KINETIKA ENZIMSKI KATALISANIH REAKCIJA

V.Dondur, 2012/13Predavanje 14.

Jednostavna enzimska reakcija

E + S ES EP E + PE: Enzim

S: Substrat

P: Produkt

ES: enzim-substrat kompleks

EP: enzim-produkt kompleks

Michaelis i Menten mehanizam delovanja enzima (1913)

Primer za

raskidanje

proteina na

manje delove

E0

1 0

ES

dt

d

ESP

2kdt

dv

2

ES E E 0

3

T-total

1,2,3, osnovne pretpostavke pri izvodjenju MM kinetike

Oblast vazenja

stacionarnosti

ESk k SES-Ek 21-01

SEk Sk k kES 01121-

S K

SE ES 0

M 1

21-

k

k k K

M

0ESESSE

ES211 kkk

dt

d

SK

SEES

P 022

M

kk

dt

dv

02max Ek V

SK

SVmax

M

v

• Ako se uzme da je d[P]/dt

= k [E]0 gde je k

efektivna (prividna)

konstanta brzine

• k = k2 [S]/([S] + KM)

• Kriva k vs. [S]

pokazuje da će se za

velike vrednosti [S], k

priblizavati k2

SK

SEES

PP 022

M

kk

dt

d

dt

d

SK

SEES

P 022

M

kk

dt

d 0E

Pk

dt

d

SK

S2

M

kk

SK

S2

M

kk

k/k2

Pred stacionarni i stacionarni režim

• Predstacionarni deo zavisi od k1, k-1, k2

– Tipično (5 millisekundi)

• Mihaelis & Menton jednačina važi u stacionarnom delu

– Pre nego što se proizvod akumulira, i reverzna reakcija postane značajna

Vreme

conc.

[ES]

[E] [E] + [ES] = [E0] = const.

[P]

[S] (>>>[ES])

Ustaljeno stanje

Stacionarni deo aproksimira se sa v0.

Pred stacionarna kinetika: nelinerni deo, [ES] se menja u okolini t = 0...

(vreme koje prethodi uspostavljanju stacionarnosti)

Eksperiment u stacionarnom stanju

Meri se v0 dok je [ES] konstantno tj u ustaljenom stanju

v0

Vmax

[S]0

Meri se početna brzina nastajanja produkta

(ili nestajanja supstrta) za različito [S]0 I crta

grafik v0 = f([S]0 )

[S] [P]

time

Pri različitim početnim

koncentracijama

supstrata menjaće se

svakako brzina nastajanja

proizvoda

Početne brzine se

standardno

odrdjuju iz nagiba

tengente u t0 za

razne [S i]0

SK

SEES

P 022

0

Mt

o

kk

dt

dv

vo je početna brzina

maksimalna brzina

02max Ek V

SK

SVmax

M

ov

Km je koncentracija supstrata

kada je vo jednako polovini

Vmax

Interpretacija osnovnih parametra MM kinetike:

Prvi red reakcije u odnosu na S Nulti red reakcije u odnosu na S

SK

SVmax

M

ov

KM = S V0 = ½ Vmax

If V0 = 1/2Vmax then

½ Vmax = Vmax[S] / (KM + [S])

½ = [S] / (KM + [S])

½ KM + ½ [S] = [S]

½ KM = ½ [S]

KM = [S]

maxmax

M

V

1

S

1

V

K1

ov

Linearizacija MM jednačine da bi se lakse odredili parametri enzimske

kinetike

KM -Mihaelisova konstanta

Turnover broj,broj ponavljanja, kcat

• broj reakcija koje se dese na svakom aktivnom

centru u jedinici vremena, ili broj molekula produkta

koji se stvori po jednom aktivnom centru u jedinici

vremena

•Turn over broj predstavlja formiranje produkta pri

visokoj koncentraciji substrata.

• kcat = Vmax/E0

• kcat = k2 za Mihaelis-Menten ovu kinetiku

• biće znatno kompleksnije za složenije

mehanizme

max 2 0( )V k E

Turnover broj, kcat

Za Mihaelis –Mentonovu kinetiku k2= kcat

Kada je [S] << KM , (nema puno produkta)

cat200

M M

kkE S [ ] S

K Kov E

kcat/KM je konstanta brzine reakcije drugog

reda i približno je mera katalitičke efikasnosti

Katalitička efikasnost: kcat/KM

kcat/KM = k2/KM = k1k2/(k-1 + k2)

za k2>> k-1 maksimalna vrednost ε= kcat/KM = k1

Katalitička efikasnost: ε=kcat/KM

Ukoliko je k1 brzo, brzina reakcije je odredjena difuzijom S i E

Šta je katalitička perfekcija?

Kada je k2>>k-1 ili odnos21

21

kk

kk

maksimalan

Tada je1

MKk

kcat Svaki supstrat koji se našao na

enzimu je reagovao.

Reakcija je samo difuziono kontrolisana, brzina

difuzije je 108 to 109 M-1s-1. Enzim toliko snižava

energiju aktivacije za reakciju da svaki susret

supstrata sa aktivnim centrom dovodi do

reakcije.

INHIBICIJA

EI

IEK I

Inhibitor je supstanca koja se vezuje za enzim I

smanjuje konverziju u produkat. Jačina ove

veze se definiše konstantom stabilnosti, koja u

slučaju direktne veze sa aktivnim centrom

enzima može da se prikaže na sledeći način:

u prisustvu inhibitora I dalje važi MM kinetika. Merene

konstante KM i Vmax su sada prividne (složene)

konstante.

Kinetika inhibicije• Inhibitori- substance koje utiču na aktivnost enzima

– Utiču na vezivanje supstrata

– Menjaju turnover broj, brzinu katalitičke reakcije

• reverzibilni inhibitori interaguju sa nekovalentnim vezama

• Ireverzibilni inhibitori se vezuju jakim kovalentnim vezama za enzim

Konkurentska inhibicija, inhibitor se vezuje na isti centar kao

supstrat, onemogućava supstrat da reaguje, smanjuje broj

mesta na kojima se supstrat vezuje.

Konkurentska inhibicija

I se vezuje na istim mestima ali se uticaj može smanjiti viškom S

– Ne utiče na Vmax

– prividna KM (aKM) će rasti sa porastom koncentracije inhibitora.

EI

IEK I

SK

SV

M

max

a

ov

IK

I1a

EI

IEK I

maxmax

111

vSv

K

v

M

o

a

Konkurentska inhibicija

Nekonkurentska inhibicija (uncompetitive ihibition)

Inhibitor se vezuje nakon vezivanja supstrata na centar koji nije

aktivni centar

Inhibitor se vezuje samo na ES

kompleks

I sprečava formiranje produkta,

•Vmax opada i

•KM opada u istom iznosu

max max

M

V S ( / )[ ]

K S / [ ]o

M

V Sv

K S

a

a a

'

I' 1

K I

a

Nekonkurentska inhibicija

maxmax

'11

vSv

K

v

M

o

a

Mešovita inhibicija

Inhibitor se vezuje

blokirajući i E i ES;

• utiče na oba faktora

Vmax i KM ali ne uvek.

max max

0

[ ] ( / ) [ ]

[ ] / [ ]M M

V S V S

K S K S

va

a a a a

EI

IEK I

ESI

IESK I

'

max max

1 1M

o

K

v v S v

a a

a

•Sa porastom [I] opada Vmax i

raste KM.

IK

I1a

IK

I1a

Ne-kompetitivna inhibicija - drugi tipovi inhibicije,

(non-competive)

Nekonkurentska inhibicija, slučaj u kome se inhibitor

vezuje potpuno nezavisno od supstrata. U tom slučaju

njegovo vezivanje ne utiče na KM, ali moze da smanjuje

Vmax,

Supstrat može da se veže

direktno na E ali i na EI.

Inhibitor može da se veže i

na E in ES.

Iz ESI ne dolazi do

gradjenja produkta zbog

konformacionih promena

izazvanih inhibitorom

Types of inhibition - Summary

1/v0Slope = KM/Vmax

1/Vmax-1/KM1/[S]

1/v0

1/Vmax-1/KM1/[S]

1/v0

1/Vmax-1/KM1/[S]

1/v0

1/Vmax-1/KM1/[S]

Uticaj inhibicije na parametre Mihelis

Mentenove jednačine

Tip inhibicije

Bez inhibicije

konkurentska

nekonkurentska

mešovita

privVmaxpriv

MK

MK

MKa

'/aa MK

'/aMK

maxV

maxV

'/max aV

'/max aV

Aktivnost enzima zavisi od

pH sredine, za svaki

enzim postoji specifična

zavisnost od pH sredine.

pH koji odgovara maksimalnoj

brzini reakcije je poznat kao

optimalni pH.

Uticaj pH je prvi vrlo malim ili pri vrlo

velikim vrednostima ireverzibilan jer u

tim uslovima dolazi do narušavanja

tercijerne strukture proteina.

Reverzibilne promene će se

dogadjati u oblastima gde se pH ne

razlikuje mnogo od optimalnog pH.

UTICAJ pH

Uticaj pH na kinetičke parametre

2

[ ][ ]

[ ];b a

EH HK

EH

E HK

EH

2

[ ] [ ][ ];

[ ]bx ax

ESH H ES HK K

ESH ESH

Protonovanje i deprotonovanje EH i ESH ne pogoduje stvaranju P. Zato za

svaki enzim postoji optimalni pH u zavisnoti od odgovarajućih kiselinskih K

22 ESHESESHEHEEHEo

1 1a aXo

b bX

H HK KE EH ESH

K KH H

0

d ESH

dt

1 2 1k k ESH k EH S

Koncentracija odredjene forme enzima će zavisiti od pH sredine

(E-, EH2+, se izraze preko Ka i Kb a ES- i ESH2

+ preko Kax i Kbx u izrazu za E0)

Stacionarno stanje

Po ESH

Slično kao kod obične MM kinetike, koncentracija preostalog

enzima EH se izrazi preko EH0 i EHS. Izračunata EHS (iz

stacionarnog stanja) se uvrsti u izraz za brzinu procesa:

2 0[ ][ ]

(1 / [ ] [ ] / ) [ ](1 / [ ] [ ] / )m a b ax bx

k E Sv

K K H H K S K H H K

Za veliko S2 0[ ][ ]

[ ](1 / [ ] [ ] / )ax bx

k E Sv

S K H H K

Za malo S 2 0[ ][ ]

(1 / [ ] [ ] / )m a b

k E Sv

K K H H K

Primer : Merenje brzine pri malim [S] na raznim pH

može da objasni yavisnost brzine od pH:

Visoka [H+] odnosno malo

pH

2 0[ ][ ]; log log[ ]

[ ] /m b

k E Sv v const H

K H K

const pH

Srednje kiselosti2 0[ ][ ]

; logm

k E Sv v ne zavisi od pH

K

Niska [H+] odnosdno

visko pH2 0[ ][ ]

; log( / [ ] )m a

k E Sv v const pH

K K H

'

1

1

a

b

M M

ax

bX

H K

K HK K

H K X

K H

'

max max

1

1 ax

bX

V VH K X

K H

SK'

SV'max

M

v

Vmax i KM su konstante aktivne forme enzima

Delenjem sa izrazom pored S u

imeniocu mogu se definisati

prividna K` m i V`max koje takodje

imaju pH zavisnost

Izraz za brzinu se može svesti na

Standardni oblik MM kinetike:

SK

SVmax

M

v1

21-

k

k k K

M

oEkV 2max

Ako je S malo

21

12

kk

SEkkv o

1

12

k

kkSlučaj 1. k2>>k-1

1

12

k

SEkkv o

SEkv o1

Energija aktivacije

odredjena sa k1

formiranja kompleksa ES

Slučaj 2. k-1>>k2

Energija aktivacije

E= E1+ E2 –E-1

Temperaturska zavisnost enzimski katalisanih reakcija

(odredjena je T zavisnošću k’1, k 1 i k2

1

2

1

1 22

1

E S ES E P

Briggs-Haldane: ;

k

k

k

cat M

k kk k K

k

Mehanizmi na koje se može primeniti Mihaelis-Menten

kinetika:

• Mnoge reakcije se mogu redukovati na ovu osnovnu

formu.

• Jednostavna kinetika ne može razdvojiti k1, k2, …

•Složene i prividne konstante su ono što se može

dobiti analizom ovih sistema kcat, KM

Mehanizmi na koje se može primeniti Mihaelis-Menten kinetika

1 2

1 2

0 0

1 2 1 22 2

1 2

0

0

E S ES E P (reversibilno)

E S E P (opsta jednacina)

1 S P

; ; ; ;

E Sako P 0 : (Mihaelis Menton)

S

k k

k k

S P

mS mP

mS S mS mP p mP

cat

mS

k kv

K K

k k k kK k k K K k k K

k k

kv

K

E + S D ES D E + P ES E E 0

S P S 0

0PEES)(SE

ES2211 kkkk

dt

d

ESkSEk

dt

Pd

dt

Sd11

2121

2121 )(

kkPkSk

EPkkSkk

dt

Pd

dt

Sd o

2121

2121 )(

kkPkSk

EPkkSkk

dt

Pd

dt

Sd o

max max/ /

1 / /

M P MP

M MP

d S V K S V K P

dt S K P K

SK

SEk

dt

Sd

M

o

2

Kada je P=0

oEkV 2max oP EkV 1max

1

21-

k

k k K

M

2-

21-

k

k k K

MP

Mehanizmi na koje se može primeniti Mihaelis-Menten kinetika

forma generalna ista ali slozenije, (znatno

;; ;

jednacina) generalna (ista PS1

PESE

)(multistep P E EP ES S E

323121

321

3221

323121

00

3

3

2

2

1

1

mPSmS

mPmS

PS

k

k

k

k

k

k

Kkkkkkk

kkkk

kkkk

kkkkkkK

KK

kkv

(ne treba izvodjenje ovo je samo ilustracija kako se složeni mehanizmi

mogu svesti na formalno slične izraze)

King-Altman:mehanizam

E

ES

EP

k1[S]

k-1k2k-2

k-3[P]

k3

2

11

max

21

0

22133221323121

321321

0

0

;; :showed Cleland

)expected! (asequation Menton -Michaelis reversible theasearlier

shown wasform this;PS

PS :constants group

PS

PS

E

N

NK

C

cK

C

NV

CCc

NNv

kkkkkkkkkkkkkk

kkkkkkv

eq

S

M

S

PS

REAKCIJE KATALISANE ENZIMIMA

Hidroliza saharoze

Označavanje Mechanizama ER

A: Sekvencijalne reakcije

• Svi supstrati se vezuju za enzim pre

nego što se dogodi reakcija

Uredjeni sekvencijalni mehanizam

A B P Q

E EA (EAB EAP) EQ E

A B P Q

E EA EA E

*Prvo se transformiše B ostavljajući EA koji naknadno prelazi u Q.

example: liver alcohol dehydrogenase.

Cleland Schematics

• Moguća konfuzija u šemi:

– Da li je supstanca reaktant ili produkt?

• Cleland schema definiše

– Po konvenciji:

• ABC... substrates

• PQR… products

• E = enzyme

E

A B P Q C R

Strelice na dole označava

vezivanje supstrata a

strelica nagore

oslobadjanje produkta

Iustracija: Enzimi mogu biti veoma komplikovani ogranski molekuli u kojima

voda (Wat) može znatno uticati na reakcije na aktivnom centru: