Galat dekarboksilaza (E.C. 4.1.1.59) katalizuje razgradnju galne kiseline do

pirogalola

Otkriće tanaza ima izuzetno veliki značaj za industriju. One igraju važnu ulogu u

industriji pića, hrane, piva, hemijsko-farmaceutskoj industriji, u proizvodnji

životinjske hrane. Takođe, tanaza se koristi u izradi popularnog alkoholnog napitka od

žira (acorn wine), kao i u proizvodnji galne kiseline, koja se kasnije može koristi za

sintezu propilgalata, snažnog antioksidansa (Aguilar i Gutierrez-Sanchez 2001).

Tanaza se koristi kao sredstvo za bistrenje u proizvodnji instant čajeva, nekih vina,

piva, voćnih sokova kao i bezalkoholnih pića na bazi kafe.

Priprema silaže jedan od efektivnih načina za konzervisanje i očuvanje stočne hrane, pri čemu se uglavnom koristi metod spontane fermentacije uz učešde divlje flore prisutne na biljnom materijalu, i u skorije vreme sve češde uz upotrebu selekcionisanih bakterijskih sojeva kao startera. Jedni od antinutritivnih faktora prisutnih određenim biljnim materijalima koji se koriste za siliranje su taninski molekuli, koji u određenim situacijama, pogotovo ako su zastupljeni u visokim koncentracijama, ispoljavaju čitav niz neželjenih dejstava na varenje kod preživara. Iz pomenutih razloga je selekcija bakterijskih sojeva koji poseduju tanaznu aktivnost značajna zbog mogudnosti njihove primene u formulaciji starter kultura za siliranje koje bi bile u stanju da pored obezbeđivanja blagovremene konzervacije silaže i povoljnog uticaja na njen nutritivni sastav, omogude snižavanje koncentracije tanina. Od posebnog je značaja što bi ovakvi starteri omogudili siliranje taninom bogatih biljnih vrsta čija se upotreba do sada izbegavala upravo iz ovih razloga

Izolacija bakterija iz silaže, kravljeg buraga i

fermentisane komine grožđa

Bakterijski sojevi korišdeni u ovom radu uzorkovani iz : spontano fermentisane silaže kukuruza (2 uzorka), buraga goveda (1 uzorak) i buraga koze (1 uzorak) hranjenih istom silažom. Iz fermentisanih komina autohtonih vinskih sorti grožđa: Bojadiser (1 uzorak), Prokupac (1 uzorak), Smederevka (1 uzorak) i Tamjanika (1 uzorak). Za testiranje tanayne aktivnosti takođe je koriščeno 114 sojeva iz kolekcije LMM

Testiranje tanazne aktivnosti sojeva

spektrofotometrijskom metodom

Odabrani sojevi iz kolekcije A450nm Odabrani izolati A450nm

L. plantarum LMG 9208 0,566 SIL 5 0,558

L. plantarum LMG 18027 0,589 SIL 8 0,593

L. plantarum ATCC 14917 0,790 SIL 26 0,553

L. paraplantarum B-23115 0,898 SIL 29 0,548

L. zeae LMG 17315 0,498 SIL 31 0,489

L.plantarum WCFS1 0,678 SIL 37 0,572

L. plantarum BGPV2-45 0,568 SIL 38 0,521

L. plantarum BGHO10 0,559 SIL 40 0,495

SIL 66 0,917

SIL 69 0,888

SIL 71 1,041

SIL 73 0,907

KO 31a 0,631

KO 26a 0,519

KO 26b 0,505

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

A 4

50

nm

t 0min

t 60min

t 120min

t 120min + centr.

Optimizacija eseja za tanaznu aktivnost u cilju preciznije

procene enzimske aktivnosti kod selektovanih sojeva

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

A4

50

mn

Detekcija tanazne i galat dekarboksilazne aktivnosti hromatografijom na

tankom sloju - TLC (Thin Layer Chromatography)

Sekvenciranje 16S

SIL 5

SIL 8

SIL 26

SIL 37

SIL 38 Lb. plantarum

SIL 39

SIL 69

SIL 71

SIL 73

SIL 31 Lb. brevis

SIL 40 Lb. pentosaceus

SIL 66 Lb. casei/pentosaceus

KO 26a

KO 26b Gluconobacter japonicus

KO 31

SIL

5

SIL

8

SIL

26

SIL

29

SIL

37

SIL

38

SIL

39

SIL

31

SIL

69

SIL

71

SIL

73

SIL

66

SIL

40

KO

26a

KO

31

KO

26b

Sekvenciranje fragmenta 16S rDNK i PFGE

Ø

Lb. rh

amno

sus B

GT

10

Lb

. plan

tarum

BG

HO

10

Lb

. plan

tarum

BG

PV

2-4

5

Lb

. pla

nta

rum

WC

FS

1 +

/-

Lb. Z

eae

Lb

. pa

rap

.B23

115

Lb

. pla

nta

rum

14

91

7 +

/+

Lb

. pla

nta

rum

18

02

7

Lb

. plan

tarum

LM

G 9

20

8

Sil 7

3 L

b. p

lantaru

m

Sil 7

1 L

b. p

lan

taru

m

Sil 6

9 L

b. p

lantaru

m

Sil 6

6 L

b. casei/p

ento

saceus

Sil 4

0 L

b. p

ento

saceus

Sil 3

8 L

b. p

lantaru

m

Sil 3

7 L

b. p

lantaru

m

Sil 3

1 L

b. b

revis

Sil 2

9 L

b. p

lantaru

m

Sil 2

6 L

b. p

lantaru

m

Sil 8

Lb

. plan

tarum

Sil 5

Lb. p

lantaru

m

Tan Blp

Tan Alp

Literatura

• Osnovi enzimologije, Đorđe N. Petrovid