EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER ABSCIZIJA ... · Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. III Dokt. disertacija

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER

ABSCIZIJA PLODIČEV JABLANE (Malus domestica

Borkh.) PO TRETIRANJU Z RASTNIMI REGULATORJI

IN SENČENJEM

DOKTORSKA DISERTACIJA

Oktober 2011 Jure KOLARIČ

UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

AGRONOMIJA

UNIVERSITY OF MARIBOR FACULTY OF AGRICULTURE AND LIFE SCIENCES

AGRONOMY

Doktorska disertacija

EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER ABSCIZIJA PLODIČEV JABLANE (Malus domestica

Borkh.) PO TRETIRANJU Z RASTNIMI REGULATORJI IN SENČENJEM

Ph. D. THESIS

EXPRESSION OF GENES ASSOCIATED WITH ETHYLENE EVOLUTION AND ABSCISSION OF

APPLE (Malus domestica Borkh.) FRUITLETS AFTER PLANT GROWTH REGULATORS AND SHADING

TREATMENTS

Oktober 2011 Jure KOLARIČ

Mentor: doc. dr. Stanislav TOJNKO UDK: 634.11:631.631.543.5:631.811.98(043)=863

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. III Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

Komisija za oceno doktorske disertacije:

Predsednik: red. prof. dr. Anton IVANČIČ

Mentor: doc. dr. Stanislav TOJNKO

Članica: doc. dr. Tatjana UNUK

Član: red. prof. dr. Zlatko ČMELIK

Komisija za zagovor doktorske disertacije:

Predsednik: red. prof. dr. Branko KRAMBERGER

Mentor: doc. dr. Stanislav TOJNKO

Član: red. prof. dr. Zlatko ČMELIK

Član: red. prof. dr. Anton IVANČIČ

Članica: doc. dr. Tatjana UNUK

Član: dr. Matej STOPAR

Lektorirala: Jožica MEGLA, prof. slov. j.

Datum zagovora: 13. oktober 2011

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. IV Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER ABSCIZIJA PLODIČEV JABLANE (Malus domestica Borkh.) PO TRETIRANJU Z RASTNIMI REGULATORJI IN SENČENJEM

Uporaba nekaterih rastnih regulatorjev z namenom redčenja plodičev pri jablani (Malus domestica Borkh.) je splošno sprejet tehnološki ukrep, čeprav način delovanja teh sredstev ni popolnoma jasen. Prav tako ni dorečena vloga etilena v procesu abscizije plodičev, čeprav se upravičeno domneva, da ta rastlinski hormon pomembno vpliva na razvoj abscizije plodičev. V dvoletnem poskusu, ki je bil zastavljen v poskusnem nasadu na Brdu pri Lukovici, smo na drevesih sorte 'Zlati delišes' spremljali evolucijo etilena ter izraženost genov, odgovornih za sintezo etilena (MdACO1, MdACS5A in MdACS5B) po tretiranju z naftil ocetno kislino (NAA), benziladeninom (BA), etefonom (ETEF) in senčenjem (SEN). Tretiranje z rastnimi regulatorji oz. senčenje je vplivalo na večjo ekspresijo genov odgovornih za sintezo etilena. Lateralni plodiči (LP) so bili veliko bolj dovzetni na aplikacijo rastnih regulatorjev oz. SEN v primerjavi s centralnimi plodiči (CP), kar se je odrazilo tako na genetskem nivoju, kakor tudi pri dejanskem spremljanju abscizije. Pokazalo se je, da je izraženost MdACO1 dober indikator kasnejše abscizije, medtem ko se MdACS5A in MdACS5B izražata na veliko nižjem nivoju. V primeru LP so obravnavanja NAA, BA, ETEF in SEN povzročila močno povišano izraženost MdACO1, medtem ko je v primeru CP samo aplikacija ETEF vplivala na izraženost MdACO1. Posledično se je abscizija CP izvršila samo v primeru obravnavanja ETEF, medtem ko je bilo odpadanje LP prisotno tudi pri obravnavanjih NAA, BA in SEN. Višja izraženost opazovanih genov v tkivu AZ je bila zabeležena samo v primeru obravnavanja ETEF. Kljub temu da izraženost MdACO1 nakazuje prisotnost abscizijskih procesov, pa količina tarčnega gena relativne kvantifikacije ni sovpadala z deležem plodičev, ki so bili podvrženi absciziji. Močnejša je povezava med frekvenco odpadanja plodičev in količino etilena oz. izraženostjo gena MdACO1, kjer smo ugotovili, precejšnje razlike v intenzivnosti odpadanja med obravnavanji. Dober pokazatelj začetka abscizijskih procesov je tudi inhibicija rasti plodičev, kjer smo ugotovili, da vsi uporabljeni rastni regulatorji in SEN zaviranjo rast plodičev, ki so kasneje podvrženi absciziji, vendar z različno intenziteto. Glede na naše rezultate lahko domnevamo, da aplikacija rastnih regulatorjev in senčenje vplivajo na višjo ekspresijo genov, povezanih s sintezo etilena v plodičih, ki bodo podvrženi absciziji, kar je poleg inhibicije rasti možen vzrok za začetek abscizijskih procesov. Ključne besede: abscizija, evolucija etilena, redčenje, rastni regulatorji, genetska

ekspresija, qPCR

OP: XIII, 110 s., 5 pregl., 3 slike, 30 graf., 118 ref.

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. V Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

EXPRESSION OF GENES ASSOCIATED WITH ETHYLENE EVOLUTION AND ABSCISSION OF APPLE (Malus domestica Borkh.) FRUITLETS AFTER PLANT GROWTH REGULATORS AND SHADING TREATMENTS

The use of plant growth regulators for thinning of apple (Malus domestica Borkh.) fruitlets is a well established measure, although its physiological basis is still not fully explained. Also, it is not clear what the role of ethylene in the young fruit abscission is, although there is reason to believe that this gaseous plant hormone has an important role in the development of abscission. Our two years long investigation, which took place in the experimental plantation situated at Brdo near Lukovica, involved the variety 'Golden Delicious'. The main objective was to observe ethylene evolution and expression of genes responsible for ethylene biosynthesis (MdACO1, MdACS5A in MdACS5B) after the application of naphthaleneacetic acid (NAA), benzyladenine (BA), ethephon (ETEF), or shading (SEN). The application of plant growth regulators and shading resulted in higher expression of genes responsible for ethylene biosynthesis. Lateral fruitlets (LF) were more susceptible to application with plant growth regulators and shading, and this was reflected on the genetic level as well as on the actual fruitlet abscission. It was found that the expression of MdACO1 could be considered as a good indicator of abscission while MdACS5A and MdACS5B were expressed at a much lower level. In the case of LF, the expression of MdACO1 was significantly increased by NAA, BA, ETEF and shading treatment while in the case of king fruitlets (KF), only the ETEF application increased the MdACO1 expression. Consequently, the abscission of KF was present only in the ETEF treatment while LF also abscised after the treatment with NAA, BA and shading. Higher expression of studied genes in the abscission zone tissue was also recorded only after the ETEF treatment. Although the MdACO1 indicate the presence of abscission processes, the expression of target gene does not correspond with the actual number of abscised fruitlets. We found a close relationship between ethylene evolution and expression of MdACO1 and abscission dynamics. In the case of abscission dynamics, differences between treatments were recorded. Plant growth regulators and shading had a differently strong effect on the inhibition of fruit growth, although the growth of fruitlets subjected to abscission was inhibited by all treatments. Our results suggest that the application of growth regulators and shading have positive effect on the expression of genes associated with the synthesis of ethylene in fruitlets which will be affected by abscission process.

Key words: abscission, ethylene evolution, thinning, growth regulators, gene expression,

qPCR

NO: XIII, 110 p., 5 tab., 3 pic., 30 graph., 118 ref.

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. VI Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

Kazalo vsebine

1 UVOD ............................................................................................................................ 1

1.1 Opredelitev problema ........................................................................................... 1

1.2 Cilji naloge ............................................................................................................. 2

1.3 Delovne hipoteze .................................................................................................... 3

2 PREGLED OBJAV ...................................................................................................... 4

2.1 Regulacija obremenitve dreves s pridelkom ....................................................... 4

2.2 Fiziološke osnove abscizije plodičev .................................................................... 8

2.3 Sredstva za regulacijo abscizije plodičev .......................................................... 13

2.3.1 Mehanizem delovanja sredstev za redčenje ................................................... 14

2.3.2 Redčenje plodičev .......................................................................................... 16

2.3.3 Sredstva za redčenje cvetov/plodičev jablane................................................ 17

2.3.4 1-naftil ocetna kislina ali NAA ...................................................................... 18

2.3.5 1-naftilacetamid ali NAD ............................................................................... 19

2.3.6 6-benziladenin ali BA .................................................................................... 19

2.3.7 Etefon ............................................................................................................. 20

2.3.8 Karbaril .......................................................................................................... 21

2.4 Vpliv zunanjih dejavnikov na učinkovitost redčenja ...................................... 22

2.5 Vloga etilena pri absciziji plodičev .................................................................... 25

2.6 Vloga posameznih genov ..................................................................................... 29

3 MATERIALI IN METODE ...................................................................................... 34

3.1 Zasnova poljskega poskusa ................................................................................ 34

3.2 Meritve evolucije etilena ..................................................................................... 40

3.3 Genetske analize .................................................................................................. 41

3.3.1 Vzorčenje ....................................................................................................... 41

3.3.2 Izolacija RNA ................................................................................................ 42

3.3.3 Razgradnja genomske DNA .......................................................................... 43

3.3.4 Reverzna transkripcija ................................................................................... 43

3.3.5 Kvantitativna PCR v realnem času (qPCR) ................................................... 44

3.3.6 Relativna kvantifikacija ................................................................................. 46

3.3.7 Oligonukleotidni začetniki ............................................................................. 47

3.4 Statistična obdelava podatkov ........................................................................... 48

4 REZULTATI............................................................................................................... 49

4.1 Pridelek ................................................................................................................ 49

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. VII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

4.2 Frekvenca odpadanja plodičev .......................................................................... 55

4.3 Evolucija etilena .................................................................................................. 60

4.4 Ekspresija MdACS5A, MdACS5B in MdACO1 ................................................. 62

4.4.1 Poskus 2008 ................................................................................................... 62

4.4.2 Poskus 2009 ................................................................................................... 66

4.5 Prirast plodičev .................................................................................................... 77

5 RAZPRAVA ................................................................................................................ 84

6 SKLEPI ....................................................................................................................... 94

7 POVZETEK ................................................................................................................ 96

8 SUMMARY ................................................................................................................. 99

9 LITERATURA ......................................................................................................... 101

ZAHVALA

PRILOGE

Delovni življenjepis

Osebna bibliografija

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. VIII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

Kazalo preglednic

Preglednica 1: Najnižje, najvišje in povprečne temperature ozračja ter količina

padavin med 1.5. in 31.5. v letu 2008 na opazovalni postaji

Brdo pri Lukovici. ...................................................................................... 38

Preglednica 2: Najnižje, najvišje in povprečne temperature ozračja ter količina

padavin med 1.5. in 31.5. v letu 2009 na opazovalni postaji

Brdo pri Lukovici. ...................................................................................... 39

Preglednica 3: Zaporedja vseh začetnih oligonukleotidnih začetnikov (F) in

končnih oligonukleotidnih začetnikov (R) uporabljenih v qPCR

pri tej raziskavi ........................................................................................... 48

Preglednica 4: Vpliv NAA, BA, etefona in senčenja na količino in velikost dozorelih

plodov v letu 2008……………………..…………………………………50

Preglednica 5: Vpliv NAA, BA, etefona in senčenja na količino in velikost dozorelih

plodov v letu 2009..………………………………………………………50

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. IX Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

Kazalo slik

Slika 1: Socvetje jablane. Številke ob plodičih kažejo hierarhično razvrstitev

plodov glede na jakost dominance (Bangerth 2000). ............................................ 12

Slika 2: Shema sintetske poti etilena. V začetni stopnji se iz metionina s pomočjo

S-adenozil metionin sintaze sintetizira S-adenozil metionin. V naslednjih

stopnji se s pomočjo encima ACS sintetizira 1-amino-ciklopropan

karbonska kislina, kot stranski produkt pa nastaja MTA, ki vstopa v

metioninski cikel katerega končni produkt je nastanek metionina. V končni

fazi se pod vplivom ACO sintetizira etilen, medtem ko kot stranski produkt

nastaneta ogljikov dioksid in vodikov cianid (Hedden in Thomas 2006,

str. 127). ................................................................................................................. 28

Slika 3: Izvedba senčenja s pomočjo polipropilenske prekrivke, ki je bila nameščena

na leseno armaturo. ................................................................................................ 36

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. X Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

Kazalo grafikonov

Grafikon 1: Povprečno število plodov na drevo ob obiranju pri sorti 'Zlati delišes' v

letih 2008 in 2009. .......................................................................................... 52

Grafikon 2: Povprečno število plodov na drevo ob obiranju na vsakih 100 socvetij pri

sorti 'Zlati delišes' v letih 2008 in 2009. ......................................................... 53

Grafikon 3: Povprečen pridelek na drevo v letih 2008 in 2009

pri sorti 'Zlati delišes'. ..................................................................................... 54

Grafikon 4: Povprečna masa plodov ob obiranju pri sorti 'Zlati delišes' v letih 2008

(A) in 2009 (B). .............................................................................................. 55

Grafikon 5: Dinamika odpadanja centralnih plodičev (CP) v letu 2008 po tretiranju z

NAA, BA, ETEF in SEN. ............................................................................... 56

Grafikon 6: Dinamika odpadanja lateralnih plodičev (LP) v letu 2008 po tretiranju z

NAA, BA, ETEF in SEN………………………………………………... ….57

Grafikon 7: Dinamika odpadanja centralnih plodičev (CP) v letu 2009 po tretiranju z

NAA, BA, ETEF in SEN. ............................................................................... 58

Grafikon 8: Dinamika odpadanja lateralnih plodičev (LP) v letu 2009 po tretiranju z

NAA, BA, ETEF in SEN. ............................................................................... 59

Grafikon 9: Evolucija etilena iz centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 2, 5 in 8 DAT

z rastnimi regulatorji oz. SEN v letu 2008. .................................................... 60

Grafikon 10: Evolucija etilena iz lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 2, 5 in 8 DAT

z rastnimi regulatorji oz. SEN v letu 2008. .................................................... 61

Grafikon 11: Ekspresija MdACS5A v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),

abscizijski coni centralnih plodičev (C) in abscizijski coni lateralnih

plodičev (D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN

v letu 2008. ..................................................................................................... 63

Grafikon 12: Ekspresija MdACS5B v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),


plodičev (D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2008. ....... 64

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. XI Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

Grafikon 13: Ekspresija MdACO1 v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),


plodičev (D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2008. ....... 65

Grafikon 14: Ekspresija MdACS5A v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC)

v terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN

v letu 2009. ..................................................................................................... 66

Grafikon 15: Ekspresija MdACS5A v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL)


v letu 2009. ..................................................................................................... 67

Grafikon 16: Ekspresija MdACS5A v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1,

4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009. ...................................... 68

Grafikon 17: Ekspresija MdACS5A v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4

in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009. ......................................... 69

Grafikon 18: Ekspresija MdACS5B v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC)


v letu 2009. ..................................................................................................... 70

Grafikon 19: Ekspresija MdACS5B v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL)


v letu 2009. ..................................................................................................... 71

Grafikon 20: Ekspresija MdACS5B v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1,

4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009. ...................................... 72

Grafikon 21: Ekspresija MdACS5B v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4


Grafikon 22: Ekspresija MdACO1 v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC)


v letu 2009. ..................................................................................................... 74

Grafikon 23: Ekspresija MdACO1 v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL) v

terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN

v letu 2009. ..................................................................................................... 75

Grafikon 24: Ekspresija MdACO1 v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1, 4


Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. XII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

Grafikon 25: Ekspresija MdACO1 v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4


Grafikon 26: Premer lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi

absciziji (črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog)

pri K obravnavanju. ........................................................................................ 78

Grafikon 27: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi


pri obravnavanju NAA. .................................................................................. 79



pri obravnavanju BA. ..................................................................................... 80



pri obravnavanju ETEF. ................................................................................. 82



pri obravnavanju SEN. ................................................................................... 83

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. XIII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

Okrajšave in simboli

1-MCP 1-metil-ciklopropan

ACC 1-amino-ciklopropan karbonska kislina

ACO 1-amino-ciklopropran oksidaza

ACS 1-amino-ciklopropan sintaza

AVG amino-etoksi-vinil-glicin

AZ abscizijska cona

BA benziladenin

cDNA komplementarna DNA

CP centralni plodič

CS socvetje s centralnim plodičem

DAT dni po tretiranju

DNA deoksiribonukleinska kislina

ETEF etefon

FC tkivo plodičev

GA4 giberelinska kislina 4

IAA indol ocetna kislina

K kontrola

LP lateralni plodič

LS socvetje z lateralnimi plodiči

NAA naftil ocetna kislina

PAR fotosintetsko aktivno sevanje

PCR verižna reakcija s polimarazo

RNA ribonukleinska kislina

SEN senčenje

qPCR kvantitativna verižna reakcija s polimerazo

Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. 1 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

1 UVOD

1.1 Opredelitev problema

V sadjarstvu se pri nekaterih gospodarsko pomembnih sadnih vrstah srečujemo s pojavom

neredne rodnosti in relativno nizkim deležem plodov 1. kakovostnega razreda. Vzrok za

pojav omenjenih težav je v prevelikem številu plodov na drevesu, kar negativno vpliva na

kakovost plodov. Prav tako veliko število plodov z večjim izločanjem hormonov, ki

nastajajo v semenu plodičev, negativno vpliva na začetek diferenciacije cvetnih brstov, ki

so pomembni za razvoj cvetov v prihodnji vegetaciji. Večina pomembnejših sadnih vrst je

razvila regulacijske mehanizme, s katerimi uravnavajo število plodov na drevesih. To so

obdobja, v katerih plodovi množično odpadajo (npr. »junijsko« trebljenje). Pojav

naravnega trebljenja plodičev je pri jablanah in hruškah sicer močno izražen, vendar je za

doseganje redne rodnosti in visoke kvalitete plodov še vedno potrebno dodatno redčenje.

V sodobnem sadjarstvu se redčenje plodičev jablane izvaja s pomočjo kemičnih

pripravkov, kot so naftil ocetna kislina (NAA), naftilacetamid (NAAm), benziladenin

(BA), etefon, karbaril in drugi (Wertheim 2000). Za vse te pripravke je znano, da poudarijo

učinek trebljenja, vendar način delovanja teh pripravkov še ni popolnoma pojasnjen.

Ugotovljeno je bilo tudi, da je učinkovitost delovanja teh pripravkov zelo variabilna in je

precej odvisna od okoljskih dejavnikov (temperatura, zračna vlaga, svetloba) in stanja

drevesa (genotip, prehranjenost s hranili, podlaga) (Byers 2003). V zadnjih letih prevladuje

mnenje, da je odpadanje plodičev povezano s spremembami v hormonskem stanju rastline.

Iz tega vidika je pomembna predvsem vloga rastlinskega hormona etilena kot pospeševalca

abscizijskih procesov ter avksinov oz. indol ocetne kisline (IAA), za katero se predvideva,

da deluje kot inhibitor abscizije. Za etilen je znano, da spodbuja odpadanje plodičev,

vendar še ni jasno, ali sodeluje tudi pri indukciji samega procesa. Prav tako obstajajo

različna mnenja, ali je etilen esencialni faktor pri odpadanju plodičev.


V zadnjem obdobju na pomenu pridobivajo raziskave o vlogi genov, ki so povezani s

procesom abscizije. V ospredju so predvsem geni, ki so povezani s sintezo etilena, ter geni,

za katere se predvideva, da vplivajo na sintezo hidrolitskih encimov, poleg tega pa se išče

gene, ki bi bili povezani s tvorbo IAA. V plodičih, ki so podvrženi absciziji, je bila v

nekaterih primerih dokazana višja stopnja ekspresije genov, za katere se domneva, da

sodelujejo v sintetski poti etilena. Kljub temu ni jasno, ali je ekspresija genov, povezanih s

sintezo etilena, razlog za pričetek abscizije ali pa gre zgolj za posledico pričetka

abscizijskih procesov. Prav tako je na genetskem nivoju zelo malo znanega o vplivu

različnih rastnih regulatorjev na terminsko izražanje genov. Za boljše poznavanje abscizije

plodičev bi bilo ključnega pomena odkriti dejavnike, ki sprožijo začetek abscizije.

1.2 Cilji naloge

S svojim raziskovanjem želim doprinesti k razumevanju procesa abscizije plodičev pri

jablani. Sama iniciacija procesa, ki aktivira tvorbo abscizijskega tkiva in korelacije med

dejavniki, ki vplivajo na tvorbo abscizijskega tkiva, so za enkrat slabo poznani. Kljub

predhodnim raziskavam še ni popolnoma jasna vloga etilena pri procesu abscizije plodičev.

Z našo raziskavo želimo ugotoviti, ali je etilen tisti dejavnik, ki je prisoten v procesu

abscizije ne glede na to, s čim spodbudimo plodiče k odpadanju (rastni regulatorji ali

redukcija svetlobe). Znano je namreč, da etefon kot sredstvo za redčenje plodičev vpliva na

pospešeno tvorbo etilena (Stopar 1998). Nas pa zanima, ali pripravka NAA in BA ter

redukcija svetlobe prav tako vplivajo na ekspresijo genov, odgovornih za sintezo etilena,

ali pa je njihov mehanizem delovanja drugačen od procesa, ki ga izzove aplikacija etefona.

Predvidevamo, da se bodo različni pripravki odražali v povezavi z ekspresijo različnih

genov oz. različno intenziteto. Glede na to, da se proces abscizije začne, preden so vidni

zunanji znaki na tkivu AZ, ki je posledica delovanja hidrolitskih encimov, nas zanima, ali

je mogoče s pomočjo sodobnih genetskih metod na podlagi ekspresije določenih genov

ugotoviti spremembe, ki se zgodijo v plodičih, ki bodo odpadli. Na ta način bi lahko že v

zgodnji fazi ocenili, kolikšen delež plodov bo podvržen odpadanju. V preteklosti je bilo


potrjeno, da so centralni plodiči (CP) manj podvrženi absciziji v primerjavi z lateralnimi

plodiči (LP). Zaradi tega bomo s pomočjo natančnega spremljanja fizioloških procesov v

obeh tipih plodičev skušali ugotoviti, ali se LP tudi na genetskem nivoju drugače odzivajo

na aplikacijo kemičnih sredstev ali redukcijo svetlobe v primerjavi s CP.

1.3 Delovne hipoteze

Etilen je ključni dejavnik v procesu abscizije plodičev jablane.

Redukcija svetlobe ali aplikacija NAA, BA oz. ETEF v fazi premera plodičev 10 mm

povzroči njihovo odpadanje.

Centralni in lateralni plodiči se bodo različno odzvali na aplikacijo kemičnih sredstev za

redčenje oz. senčenje.

Aplikacija ETEF bo povzročila močan in nedvoumen vpliv na ekspresijo genov, povezanih

s sintezo etilena.

Redukcija svetlobe vpliva na ekspresijo genov, ki so odgovorni za sintezo etilena.

NAA in BA vplivata na ekspresijo genov, odgovornih za sintezo etilena, vendar ne tako

intenzivno kot ETEF.

Gen MdACO1 je dober indikator začetka abscizije plodičev.

Na podlagi ekspresije genov je možno ugotoviti učinkovitost sredstva za redčenje v

zgodnji fazi po aplikaciji.


2 PREGLED OBJAV

2.1 Regulacija obremenitve dreves s pridelkom

Večina sadnih vrst v optimalnih pogojih ter ob ustrezni oskrbi in prehranjenosti s hranili

močno zacveti. Posledično zasnuje veliko število plodov, običajno več kot je potrebno za

optimalno obremenitev drevesa in s tem povezan kakovosten pridelek. Med takšne sadne

vrste sodi tudi jablana (Malus domestica Borkh.).

Brez uporabe tehnoloških ukrepov, s katerimi reguliramo število plodov na določenem

drevesu, smo v jeseni priča obilnemu pridelku nekvalitetnih in majhnih plodov, ki na trgu

nimajo vrednosti. Obenem s takšnim (ne)ukrepanjem vzpodbudimo še dodatno težavo, ki

je izrazita pri nekaterih gospodarsko pomembnih sadnih vrstah (med katere sodi tudi

jablana) in se imenuje izmenična rodnost ali alternanca. Pri alternanci gre za pojav, ko letu

z izredno močnim cvetenjem (ón year´) sledi leto z izrazito slabim cvetenjem (óff year´)

(Byers 2003). Vzroki za alternanco so v slabi diferenciaciji cvetnih brstov v letu z obilnim

cvetenjem. Obilnemu cvetenju ob normalnih pogojih sledi tudi velik nastavek plodov, ki

negativno vpliva na iniciacijo diferenciacije cvetnih brstov, ki je pomembna za cvetni

nastavek v prihodnji vegetaciji. Ugotovili so, da v semenskih zasnovah mladih plodičev

nastajajo razmeroma velike količine giberelinov, ki so inhibitorji začetka diferenciacije

cvetnih zasnov (Faust 1989). Da je možno izmenično rodnost kontrolirati z

odstranjevanjem plodov takoj po cvetenju, sta leta 1919 prva opazila Russel in Pickering

(Faust 1989). Podobno ugotovitev je mnogo let pozneje, na podlagi številnih raziskav,

podal Greene (2002), ki meni, da je preprečitev alternance in zagotavljanje rednega

pridelka možno le z regulacijo nastavka plodov. Z redčenjem plodičev, kot tehnološkim

ukrepom, torej pozitivno vplivamo na več parametrov, kot so: velikost zrelih plodov,

obarvanost plodov, notranja kakovost plodov, preprečimo lomljenje vej ter ugodno

vplivamo na zasnovo cvetnih brstov za naslednje leto (Westwood 1992 in Arteca 1995).


Z analizo velikosti plodov treh jablanovih sort ('Jonagold', 'Elstar' in 'Zlati delišes') se je

izkazalo, da delež majhnih (<60 mm) in srednje velikih (60-70 mm) plodov eksponentno

narašča z obremenitvijo drevesa (Link 2000). Isti avtor ugotavlja tudi, da je možno z

redčenjem plodov zvišati delež debelih plodov za med 7-45 %, odvisno od kultivarja in

metode redčenja. Pri tem je treba omeniti, da je najzanesljivejši način, s katerim se vpliva

na večjo povprečno maso dozorelih plodov, še vedno ročno redčenje, ki pa je zaradi

pomanjkanja delovne sile in visokega stroška med pridelovalci nepriljubljeno. Prav tako z

redčenjem vplivamo na trdoto plodov, ki se zviša za 2-18 % ter ugodno vplivamo na

intenzivnost obarvanosti plodov (Link 2000).

Eden izmed pogojev za dobro kakovost plodov je tudi zadostno število listov na plod

(Wertheim 2000). V eni izmed svojih raziskav Westwood (1992) omenja, da je za

normalen razvoj plodov potrebno med 20-40 listov na plod. Z redčenjem torej vplivamo

tudi na večje razmerje med listi in plodovi, kar ugodno vpliva na kakovost in razvoj

plodov.

Redčenje plodov nedvomno izboljša kvaliteto plodov (velikost, obarvanost, trdota), vendar

s premočnim redčenjem dobimo višji delež zelo debelih plodov, ki se slabo skladiščijo.

Tovrsten problem nastaja predvsem pri debelo plodnih sortah, kjer se z močnim redčenjem

zviša delež plodov, debelejših od 75 mm, za katere je ugotovljeno, da imajo slabšo

skladiščno sposobnost ter več fizioloških nepravilnosti (grenka pegavost). Prav tako imajo

takšni plodovi višjo vsebnost kalija in nižjo vsebnost kalcija v primerjavi z drobnejšimi

plodovi (Byers 2003).

Poleg tega s premočnim redčenjem (pre-)več izgubimo na količini skupnega pridelka.

Zaradi tega je danes eno izmed glavnih vprašanj, kako močno je potrebno redčiti (Link

2000). Skupen pridelek je namreč v pozitivni korelaciji s številom plodov. Tako nekatere

raziskave dokazujejo, da je v določenih primerih povečanje pridelka na račun debelejših

plodov nižje v primerjavi z zmanjšanjem pridelka na račun števila plodov (Byers 2003). Na

tem mestu si moramo odgovoriti na vprašanje, kolikšno količinsko zmanjšanje pridelka je

za nas sprejemljivo. Seveda je eden izmed ciljev uspešnega redčenja tudi izničenje


ekstremnega nihanja med pridelki. Kljub temu da se z redčenjem skupni pridelek v

posameznih letih (ón year´) zmanjša, pa lahko ugotovimo, da je ekonomski učinek

redčenja dosežen s povečanjem pridelka najkakovostnejših plodov, ki imajo najboljšo

ceno. Ne glede na to, da se z redčenjem pridelek v posameznem letu zmanjša, sta

povprečni pridelek in ekonomski rezultat na daljše časovno obdobje boljša (Byers 2003).

Iz vidika preprečevanja alternance je potrebno redčiti čimbolj zgodaj, da čim prej

odstranimo izvor giberelinov, ki negativno vplivajo na iniciacijo diferenciacije cvetnih

brstov. Večina raziskovalcev se strinja glede trditve, da čim zgodnejše je redčenje, večji je

pozitivni učinek na povratno cvetenje ter na velikost plodov (Wertheim 2000). Vendar

moramo biti predvsem pri debeloplodnih sortah z zgodnjim redčenjem nekoliko bolj

previdni, saj lahko le-to neugodno vpliva na delež predebelih plodov, katerih slabosti smo

že omenili. V takšnih primerih običajno redčenje nekoliko »zavlečemo«, da ne dobimo

predebelih plodov, vendar se s tem pozitiven učinek na povratno cvetenje zmanjša (Byers

2003).

Glede časa redčenja in metode redčenja je uveljavljenih več pristopov. Glede na čas

redčenja ločimo redčenje cvetov in redčenje plodičev (Wertheim 2000). Kot lahko

razberemo že iz imena, redčenje cvetov opravimo v fazi cvetenja, redčenje plodičev pa v

zgodnjih fazah razvoja ploda vse do premera plodov 30 mm. Oba pristopa imata svoje

prednosti in slabosti, vendar je med pridelovalci nekako bolj zaživelo redčenje plodičev.

Glavni razlogi, da se pridelovalci odločajo za redčenje plodičev, so spomladanske pozebe

in nezmožnost predvidevanja uspešnosti oploditve v času cvetenja. V času, ko so plodiči

debeline 10-12 mm in so primerni za redčenje, lahko pridelovalec že vizualno oceni,

kakšen je nastavek plodov in kako močno je potrebno redčiti za dosego optimalne

obremenitve drevesa. Druga slabost redčenja v času cvetenja je, da nas po izvedenem

redčenju lahko preseneti pozna spomladanska pozeba, ki nam še dodatno razredči cvetove

in soočimo se s težavo, da je obremenitev drevesa premajhna, kar povzroči dodatne

nevšečnosti.


Glede na metodo redčenja poznamo poleg naravnega trebljenja plodov, ki je pri sadnih

vrstah kot je jablana močno izraženo, tri tehnološke načine, in sicer ročno redčenje,

mehansko redčenje in kemično redčenje. Pri ročnem redčenju gre za enostavno

odstranjevanje cvetov ali plodičev (običajno manjših oz. slabše razvitih). Pri mehanskem

redčenju imamo na voljo več pristopov. Ob ali tik po cvetenju lahko uspešno redčimo z

razpršenim curkom vode, ki je pod določenim pritiskom. Drugi način je z uporabo strojev,

ki stresajo drevesa. Takšni stroji se uporabljajo tudi za mehansko obiranje plodov. Vendar

ta način ni optimalen, ker odpadejo večinoma debelejši plodiči, prav tako je veliko

poškodb na drevesih (Westwood 1992). Tretji način mehanskega redčenja je s pomočjo

naprave, ki deluje po principu vertikalno vrtečih se sintetičnih vrvic, ki odstranijo določen

delež cvetov (Blanke 2008). Pri slednjem gre po avtorjevem mnenju za dokaj dodelano

tehniko, kjer lahko z različnim kotom vrtenja teh vrvic in uravnavanjem obodne hitrosti

posameznega dela naprave uspešno prilagajamo jakost redčenja. Vendar naprava povzroča

tudi poškodbe na listih, ki so nato potencialna vstopna mesta za okužbe, prav tako se na ta

način lahko prenašajo bolezni, katerih okužba se vrši preko celičnega soka (virusi,

fitoplazme).

Tretji način pa je redčenje s pomočjo kemičnih sredstev oz. rastnih regulatorjev in je med

pridelovalci najbolj razširjen. V tem primeru gre za aplikacijo različnih (običajno)

sintetičnih snovi, ki poudarijo/inducirajo odpadanje večjega/manjšega deleža

cvetov/plodov na drevesu. Sodobno intenzivno sadjarstvo, ki zaradi močne konkurence na

trgu teži k optimiranju stroškov v današnjem času več ne prenese dodatnega stroška, ki bi

ga predstavljalo ročno redčenje plodičev. Zato se današnji sadjarji največkrat poslužujejo

redčenja s kemijskimi sredstvi. Težava, s katero se srečujejo pridelovalci kot tudi

raziskovalci pri redčenju s kemijskimi sredstvi, je predvsem v preslabi zmožnosti

predvidevanja delovanja. Na učinek delovanja vpliva veliko število dejavnikov od

kultivarja, koncentracije aktivne snovi, časa aplikacije, načina aplikacije do vrste okoljskih

faktorjev. Glede na število dejavnikov, ki vplivajo na učinkovitost delovanja teh sredstev

Wertheim (2000) meni, da obstaja dvom, ali bo učinkovitost teh sredstev sploh kdaj možno

popolnoma predvideti.


2.2 Fiziološke osnove abscizije plodičev

Abscizija je proces, ki se pri rastlini lahko pojavi v različnih razvojnih fazah v času rastne

dobe. Samo abscizijo lahko definiramo kot ločitev organa ali dela rastline od starševske

rastline (Arteca 1995). V sklopu raziskav doktorske disertacije smo se podrobneje

osredotočili na abscizijo plodičev jablane. Abscizija plodov ali odpadanje plodov se lahko

ob določenih razmerah izvrši od oplodnje pa vse do zrelosti. Za sadjarstvo so pomembna

predvsem obdobja, ko je odpadanje plodov bolj poudarjeno. Nekako velja, da so pri sadnih

vrstah tri obdobja močnejšega odpadanja plodov, in sicer odpadanje plodičev kmalu po

oplodnji (1-2 tedna po koncu cvetenja), drugo naravno trebljenje plodov oz. »junijsko

trebljenje« (4-6 tednov po cvetenju) in odpadanje že skoraj dozorelih plodov tik pred

obiranjem. Z nekaterimi ukrepi lahko vzpodbudimo ali zavremo abscizijo in s tem

vplivamo na dejavnike, ki so pomembni za kvaliteto pridelka, redno rodnost. Vendar je za

izvajanje takšnih ukrepov najprej potrebno poznavanje naravnega procesa abscizije.

Fiziološko gledano abscizija zajema dva pomembna procesa, in sicer: ločitev (separacijo)

in zaščito ranjenega dela. V večini primerov se oba procesa odvijata hkrati, čeprav

obstajajo tudi izjeme (Arteca 1995). Predpogoj za izvedbo abscizije je nastanek oz.

definiranje mesta, kjer bo prišlo do ločitve celic. Odpadanje organov (plodov, cvetov) se

izvrši na določenem, predhodno definiranem mestu, ki ga imenujemo abscizijska cona

(AZ) (Roberts in sod. 2002). AZ je običajno zgrajena iz enega ali več plasti tankih

parenhimskih celic, ki so razporejene okrog peclja in tvorijo nekakšen omot (Arteca 1995).

Na mestu AZ lahko že pred začetkom vidimo sloj sploščenih manjših celic. Do

diferenciacije AZ pride že mnogo prej, preden se začne abscizija. Sama formacija je prav

tako pod vplivom rastnih regulatorjev, pri tem podatki iz raziskav nakazujejo, da etilen

verjetno sproži začetek tvorbe AZ, medtem ko indol ocetna kislina (IAA) »določi« mesto

formiranja cone (Roberts in sod. 2002). Primarna dejavnika, ki vplivata na aktivacijo

abscizije na nivoju AZ, sta etilen ter avksin IAA oz. razmerje med njima (Taylor in

Whitelaw 2001). Dokler je bazipolarni tok IAA skozi AZ dovolj močan, je le-ta

neobčutljiva na etilen in abscizija se ne izvrši, ko pa pade pretok avksinov pod določen

nivo, postanejo celice AZ občutljive na etilen, ki vzpodbudi sintezo hidrolitskih encimov


(Bonghi in sod. 2000). Če poenostavimo, je abscizija proces, zaviran s strani avksina in

stimuliran s strani etilena (Wertheim 2000). Sama vloga IAA je, da vzdržuje AZ

neobčutljivo na etilen. Vendar vloge etilena in IAA le niso tako enostavne. V prvi fazi IAA

preprečuje začetek abscizije, ko pa je le-ta inducirana, pa ima pozitiven učinek na potek

abscizije. Prav aplikacija etilena v fazi, ko je AZ neobčutljiva na etilen, ne vzpodbudi

abscizije, medtem ko aplikacija v fazi, ko se je abscizija že začela, močno pospeši razvoj

(Arteca 1995). Vzrokov za padec oz. zmanjšanje t.i. bazipolarnega transporta IAA je lahko

več in jih bomo omenjali v nadaljevanju, vendar ko je dosežen tako nizek nivo IAA na

mestu AZ, da so izpolnjeni pogoji za začetek abscizije, se najprej razgradi osrednja lamela

celic, ki ležijo na distalni strani AZ (so bolj oddaljene od stebla). To se zgodi pod vplivom

hidrolitskih encimov (pektinaze, celulaze), ki se v celične stene izločijo iz citoplazme.

Obenem se z razgradnjo teh celic v celicah, ki ležijo bližje steblu (proksimalni del), začne

povečana sinteza etilena. Nato se celice, ki ležijo na proksimalni strani AZ, začnejo večati,

medtem ko rast celic na distalni strani AZ stagnira. Kombinacija razgradnje osrednjih

lamel in mehanskih sil, ki jih povzroča različna rast celic, privede do ločitve dveh plasti -

separacije (Arteca 1995). Kljub tej dokaj razumljivi razlagi abscizije se pojavi vprašanje,

zakaj nekateri plodovi odpadejo, drugi pa ne? Kateri so tisti dejavniki, ki določijo, kateri

plodovi se bodo obdržali na drevesu? Odgovor je poskušal podati Bangerth (2000), ki

govori o absciziji kot posledici rezultata več korelativnih dejavnikov.

V zadnjem obdobju kot vzroka oz. razlagi za odpadanje mladih plodičev prevladujeta dve

hipotezi: a) nezadostna oskrba plodov z asimilati, kot posledica omejene produkcije

asimilatov ali omejenega transporta amimilatov do plodičev (t.i. asimilatna teorija), b)

hormonsko reguliran mehanizem.

V začetku vegetacije jablana za rast in razvoj porablja večinoma rezervne hranilne snovi,

nakopičene ob koncu prejšnje vegetacije, saj je asmimilacijska sposobnost manjša, kot so

dejanske potrebe rastline (Dickson 1991). Ta negativna bilanca ogljikovih asimilatov bi naj

bila na najnižji točki 2-4 tedne po cvetenju (Lakso in sod. 1999), kar sovpada s časom, ko

na drevesu začnejo intenziven razvoj in rast mladi plodiči, ki pa so zelo dovzetni za

pomanjkanje ogljikovih asimilatov (Byers in sod. 1985), kar bi posledično lahko sprožilo


začetek abscizije. Aplikacija sredstev, ki inhibirajo fotosintezo, kot je npr. terbacil, vpliva

na večjo abscizijo plodičev. Prav tako uporaba NAA vpliva na zmanjšanje fotosinteze za

do 25 % (Stopar in sod. 1997). Nižjo fotosintetsko aktivnost pa lahko dosežemo tudi s

senčenjem (Zibordi in sod. 2009, Morandi in sod. 2011). Na genetskem nivoju so

ugotovili, da se je po senčenju ekspresija genov, ki so povezani z metabolizmom

ogljikovih spojin, najbolj povečala (Zhou in sod. 2008). Prav tako pomanjkanje asimilatov

močno poveča kompeticijo med plodovi. Kompeticija je eden izmed pomembnih

dejavnikov abscizije (Black in sod. 1995). Plodovi brez kompeticije v socvetju so namreč

mnogo manj dovzetni za abscizijo v primerjavi s plodovi, ki so znotraj socvetja podvrženi

konkurenčnosti. V primeru kompeticije znotraj socvetja ima pomembno vlogo tudi pozicija

v socvetju, kajti LP so vedno v podrejenem položaju v primerjavi z CP (Bangerth 2000) in

zaradi tega bolj podvrženi absciziji.

Za razumevanje hormonsko regulirane abscizije je potrebno poznavanje dveh fizioloških

procesov: 1. aktivacija abscizijske cone (AZ) določenega plodiča, kar je ključen dogodek

za začetek abscizije in 2. hormonsko kontroliran pojav dominance med plodiči ter med

plodičem in vegetativnim poganjkom. V splošnem velja, da je aktivacija AZ pod vplivom

dveh regulatorjev, in sicer etilena ter avksinov (predvsem indol ocetne kisline-IAA)

(Bangerth 2000).

Medtem ko je zadnja stopnja delovanja etilena dokaj dobro raziskana, pa je proces

desenzibiliziranja AZ kot posledica zmanjšanja koncentracije IAA zelo slabo proučevan.

IAA se smatra kot glavni dejavnik, ki vpliva na (ne-)občutljivost celic AZ na etilen, vendar

ni nujno, da je to edini dejavnik. Obstajajo obdobja, ko AZ ni občutljiva na etilen, čeprav

je transport IAA nizek. V preteklosti so abscizijo plodičev razlagali na podlagi dognanj z

abscizijo listov in zorečih plodov. Abscizija starajočih listov ali zorečih plodov je vodena

preko etilena na način, da se ob staranju v plodu ali listu začne tvorba etilena, ki nato

negativno vpliva na pretok avksinov do AZ, kar posledično povzroči občutljivost AZ na

etilen, ki sproži začetek abscizije. Bangerth (2000) meni, da teorija o odpadanju zorečih

plodov ne more vzdržati v primeru, ko gre za odpadanje mladih plodičev, zato je sam

razvil novo različico hormonsko vodene abscizije. Tudi Dennis (2002) meni, da abscizije


plodičev ne moremo primerjati z abscizijo listov, saj kemična sredstva, ki jih uporabljamo

za redčenje plodičev, nimajo vpliva na odpadanje listov. To potrjuje dejstvo, da s sredstvi

za kemično redčenje samo vzpodbudimo oz. povečamo delež plodov, ki odpadejo ob

naravnem »junijskem trebljenju«.

Pri mladih plodičih se staranje prične takrat, ko so ti predhodno že določeni, da bodo

odpadli. To pomeni, da etilen ne more biti tisti, ki bi neposredno vplival na pretok

avksinov. Prav tako povišanje etilena ni značilno za zelo zgodnje faze abscizije. Ugotovili

so, da se v kratkem po nastavku plodov zviša koncentracija IAA, medtem ko se sinteza

etilena zmanjša.

Vsa ta dejstva nakazujejo, da etilen ni primarni dejavnik, ki sproži abscizijo plodičev, kot

to velja za abscizijo listov. Verjetno obstaja nek drug mehanizem, ki povzroči negativno

regulacijo IAA in s tem občutljivost AZ. Bangerth (2000) meni, da gre za korelativen

dominanten učinek več dejavnikov, v prvi vrsti za učinek med plodovi v socvetju in

sosednjimi vegetativnimi poganjki. Po tej teoriji je odločitev, kateri plodiči v socvetju bodo

odpadli, odvisna od jakosti bazipolarnega toka IAA. Avtor predvideva, da dominantni

plodiči s svojim močnim bazipolarnim tokom inhibirajo bazipolarni tok recesivnih

plodičev. Na jakost dominance vpliva več dejavnikov:

- razlika (ure ali dnevi) v času oploditve,

- število semen v plodu,

- neposredna bližina in bujnost bližnjih poganjkov,

- število plodov v socvetju.


Slika 1: Socvetje jablane. Številke ob plodičih kažejo hierarhično razvrstitev plodov glede

na jakost dominance (Bangerth 2000, str. 47).

Znano je, da centralni cvet zacveti prvi in je v razvoju pred lateralnimi cvetovi, zaradi tega

je tudi njegov bazipolaren tok dominanten nad ostalimi. Število semen v plodu prav tako

vpliva na jakost bazipolarnega toka, in sicer večje je število semen, višja je moč

dominance. Tudi bližina vegetativnih poganjkov lahko zavira bazipolarni tok iz cvetov. Ko

se vsi ti dejavniki kumulativno seštejejo, pade jakost bazipolarnega toka IAA nekega

plodiča pod neko kritično mejo in AZ teh plodičev ni več neobčutljiva na etilen in s tem so

omogočeni pogoji za delovanje etilena, ki povzroči abscizijo. Vendar so pri nekaterih

plodovih, ki pozneje odpadejo, ugotovili tudi povišanje koncentracije IAA na bazi peclja.

Takšen rezultat je možna posledica prekinitve ali inhibicije transporta IAA na stiku z vejo

pri čemer bi nato prišlo do kopičenja IAA na bazi peclja. Zaradi takšnih in podobnih

rezultatov se postavlja tudi vprašanje, ali je za desenzibiliziranje AZ odločilna

koncentracija IAA v predelu AZ ali pretok IAA skozi AZ (Bangerth 2000). Glede na to, da


delovanje oz. mehanizem delovanja sredstev za redčenje še ni popolnoma jasen, so

ugotavljali tudi učinek nekaterih sredstev na IAA, pri čemer je bilo ugotovljeno, da se je

transport IAA po tretiranju z NAA, Ethrelom in Karbarilom nekoliko zmanjšal (Bangerth

2000).

2.3 Sredstva za regulacijo abscizije plodičev

Prvi načrtni poskusi redčenja s kemijskimi sredstvi segajo v 30. leta prejšnjega stoletja

(Faust 1989). Prve kemične spojine, ki povzročijo odpadanje cvetov oz. plodov je odkril

Bagenal (1925 V: Dennis 2000), ki je testiral različne pripravke na jablanov škrlup

(Venturia inaequalis) in ugotovil, da sredstva, ki vsebujejo »apneno žveplo«, povzročijo

nenormalno odpadanje plodov. Pozneje se je pričelo preizkušanje različnih snovi, kot so

kalcijev polisulfid, cinkov sulfid, bakrov sulfid, natrijev nitrat ter razne oljne emulzije,

vendar nobeno sredstvo ni dalo zadovoljivih rezultatov. Ta sredstva, ki so sicer uspešno

redčila cvetove, so obenem povzročala veliko poškodb na vejah in listih. Na koncu so prišli

do ugotovitve, da so najboljši rezultati z uporabo tarovega olja, čeprav je v določenih

pogojih delovalo toksično in povzročalo mrežavost plodov (Dennis 2000). Nato sta leta

1940 MacDaniels in Hildenbrand ugotovila, da sredstvo dinitro-orto-krezol (DNOC ali

Elgetol), ki ga apliciramo na brazdo pestiča, preprečuje kalitev peloda. Uporaba DNOC se

je precej razširila v ZDA, vendar se je leta 1989 uporaba prekinila predvsem zaradi velikih

stroškov ponovne registracije in oporečnosti zaradi težkih kovin, ki jih je vsebovalo

sredstvo.

V današnjem času sredstva za redčenje razdelimo v dve skupini, in sicer v prvo skupino

sodijo sredstva za zaščito rastlin s stranskim učinkom na odpadanje plodov (karbaril,

metiokarb). V drugo skupino pa pripravki, ki delujejo na hormonski osnovi, to pa so:

etefon, naftil ocetna kislina (NAA), naftilacetamid (NAAm) in benziladenin (BA) (Stopar

1998). Sredstva iz prve skupine so v bistvu insekticidi in zaradi tega ekološko manj

primerni. Čeprav je bilo redčenje s karbarilom (pripravek Sevin) zadovoljivo, se ravno


zaradi toksičnosti na opraševalce (čebele) ni uveljavilo. Skupina t.i. hormonskih

pripravkov je iz ekološkega vidika veliko manj oporečna. Problem teh sredstev pa je v

nekonsistentnosti delovanja. V nekaterih letih sploh ne redčijo, medtem ko v nekaterih

letih ob enaki uporabljeni dozi povzročijo preobilno odpadanje plodičev (Stopar 1998).

2.3.1 Mehanizem delovanja sredstev za redčenje

Sredstva, ki se uporabljajo za t.i. kemično redčenje, delujejo po dveh principih. Z njimi

lahko preprečimo velik nastavek cvetov/plodov, pri tem gre za redčenje cvetov. Lahko pa s

pomočjo kemičnih sredstev povečamo delež plodov, ki bodo odpadli ob »junijskem

trebljenju« (Dennis 2002).

Pri principu delovanja redčenja cvetov gre za mehanizme, ki preprečijo oprašitev, kalitev

peloda in oploditev na način, da poškodujejo prašnike, pestič ali pelodno cev (Fallahi in

Willemsen 2002). Znano je namreč, da plodovi, ki niso oplojeni, odpadejo (Wertheim

2000). Nekatera sredstva pa povzročijo poškodbe na cvetovih, zaradi katerih le-ti odpadejo

(Dennis 2002). Prednost redčenja cvetov je v ugodnem vplivu na nastavek cvetnih brstov

za prihodnje leto ter ugodnem vplivu na velikost plodov. Pri raziskavi, ki jo je opravil Link

(2000), so ugotovili, da se je povprečna velikost plodov pri obravnavanju, ki je bilo rečeno

v času pred polnim cvetenjem, povišala za 30 % v primerjavi s povprečjem plodov, ki so

bili redčeni po »junijskem trebljenju«. Vendar pa je, kljub tem ugodnim rezultatom

redčenje cvetov med pridelovalci manj priljubljeno, saj se v času cvetenja ne da točno

predvideti, kolikšno število cvetov se bo uspešno oplodilo. Oplodnja je predvsem odvisna

od vremenskih pogojev v času cvetenja in s tem pogojene aktivnosti opraševalcev.

Nekatera izmed teh sredstev v določenih pogojih delujejo fitotoksično ter povzročajo

mrežavost plodov. Poleg koncentracije je zelo pomemben dejavnik tudi čas aplikacije, ki

pa je lahko pri redčenju cvetov precej težaven. Začetek cvetenja med posameznimi drevesi

v sadovnjaku je običajno različen, prav tako obstaja tudi variabilnost med posameznimi

deli drevesa. Pozabiti pa ne smemo na naknadno nevarnost pozebe, ki nam lahko še


dodatno »razredči« pridelek. Predvsem zaradi zadnjega dejavnika Fallahi in Willhelmsen

(2002) zaključujeta, da je redčenje cvetov primerno le v območjih, kjer je nizka verjetnost

pozebe.

Mehanizem delovanja sredstev, ki se uporabljajo za redčenje plodičev, pa je bolj

kompleksen. Fiziologi, ki se ukvarjajo s to tematiko, še niso izoblikovali enotnega mnenja

glede vpliva teh sredstev na pomembne fiziološke dejavnike, kot so: floemski tok, vsebnost

rastlinskih hormonov, biosinteza hormonov, razvoj semen in drugi (Dennis 2002).

Raziskovalci so skozi proces eksperimentiranja dobili različne rezultate, ki potrjujejo ali

negirajo določene mehanizme delovanja. Tako Dennis (2002) v svojem članku, ki

povzema pomembnejše raziskave iz preteklosti, navaja sedem potencialnih poti oz.

mehanizmov preko, katerih delujejo sredstva za redčenje plodičev. Po njegovih podatkih

so potencialni mehanizmi delovanja naslednji:

1. zaviranje razvoja semen,

2. poznejša abscizija (močno se poveča kompeticija med plodiči),

3. blokada transporta hranil iz listov v plodove,

4. zmanjšana sinteza avksinov v semenih,

5. zmanjšan transport avksinov iz plodov,

6. pospešena biosinteza etilena,

7. zaviranje fotosinteze.

Posamezne izmed naštetih hipotez so bile različno sprejete v strokovnih krogih. V zadnjem

obdobju sta nekako najbolj uveljavljeni in najbolj raziskani t.i. »hormonska« teorija

abscizije in t.i. »asimilatna« teorija abscizije (Stopar 1998). Če pregledamo samo nekaj

pomembnejših rezultatov različnih raziskav, lahko pridemo do kontradiktornih zaključkov.

Prvi rezultati proučevanja vpliva sredstva za redčenje NAA na razvoj semen v plodičih so

nakazali, da NAA vpliva na manjše število semen v plodovih. Plodovi z manjšim številom

semen pa niso tako konkurenčni za hranila. Pri dokazovanju tega mehanizma so naleteli

tudi na nekatera nasprotja, in sicer vpliva NAA na manjše število semen v plodovih ni

uspelo dokazati pri vseh kultivarjih, prav tako je Denis (1970 V: Dennis 2002) ugotovil, da

NAA redči tudi plodiče, ki nimajo semen. Pozitivne rezultate o redčenju brez semenskih


plodov z NAA navaja tudi Byers (2003). Podatkov, s katerimi bi lahko potrdili ali ovrgli

hipotezo, da sredstva za redčenje blokirajo oz. prekinejo dotok hranil iz listov v plodove, je

malo. Z večjo gotovostjo lahko trdimo, da aplikacija NAA vpliva na zmanjšanje sinteze

avksinov v plodovih ter zmanjšan transport avksinov proti AZ, kar sta s poskusi dokazala

Ebert in Bangerth (1981 in 1982). Povezanost etilena z odpadanjem plodičev je prvi opazil

Murneek (1954 V: Dennis 2002), vendar dejanske korelacije ni mogel dokazati. Korelacijo

med abscizijo in etilenom je uspelo dokazati šele 25 let kasneje Walshu in Williamsu, ki

sta v poskusih opazovala vpliv etefona in NAA na koncentracijo etilena. Nasprotno pa

Ebert in Bangerth (1981) ugotavljata močno zvišanje etilena samo ob aplikaciji etefona,

medtem ko ima NAA majhen učinek na sintezo etilena. Pozneje je bil tudi dokazan majhen

vpliv NAA in BA na biosintezo etilena (Greene in sod. 1992). Tudi Byers (2003) in

Greene s sod. (1992) sta ugotovila pozitivno korelacijo med BA in etilenom, vendar

navajata, da povečanje etilena, ki ga je sprožila BA, ni bilo tako močno, da bi lahko trdili,

da je etilen bil glavni promotor abscizije. Na podlagi teh rezultatov bi lahko zaključili, da

etilen ni primarni dejavnik, ki kontrolira odpadanje plodičev. O mehanizmu delovanja

preko zaviranja fotosinteze obstajajo prav tako rezultati, ki to potrjujejo. Ugotovili so, da

senčenje ali pa aplikacija kemičnih sredstev, ki zavirajo fotosintezo (terbacil), močno

vpliva na odpadanje plodičev (Dennis 2002). Tudi aplikacija NAA zavre asimilacijo

ogljika do 25 %, medtem ko BA nima vpliva na fotosintezo (Stopar s sod. 1997). Na

podlagi zbranih podatkov Dennis (2002) zaključuje, da v bistvu nobena hipoteza ne ustreza

vsem sredstvom, ki se uporabljajo.

2.3.2 Redčenje plodičev

Kot smo že omenili, se je v praksi bolj uveljavilo redčenje plodičev, zaradi tega se bomo v

nadaljevanju nekoliko bolj osredotočili na to metodo, vendar bomo vmes podali tudi

nekatere podatke, ki se nanašajo na redčenje cvetov. Za redčenje plodičev se uporabljajo

sredstva, ki temeljijo na hormonskem delovanju (Stopar 1998), in sicer: naftil ocetna

kislina (NAA), naftilacetamid (NAAm), etefon ter benziladenin (BA) (Wertheim 2000).


Ena izmed slabosti pri redčenju s temi pripravki je nekonsistentno delovanje. Do tega pride

predvsem zaradi velikega števila dejavnikov, ki imajo vpliv na učinkovitost določenega

sredstva. Na učinkovitost nekega sredstva lahko vplivajo zunanji dejavniki, kot so

temperatura, vlažnost (Wertheim 2000), kultivar, lokacija, »kondicija« dreves oz. nasada

(Byers 2003) ter koncentracija in čas aplikacije (Jones s sod. 1997). Predvsem zadnja dva

dejavnika sta popolnoma pod vplivom človeka in ju je mogoče prilagajati vsem ostalim

dejavnikom, na katere nimamo direktnega vpliva. Optimalen čas aplikacije se v praksi

določa glede na število dni po polnem cvetenje ali pa glede na debelino oz. premer CP. Pri

aplikaciji NAA so ugotovili, da je bolj primerno čas izvedbe določiti na podlagi debeline

CP, in sicer je to v času, ko je CP premera med 10-12 mm (Black in sod. 1995). Precej

nejasen je tudi vpliv svetlobe oz. intenzitete osvetlitve na učinek redčenja, ki ima sicer

indirekten vpliv, vendar očitno zelo pomemben. Wertheim (2000) zato pravi, da bi bilo

potrebno raziskati predvsem vpliv interakcij med temperaturo, zračno vlago in svetlobo.

Vplive različnih dejavnikov nekako najbolje povzema Hull (neobjavljeno), ki pravi da

moramo pri redčenju z rastnimi regulatorji posvetiti pozornost naslednjim dejavnikom: 1.

koncentracija - zelo ozek razpon, kjer je delovanje optimalno; 2. čas aplikacije - optimalen

čas je običajno le nekaj ur; 3. sorta - variabilna odzivnost kultivarjev; 4. listna masa - nanos

sredstva mora biti po celi krošnji drevesa; 5. okolje - vpliv okolja je zelo močan in

nepredvidljiv; 6) drevesna bujnost ter stres - drevesa s slabo bujnostjo in izpostavljenostjo

stresu se ponavadi (pre)močno odzovejo.

2.3.3 Sredstva za redčenje cvetov/plodičev jablane

V primeru, ko se odločimo za redčenje s kemičnimi pripravki, ima lahko pridelovalec

težave pri izboru pripravkov. Pridelovalcem največ težav povzroča dejstvo, da je na trgu

premalo registriranih pripravkov ali pa jih sploh ni. Poraba sredstev za redčenje je relativno

majhna v primerjavi s porabo ostalih fitofarmacevtskih sredstev. Zaradi tega velike

farmacevtske družbe nimajo interesa za registracijo teh sredstev, ki običajno stanejo precej

denarja. V Sloveniji je trenutno stanje glede registracije sredstev za redčenje zelo ugodno,


saj so bila v letu 2007 tri sredstva registrirana na novo. Tako smo imeli v letu 2008 za

redčenje na voljo 3 rastne regulatorje (Stopar in sod. 2008):

- AMID THIN W (a.s.: 1-naftilacetamid oz. NAD),

- DIRAGER (a.s.: 1-naftil ocetna kislina oz. NAA),

- MAXCEL (a.s.: 6-benziladenin oz. BA).

Na podlagi tega lahko sklepamo, da imamo v Sloveniji dovolj pripravkov za uspešno

redčenje. Če primerjamo z ostalimi evropskimi državami, ugotovimo, da je v Sloveniji

registriranih več sredstev kot v nekaterih ostalih evropskih državah.

2.3.4 1-naftil ocetna kislina ali NAA

NAA spada med avksine in jo nekako štejemo kot sintetično »različico« indol ocetne

kisline (IAA). Za avksine je značilno, da sodelujejo pri veliko procesih, kot so: apikalna

dominanca, rast plodov, nastavek plodov, zorenje plodov, abscizija listov in plodov

(Greene 2003).

NAA je bilo prvo sredstvo, ki so ga uporabljali za redčenje plodičev (Wertheim 2000).

Njegova jesenska aplikacija pa tudi preprečuje predčasno odpadanje zorečih plodov (Hull,

neobjavljeno). NAA učinkovito deluje na odpadanje plodičev od konca cvetenja do

debeline plodičev 15 mm (Byers 2003), najboljšo učinkovitost pa dosežemo, če aplikacijo

izvedemo, ko je centralni plodič premera 9-12 mm (Hull, neobjavljeno). Sredstvo je

primerno predvsem za kultivarje, ki se težje redčijo. V praksi se najpogosteje uporabljajo

koncentracije 5-12 mg/l (Greene 2002), lahko pa tudi do 20 mg/l (Wertheim 2000). Vendar

je treba opozoriti, da prevelike koncentracije povzročijo večji delež pritlikavih plodov

(Greene 2002), predvsem pri višjih temperaturah (Wertheim 2000). Učinek delovanja je

viden po 7-10 dneh, ter se odrazi v tem, da nekateri plodiči zastanejo v rasti (Hull,

neobjavljeno). Glede načina aplikacije sta Schneider in Lasheen (1973) ugotovila, da ima

aplikacija NAA samo na liste ali pa samo na plodove enak učinek. NAA vpliva na


zmanjšanje pretoka avksinov, predvsem pri slabše razvitih plodovih, kar vpliva direktno na

pritok asimilatov ali pa indirektno z zmanjšanjem fotosintetske aktivnosti listov (Wertheim

2000). Takoj po aplikaciji je lahko tudi za kratek čas prekinjena rast plodičev (Link 2000).

Stopar s sod. (1997) je ugotovil, da je tretiranje z NAA vplivalo na zmanjšanje

fotosintetske aktivnosti med 10-24 %, odvisno od koncentracije. Hull je nekatere

pomembnejše sorte jablan razdelil v dve skupini, glede na odzivnost redčenja z NAA:

1. sorte, ki se lažje redčijo (McIntosh, Delišes, Empire, Jonatan, Jonagold, Gala); 2. sorte,

ki se težje redčijo ('Wealty', 'Fuji', 'Zlati delišes'). Pri sortah, ki se lažje redčijo, zadošča

koncentracija okrog 10 mg/l, medtem ko je pri sortah, ki se težje redčijo, potrebna višja

koncentracija ( 20 mg/l).

2.3.5 1-naftilacetamid ali NAD

NAD je po učinku blažje sredstvo v primerjavi z NAA. Uporablja se lahko v

koncentracijah do 100 mg/l, vendar običajno med 35-50 mg/l. Za NAD so ugotovili, da ni

primeren za redčenje sorte 'Zlati delišes', ker močno zviša delež pritlikavih plodov

(Williams in Edgeerton 1981). Redčenje z NAD se uporablja predvsem pri sortah, ki

zgodaj zorijo, potrebna je koncentracija okrog 50 mg/l, ki jo apliciramo ob odpadanju

venčnih listov.

2.3.6 6-benziladenin ali BA

Citokinini v osnovi stimulirajo delitev celic (citokineza), predvsem v začetnih razvojnih

fazah. Najpomembnejši citokinin je snov zeatin, pri zunanjih aplikacijah pa uporabljamo

sintetično obliko citokinina, ki je v obliki benziladenina (Greene 2003). BA se je začel

uporabljati pozneje kot NAA in je sprva kazal zelo obetavne rezultate. Benziladenin (BA)

sodi med novejše pripravke. Poleg tega, da redči plodiče, ima tudi pozitiven učinek na

velikost plodov ter na povratno cvetenje (McLaughlin and Greene 1984 V: Greene 2002).


Uporablja se v koncentracijah med 50-150 mg/l, lahko tudi do 200 mg/l (Link 2000). BA

ima pozitiven vpliv na velikost plodov s tem, da stimulira delitev celic in na ta način vpliva

na večje število celic v plodu, nima pa vpliva na velikost samih celic (Byers 2003). Na

povečanje plodov vpliva tudi takrat, ko ne sproži abscizije (Link 2000). Učinkovitost BA

je najboljša, če jo apliciramo ob debelini CP 10 mm. Za optimalen učinek je potrebno

sredstvo enakomerno nanesti na celotno krošnjo (Hull, neobjavljeno). Pri sortah, ki se lažje

redčijo, zadostuje koncentracija 50-75 mg/l, medtem ko pri sortah, ki se težje redčijo,

uporabimo koncentracijo 75-150 mg/l BA. Opozoriti je potrebno tudi, da imajo prevelike

koncentracije za posledico večjo mrežavost plodov, slabšo obarvanost plodov, večjo

vegetativno rast (Wertheim 2000). Za BA so tudi ugotovili, da ima aplikacija samo na liste

boljši učinek v primerjavi z aplikacijo samo na plodove (Greene in sod. 1992). Vendar do

pozitivnega učinka BA na povečanje plodov pride le v primeru, ko je aplikacija izvedena

tudi na plodove (Greene in sod. 1992).

Zaenkrat še ni znan mehanizem delovanja BA, vendar se predvideva, da pospeši

vegetativno rast, kar negativno vpliva na pretok avksinov iz plodov (Wertheim 2000).

Stopar (1997) je ugotovil, da BA nima vpliva na neto fotosintezo, medtem ko sta Yuan in

Greene (2000) ugotovila, da bi naj BA vplival na večjo respiracijo v temotni fazi, kar bi

lahko imelo negativen vpliv na neto asimilacijski pridobitek rastline.

Kljub temu da BA v določenih okoljskih pogojih kaže spremenljivo delovanje, lahko

rečemo, da je učinkovitost delovanja manj nekonsistentna v primerjavi z NAA.

2.3.7 Etefon

Etefon smatramo kot sredstvo, katerega delovanje je zelo odvisno od koncentracije in

temperature, na učinkovitost pa močno vpliva tudi količina škropilne brozge. Je edino

sredstvo, ki redči v fenološkem stadiju od cvetenja do premera plodov 25-30 mm (Byers

2003). Vendar je učinkovitost redčenja z etefonom precej odvisna od razvojne faze jablane

(Greene 2002). Učinkovito deluje, če izvedemo aplikacijo v času cvetenja, vendar je


aplikacija 7 dni pozneje lahko že neučinkovita (Bound in sod. 1993). Občutljivost plodičev

se nato zopet poveča, ko ti dosežejo debelino 16-22 mm (Marini 1996). Če etefon

uporabljamo za redčenje cvetov, je potrebno aplikacijo izvesti v fazi »rdečih brstov«

(Wertheim 2000). Delovanje etefona je v primerjavi z ostalimi sredstvi jasno, saj je

nesporno, da aplikacija etefona močno zviša koncentracijo etilena. Razlage glede vloge

etilena pri procesu abscizije pa so si še vedno kontradiktorne (Dennis 2000). Prav zaradi

lastnosti, ker je etefon učinkovit še v poznejših fazah napram ostalim sredstvom, se ga

pogosto uporablja za korekcijsko redčenje. Ugotovili so tudi, da etefon ugodno vpliva na

povratno cvetenje, po aplikaciji pa tudi nekoliko zavre rast vegetativnih poganjkov

(Wertheim 2000). Pri delu z etefonom so potrebne tudi določene izkušnje oz. previdnost,

saj lahko ob nepravilni uporabi povzroči popolno abscizijo (Byers 2003).

2.3.8 Karbaril

Karbaril je najbolj vsestransko sredstvo za redčenje plodičev pri jablani. Učinkovito deluje

od odpadanja venčnih listov pa do debeline plodov 18 mm (Greene 2002). Najučinkoviteje

deluje, če aplikacijo izvedemo, ko so plodovi debeline 12 mm. Zadostuje koncentracija

750 mg/l. Dobra lastnost karbarila je, da nima negativnih vplivov na drevo, prav tako je

delovanje manj odvisno od okoljskih dejavnikov (Wertheim 2000). Karbaril je v bistvu

akaricid, ki ga poznamo pod komercialnim imenom Sevin. Zaradi svojega toksičnega

delovanja na roparske pršice in čebele je njegova uporaba sporna. Prav tako od leta 2003

dalje v Sloveniji nima registracije, zato njegova uporaba ni dovoljena, tako kot v večini

držav EU.

V zadnjem času se za redčenje sadnih vrst preizkušajo tudi nove aktivne snovi, ki kažejo

potencialno ugoden vpliv na redčenje. Takšne snovi so: pelargonska kislina,

monokarbamid dihidrogen sulfat, endotalska kislina, amonijev tiosulfat, urea, idr.

(Wertheim 2000).


2.4 Vpliv zunanjih dejavnikov na učinkovitost redčenja

Nekonsistentno delovanje sredstev za redčenje plodičev je najverjetneje v veliki meri

posledica zunanjih dejavnikov, ki vplivajo na učinkovitost delovanja določenega sredstva.

Pri nadzorovanju zunanjih dejavnikov smo bolj ali manj omejeni, poleg tega je v določenih

primerih težko predvideti, v kolikšni meri bodo zunanji dejavniki vplivali na samo

učinkovitost sredstva. Na podlagi predhodno opravljenih raziskav lahko zaključimo, da

imata glede vpliva na učinkovitost redčenja nezanemarljivo vlogo temperatura in osvetlitev

oz. vzajemen učinek teh dveh dejavnikov. Vendar poleg tega, da vplivata na učinkovitost

kemičnih sredstev za redčenje, imata tudi vpliv na samo abscizijo plodičev brez uporabe

sredstev za redčenje.

Zmanjšanje sončnega obsevanja oz. fotosintetsko aktivnega obsevanja (PAR-

photosynthetic active radiation) vpliva na abscizijo plodičev (Greene 2002, Byers in sod.

1990, Zibordi in sod. 2009). S poskusi je bilo ugotovljeno, da 2-3 dnevno zmanjšanje

osvetlitve oz. PAR občutno vpliva na povečano abscizijo plodov, če se redukcija svetlobe

izvrši v času med 14-28 dni po cvetenju (Byers in sod. 1991). Do takšne redukcije

sončnega obsevanja lahko pride v naravi ob oblačnem vremenu. Umetno take pogoje

vzpostavimo z uporabo polipropilenskih prekrivk. Nekateri podatki govorijo celo o 100 %

absciziji, če senčenje traja 5 dni, čeprav pa senčenje v obdobju po končanem junijskem

trebljenju ne vpliva na abscizijo plodov (Berueter in Droz 1991). To pomeni, da se drevesa

v različnih fenoloških fazah različno odzivajo na iste okoljske dejavnike. Običajno je tudi

naravno junijsko trebljenje plodov inducirano s pomočjo 2-3 dnevnega obdobja nekoliko

slabše osvetlitve. Slabša osvetlitev vpliva predvsem na manjšo fotosintezo (Morandi in

sod. 2011), kar privede do vse večjega pomanjkanja ogljikovih snovi in rastlina več ni

sposobna zagotoviti dovolj asimilatov za vse plodove, kar je lahko potencialen vzrok za

indukcijo abscizije (Corelli Grappadelli in sod. 1994). Zaradi kompeticije znotraj socvetja

zato najprej odpadejo slabši oz. manj razviti plodovi. Poleg tega da je redukcija svetlobe

lahko potencialen iniciator abscizije, ima količina osvetlitve po tretiranju s kemičnimi

sredstvi vpliv na učinkovitost oz. jakost odpadanja plodičev.


Poleg temperature, ki velja za najpomembnejši okoljski dejavnik, ki vpliva na odzivnost

plodičev po tretiranju s sredstvi za redčenje (Jones in Koen 1985) in svetlobe kot

samostojnih dejavnikov, obstaja tudi nezanemarljiv dejavnik korelacije med temperaturo in

osvetlitvijo/senčenjem. V primeru, ko so bila drevesa 3 dni senčena pri temperaturi 4,4 °C,

ni bilo povečanega odpadanja plodov, medtem ko je z dreves, ki so bila enako obdobje na

temperaturi 21,1 °C odpadlo več kot 50 % plodov (Byers 2003). Podobne rezultate so

ugotovili tudi pri naslednjem poskusu, vendar so dodali še en dodaten podatek. Dokazali

so, da predvsem temperatura ponoči močno vpliva na abscizijo. To so dokazali s

poskusom, ko so drevesa izpostavili visokim nočnim temperaturam ( > 15 °C) in nizkim

nočnim temperaturam (< 10 °C). Ugotovili so, da so plodovi dreves, izpostavljenih višjim

temperaturam, bili bolj dovzetni na odpadanje v primerjavi s plodovi dreves, izpostavljenih

nižjim temperaturam (Kondo in Takahashi 1987). Višje temperature ponoči imajo tudi

ugoden učinek na rast plodov. V istem poskusu so tudi ugotovili, da imajo višje

temperature močan negativen vpliv na transport IAA pri sorti 'Zlati delišes' in pa pozitiven

učinek na sintezo etilena (Kondo in Takahashi 1987). Ker je učinek visokih nočnih

temperatur vezan predvsem na temotno fazo fotosinteze, ne gre izključiti mehanizma

delovanja abscizije preko pomanjkanja asimilatov do katerega pride zaradi višje porabe

ogljikovih hidratov v nočnem času. Zanimiv podatek je tudi, da trikratna aplikacija GA4 v

času senčenja za 95 % izniči abscizijo, ki bi jo povzročilo senčenje. Ker je malo verjetno,

da bi aplikacija GA4 vplivala na dostopnost ogljikovih hidratov, lahko učinek GA4

razložimo preko pozitivnega vpliva na transport IAA iz plodičev (Callejas in Bangerth

1997).

Temperatura pa posredno vpliva tudi na samo učinkovitost določenih sredstev, ki se

uporabljajo za redčenje plodov. Za dobro učinkovitost sredstva je zelo pomembno, da se

aktivna snov čim bolje absorbira v rastlinska tkiva (Hull, neobjavljeno). Absorbcijo

zvišujejo faktorji, kot so: višja temperatura, počasno sušenje sredstva, zdravo listje,

medtem ko negativno na absorbcijo sredstev vplivajo hitro sušenje, nizke temperature in

poškodovana listna masa (Hull, neobjavljeno). Absorbcija NAA preko listov se povečuje

sorazmerno z višjo temperaturo, v razponu od 12-24 °C, in je boljša v pogojih s slabšo

osvetlitvijo, medtem ko je vpliv vlažnosti zraka sporen (Wertheim 2000). Poleg


temperature je drugi zelo pomemben dejavnik, ki vpliva na absorbcijo v rastlino, čas

sušenja kapljic (Greene 2002). Dalj časa se kapljice sušijo, večja je penetracija aktivnih

snovi v tkiva. Aktivne snovi, ki se ne absorbirajo v rastlinska tkiva in ostanejo na listni

površini, hitro izgubijo svojo učinkovitost, saj je bilo ugotovljeno, da je 4 dni po aplikaciji

NAA 80 % aktivne snovi uničene (zaradi vpliva ultravijoličnih žarkov), 10 % se je

absorbiralo v rastlino in 10 % aktivne snovi se je nahajalo na površini listov ter plodov

(Byers 2003). Boljšo penetracijo aktivne snovi se lahko doseže tudi z različnimi dodatki,

kot so močila, sredstva za boljši oprijem, sredstva za boljšo absorbcijo (Byers 2003). Z

uporabo omenjenih dodatkov se namreč podaljša čas sušenja kapljic, kar pozitivno vpliva

na količino absorbirane aktivne snovi. Do zanimivega rezultata je v svoji raziskavi prišel

tudi Jones s sod. (1988), ki je ugotovil, da učinkovitost redčenja z NAA linearno pada

glede na čas aplikacije od 8. ure zjutraj do 20. ure zvečer. Možna razlaga takšnih rezultatov

je, da je jutranja aplikacija učinkovitejša, ker je izvedena na moker list, prav tako pa je

temperatura nižja kar posledično vpliva na počasnejše sušenje kapljic.

Na podlagi različnih poskusov, osebnih opažanj in opazovanj pri pridelovalcih Byers

(2003) ugotavlja, da kombinacija kemičnega redčenja + slaba osvetlitev + tople noči

pogosto privede do (pre)močnega redčenja, medtem ko kemično redčenje ob dobri

osvetlitvi in nizki temperaturi povzroči slabši učinek redčenja. Podobnega mnenja je tudi

Greene (2002), ki ugotavlja, da so v letih, ko je pred redčenjem oblačno, hladno in mokro

so drevesa bolj odzivna, medtem ko so ob toplem suhem vremenu manj odzivna in je

redčenje plodičev težje izvedljivo oz. so le-ti manj podvrženi absciziji. V praksi se

velikokrat za izogibanje nekonsistentnosti poslužujejo kombiniranja različnih sredstev za

redčenje, kar kaže dobre rezultate (Wertheim 2000).

Če omenimo še dva tehnična dejavnika, ki imata prav tako nezanemarljiv vpliv na

učinkovitost redčenja: poraba vode in nanos škropilne brozge. Veliko poskusov je bilo

opravljenih glede optimalne porabe vode ob aplikaciji sredstev za redčenje. Glede na

različne podatke nekako še vedno prevladuje mnenje, da so najboljši rezultati ob porabi

1000 litrov škropilne brozge na hektar (Wertheim 2000). Kot drugi tehnični dejavnik, ki je

ključnega pomena za uspešno oz. enakomerno redčenje pa je enakomeren nanos škropilne


brozge. Najpogostejša napaka, ki se dogaja je premočno redčenje na delih krošnje, ki so

bližje šobam pršilnika in majhen učinek redčenja na delih krošnje, ki so bolj oddaljena

(Unrath 2002). Iz tega vidika je optimalen nanos škropilne brozge zelo pomemben

dejavnik za dosego želenih rezultatov.

Na podlagi omenjenih dejstev lahko zaključimo, da redčenje še zdaleč ni enostaven

tehnološki postopek saj zahteva od pridelovalca:

- dobro poznavanje sredstev, ki jih bo uporabil,

- poznavanje odziva sorte na posamezno sredstvo,

- poznavanje nasada,

- izkušnje z redčenjem,

- dobro opazovanje in predvidevanje vpliva okoljskih dejavnikov,

- brezhibno tehniko nanosa.

2.5 Vloga etilena pri absciziji plodičev

Etilen je edini rastni regulator, ki se v rastlini nahaja v plinasti obliki. Prav zaradi te

lastnosti so raziskovalci dolgo dvomili, ali gre za rastni regulator (Vandenbussche in sod.

2006). Etilen je najbolj znan kot rastni regulator zorenja, vendar poleg tega sodeluje oz.

vpliva na razvoj mnogih drugih fizioloških procesov v rastlini in nastaja v skorajda vseh

rastlinskih celicah ob procesih staranja, abscizije, kalitve semen, elongacije celic, razvoja

cvetov itd. (Abeles in sod. 1992, Ruperti in sod. 2002). Etilen se prav tako sintetizira v

skoraj vseh tkivih zaradi posledic stresa na rastlino, ki nastanejo zaradi biotskih ali

abiotskih dejavnikov (Davies 2004). Etilen ali kemijsko eten je najenostavnejši nenasičeni

aciklični ogljikovodik in je sestavljen iz dveh molekul ogljika in štirih molekul vodika

(C2H4).


Etilen se v rastlini sintetizira iz amino kisline metionin. V prvi fazi se metionin s pomočjo

S-adenozil-metionin sintaze pretvori v S-adenozil-metionin (AdoMet). Dalje poteka

sinteza etilena v dveh korakih, in sicer se v prvem koraku sintetizira 1-amino-ciklopropan

karbonska kislina (ACC), ki nastane iz AdoMet s pomočjo ACC sintaze (ACS). V drugem

koraku se ACC s pomočjo ACC oksidaze (ACO) oksidira v etilen, ogljikov dioksid in

vodikov cianid (Yang in Hoffman 1984, Kende 1993). Pri reakciji se iz AdoMet s pomočjo

ACS sintetizira tudi 5'-metilthioadenozin (MTA), ki se dalje pretvori v metionin in na ta

način predstavlja stalno zalogo metionina, ki je potreben za ponovni »krog« sinteze etilena

(Wang in sod. 2002, Blecker in Kende 2000). Količina sintetiziranega etilena je odvisna od

encimov ACS in ACO. Sprva je veljalo, da je omejitveni dejavnik sinteze etilena samo

encim ACS, medtem ko bi naj ACO imel manjšo vlogo, vendar je pozneje postalo jasno,

da tudi ACO igra pomembno vlogo (Alexander in Grierson 2002). Za zadnjo fazo sinteze

etilena, ki poteka s pomočjo encima ACO je potrebna prisotnost kisika, saj je v anaerobnih

pogojih reakcija popolnoma zaustavljena (Lin in sod. 2009).

Povečana sinteza etilena je običajno posledica biotskih ali abiotskih dejavnikov kakor tudi

spremljajoč proces raznih fizioloških procesov v rastlini, vendar lahko na sintezo etilena

vplivamo tudi z aplikacijo rastnih regulatorjev (Addicott 1982, Reid 1985). Zorenje

nekaterih sadnih vrst, med katere spada tudi jablana, je povezano z močnim porastom

sinteze etilena (Alexander in Grierson 2002), ki v zadnji fazi zorenja stimulira sintezo

hidrolitskih encimov, ki so odgovorni za tvorbo abscizijskega tkiva in posledično

odpadanje plodov (Bonghi in sod. 2000). Vendar pa je etilen prisoten tudi v primeru

abscizije mladih plodičev v času junijskega trebljenja, kar je bilo dokazano v več

raziskavah. Povišana sinteza etilena je bila izmerjena v plodičih jablane po tretiranju z

NAA (McArtney 2002, Zhu in sod. 2008, Walsh in sod. 1979), BA (Dal Cin in sod. 2005,

Dal Cin in sod. 2007, McArtney 2002) in etefonom (McArtney 2002, Yuan 2007). Kljub

ugotovitvam, da omenjeni rastni regulatorji stimulirajo sintezo etilena in vplivajo na večjo

abscizijo plodičev, pa ni enotnega odgovora na vprašanje, ali izključno povečana sinteza

etilena povzroči abscizijo plodičev. Načeloma je sprejeto mnenje, da se etilen vključi v

proces abscizije mladih plodičev v sklepni fazi, medtem ko njegova vloga v sami iniciaciji

abscizije ni jasna (Bangerth 2000). K temu dejstvu pričajo tudi podatki, da se v določenih


primerih abscizija izvrši kljub temu, da ni bilo povečane sinteze etilena v odpadlih tkivih

(Abeles 1973, Davenport in sod. 1976). Vendar ne glede na dvome, ki se nanašajo na samo

delovanje etilena v procesu abscizije plodičev, je nesporno, da zunanja aplikacija sredstev,

ki stimulirajo sintezo etilena, prav tako stimulira abscizijo plodičev, medtem ko aplikacija

sredstev, ki zavirajo sintezo etilena, hkrati zavira tudi abscizijo (Bonghi in sod. 2000).

Aplikacija sredstev, ki zavirajo sintezo etilena, kot je npr. amino etoksi vinil glicin (AVG),

vpliva tudi na večjo retencijo plodov (Dal Cin in sod. 2008, Bangerth 1978).

Vendar kljub temu ni jasno, ali je retencija plodov po tretiranju z AVG večja zaradi nižje

sinteze etilena, ali pa AVG na večjo retencijo vpliva preko kakšnega drugega, doslej

neznanega mehanizma (Fukui in sod. 1984, Rahemi in sod. 1997).

Poleg rastnih regulatorjev pa večjo sintezo etilena pospešuje tudi slabša osvetlitev (Taylor

in Whitelaw 2001), kar je še posebej izrazito, če se istočasno s slabšo osvetlitvijo poviša

temperatura (Kondo in Takahashi 1987). O učinku svetlobe na razvoj abscizije je prav tako

več teorij. Poleg tega, da vpliva na sintezo etilena, povzroči tudi manjšo fotosintezo, kar

privede do pomanjkanja asimilatov (Morandi in sod. 2011), prav tako vpliva tudi na rast

plodičev. Na podlagi omenjenih dejstev se tudi v primeru abscizije, sprožene s pomočjo

redukcije osvetlitve, upravičeno vprašamo, ali je višja sinteza etilena direktna posledica

senčenja, preko katerega posledično pride do začetka procesa abscizije ali pa je tudi v tem

primeru višja sinteza etilena zgolj posledica abscizije, ki je bila sprožena preko drugega

(zaenkrat neznanega) mehanizma.


Slika 2: Shema sintetske poti etilena. V začetni stopnji se iz metionina s pomočjo S-

adenozil metionin sintaze sintetizira S-adenozil metionin. V naslednji stopnji se s

pomočjo encima ACS sintetizira 1-amino-ciklopropan karbonska kislina, kot

stranski produkt pa nastaja MTA, ki vstopa v metioninski cikel, katerega končni

produkt je nastanek metionina. V končni fazi se pod vplivom ACO sintetizira

etilen, medtem ko kot stranski produkt nastaneta ogljikov dioksid in vodikov cianid

(Hedden in Thomas 2006, str. 127).

Ne glede na nekatere nasprotujoče si podatke o vlogi etilena v procesu abscizije plodičev

lahko ugotovimo, da je rastlinski hormon etilen pomemben člen v procesu abscizije. Kljub


temu, da je etilen največkrat opazovan rastlinski hormon pri procesu abscizije ter da

obstaja o vlogi etilena največ podatkov (tudi kontradiktornih) še vedno ni enotnega mnenja

o njegovi vlogi pri iniciaciji abscizije. Vsekakor pa obstajajo dovolj močni argumenti, na

podlagi katerih lahko trdimo, da je etilen vključen v proces abscizije kot »pospeševalec«

(promoter) ter da je v neugodnih pogojih za sintezo etilena prav tako inhibiran oz.

upočasnjen sam proces abscizije.

2.6 Vloga posameznih genov

Hiter razvoj genetskih metod v zadnjem obdobju, kakor tudi večja dostopnost modernih

aparatur sta povzročila velik porast v spremljanju različnih fizioloških procesov na

genetskem nivoju. Tako so raziskovalci v primeru opazovanja abscizije listov, plodov,

zorenja, pričeli uporabljati tudi genetske metode. Najpogosteje gre za odkrivanje sekvenc

genov v genotipu rastline, ki so odgovorni za sintezo določenih spojin. V zadnjem obdobju

se kar precej skupin raziskovalcev ukvarja s proučevanjem celotnega genoma posamezne

rastlinske ali živalske vrste, med katerimi so uspeli analizirati tudi sekvenco genoma

jablane pri sorti 'Zlati delišes' (Velasco in sod. 2010). Ko uspemo »izolirati« nek gen in mu

določiti njegovo vlogo v rastlini, lahko dalje spremljamo njegovo časovno izražanje skozi

vegetacijsko dobo oz. t.i. ekspresijo gena ter na ta način spremljamo razvoj različnih

fizioloških procesov skozi vegetacijo.

V primeru abscizije plodičev, ki smo se ji posvetili v tej nalogi, je največ novejših raziskav

povezanih z ekspresijo genov, ki so odgovorni za sintezo etilena. Glede na dejstvo, da pri

sintezi etilena najpomembnejšo vlogo igrata encima ACS in ACO, so geni, ki so odgovorni

za sintezo omenjenih encimov, najprimernejše »tarče« za opazovanje ekspresije. V tkivih

jablane so že v devetdestetih letih odkrili gene, ki so odgovorni za sintezo ACS, in sicer:

ACS1 (Lay-Yee in Knighton 1995), ACS2 in ACS3 (Rosenfield in sod. 1996) ter ACS5A in

ACS5B (Sunako in sod. 2000). Prav tako so pri jablani izolirali gene, odgovorne za sintezo

ACO, in sicer: ACO1 (Dong in sod. 1992, Ross in sod. 1992), ACO2, ACO3 in ACO4


(Wiersma in sod. 2007). Na podlagi raziskav je bilo ugotovljeno, da je ekspresija

omenjenih genov v pozitivni korelaciji s sintezo etilena. Vendar se posamezni izmed

omenjenih genov različno močno izražajo v posameznih obdobjih. Pri določenih sadnih

vrstah, tudi pri jablani, je povečana sinteza etilena v plodovih značilna za dve obdobji.

Prvič se to zgodi v začetni fazi rasti plodičev in drugič v času mehčanja plodov (Tonutti in

sod. 1997). Prvo obdobje tako sovpada s časom povečanega odpadanja plodičev, medtem

ko je drugo obdobje povezano z zorenjem plodov. Poleg povečane sinteze etilena je v

omenjenih obdobjih zabeležena močnejša ekspresija genov, odgovornih za sintezo etilena.

V mladih plodičih so tako zabeležili predvsem povečano ekspresijo MdACS5A, MdACS5B

in MdACO1 (Dal Cin in sod. 2005, Zhu in sod. 2008) medtem ko je za drugo obdobje

povečane sinteze etilena značilna ekspresija MdACS1, MdACS3 in MdACO1 (Wiersma in

sod. 2007, Li in Yuan 2008, Li in sod. 2010).

Čeprav se je v začetnih fazah raziskovanja sinteze etilena domnevalo, da je encim ACS

omejitveni faktor pri sintezi, pa je kasneje postalo jasno, da je vloga encima ACO enako

pomembna. To se sedaj dokazuje tudi z opazovanjem na genetskem nivoju, kjer izstopa

aktivnost MdACO1. Ekspresija MdACO1 je značilna za tkiva, kjer poteka sinteza etilena in

je običajno mnogo višja v primerjavi z MdACS1 (Davies 2004).

V poskusu, ki so ga izvedli na zorečih plodovih jablane, so dokazali, da stopnja ekspresije

MdACS1 sovpada s količino etilena (Harada in sod. 2000). Spremljanje ekspresije

omenjenih genov v zadnjih štirih tednih zorenja jablane je pokazalo, da se je MdACS1 v

plodovih jablane sorte 'Zlati delišes' in 'Sunrise' zvišala za 1000-krat, medtem ko se je

akumulacija MdACO1 zvišala do 10000-krat, kar dokazuje povezanost ACS in ACO s

sintezo etilena v času zorenja plodov (Wiersma in sod. 2007). Tudi v plodovih breskve se v

času zorenja poveča ekspresija PpACO ter sinteza etilena. V primeru, da pa se plodovi

breskve izpostavijo propilenu (500 ml/l), ki velja za analog etilena za čas 48 ur, pa pride do

dvakratnega povečanja tako ekspresije PpACO kot tudi sinteze etilena, prav tako pa se

pospeši proces zorenja (Tonutti in sod. 1997). Nasprotno pa aplikacija inhibitorjev sinteze

etilena, kot sta amino-etoksi-vinil-glicin (AVG) in 1-metil ciklopropan (1-MCP) poleg

tega, da inhibirata sintezo etilena, zavreta tudi ekspresijo MdACS1, MdACO1 in MdPG1


(Li in Yuan 2008). Ekspresija genov, odgovornih za sintezo etilena, kakor tudi sama

sinteza etilena sta tesno povezani z dozorevanjem plodov in s predčasnim odpadanjem

zorečih plodov. Pri sorti 'Zlati delišes' se z dozorevanjem plodov povečuje sinteza etilena v

plodovih, ki se pričnejo mehčati, prične se predčasno odpadanje nedozorelih plodov prav

tako je povišana tudi ekspresija MdACS1, MdACS3 in MdACS5A. Nasprotno pa se

omenjeni procesi v istem terminu ne dogajajo pri sorti 'Fuji' (Li in sod. 2010). Trdota

plodov, kot eden izmed pokazateljev zrelosti se je s časom zniževala v obeh primerih,

vendar veliko bolj intenzivno pri sorti 'Zlati delišes' v primerjavi s sorto 'Fuji' (Li in sod.

2010). Domnevamo lahko, da je vzrok za počasnejše dozorevanje sorte 'Fuji' in s tem

povezane dobre skladiščne lastnosti v nižji oz. počasnejši evoluciji etilena. Ekspresija

MdACO1 v plodovih se je v času dozorevanja povišala pri obeh kultivarjih, vendar se je

samo pri sorti 'Zlati delišes' ekspresija povišala tudi v AZ. Prav tako so bili plodovi te sorte

podvrženi predčasnemu odpadanju, medtem ko le-tega ni bilo opaziti pri sorti 'Fuji' (Li in

sod. 2010). Na sintezo etilena v času dozorevanja in predčasno odpadanje zorečih plodov

pa lahko vliva tudi alelotip MdACS1 gena. Ugotovili so, da plodovi na rastlinah, ki imajo

MdACS1-2/2, sintetizirajo manjše količine etilena v primerjavi s plodovi rastlin, ki imajo

alelotip MdACS1-1/2 ali MdACS1-1/1. Prav tako pa so plodovi iz teh rastlin manj nagnjeni

k predčasnemu odpadanju (Sato in sod. 2004).

Ugotovljeno je, da aktivnost etilena korelira z ekspresijo ACS- in ACO-genov, vendar je

odzivnost večja v primeru ACO-genov, zaradi tega tudi več rezultatov temelji na

opazovanju tega gena. Ekspresija ACO-genov je specifična za različna tkiva in je

regulirana preko okoljskih in hormonskih faktorjev, vključno z etilenom. Pri nekaterih

sadnih vrstah se aktivnost ACO mRNA zviša v času zorenja, prav takrat, ko je tudi najvišja

vsebnost etilena (Tonutti in sod. 1997). V času zorenja so pri breskvi ugotovili povišanje

koncentracije transkriptov ACS in ACO v mezokarpu, še preden je bila vsebnost etilena v

mejah detekcije. Vendar v zgodnji fazi razvoja (≈27 dni po cvetenju) pri sorti Redhaven

niso uspeli dokazati prisotnosti transkripta ACO, medtem ko so pri sorti Springcrest v

istem obdobju ugotovili prisotnost (Tonutti in sod. 1997). Takšen rezultat potrjuje

domnevo, da na ekspresijo različnih genov vpliva tudi genotip. Podobno navaja tudi Dal

Cin in sod. (2007), ki je spremljal ekspresijo MdACO1 pri jablanah sorte 'Zlati delišes' in


'Rdeči delišes'. Opazil je manjšo aktivnost omenjenega gena pri sorti 'Rdeči delišes' v

primerjavi s sorto 'Zlati delišes'.

Povezanost etilena z ACS- in ACO-geni so dokazovali tudi s pomočjo dovajanja plina

propilena (analog etilena). V plodovih breskve, ki so jih 27. dan po cvetenju za 48 ur

izpostavili propilenu, so ugotovili 2-kratno povišanje etilena (Tonutti in sod. 1997). Prav

tako so ob tretiranju s propilenom ugotovili precejšnje povečanje ekspresije ACO genov.

Do zaključka, da akumulacija ACO in sorodnih transktiptov sovpada z evolucijo etilena je

prišel tudi Ruperti (1998). Geni ACS in ACO so v času zorenja vzpodbujeni preko etilena

in nato sodelujejo v avtokatalitični sintezi etilena (Dal Cin in sod. 2006).

Kakor smo ugotovili, da je evolucija etilena in ekspresija z njim povezanih genov lahko

vzpodbujena k večji aktivnosti, lahko ob določenih pogojih opazimo tudi znižanje.

Aplikacija metil ciklo propana (1-MCP), ki je inhibitor sinteze etilena, saj se veže na

etilenske receptorje, na zoreče plodove jabolk močno vpliva na nižjo produkcijo etilena, s

tem se je znižala tudi ekspresija ACS- in ACO-genov (Dal Cin in sod. 2006). Prav tako so

v istem poskusu ugotovili negativen vpliv 1-MCP na ekspresijo receptorjev MdERS in

MdETR. Lahko zaključimo, da 1-MCP kot inhibitor etilena zavira razvoj vseh parametrov,

ki so povezani s sintezo etilena (Dal Cin in sod. 2006).

Poleg časa dozorevanja plodov je povišana sinteza etilena in z njo povezani geni prisotna

tudi v začetni fazi razvoja mladih plodičev. Podobno kot v fazi dozorevanja plodov prihaja

tudi v tej fazi do abscizije plodičev. Na primeru jablane obstaja le nekaj raziskav, ki

spremljajo razvoj etilena na genetskem nivoju in vpliv rastnih regulatorjev ter senčenja na

ekspresijo MdACO1, MdACS5A in MdACS5B v razvijajočih se plodičih in AZ.

V poskusu, ki so ga izvedli na jablani sorte 'Zlati delišes', so oblikovali dve populaciji

plodičev z različnim abscizijskim potencialom (visok abscizijski potencial – AF > 90 % in

nizek abscizijski potencial – NAF < 10 %). Analiza ekspresije genov se je izvajala v času

med 17-24 dni po odpadanju venčnih listov, saj so predhodne raziskave pokazale, da se v

tem obdobju dogajajo največje spremembe genov, ki so povezani z abscizijo plodičev (Dal


Cin in sod. 2005). Akumulacija transkriptov genov, vezanih na sintezo etilena (MdACS5B

in MdACO) in receptorjev (MdETR1, MdERS1 in MdCTR1) je bila opazovana v semenu,

mezokarpu, peclju in AZ. Ugotovili so, da je bila ekspresija MdACO1 v semenih 3 dni po

tretiranju z BA 10 krat višja pri obravnavanju AF v primerjavi z obravnavanjem NAF, nato

je razlika strmo naraščala do 7 dneva po tretiranju, ko je znašala 1000-krat več. Do

podobnega razmerja, vendar z manjšimi razlikami, je prišlo tudi v vzorcih mezokarpa

plodov (Dal Cin in sod. 2005). Prav so v plodičih AF izmerili signifikantno povečanje

sinteze etilena, medtem ko je raven etilena v NAF plodičih ostala nespremenjena.

Poskus, ki so ga izvajali na dveh sortah jablane, in sicer 'Zlati delišes' in 'Rdeči delišes' je

pokazal, da je bila aktivnost etilena višja v LP v primerjavi s CP. Prav tako je bila

ekspresija MdACO1 povečana v LP in je pri sorti 'Zlati delišes' bila sorazmerna z dejansko

abscizijo, medtem ko so pri sorti 'Rdeči delišes' povečano ekspresijo MdACO1 zabeležili

tako v LP kot tudi v CP (Dal Cin in sod. 2007). Pri ZD je tretiranje z BA povzročilo 3-

kratno povečanje sinteze etilena v LF (3-5 dni po tretiranju), vendar se je delež odpadlih

plodov zvišal le za 15 % (Dal Cin in sod. 2007). Ker so merili aktivnost v različnih tkivih,

so ugotovili tudi višjo ekspresijo MdACO1-gena v mezokarpu plodov in semenih v

primerjavi s pecljem. Poleg BA na sintezo etilena in z njo povezanih genov vpliva tudi

NAA. Aplikacija NAA v fazi premera CP 10 mm je vplivala na ekspresijo MdACO1,

MdACS5A in MdACS5B. Posledično sta se povišala sinteza etilena ter delež plodov, ki so

bili podvrženi absciziji (Zhu in sod. 2010).

Pri spremljanju ekspresije genov v plodičih pa v nasprotju s pričakovanji ni povečane

ekspresije MdACS1 gena (Li in sod. 2010). Na podlagi dosedanjih objav lahko

domnevamo, da je sinteza etilena v plodičih ter abscizija plodičev povezana predvsem z

ekspresijo MdACO1, MdACS5A in MdACS5B. Predvsem za MdACO1 velja, da je njegova

ekspresija dober indikator abscizije plodičev (Zhu in sod. 2010, Dal Cin in sod. 2005, Dal

Cin in sod. 2009).


3 MATERIALI IN METODE

Za potrebe opazovanja ekspresije genov, odgovornih za sintezo etilena, ter samo evolucijo

etilena smo v letih 2008 in 2009 zastavili poljski poskus v poskusnem nasadu Kmetijskega

inštituta Slovenije na Brdu pri Lukovici. Za izvajanje poskusa smo izbrali 10 let stara

drevesa sorte 'Zlati delišes', cepljena na podlago 'M9', katerih vzgojna oblika je bila vitko

vreteno. V zimskem času je bila na drevesih opravljena zimska rez, značilna za vzgojno

obliko vitko vreteno. Skozi celotno dobo vegetacije se je v nasadu izvajalo varstvo rastlin

pred boleznimi in škodljivci v skladu s tehnološkimi navodili za integrirano pridelavo sadja

za leto 2008 (Džuban in sod. 2008). Za sorto 'Zlati delišes' smo se odločili zaradi tega, ker

gre za najbolj razširjeno sorto v evropskem prostoru, poleg tega je bilo tudi veliko raziskav

glede redčenja in drugih lastnosti opravljenih na sorti 'Zlati delišes', na podlagi česar lahko

sklepamo, da je sorta primeren objekt opazovanja. Poleg meritev, ki smo jih opravljali v

nasadu (prirast plodičev, abscizija plodičev, ovrednotenje pridelka po posameznem

drevesu), smo na poljskem poskusu tudi odvzeli vzorce za laboratorijski del eksperimenta

oz. meritve, in sicer za merjenje evolucije etilena na plinskem kromatografu ter analizo

ekspresije genov povezanih s sintezo etilena (MdACO1, MdACS5A in MdACS5B).

3.1 Zasnova poljskega poskusa

Za poskus smo v dveh sosednjih vrstah nasada, na podlagi števila socvetij, izbrali 80

izenačenih dreves. Pogoj za izbor v eksperiment je bil, da ima drevo v tem letu velik cvetni

nastavek, med 180-230 socvetij. V letu 2008 smo štetje opravili 23. aprila, v letu 2009 pa

15. aprila. Poleg tega smo želeli, da so drevesa primerljiva po habitusu, zato smo izločili

vsa drevesa, ki so na podlagi vizualne presoje odstopala od povprečja. Izbranih 80 dreves

smo razdelili v dve skupini, in sicer skupino 'A' in skupino 'B'. Iz obeh skupin smo nato

oblikovali naključni bločni poskus s 5 obravnavanji in 8 bloki.


Obravnavanja so bila:

1. KONTROLA (netretirano)

2. NAA 15 mg/l

3. BA 150 mg/l

4. ETEFON 500 mg/l

5. SENČENJE (3-dni, 96 % redukcija fotosintetsko aktivnega sevanja)

Skupina kontrolnih dreves ni bila tretirana z rastnimi regulatorji, medtem ko smo za ostala

obravnavanja uporabili naslednje komercialne pripravke: NAA-Dirager (L.Gobbi, Genoa,

Italija), BA-MaxCel (Valent BioSciences, Libertyville, IL), etefon-Flordimex 420 (Bayer

CropScience, Dunaj, Avstrija) in SEN-PP SB črn (Filc Mengeš, Slovenija). Drevesa v

skupini 'A' so bila namenjena spremljanju evolucije etilena, medtem ko smo na drevesih

skupine 'B' spremljali prirast plodičev, frekvenco odpadanja plodičev ter odvzeli vzorce

tkiva za genetske analize. Razlog za razdelitev poskusa na dva dela je v destruktivni

metodi. V primeru, da bi vse meritve in hkrati vsa vzorčenja opravljali na istih drevesih, bi

s takim posegom najverjetneje premočno vplivali na fiziološko stanje drevesa, saj bi

zmanjševali kompeticijo znotraj plodičev, kar bi lahko bil vzrok za nerelevantne rezultate.

Zaradi tega smo meritve ter vzorčenja smiselno razdelili na dva dela, s čimer smo skušali

zmanjšati vpliv destruktivne metodike na odzivnost dreves. Vsi ostali ukrepi so se enako in

istočasno izvajali na drevesih skupine 'A' in 'B'.

Dva dni po odpadanju venčnih listov smo na drevesih skupine 'A' naključno izbrali 10

optimalno razvitih socvetij. Nato smo 5 izmed njih naključno označili z modrim trakcem,

preostalih 5 pa z rdečim trakcem. Modro označenim socvetjem smo s skalpelom odstranili

vse LP, da smo ustvarili t.i. socvetje s centralnim plodičem (CS), medtem ko smo rdeče

označenim socvetjem s skalpelom odstranili CP in na ta način dobili socvetje z lateralnimi

plodiči (LS). S socvetji na drevesih skupine 'B' smo ravnali enako z razliko, da je bilo

naključno izbranih 28 socvetij iz katerih smo ustvarili 14 CS in 14 LS. Ob tem naj

pojasnim, da so v skupini 'B' 4 CS in 4 LS bila namenjena za genetske analize, medtem ko

so ostala socvetja služila za spremljanje frekvence odpadanja in merjenje prirasta plodičev.


Ko je povprečni premer CP dosegel 10 mm, smo z ročno škropilnico izvedli aplikacijo

rastnih regulatorjev v zgoraj navedenih koncentracijah do »točke kapljanja«. Prav tako smo

na isti dan izvedli senčenje dreves pri obravnavanju SEN. Dan, ko smo izvedli aplikacijo

rastnih regulatorjev in pričeli s senčenjem, smo določili kot izhodiščni termin (0 DAT), ki

je bil v letu 2008 19. maj in v letu 2009 11. maj. Senčenje smo izvedli tako, da smo okrog

vsakega posameznega drevesa postavili armaturo iz lesenih palic, na katere smo namestili

polipropilensko prekrivko (PP SB 100 ČRN, Filc Mengeš, SLO), ki je zmanjšala količino

fotosintetsko aktivnega sončnega obsevanja za približno 96 %, kar smo izmerili s

ceptometrom (Sunfleck, Decagon, Pullman, WA). Drevesa so bila senčena 72 ur, nato pa

smo prekrivko odstranili.

Slika 3: Izvedba senčenja s pomočjo polipropilenske prekrivke, ki je bila nameščena na

leseno armaturo.


Prirast plodičev smo spremljali tako, da smo z digitalnim kljunastim merilom v dva- do tri

dnevnih intervalih izmerili premer označenih plodičev. Premer plodičev smo merili v letu

2008 v terminih -5, -3, -2, 0, 2, 5, 8, 10, 15 DAT, medtem ko v letu 2009 prirasta plodičev

nismo spremljali. Plodiči, na katerih smo merili premer, so bili še dodatno označeni na

način, da je bilo možno posamezen plodič spremljati od izbora pa vse do zadnjega

merjenja. Hkrati smo na istih plodičih spremljali frekvenco odpadanja oz. abscizijo. Na ta

način smo lahko na koncu analizirali prirast plodičev, ki so odpadli, ter posebej prirast

plodičev, ki niso bili podvrženi absciziji. Frekvenco odpadanja oz. abscizijo smo merili na

način, da smo v posameznem terminu na opazovanem drevesu prešteli število plodičev na

označenih CS in LS. V letu 2008 in 2009 smo štetje izvedli v terminih 0, 2, 5, 8, 10, 15, 22

DAT.

V času tehnološke zrelosti plodov v letu 2008 je bilo to 16. septembra in v letu 2009 15.

septembra, smo ovrednotili celoten pridelek na vsakem drevesu. Na podlagi kriterija

premera smo plodove razdelili v skupino večji od 70 mm (debeli plodovi) in manjši od 70

mm (drobni plodovi). Nato smo prešteli število debelih in drobnih plodov ter posebej

stehtali maso debelih in drobnih plodov. Po končanem obiranju smo izmerili obseg debla

posameznega drevesa približno 15 cm nad cepljenim mestom.

Pomembno vlogo pri učinkovitosti rastnih regulatorjev oz. senčenja na razvoj abscizije

imajo tudi okoljski dejavniki, med katerimi še posebej izstopa temperatura. Zaradi tega

smo v obeh letih v času tretiranja spremljali temperaturo ozračja v nasadu in količino

padavin. Povprečna temperatura na določen datum je izračunana na podlagi 24-urnih

meritev v 15-minutnem intervalu, medtem ko maksimalna in minimalna temperatura

predstavljata najvišjo oz. najnižjo vrednost na določen datum. Podrobnejše vrednosti

gibanja temperatur in padavine so predstavljene v Preglednicah 1 in 2.


Preglednica 1: Najnižje, najvišje in povprečne temperature ozračja ter količina padavin

med 1. 5. in 31. 5. v letu 2008 na opazovalni postaji Brdo pri Lukovici.

Datum Padavine (mm) Tpovprečna* Tmin Tmax

1.5. 3,2 12,1 8,2 16,9 2.5. 0 13 6,7 21,2 3.5. 0 13,5 7,1 20,8 4.5. 0,8 14 8,6 20 5.5. 12,6 9,3 7,1 13,3 6.5. 1,2 12,2 7,1 19,6 7.5. 0 12,9 5,9 19,6 8.5. 0 14,2 5,5 22,7 9.5. 0 15,7 7,8 23,5 10.5. 0 15,9 9,8 22,4 11.5. 0 15,1 7,5 21,2 12.5. 0 14,1 5,5 22 13.5. 0 15,1 5,9 23,9 14.5. 0 16,6 7,5 25,9 15.5. 0 17 8,2 24,7 16.5. 0,4 16,6 11,8 23,1 17.5. 0 17 13,7 21,6 18.5. 11,4 15 12,9 20,8 19.5. 8,2 16,2 13,3 23,5 20.5. 19,8 11,8 10,2 13,7 21.5. 0,2 12,5 10,2 14,5 22.5. 0 14 10,6 18,4 23.5. 0 14,5 11,8 17,3 24.5. 0 16,3 12,2 21,6 25.5. 0 17,8 11 24,7 26.5. 0 19,2 12,2 27,5 27.5. 0 22,1 12,5 32,2 28.5. 0 22,7 14,5 31,4 29.5. 0 22,7 15,7 30,2 30.5. 2,2 20,2 14,9 28,6 31.5. 0,2 18,2 12,2 24,7

*povprečna temperatura je izračunana na podlagi 24-urnih meritev v 15-minutnem

intervalu


Preglednica 2: Najnižje, najvišje in povprečne temperature ozračja, ter količina padavin

med 1. 5. in 31. 5. v letu 2009 na opazovalni postaji Brdo pri Lukovici.

Datum Padavine (mm) Tpovprečna* Tmin Tmax

1.5. 0,6 13,5 6,3 24,7 2.5. 0,4 12,4 7,1 19,2 3.5. 1,2 12 7,5 18,8 4.5. 0 12,6 4,7 19,6 5.5. 0 12,7 9,4 16,5 6.5. 0 13,2 6,3 21,6 7.5. 0 17,8 11 25,1 8.5. 0 18,6 10,2 24,7 9.5. 0 17,5 10,2 23,9 10.5. 0 20,9 14,1 26,7 11.5. 0 18,7 11 26,7 12.5. 0,4 18,8 11,8 25,5 13.5. 1 15 12,9 21,2 14.5. 0 17,5 12,5 24,7 15.5. 0,6 15,2 9,4 22 16.5. 0 17,7 11,4 24,7 17.5. 0 19,6 11 27,8 18.5. 0 20,6 12,5 29,4 19.5. 22,2 19,8 13,7 26,7 20.5. 0 18,8 13,3 24,3 21.5. 0 19,9 11,4 27,8 22.5. 0 21,1 13,7 28,6 23.5. 0 21,5 13,3 29,4 24.5. 0 21,1 16,1 27,5 25.5. 4,2 21,7 14,1 31,8 26.5. 0 22,7 14,1 31,8 27.5. 23 15,1 11,4 21,2 28.5. 0 15,9 9 22 29.5. 0,2 14,1 10,2 20,8 30.5. 1,2 11,4 5,5 18,4 31.5. 2 12,8 7,8 18,8

* povprečna temperatura je izračunana na podlagi 24-urnih meritev v 15-minutnem

intervalu


3.2 Meritve evolucije etilena

Količino etilena, ki ga sintetizirajo plodiči oz. posamezna socvetja smo spremljali s

pomočjo plinske kromatografije. Za merjenje koncentracije etilena v vzorcih smo uporabili

plinski kromatograf Hewlett-Packard 6890 s plamensko ionizacijskim detektorjem (FID),

ki je bil opremljen s HP-5 (Agilent, Santa Clara, CA) kapilarno kolono (30 m x 0,32 mm x

0,25 µm). Temperatura na injektorju je bila 120 °C, na detektorju 300 °C in na koloni 60

°C. Za nosilni plin smo uporabili dušik (N2) s pretokom čez kolono 2,9 ml/min. Za

standardno vsebnost etilena smo določili primerjalno površino pika, za kar smo imeli na

voljo dva standarda v koncentraciji 1 ml/l in 10 ml/l (C2H4 v čistem dušiku) (Messer

Schweiz AG, Lenzburg, Švica). Izmerjene površine pikov naših vzorcev je integrator

primerjal s površino pika standarda ter določil koncentracijo etilena v vzorcih. Iz

koncentracij etilena in volumna zraka smo izračunali količino razvitega etilena iz plodičev.

Razvoj etilena iz plodičev smo predstavili v nl C2H4 / gram sveže mase plodičev.

Evolucijo etilena iz plodičev smo merili v štirih terminih glede na število dni po aplikaciji

rastnih regulatorjev oz. začetka senčenja (DAT). Prvi termin je bil na dan tretiranja, vendar

pred samo izvedbo, kar se šteje kot 0 DAT, nato pa smo meritve opravili še 2, 5 in 8 DAT.

V vsakem terminu smo na posameznem drevesu v skupini 'A' izmed označenih socvetij

naključno izbrali eno CS in eno LS. Nato smo na izbrano socvetje namestili 245 ml

plastični lonček in ga zaprli s pokrovčkom ter odprtine zatesnili s tesnilom Enoplastico

special (Esseco, S. Martino Trecate, Italy). Postopek zaprtja socvetja je podoben, kot ga je

uporabil Burns s sod. (1999) z manjšimi modifikacijami. Po 3 urah inkubiranja smo skozi

luknjico na pokrovčku, ki je bila med inkubacijo zatesnjena z gumijasto prelepko, z brizgo

odvzeli 1 ml vzorca zraka ter brizgo označili, zatesnili in dali v hladilno torbo. Po odvzemu

vzorcev smo odstranili lončke in porezali plodiče ter jih stehtali. Nato smo vzorce v

hladilni torbi prenesli v laboratorij Kmetijskega inštituta Slovenije, kjer smo v plinski

kromatograf ročno injicirali 1 ml zraka posameznega vzorca ob zgoraj navedenih pogojih.

Poleg vzorcev zraka smo injicirali tudi t.i. »slepe« vzorce, ki smo jih na enak način kot

ostale odvzeli iz atmosfere v nasadu med drevesi. Za kontrolo metode in delovanja

plinskega kromatografa smo na vsakih šest vzorcev injicirali 1 ml standarda etilena


(izmenično 1 ml/l in 10 ml/l C2H4). Po končanih meritvah smo po zgoraj navedenem

postopku preračunali sintezo etilena iz plodičev v nl/g sveže mase/uro.

3.3 Genetske analize

3.3.1 Vzorčenje

Vzorčenje tkiva plodičev in AZ za potrebe spremljanja ekspresije genov smo opravili v

štirih terminih glede na tretiranje z rastnimi regulatorji in začetek senčenja (0 DAT). V letu

2008 so bili termini vzorčenja 0 in 8 DAT, medtem ko smo v letu 2009 vzorčenje razširili

na dva dodatna termina, tako da smo vzorce za ekspresijo odvzeli 0, 1, 4 in 7 DAT. V

posameznem terminu smo na vsakem drevesu skupine 'B' naključno izbrali eno CS in eno

LS. Najprej smo odrezali posamezno socvetje, nato pa s skalpelom plodiče prečno

prerezali na kolobarje. Kolobarje smo nato razrezali še na štiri dele, ter iz sredinskih treh

kolobarjev odvzeli po dva nasproti ležeča dela. Izbrano tkivo smo takoj dali v 2 ml

označeno mikrocentrifugirko in nemudoma potopili v posodo s tekočim dušikom. Na ta

način smo skušali čim bolj preprečiti oksidacijo in degradacijo vzorčenega tkiva. Vzorec

AZ smo odvzeli na podoben način s to razliko, da smo odrezali 1 mm tkiva na vsako stran

predhodno formirane AZ ter tkivo takoj dali v označeno centrifugirko in potopili v posodo

s tekočim dušikom. Za preprečevanje kontaminacije med vzorci smo med vsakim

posameznim odvzemom vzorca zamenjali sterilne rokavice, sterilno rezilo skalpela in

tehtalno posodico, na kateri smo izvajali rezanje tkiva. Zbrane vzorce posameznega

termina smo v tekočem dušiku odnesli v genetski laboratorij Kmetijskega inštituta

Slovenije, kjer smo jih prestavili v hladilne omare na temperaturo -80 °C, kjer so vzorci

počakali na nadaljnjo obravnavo.


3.3.2 Izolacija RNA

Za izolacijo RNA iz tkiva plodičev (FC) in tkiva AZ smo uporabili RNeasy Plant Mini Kit

(Qiagen, Hilden, Nemčija). Najprej smo vzorce izenačili glede na maso izhodiščnega

materiala, in sicer smo tkivo FC izenačili na približno 50 mg, tkivo AZ pa na 25 mg.

Preden smo začeli s samim postopkom izolacije smo RLT pufru dodali ß-merkapto etanol

in sicer 10 µl na 1 ml pufra. Nato smo RLT pufru dodali še 2 % (w/v) polivinilpirolidona

(PVP) (Sigma-Aldrich, Stenheim, Nemčija). Preliminarne raziskave so namreč pokazale

višjo učinkovitost ekstrakcije RNA iz tkiva FC in AZ jablane ob dodatku 2 % PVP.

Postopek izolacije je bil sledeč:

• vzorcu tkiva smo v digestoriju dodali 450 µl RLT pufra (RNeasy Plant Mini Kit),

• dodali smo keramično kroglico in stresali 2 minuti 30 tresljajev na sekundo na

aparaturi Tissue Lyser Qiagen (Retsch, Haan, Nemčija),

• nato smo lizat odpipetirali direktno na vijolično kolono (RNeasy Plant Mini Kit) in

centrifugirali 2 minuti pri hitrosti 15.000 g,

• filtrat smo pazljivo prenesli v novo mikrocentrifugirko, pri tem pa smo pazili, da

nismo premešali peleta na dnu centrifugirke,

• dodali smo 225 µl 96 % etanola in takoj premešali s pipetiranjem ter celoten vzorec

prenesli na roza kolono,

• nato smo centrifugirali 15 sekund pri hitrosti 10.000 g ter zavrgli filtrat,

• na membrano roza kolone smo odpipetirali 700 µl pufra RW1 (RNeasy Plant Mini

Kit) ter centrifugirali 15 sekund pri hitrosti 10.000 g, ter zavrgli filtrat in zbiralno

tubico,

• roza kolono smo prestavili na novo zbiralno tubico, odpipetirali na membrano

kolone 500 µl RPE pufra (RNeasy Plant Mini Kit) ter centrifugirali 15 sekund pri

hitrosti 10.000 g, ter zavrgli filtrat,

• ponovno smo na membrano roza kolone odpipetirali 500 µl RPE pufra ter

centrifugirali 2 minuti pri hitrosti 10.000 g. Zavrgli smo filtrat in zbiralno tubico,


• roza kolono smo prestavili na novo sterilno mikrocentrifugirko in direktno na

membrano odpipetirali 40 µl RNaz-proste vode in centrifugirali 1 minuto pri hitrost

10.000 g,

• filtrat smo ponovno odpipetirali na membrano kolonice in ponovili centrifugiranje,

s tem je bila koncentracija RNA višja saj smo eluirali več RNA.

• izolirano RNA smo shranili na -80°C.

3.3.3 Razgradnja genomske DNA

Izolirano RNA smo pred nadaljnjo obravnavo še tretirali z encimom deoksiribonukleaza I

(DNaza I). Pri izolaciji RNA namreč poleg le-te kot stranski produkt izoliramo tudi dele

genomske DNA molekule, ki v nadaljnjem procesu moti analizo RNA pri qPCR reakcijah.

Zaradi tega smo vzorce izolirane RNA pred nadaljnjo obravnavo tretirali z encimom

DNaza I, ki razgrajuje eno- in dvoverižno genomsko DNA.

Za tretiranje smo uporabili deoksiribonukleazo I (Invitrogen by Life Technologies,

Carlsbad, CA), po protokolu proizvajalca. Namesto 1 µl vzorca RNA smo za izhodišče

vzeli 2 µl RNA, ki smo mu dodali 1 µl 10X DNase I Reaction Buffer, 1 µl DNase I, Amp

Grade, 1 U/ µl in razliko do skupnega volumna 10 µl dopolnili z deionizirano in destilirano

vodo. Ostali pogoji so bili v skladu z navodili proizvajalca. Po končanem postopku smo z

DNase I tretirano RNA shranili na -80 °C.

3.3.4 Reverzna transkripcija

V postopku reverzne transkripcije smo celokupno RNA prepisali v komplementarno DNA

(cDNA). Za izvedbo reakcije smo uporabljali komplet High-Capacity cDNA Reverse


Transcription Kit (Applied Biosystems by life Technologies, Carlsbad, CA). Reakcijska

mešanica je bila sestavljena iz:

- 10X RT Buffer 2,5 µl

- 25X dNTP Mix (100 mM) 1,0 µl

- Oligo-d(T) 16 Primers 2,5 µl

- RNase Inhibitor 1,25 µl

- MultiScribe Reverse Transcriptase 1,25 µl

- Deionizirana in destilirana voda 14,5 µl

- Z DNazo I tretirana izolirana RNA 2,0 µl

Vse komponente smo odpipetirali v 0,5 ml mikrocentrifugirko, na kratko centrifugirali in

prenesli v termoblok GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems by life

Technologies, Carlsbad, CA) kjer smo napravo nastavili na inkubacijske pogoje, ki jih

priporoča proizvajalec (Applied Biosystems By Life Technologies, Carlsbad, CA):

1. stopnja 10 minut 25 °C



4. stopnja nedefinirano 4 °C

Vzorce cDNA smo do nadaljnjega postopka shranili na temperaturi -20 °C, kratkoročno pa

je možno vzorce cDNA hraniti tudi na temperaturi 4 °C.

3.3.5 Kvantitativna PCR v realnem času (qPCR)

S pomočjo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) smo merili ekspresijo

genov MdACS5A, MdACS5B in MdACO1. Za spremljanje omenjenih genov smo


uporabljali nespecifično SYBR Green I metodo, pri kateri se merjenje nastalega PCR

produkta v času reakcije meri na podlagi količine fluorescence, ki jo barvilo oddaja, ko se

veže na dvoverižno DNA. Pomanjkljivost metode s SYBR Green I barvilom je v tem, da se

barvilo veže tudi na nespecifične produkte, zaradi česar je lahko svetlobni signal močnejši

od dejanske količine, ki jo oddaja barvilo, vezano na tarčni produkt. Zaradi omenjene

slabosti je potrebna dobra optimizacija metode, s katero se prepričamo, da nam v reakciji

ne nastajajo nespecifični produkti, ki bi bili razlog za napačne rezultate.

Končni volumen qPCR reakcij je bil 25 µl. Mešanica je bila sestavljena iz naslednjih

reagentov:

- Power SYBR® Green PCR Master Mix (2x)* 12,5 µl

- začetni oligonukleotidni začetnik (100 pmol / µl) 0,15 µl

- končni oligonukleotidni začetnik (100 pmol / µl) 0,15 µl

- deionizirana in destilirana voda 10,2 µl

- vzorec cDNA 2,0 µl

*(Applied Biosystems by Life Technologies, Carlsbad, CA)

Reakcijsko mešanico z ustreznimi oligonukleotidnimi začetniki smo si pripravili posebej,

nato pa smo na optično ploščico formata 96-luknjic najprej nanesli 23 µl reakcijske

mešanice, nato pa še 2 µl ustreznega vzorca cDNA. Vsak vzorec smo nanesli v dveh

ponovitvah. V zadnji dve koloni optične ploščice smo namesto vzorca k reakcijski

mešanici dodali 2 µl deionizirane in destilirane vode, kar nam je služilo kot kontrola

kontaminacije (NTC – »no template control«). Ploščico smo prekrili z lepljivo prozorno

folijo Abi Prism (Applied Biosystems By Life Technologies, Carlbad, CA) ter

centrifugirali 2 minuti pri hitrosti 1000 g. Zatem smo optično ploščico vstavili v ciklični

termostat ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems by Life Technologies,

Carlsbad, CA), kjer je pomnoževanje specifičnega odseka nukleotidnega zaporedja

potekalo ob sledečih pogojih:


1. korak 2 minuti 50 °C

2. korak 10 minut 95 °C

3. korak 40 ciklov:

30 sekund 94 °C

30 sekund 62 °C

40 sekund 72 °C

4. korak Disociacijski protokol:

15 sekund 95 °C

60 sekund 60 °C

15 sekund 95 °C

3.3.6 Relativna kvantifikacija

Rezultate pridobljene s qPCR smo analizirali z računalniškim programom Sequence

Detection Software (SDS) v1.3 (Applied Biosystems By Life Technologies, Carlbad, CA).

Najprej smo ročno nastavili vrednost praga in bazne linije, nato pa smo Ct-vrednosti

izvozili v Microsoft Excell dokument, kjer smo opravili nadaljnje izračune ekspresije

tarčnih genov.

Za relativno kvantifikacijo PCR je pomemben tudi izbor natančnega postopka spremljanja

učinkovitosti pomnoževanja tarčnega odseka (Foley in sod. 1993). Zaradi tega je potrebno

za relativno kvantifikacijo poleg tarčnih genov spremljati tudi referenčne gene (Libault in

sod. 2008). Za referenčne gene so primerni tisti geni, za katere so na podlagi testiranj

ugotovili, da se bolj ali manj enakomerno izražajo v določenih tkivih. Kot pogost

referenčni gen v rastlinskih tkivih se uporablja aktin (Li in sod. 2005, Williams in sod.

2005, Domoki in sod. 2006), ki smo ga kot referenčni gen v letu 2008 uporabili tudi v naši

kvantifikaciji. Poleg aktina smo v letu 2009 kot referenčne gene uporabili tudi r18S, F-

BOX in GAPDH. Rezultati leta 2008 se nanašajo na kvantifikacijo glede na aktin, medtem


ko so rezultati leta 2009 kvantificirani na geometrijsko povprečje vseh štirih referenčnih

genov.

Poleg izbora referenčnega gena je za relativno kvantifikacijo pomembna učinkovitost

pomnoževanja PCR produkta. Za relevantno relativno kvantifikacijo je pomembno, da je

učinkovitost pomnoževanja tarčnega gena in referenčnega gena približno enaka (Livak in

Schmittgen 2001). Učinkovitost pomnoževanja posameznega gena smo preverili s pomočjo

redčenja vzorcev 1 : 102 : 103 : 104 : 105 : 106. Nato smo učinkovitost preračunali po enačbi

E (%) = ((10(1/-S))-1)x 100 (Pfaffl, 2004, Rutledge in Côté, 2003). Z izračunom smo

ugotovili, da je učinkovitost pomnoževanja tarčnih in referenčnih genov na približno

enakem nivoju (med 92-96 %), kar je osnova za nadaljnjo relativno kvantifikacijo, ki smo

jo izvedli po 2-∆∆Ct metodi (Livak in Schmittgen 2001). Za kalibrator smo v letu 2008

izbrali kontrolo, medtem ko je v letu 2009 kot kalibrator služila kontrola v terminu

vzorčenja 0 DAT.

3.3.7 Oligonukleotidni začetniki

V qPCR smo uporabili nekatere že preverjene oligonukleotidne začetnike, in sicer za

MdACO1 (Dal Cin in sod. 2005), MdActin (Li in Yuan 2008, Espley in sod. 2007), Mdr18s

(Dal Cin in sod. 2005, Dal Cin in sod. 2009) in MdGAPDH (Tacken in sod. 2010). V

primeru MdACS5A, MdACS5B in MdF-BOX smo oligonukleotidne začetnike načrtovali z

iskanjem sekvenc po spletni bazi NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), nato

smo naredili poravnavo sekvenc s programom BioEdit v7.0.9.0. in izdelali začetne in

končne oligonukleotidne začetnike s spletnim orodjem Primer-BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome).

Zaporedja vseh uporabljenih oligonukleotidnih začetnikov so podana v Preglednici 3.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome


Preglednica 3: Zaporedja vseh začetnih oligonukleotidnih začetnikov (F) in končnih

oligonukleotidnih začetnikov (R), uporabljenih v qPCR pri tej raziskavi.

Gen Oligonukleotidni začetnik 5’→3’ Vir

MdACO1 F CAGTCGGATGGGACCAGAA Dal Cin in sod. 2005

MdACO1 R GCTTGGAATTTCAGGCCAGA Dal Cin in sod. 2005

MdACS5A F GCCAGCCAAGTTTCATAAGC Lastno načrtovanje

MdACS5A R CAACTCTGAAGCCAGGGAAC Lastno načrtovanje

MdACS5B F GAGCAACAGGTTATGGCACA Lastno načrtovanje

MdACS5B R GGTATCGGCGTATGAGGAGA Lastno načrtovanje

MdActin F TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT Espley in sod. 2007

MdActin

MdF-BOX

MdF-BOX

MdR18s

MdR18s

MdGAPDH

MdGAPDH

R

F

R

F

R

F

R

TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC

CTGAGACAGCTCATCGGTCA

GATGATGGCGGAGTAGAGGA

GTTACTTTTAGGACTCCGCC

TTCCTTTAAGTTTCAGCCTTG

TCATTCTCTGCCCCCAGTAAGGAT

CCAGGGGAGCAAGACAGTTGGT

Espley in sod. 2007

Lastno načrtovanje

Lastno načrtovanje

Dal Cin in sod. 2005

Dal Cin in sod. 2005

Tacken in sod. 2010

Tacken in sod. 2010

3.4 Statistična obdelava podatkov

Pridobljene rezultate različnih meritev smo v končni fazi statistično obdelali z

računalniškim programom Statgraphics Centurion XVI v16.0.09 (StatPoint Tecnologies,

Warrenton, Virginia, ZDA). Za ugotavljanje statističnih razlik med obravnavanji smo

uporabljali analizo variance (ANOVA) in Duncanov razvrstitevni test (p ≤ 0,05). Za

predstavitev rezultatov smo izdelali preglednice v programu Excell in Word (Microsoft

Office 2007, ZDA) ter grafikone s programom OriginPro v7.5 (OriginLab Corp.,

Northampton, MA, ZDA).


4 REZULTATI

4.1 Pridelek

Za ugotavljanje učinkovitosti redčenja smo poleg spremljanja frekvence odpadanja

plodičev po tretiranju ovrednotili tudi pridelek plodov po posameznem drevesu ob

obiranju. Vrednotenje pridelka po posameznem drevesu na podlagi različnih tretiranj nam

pokaže dejanski učinek redčenja z določenim sredstvom na količino in kakovost pridelka.

V letu 2008 je bilo pri obravnavanju K in SEN statistično značilno več plodov po

posameznem drevesu v primerjavi z obravnavanji NAA, BA in ETEF. Na drevesih

obravnavanja K so bili povprečno 204 plodovi, medtem ko pri obravnavanju SEN 205

plodov. Za razliko od teh dveh obravnavanj je bilo pri ostalih statistično značilno manj

plodov, in sicer pri NAA 128 plodov, BA 110 plodov in ETEF 146 plodov (Preglednica 4).

Podobno razmerje med obravnavanji smo ugotovili tudi pri izračunu parametra števila

plodov na 100 socvetij. Povprečen pridelek na drevo je bil prav tako najvišji pri

obravnavanju K (24,59 kg) in obravnavanju SEN (25,49 kg), medtem ko je bil povprečen

pridelek pri ostalih obravnavanjih nižji in sicer 21,08 kg pri obravnavanju NAA, 21,03 kg

pri obravnavanju BA in 19,53 kg pri obravnavanju ETEF. Delež debelejših plodov (>70

mm premera) je bil obratno sorazmeren s številom plodov na drevo in sicer je bil najvišji

pri obravnavanju BA (89,5 %), sledi obravnavanje NAA (82,8 %), ETEF (62,3 %). Pri

obravnavanju SEN (37,4 %) in K (26,9 %) pa je bil delež debelih plodov statistično

značilno nižji v primerjavi z ostalimi obravnavanji, medtem ko med K in SEN ni bilo

statistično značilne razlike. Povprečna masa plodov je bila najvišja pri obravnavanju BA

(196 g) in NAA (166 g). V primeru ostalih obravnavanj je bila povprečna masa statistično

značilno nižja, in sicer 141 g pri ETEF, 129 g pri SEN in 119 g pri K-obravnavanju.

Pomembno je opozoriti tudi na podatek, da so bila drevesa v začetku vegetacije oz.

izvajanja poskusa izenačena, kar vidimo iz podatka števila socvetij na drevo, ki je bilo

statistično nesignifikantno med obravnavanji.



V letu 2009 vidimo, da je za razliko od leta 2008, samo v primeru K število plodov na

drevo statistično značilno večje od ostalih obravnavanj, medtem ko med obravnavanji

NAA, BA, ETEF in SEN ni statistično značilnih razlik. Podobno razmerje je tudi pri

parametru števila plodov na 100 socvetij. Povprečen pridelek na drevo je bil najvišji pri K-

obravnavanju, vendar je bila kot posledica tega pri tem obravnavanju najnižja povprečna

masa plodov, in sicer 153 g. Najnižji pridelek na drevo smo ugotovili pri obravnavanju

ETEF, kjer pa je bila tudi povprečna masa plodov (164 g) relativno nizka v primerjavi z

ostalimi obravnavanji. Delež debelih plodov je bil v letu 2009 v vseh primerih višji v

primerjavi z letom 2008. V primeru NAA in BA smo ugotovili, da je bilo celo 97 oz. 98

odstotkov plodov debelejših kot 70 mm. Nekoliko nižji odstotek debelejših plodov smo

ugotovili le pri obravnavanju K, in sicer 74 %.

Na podlagi primerjave določenih parametrov med letoma 2008 in 2009 lahko ugotovimo,

da je bilo povprečno število plodov na drevo v letu 2008 statistično značilno nižje pri

obravnavanjih NAA, BA in ETEF. V letu 2009 pa je bilo v primerjavi s K-obravnavanjem

statistično značilno nižje število plodov tudi pri obravnavanju SEN. Podoben rezultat smo

ugotovili tudi pri parametru števila plodov na 100 socvetij (Grafikon 1 in 2).


Grafikon 1: Povprečno število plodov na drevo ob obiranju pri sorti 'Zlati delišes' v letih

2008 in 2009.


Grafikon 2: Povprečno število plodov na drevo ob obiranju na vsakih 100 socvetij pri sorti

'Zlati delišes' v letih 2008 in 2009.

V skladu s prejšnjimi rezultati je bil povprečen pridelek na drevo v letu 2008 najvišji pri K-

in SEN-obravnavanju. Povprečen pridelek pri obravnavanjih NAA, BA in SEN se med

seboj statistično ni razlikoval, medtem ko je bil statistično značilno nižji v primerjavi s K

in SEN. V letu 2009 pa so bili povprečni pridelki na drevo v primerjavi s K-

obravnavanjem statistično značilno nižji pri vseh ostalih obravnavanjih.

Na podlagi prikazanih rezultatov lahko ugotovimo, da je v letu 2008 tretiranje z NAA, BA

in ETEF učinkovito vplivalo na večjo abscizijo plodičev, kar se je pri končnem

vrednotenju izrazilo v obliki manjšega števila plodov na drevo oz. manjšega skupnega


pridelka (Grafikon 3). Obravnavanje SEN pa v tem letu ni imelo vpliva na abscizijo

plodičev v primerjavi s K. V letu 2009 pa je poleg obravnavanj NAA, BA in ETEF tudi

obravnavanje SEN vplivalo na močnejšo abscizijo plodičev v primerjavi s K. Prav tako je

bil povprečen pridelek SEN-dreves manjši v primerjavi s K-drevesi. Pozitiven učinek se je

seveda odrazil v povprečni masi plodov, ki je bila v obeh letih največja pri obravnavanju

BA nato sledi NAA. Za razliko od leta 2008 je v letu 2009 SEN vplivalo na statistično

značilno večjo maso plodov v primerjavi s K plodovi, medtem ko v letu 2009 med tema

dvema obravnavanjema ni bilo razlik glede povprečne mase plodov (Grafikon 4).

Grafikon 3: Povprečen pridelek na drevo v letih 2008 in 2009 pri sorti 'Zlati delišes'.


Grafikon 4: Povprečna masa plodov ob obiranju pri sorti 'Zlati delišes' v letih 2008 (A) in

2009 (B).

4.2 Frekvenca odpadanja plodičev

Frekvenco odpadanja plodičev smo merili v 2-3 dnevnih intervalih po aplikaciji rastnih

regulatorjev in senčenju. Zaradi pričakovanih razlik, glede poteka abscizije, smo posebej

spremljali frekvenco odpadanja pri CP in LP. V letu 2008 so CP pričeli aktivno odpadati

nekje 8 dni po tretiranju (DAT), vendar le pri obravnavanju ETEF. Odpadanje CP pri

obravnavanju ETEF se je izvršilo v zelo kratkem času, saj je večina plodičev odpadla med

8 in 10 DAT. Pri ostalih obravnavanjih smo beležili le manjši delež odpadlih CP. Končno

štetje neodpadlih CP, ki smo ga izvedli 22 DAT je pokazalo, da je odstotek odpadlih CP


pri obravnavanju ETEF bil statistično značilno večji v primerjavi z ostalimi obravnavanji.

Med K, NAA, BA in SEN pa 22 DAT ni bilo statističnih razlik glede števila odpadlih CP,

ki je bilo pri omenjenih obravnavanjih nizeko (Grafikon 5). Odpadanje LP se je v letu 2008

pričelo nekoliko hitreje v primerjavi s CP. Plodiči so pričeli odpadati po 5 DAT, in sicer

najbolj intenzivno pri obravnavanju ETEF, kjer je do 8 DAT odpadla večina plodičev, ki

so bili podvrženi absciziji. Za razliko od CP so LP z različno intenziteto odpadali tudi pri

ostalih obravnavanjih. Obravnavanju ETEF, kjer je bilo odpadanje najbolj intenzivno je

sledilo obravnavanje SEN, medtem ko je bila intenziteta odpadanja LP pri obravnavanjih

NAA, BA in K bolj zmerna. Najbolj počasna je bila frekvenca odpadanja pri obravnavanju

NAA, vendar kot smo ugotovili na podlagi končnega štetja 22 DAT intenziteta oz.

frekvenca odpadanja ne vpliva na odstotek končno odpadlih plodičev (Grafikon 6).

Grafikon 5: Dinamika odpadanja centralnih plodičev (CP) v letu 2008 po tretiranju z NAA,

BA, ETEF in SEN.


Grafikon 6: Dinamika odpadanja lateralnih plodičev (LP) v letu 2008 po tretiranju z NAA,

BA, ETEF in SEN.

V ponovitvi spremljanja frekvence odpadanja plodičev v letu 2009 smo dobili rezultate, ki

so zelo primerljivi z rezultati iz leta 2008. Odpadanje CP se je podobno kot predhodno leto

pričelo 8 DAT in je bilo najbolj izrazito pri obravnavanju ETEF, vendar odpadanje v tem

letu ni bilo tako intenzivno, saj so CP enakomerno odpadali med 8 in 15 DAT. Prav tako je

bil končni delež odpadlih plodov 22 DAT po tretiranju z ETEF mnogo nižji v primerjavi s

predhodnim letom. V primerjavi z letom 2008 je v letu 2009 tudi SEN vplivalo na

odpadanje CP, ki se je pričelo 10 DAT. Obravnavanja NAA, BA in K pa podobno kot v

letu 2008 niso pomembno vplivala na frekvenco odpadanja CP (Grafikon 7). Frekvenca

odpadanja LP je bila v letu 2009 podobna, kot v letu 2008, in sicer so LP najintenzivneje

odpadali med 5 in 15 DAT. Kljub temu da je tretiranje z ETEF povzročilo močno

odpadanje LP med 5 in 8 DAT, pa le-to ni bilo tako izrazito kot v letu 2008. Nekoliko

manj intenzivno so odpadali LP obravnavanja SEN, medtem ko je bila frekvenca

odpadanja LP pri obravnavanjih NAA, BA in ETEF bolj zmerna, podobno kot v


predhodnem letu. Prav tako smo na podlagi končnega štetja 22 DAT ponovno ugotovili, da

intenziteta odpadanja ne vpliva na končni odstotek odpadlih plodičev.

Grafikon 7: Dinamika odpadanja centralnih plodičev (CP) v letu 2009 po tretiranju z NAA,

BA, ETEF in SEN.


Grafikon 8: Dinamika odpadanja lateralnih plodičev (LP) v letu 2009 po tretiranju z NAA,

BA, ETEF in SEN.

Na podlagi dvoletnih rezultatov spremljanja frekvence odpadanja CP in LP lahko

ugotovimo, da aplikacija sredstev za kemično redčenje in senčenje vpliva na frekvenco

odpadanja plodičev. V obeh letih smo ugotovili, da so LP bolj podvrženi absciziji v

primerjavi s CP, saj je abscizijo slednjih povzročila le aplikacija ETEF, medtem ko so bili

LP podvrženi absciziji pri vseh obravnavanjih. Pri spremljanju odpadanja LP smo

ugotovili, da ETEF povzroči kratkotrajno intenzivno odpadanje, medtem ko je odpadanje

pri ostalih obravnavanjih nekoliko počasnejše in terminsko traja dalj časa. Vendar pa, kot

je bilo dokazano v obeh letih, končni delež odpadlih plodov ni odvisen od intenzivnosti

odpadanja plodičev.


4.3 Evolucija etilena

Evolucija etilena iz CP se med 0 in 2 DAT ni bistveno spremenila. Nato se je med 2 in 5

DAT sinteza etilena pri obravnavanju ETEF povečala iz 4,8 nl g-1 h-1 na 8 nl g-1 h-1, čemur

je sledilo še dodatno povišanje, in sicer na 22 nl g-1 h-1 8 DAT (Grafikon 9). Pri ostalih

obravnavanjih se sinteza etilena iz CP med 0 in 8 DAT ni povečala, ampak smo beležili

rahel trend zmanjšanja sinteze etilena. Vendar se je med 5 in 8 DAT tudi pri vseh ostalih

obravnavanjih vsebnost etilena povišala. V terminih 5 in 8 DAT smo pri obravnavanju

ETEF izmerili statistično značilno višjo vsebnost etilena v primerjavi z ostalimi

obravnavanji, med katerimi ni bilo statističnih razlik.

Grafikon 9: Evolucija etilena iz centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 2, 5 in 8 DAT z

rastnimi regulatorji oz. SEN v letu 2008.


Pri LP med 0 in 2 DAT nismo izmerili povečane sinteze etilena. Med 2 in 5 DAT pa smo

izmerili ≈2-krat večjo vsebnost etilena v vzorcih LP obravnavanja ETEF. Med 5 in 8 DAT

se je sinteza etilena iz LP obravnavanja ETEF še dodatno povečala na 14,6 nl g-1 h-1.

Povečano vsebnost etilena med 5 in 8 DAT smo izmerili tudi pri ostalih obravnavanjih,

vključno s K (Grafikon 10). Največjo vsebnost etilena iz LP smo 8 DAT izmerili pri

obravnavanju ETEF (14,6 nl g-1 h-1), sledi obravnavanje SEN (10,7 nl g-1 h-1), K (7,9 nl g-1

h-1), NAA (4,1 nl g-1 h-1) in BA (2,7 nl g-1 h-1).

Grafikon 10: Evolucija etilena iz lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 2, 5 in 8 DAT z

rastnimi regulatorji oz. SEN v letu 2008.


4.4 Ekspresija MdACS5A, MdACS5B in MdACO1

4.4.1 Poskus 2008

Vzorce za ekspresijo genov smo v letu 2008 odvzeli na dan tretiranja (pred tretiranjem) in

8 DAT. Pri vrednotenju rezultatov smo ugotovili, da se količina tarčnega transkripta med

vzorci odvzetimi 0 DAT in K obravnavanjem 8 DAT ni statistično značilno razlikovala. Na

podlagi tega smo se odločili, da bomo kot »kalibrator« za predstavitev rezultatov

ekspresije MdACS5A, MdACS5B in MdACO1 uporabili K-obravnavanje 8 DAT. Se pravi,

da so predstavljeni rezultati ekspresije posameznega gena v določenem vzorcu relativni

glede na K-obravnavanje v terminu 8 DAT. V primeru, da bi se ekspresija vzorcev

obravnavanja K med 0 in 8 DAT spremenila, bi bilo smiselno prikazati tudi rezultate

termina 0 DAT. Ker pa se v našem primeru to ni zgodilo, pa je za boljšo preglednost

rezultatov bolj smiselno uporabiti zgoraj omenjen način izračuna.

V letu 2008 je bila ekspresija MdACS5A v CP relativno nizka pri vseh obravnavanjih. Pri

obravnavanjih NAA, BA in SEN smo zabeležili celo zmanjšanje ekspresije tarčnega gena

v primerjavi s K-obravnavanjem (Grafikon 11A). Pri LP smo ugotovili povečano

ekspresijo MdACS5A pri obravnavanjih NAA, BA in ETEF, medtem ko se SEN ni

statistično razlikovalo od K (Grafikon 11B). Kljub nekaterim statistično značilnim

razlikam med obravnavanji pa zaradi precej velike variabilnosti težko povežemo omenjene

rezultate z vplivom na evolucijo etilena oz. abscizijo. Ekspresija MdACS5A v tkivu AZ je

bila povišana samo v primeru obravnavanja SEN. Tako smo pri AC zabeležili ≈31-krat

večjo ekspresijo tarčnega gena, medtem ko je bila ekspresija v AL ≈7,8-krat višja v

primerjavi s K (Grafikon 11C in D). Ekspresija omenjenega gena je bila v primeru AC kot

tudi v primeru AL statistično značilno višja od vseh ostalih obravnavanj, medtem ko med

njimi ni bilo statističnih razlik.


Ekspresija MdACS5B je bila v primeru CP in LP relativno nizka. V primeru CP sta NAA

in SEN povzročila zmanjšanje ekspresije tarčnega gena 8 DAT, medtem ko sta BA in

ETEF vplivala na večjo ekspresijo MdACS5B (Grafikon 12A). Pri LP so vsa obravnavanja

vplivala na večjo ekspresijo MdACS5B, ki je bila najvišja pri obravnavanju BA (2,9-krat)

in NAA (2,4-krat), nato sledita obravnavanji ETEF (1,6-krat) in SEN (1,5-krat) (Grafikon

12B). Rezultati ekspresije v tkivu AZ so podobni kot v primeru MdACS5A. Povečano

ekspresijo MdACS5B je povzročila samo aplikacija ETEF, in sicer v primeru AC za 40,1-

krat in v AL za 12-krat (Grafikon 12C in D). Ekspresija obeh genov v plodičih je bila

relativno nizka, ne glede na obravnavanje. Nekoliko drugače je v primeru AZ, kjer je

aplikacija ETEF nedvomno vplivala na večjo ekspresijo MdACS5A in MdACS5B ne glede

na tip socvetja oz. plodiča.

Grafikon 11: Ekspresija MdACS5A v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),

abscizijski coni centralnih plodičev (C) in abscizijski coni lateralnih plodičev

(D), 8 dni po aplikaciji NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2008.


Grafikon 12: Ekspresija MdACS5B v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),



Na ekspresijo MdACO1 v CP je najbolj vplivalo obravnavanje ETEF, ki je povzročilo

6774-kratno povečanje. Ostala obravnavanja pa niso vplivala na ekspresijo MdACO1 oz.

smo zabeležili celo manjše znižanje ekspresije tarčnega gena (Grafikon 13A). V LP so vsa

obravnavanja vplivala na višjo ekspresijo MdACO1 gena, ki je bila najvišja v primeru

ETEF (8370-krat), nato sta sledili obravnavanji BA in SEN z 1233-kratnim oz. 1256-

kratnim povečanjem in obravnavanje NAA, kjer smo zabeležili 270-kratno povečanje

ekspresije MdACO1. Vsa obravnavanja so statistično značilno vplivala na ekspresijo

MdACO1 v primerjavi s K-obravnavanjem, prav tako so statistično značilne razlike med

obravnavanji, razen v primeru BA in SEN, med katerima ni statističnih razlik. Ekspresija

MdACO1 v tkivu AZ pa je bila veliko manjša v primerjavi s tkivom plodičev (Grafikon

13). V tkivu AC je samo ETEF vplival na višjo ekspresijo MdACO1, ki pa ni bila

sorazmerna z ekspresijo, ki smo jo ugotovili v tkivu CP. Ostala obravnavanja pa niso imela


vidnega vpliva na izraženost gena v AC, kakor tudi ne v primeru AL. Podobno kot v AC je

tudi v primeru AL samo obravnavanje ETEF povzročilo statistično značilno višjo

izraženost MdACO1.

Na podlagi genetskih rezultatov v letu 2008 vidimo, da v primeru AZ samo ETEF vpliva

na občutno povečanje ekspresije opazovanih genov, medtem ko ostala obravnavanja niso

imela večjega vpliva. Kar se tiče plodičev pa lahko zaključimo, da so obravnavanja NAA,

BA, ETEF in SEN vplivala predvsem na ekspresijo MdACO1 gena v LP, ki so najbolj

dovzetni za abscizijo. Prav tako smo ugotovili, da je bila ekspresija MdACS5A in

MdACS5B v tkivu plodičev občutno nižja v primerjavi z MdACO1. Tudi razlike med

obravnavanji so bile v primeru MdACS5A in MdACS5B relativno majhne.

Grafikon 13: Ekspresija MdACO1 v centralnih plodičih (A), lateralnih plodičih (B),




4.4.2 Poskus 2009

V letu 2009 smo vzorčenje za genetske analize razširili na štiri termine, in sicer prvič na

dan tretiranja oz. začetka senčenja (0 DAT), nato pa še 1, 4 in 7 DAT. Pri kvantifikaciji

smo kot kalibrator izbrali vzorčenje pred tretiranjem, se pravi 0 DAT. To pomeni, da so

predstavljeni rezultati ekspresije posameznega gena v določenem tkivu relativni, glede na

izraženost istega gena v terminu 0 DAT.

Grafikon 14: Ekspresija MdACS5A v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC) v

terminih 0, 1, 4 in 7 DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.

Ekspresija MdACS5A se v vzorcih AC med 0 in 4 DAT ni bistveno spremenila pri

nobenem obravnavanju. Smo pa med 4 in 7 DAT zabeležili 16,9-kratno povečanje pri

obravnavanju ETEF v primerjavi z ekspresijo 0 DAT (Grafikon 14). V vzorcih AL prav

tako ni bilo med 0 in 4 DAT pri nobenem obravnavanju nihanj v izraženosti MdACS5A,


nato pa se je ekspresija med 4 in 7 DAT povečala pri obravnavanju ETEF. 7 DAT je bila

ekspresija pri obravnavanju ETEF (5,1-krat) statistično značilno višja od ostalih

obravnavanj, pri katerih je bila izraženost gena skozi vse termine na začetnem nivoju

(Grafikon 15).

Grafikon 15: Ekspresija MdACS5A v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL) v


Aplikacija ETEF je na CP povzročila povečanje ekspresije MdACS5A v terminu 1 DAT za

2,6-krat v primerjavi z 0 DAT, nato pa se je ekspresija tarčnega gena do 4 DAT zmanjšala

in ni več statistično značilno odstopala od ostalih obravnavanj. V primeru K, NAA, BA in

SEN smo ugotovili rahlo povečanje ekspresije MdACS5A med 1 in 4 DAT, nato pa se med

4 in 7 DAT vrednost pri K in NAA ni bistveno spremenila, medtem ko se je pri BA in SEN

nekoliko zmanjšala (Grafikon 16). Razpon, v katerem so se gibale izračunane vrednosti

ekspresije, pa je bil relativno majhen. Pri LP smo ugotovili nekoliko večjo aktivnost


MdACS5A v primerjavi s CP. Tako smo v primeru LP že v terminu 1 DAT opazili rahel

trend povečane ekspresije pri vseh obravnavanjih razen K. Podoben trend se je nadaljeval

do 4 DAT. V tem terminu je obravnavanje ETEF statistično značilno vplivalo na višjo

ekspresijo v primerjavi s K-obravnavanjem, medtem ko se obravnavanja NAA, BA in SEN

statistično niso razlikovala od K. Med 4 in 7 DAT smo pri vseh obravnavanjih beležili

rahlo zmanjšanje ekspresije tarčnega gena (Grafikon 17).

Grafikon 16: Ekspresija MdACS5A v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1, 4 in 7

DAT z NAA, BA, ETEF in SEN v letu 2009.


Grafikon 17: Ekspresija MdACS5A v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4 in 7


Gen MdACS5B se je v vzorcih AC odzival s povečanim izražanjem samo v primeru

obravnavanja ETEF, kjer se je zvišal v terminu 7 DAT za ≈26-krat, medtem ko ostala

obravnavanja niso vplivala na izraženost gena v omenjenem tkivu. Tudi na izraženost

MdACS5B v tkivu AL je imelo največji vpliv obravnavanje ETEF, ki je povzročilo že v

terminu 1 DAT ≈2-kratno povečanje ekspresije, ki je nato stagnirala do 4 DAT, nato pa se

je do 7 DAT dodatno povečala na ≈9,2-krat v primerjavi z 0 DAT. Manjše povečanje

ekspresije tarčnega gena smo zabeležili tudi pri obravnavanju BA, in sicer med 1 in 4

DAT. Pomembnejši vpliv na ekspresijo gena MdACS5B v AZ obeh tipov socvetij je imelo

samo obravnavanje ETEF (Grafikon 18 in 19).


Grafikon 18: Ekspresija MdACS5B v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC) v



Grafikon 19: Ekspresija MdACS5B v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL) v


V CP obravnavanja ETEF se je ekspresija MdACS5B v terminu 1 DAT zvišala za ≈4,3-

krat, nato pa se je do 4 DAT zmanjšala na 2,8-krat in nato še v terminu 7 DAT na ≈1,1-krat

v primerjavi z 0 DAT. Ekspresija je bila v terminih 1 in 4 DAT statistično značilno višja od

ostalih obravnavanj, medtem ko med ostalimi obravnavanji ni bilo statističnih razlik. V

terminu 7 DAT pa se obravnavanja med seboj niso statistično razlikovala (Grafikon 20).

Na višjo ekspresijo MdACS5B v LP sta najbolj vplivali obravnavanji NAA in ETEF

(Grafikon 21). V terminu 1 DAT se je pokazal trend naraščanja, ki se je nato močneje

izrazil 4 DAT, kjer sta NAA in BA statistično značilno vplivali na ekspresijo tarčnega

gena. Povečano ekspresijo tarčnega gena v primerjavi z 0 DAT smo 4 DAT zabeležili tudi

pri obravnavanjih K, BA in SEN, med katerimi pa ni bilo statističnih razlik.


Grafikon 20: Ekspresija MdACS5B v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1, 4 in 7



Grafikon 21: Ekspresija MdACS5B v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4 in 7


Podobno kot pri MdACS5A in MdACS5B je tudi v primeru MdACO1 ekspresija v tkivu AZ

povišana samo v primeru obravnavanja ETEF. V vzorcih AC v terminu 1 DAT in 4 DAT

ni bilo statistično značilnih razlik med obravnavanji, prav tako nismo beležili spremembe

ekspresije pri nobenem obravnavanju. Tudi v terminu 7 DAT nismo pri obravnavanjih K,

NAA, BA in SEN beležili sprememb glede ekspresije. Se pa je ekspresija tarčnega gena v

terminu 7 DAT statistično značilno povečala pri obravnavanju ETEF, in sicer za ≈3,9-krat.

V tkivu AL smo v terminih 4 DAT in 7 DAT zabeležili rahlo povečanje ekspresije

MdACO1 pri obravnavanju ETEF, medtem ko se je ekspresija tarčnega gena v teh terminih

pri ostalih obravnavanjih nekoliko zmanjšala.


Grafikon 22: Ekspresija MdACO1 v tkivu abscizijske cone centralnih plodičev (AC) v



Grafikon 23: Ekspresija MdACO1 v tkivu abscizijske cone lateralnih plodičev (AL) v


Aplikacija rastnih regulatorjev in senčenje so najbolj vplivali na ekspresijo MdACO1 v

tkivu plodičev. V vzorcih CP je obravnavanje ETEF povzročilo močno povečano

ekspresijo MdACO1 v terminih 4 in 7 DAT, in sicer 18,9 oz. 721-krat. V terminu 1 DAT

nismo zabeležili povečane ekspresije pri nobenem obravnavanju. Prav tako je bila

ekspresija pri obravnavanjih K, NAA, BA in SEN skozi vse štiri termine opazovanja na

bazalnem nivoju (Grafikon 24). Pri LP se ekspresija MdACO1 med terminoma 0 in 1 DAT

ni spremenila pri nobenem obravnavanju, nato pa se je ekspresija tarčnega gena pri vseh

obravnavanjih postopoma dvigala, razen pri obravnavanju K, kjer je bila skozi vse štiri

termine na bazalnem nivoju (Grafikon 25). V terminu 4 DAT je SEN povzročilo ≈125-krat

višjo ekspresijo MdACO1 v primerjavi z 0 DAT, medtem ko smo pri obravnavanju ETEF

zabeležili ≈111-krat večjo ekspresijo tarčnega gena. Še manjše je bilo povečanje pri

obravnavanju BA, in sicer za 53,2-krat, ter NAA, kjer se je ekspresija tarčnega gena

povečala za 19,2-krat. Tudi pri obravnavanju K smo v terminu 4 DAT zabeležili manjše


povečanje ekspresije MdACO1, ki je znašala 3,4-krat v primerjavi z 0 DAT. Med 4 in 7

DAT je pri obravnavanjih ETEF, NAA in BA sledilo še dodatno povečanje ekspresije,

medtem ko je pri K in SEN ekspresija tarčnega gena v tem obdobju stagnirala. Tako je bila

izraženost MdACO1 7 DAT najvišja v tkivu LP obravnavanja ETEF, kjer je bila ≈460-krat

povečana v primerjavi z 0 DAT. Nekoliko nižje povečanje smo izmerili pri obravnavanju

BA, in sicer ≈234-krat. Nato sta sledili obravnavanji SEN z ≈123-krat in NAA z ≈104-krat

povečano ekspresijo MdACO1. Tudi v primeru K se je ekspresija tarčnega gena povečala

za 11,2-krat.

Na podlagi naših rezultatov lahko ugotovimo, da se je ekspresija MdACO1 močneje

povišala v LP v primerjavi s CP. V primeru CP je le obravnavanje ETEF sprožilo izražanje

opazovanega gena, medtem ko so v primeru LP vsa obravnavanja vplivala na ekspresijo

tarčnega gena, ki pa je bila različna med posameznimi obravnavanji.

Grafikon 24: Ekspresija MdACO1 v tkivu centralnih plodičev (CP) v terminih 0, 1, 4 in 7



Grafikon 25: Ekspresija MdACO1 v tkivu lateralnih plodičev (LP) v terminih 0, 1, 4 in 7


4.5 Prirast plodičev

V letu 2008 smo spremljali tudi prirast plodičev pred in po aplikaciji rastnih regulatorjev in

senčenju. Ugotovili smo, da so manjši plodiči bolj nagnjeni k absciziji v primerjavi z

večjimi plodiči. Prav tako je prirast plodičev, ki bodo po aplikaciji rastnih regulatorjev oz.

senčenju odpadli, manjši v primerjavi s tistimi plodiči, ki ne bodo odpadli. V določenih

primerih se prirast plodičev, ki bodo podvrženi absciziji, celo zaustavi. Vpliv na prirast

plodičev pa imajo tudi različni rastni regulatorji in senčenje.

Pri K-obravnavanju (Grafikon 26) vidimo, da so tako CP kakor tudi LP, ki so bili

podvrženi absciziji, slabše priraščali. Prav tako lahko opazimo, da so tudi v začetku

spremljanja premera plodičev -5 DAT bili plodiči, ki so pozneje odpadli, nekoliko

drobnejši. V terminih od -5 do nekje 5 DAT so plodiči priraščali enakomerno, nato pa je


bil v terminih 8, 10 in 15 DAT premer plodičev, ki so bili podvrženi absciziji, statistično

značilno manjši v primerjavi s plodiči, ki niso odpadli. V primeru CP smo ugotovili, da se

je rast plodičev podvrženim absciziji med terminoma 8 in 15 DAT skorajda zaustavila.

Grafikon 26: Premer lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi absciziji

(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri K obravnavanju.


Pri obravnavanju NAA so LP, ki so bili podvrženi poznejši absciziji, priraščali z enako

stopnjo kot tisti, ki pozneje niso odpadli. Manjše priraščanje LP, ki so bili podvrženi

absciziji, je bilo opazno komaj v terminih 10 in 15 DAT. Nekoliko večji vpliv je imela

aplikacija NAA na prirast CP, kjer so razlike v stopnji priraščanja opazne že 5 DAT in se

nato povečujejo do 15 DAT (Grafikon 27).

Grafikon 27: Prirast lateralnih (A) in centralnih (B) plodičev, ki so bili podvrženi absciziji

(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri obravnavanju NAA.


Pri obravnavanju BA vidimo, da tretiranje ni povzročilo odpadanja opazovanih CP

(Grafikon 28B), ter da so CP enakomerno priraščali skozi celotno dobo spremljanja. Pri LP

obravnavanja NAA vidimo trend, da so bili plodiči podvrženi poznejši absciziji že v osnovi

nekoliko manjšega premera (Grafikon 28A), vendar razlika v terminih -5, -3, 0, 2, 5 in 8 ni

bila statistično značilna. Kljub temu je obravnavanje BA vplivalo na statistično značilno

manjši premer LP v terminih 10 in 15 DAT.


(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri obravnavanju BA.


Aplikacija ETEF je že v terminu 2 DAT vplivala na prirast LP (Grafikon 29A), ki so bili

kasneje podvrženi absciziji. V primeru LP se je priraščanje plodičev, ki so pozneje odpadli,

skorajda ustavilo, saj se je premer med 2 in 10 DAT le malenkost povečal. Prav tako se je

abscizija pri vseh LP, ki so bili le-tej podvrženi pri obravnavanju ETEF, izvršila do termina

10 DAT. Kot lahko razberemo iz Grafikona 29A, so tudi LP, ki pozneje niso odpadli, med

terminoma 2 in 5 DAT nekoliko zastali v rasti, kar je verjetno posledica močnega

delovanja ETEF. Tudi CP obravnavanja ETEF so priraščali s podobnim trendom kot LP.

Med terminoma -5 in 0 DAT ni bilo razlik v premeru plodičev, nato se je 2 DAT nakazal

padec priraščanja plodičev, ki so bili kasneje podvrženi absciziji (Grafikon 29B). V

terminu 5 DAT pa smo že opazili statistično značilno manjši premer plodičev, ki so bili

podvrženi absciziji v primerjavi s CP, ki pozneje niso odpadli. Podobno kot v primeru LP

se je tudi v primeru CP abscizija pri vseh plodičih izvršila pred 15 DAT. Med terminoma 2

in 5 DAT pa je opazen tudi trend manjšega priraščanja plodičev, ki niso podlegli absciziji.

Rezultati obravnavanja ETEF nakazujejo, da sredstvo močno vpliva na priraščanje

plodičev tudi v primeru, ko se abscizija ne izvrši.



(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri obravnavanju ETEF.

Tridnevno SEN ni vplivalo na abscizijo CP, saj nobeden izmed opazovanih plodičev ni

odpadel (Grafikon 30B). Priraščanje CP obravnavanja SEN je bilo v opazovanem obdobju

skorajda linearno, kar pomeni, da SEN ni vplivalo na priraščanje. V prvih treh meritvah na

LP obravnavanja SEN nismo opazili razlik v premeru plodičev, nato pa je SEN v terminu 2

DAT vplivalo na manjši premer LP, ki so bili podvrženi absciziji. Statistično značilne

razlike so bile izmerjene tudi v poznejših terminih, in sicer 5, 8, 10, in 15 DAT. Kot lahko


razberemo iz Grafikona 30A, je bilo priraščanje LP, ki niso bili podvrženi absciziji,

linearno in se tudi v času SEN ni spremenilo. V primeru LP, ki so bili podvrženi absciziji,

pa se je v času SEN oz. med terminoma 2 in 5 DAT pokazalo, da je bilo priraščanje

nekoliko inhibirano. Nato se je po 5 DAT prirast ponovno nekoliko povečal, vendar kot

nakazujejo rezultati, je inhibicija priraščanja v času SEN pomembno pripomogla k poznejši

absciziji.


(črni kvadrat) in tistih, ki niso odpadli (rdeči krog) pri obravnavanju SEN.


5 RAZPRAVA

Na podlagi rezultatov vrednotenja pridelka po posameznem drevesu v času obiranja lahko

sklepamo, da je imela aplikacija NAA, BA in ETEF v letu 2008 vpliv na abscizijo

plodičev. Učinkovitost rastnih regulatorjev se je pokazala v manjšem številu plodov na

drevo, ki pa so imeli zaradi tega večjo maso. Prav tako se je povečal delež debelejših

plodov, čeprav se je skupni pridelek po posameznem drevesu nekoliko zmanjšal. V letu

2009 pa je poleg omenjenih rastnih regulatorjev tudi SEN vplivalo na večjo abscizijo

plodičev, kar se je rezultiralo v manjšem številu dozorelih plodov na drevo in večji

povprečni masi plodov obravnavanja SEN. Prav tako se je povečal tudi delež debelejših

plodov pri obravnavanju SEN. Rezultati potrjujejo predhodne objave, ki govorijo o

pozitivnem učinku redčenja na velikost oz. maso dozorelih plodov (Link 2000, Stopar in

Lokar 2003, Westwood in sod. 1967). Z učinkovitim redčenjem sicer nekoliko zmanjšamo

skupni pridelek, vendar se občutno poveča delež kakovostnejših plodov, ki imajo na trgu

višjo vrednost. Na podlagi analize pridelka smo ugotovili, da je aplikacija BA najbolj

vplivala na maso plodov ob obiranju, saj je bila povprečna masa dozorelih plodov tako v

letu 2008, kot tudi v letu 2009 pri obravnavanju BA največja v primerjavi z ostalimi

obravnavanji. Pozitiven učinek BA na velikost oz. maso plodov je že bil dokazan pri več

sadnih vrstah, med drugimi tudi pri hruški (Stern in Flaishman 2003) in jablani (Wismer in

sod. 1995). Vendar večja masa plodov, tretiranih z BA, ni samo posledica učinkovitega

redčenja plodičev, ampak predvsem pozitivnega učinka na delitev celic v plodiču v zgodnji

fazi rasti oz. razvoja. Rast plodov je pri jablani sestavljena iz dveh obdobij, in sicer je v

prvi fazi, ki traja do približno 35-45 dni po oploditvi, rast oz. večanje ploda predvsem

posledica eksponentne delitve celic. Nato se delitev celic zaustavi in nastopi druga faza,

kjer se plod povečuje predvsem zaradi povečevanja oz. rasti samih celic (Warrington in

sod. 1999, Blanpied in Wilde 1968). Ker je končna masa oz. velikost ploda v pozitivni

korelaciji s številom celic ploda, ima aplikacija BA posredno preko stimulacije delitve

celic pozitiven vpliv na končno maso dozorelih plodov. Nasprotno pa lahko ugotovimo pri

obravnavanju ETEF. Kljub temu da je aplikacija ETEF tako v letu 2008, kakor tudi v letu

2009 učinkovito vplivala na abscizijo plodičev, se povprečna masa plodov statistično ni


razlikovala od povprečne mase plodov pri K-obravnavanju, kjer je bila le-ta najnižja. Na

podlagi tega lahko domnevamo, da ETEF nima tako močnega pozitivnega učinka na maso

dozorelih plodov kot NAA in BA, kljub temu da je učinkovitost redčenja podobna. Pri

opazovanju priraščanja plodičev je bilo razvidno, da aplikacija ETEF zavira debeljenje

plodičev tudi v primeru, ko ti ne odpadejo.

Glavna razlika med učinkovitostjo redčenja v letih 2008 in 2009 je bila pri obravnavanju

SEN. Ugotovili smo, da v letu 2008 SEN ni imelo vpliva na močnejšo abscizijo plodičev,

saj se nobeden od parametrov, ki smo jih ovrednotili ob obiranju in odražajo učinkovitost

redčenja, ni statistično razlikoval od K-obravnavanja. Medtem ko je v letu 2009 tudi

tridnevno senčenje vplivalo na povečano odpadanje plodičev, podobno kot rastni

regulatorji NAA, BA in ETEF. Glede na to, da je bila metoda dela oz. način senčenja v

obeh letih enak, je najverjetnejši razlog za različen odziv dreves oz. plodičev v okoljskih

dejavnikih. Dva- do tridnevno senčenje dreves učinkovito vpliva na abscizijo plodičev, če

se ukrep izvede v terminu med 14. in 28. dnevom po polnem cvetenju (Byers in sod. 1991).

Poznejše ali zgodnejše SEN pa nima tako močnega vpliva na abscizijo. Pomemben

okoljski dejavnik, ki vpliva na učinkovitost redčenja z rastnimi regulatorji in tudi

senčenjem je temperatura (Yuan in Burns 2004, Jones in Koen 1985). Senčenje nima

vpliva na abscizijo plodičev v primeru, da je temperatura okolja ob senčenju relativno

nizka (Byers 2003). V našem primeru je bilo leta 2008 vreme v času, ki je optimalen za

aplikacijo rastnih regulatorjev oz. izvedbo senčenja spremenljivo. V času, ko smo se

odločili za SEN dreves in aplikacijo rastnih regulatorjev, je sledilo obdobje hladnejšega

vremena, ko najvišja dnevna temperatura dva dni ni presegla 14,5 °C, medtem ko se je

ponoči temperatura spustila tudi pod 10,5 °C, tudi tretji in četrti dan po tretiranju je bila

povprečna temperatura pod 14,5 °C. Prav tako je občasno deževalo in bilo večinoma

pretežno oblačno. Zato upravičeno domnevamo, da je bila ravno temperatura tisti dejavnik,

ki je v primeru obravnavanja SEN povzročila razliko glede učinka SEN na abscizijo

plodičev. Kljub temu da SEN v večini primerov vpliva na odpadanje plodičev in so v

preteklosti bile izvedene tudi preliminarne študije glede vpeljave senčenja kot

tehnološkega ukrepa v pridelavi jabolk (Zibordi in sod. 2009), lahko ugotovimo, da tudi ta

ukrep v določenih pogojih ne zagotavlja povečanega odpadanja plodičev. Za razliko od


leta 2008 so bile temperature okolja v letu 2009 v času senčenja in aplikacije rastnih

regulatorjev ter nekaj naslednjih dni, precej višje v primerjavi z letom 2008, saj so vsak

dan presegale 22 °C (Preglednica 1 in 2). Na podlagi tega upravičeno domnevamo, da ima

v primeru senčenja temperatura okolice pomembno vlogo.

Motnje v rasti plodičev oz. v priraščanju plodičev so eden izmed osnovnih indikatorjev

abscizije. Plodiči, ki so podvrženi procesu abscizije, najprej zastanejo v rasti, šele nato tudi

fizično odpadejo (Magein 1989, Byers in sod. 1991). Rezultati, ki smo jih pridobili z

merjenjem premera plodičev v času pred in po aplikaciji rastnih regulatorjev in senčenja,

prikazujejo različen trend priraščanja odpadlih in neodpadlih plodičev. Tudi v primeru K-

obravnavanja se nakazuje različen trend priraščanja plodičev, ki bodo odpadli v primerjavi

s tistimi, ki ne bodo podvrženi absciziji. Pri nobenem obravnavanju ni bilo statistične

razlike v premeru plodičev ob izboru (-5 DAT) glede na to, ali bodo plodiči pozneje

podvrženi absciziji. Pri nadaljnjem opazovanju priraščanja CP in LP smo pri vseh

obravnavanjih ugotovili počasnejše debeljenje plodičev, ki so kasneje odpadli. Plodiči, ki

so bili podvrženi absciziji, so v začetku nekoliko slabše priraščali, nato pa se je razlika v

premeru čedalje bolj povečevala v prid tistih, ki niso odpadli. Najbolj izrazit učinek na

priraščanje plodičev je imela aplikacija ETEF, kjer je že 2 DAT vidno, da je bila rast

plodičev močno inhibirana oz. skorajda zaustavljena. Podobni negativni učinek na rast

plodičev se lahko doseže tudi z aplikacijo kombinacije etefon + karbaril (Ward in Marini

1999). Tretiranje z ETEF je začasno (med 2 in 5 DAT) vplivalo tudi na rast plodičev, ki

niso bili podvrženi absciziji. Tovrstnega učinka nismo opazili pri obravnavanjih NAA, BA

in SEN. Poleg ETEF je tudi SEN v terminu med 0 in 5 DAT inhibiralo rast LP, vendar

samo tistih, ki so bili pozneje podvrženi absciziji. Predvideva se, da SEN povzroči

inhibicijo rasti preko redukcije fotosintetske aktivnosti drevesa (Morandi in sod. 2011).

Negativno delovanje ETEF na prirast plodičev je opazno tudi pri vrednotenju količine in

kakovosti pridelka, kjer smo ugotovili, da so imeli plodovi, tretirani z ETEF, povprečno

statistično značilno nižjo maso v primerjavi s plodovi pri obravnavanjih NAA, BA in SEN.

V primerjavi z ETEF imata NAA in BA ter tudi SEN nekoliko manj izrazit učinek na rast

plodičev, vendar je nesporno dejstvo, da se prirast plodičev, podvrženih absciziji, najprej


zmanjša in nato zaustavi, dokler ne pride do fizične ločitve absczijskega tkiva. Glede na

naše rezultate lahko domnevamo, da je takoj po aplikaciji ETEF rast plodičev močno

inhibirana, medtem ko se rast plodičev, podvrženih absciziji, pri ostalih obravnavanjih

postopoma zmanjšuje in nato zaustavi. Očitno je, da se abscizija v primeru uporabe ETEF

izvrši v krajšem času kot po aplikaciji NAA oz. BA. V prid temu govori tudi podatek, da

so vsi CP in LP, ki so bili podvrženi absciziji, odpadli pred 15 DAT (večinoma med 5 in 10

DAT), medtem ko je bilo odpadanje plodičev pri obravnavanjih NAA, BA in SEN bolj

zmerno oz. je terminsko potekalo dalj časa. Vendar dinamika odpadanja plodičev nima

neposrednega vpliva na končni delež plodičev, ki bodo odpadli, saj je bilo redčenje v letih

2008 in 2009 pri obravnavanjih NAA, BA in ETEF skoraj enako učinkovito.

Na podlagi spremljanja prirasta plodičev je možno tudi predvideti, v kolikšni meri bodo

plodiči podvrženi absciziji (Greene in sod. 2004). Model za izračun verjetnosti je še v fazi

testiranja, vendar bi bilo zelo dobrodošlo, če bi lahko s pomočjo enostavnih meritev

spremljanja premera plodičev ocenili, kakšen delež plodičev bo podvržen absciziji.

Optimalen čas za izvedbo aplikacije je zelo kratek, zato je hitra informacija o učinkovitosti

določenega sredstva v praksi še kako dobrodošla. V primeru, da bi se na podlagi

modelnega izračuna izkazalo, da neko sredstvo v določenem letu ni oz. ne bo v zadostni

meri vplivalo na abscizijo plodičev, bi bil še čas za ponovno aplikacijo. Fizično plodiči

običajno odpadejo med 10-15 DAT, kar pomeni, da ponovna aplikacija ne bi bila več

učinkovita, ker so plodiči prerasli fazo, v kateri so občutljivi na aplikacijo rastnih

regulatorjev. Redčenje z rastnimi regulatorji je učinkovito, če jih uporabimo v fazi premera

plodičev ≈5-16 mm za NAA in BA (Byers 2003, Marini 1996), medtem ko ETEF

učinkovito redči tudi do premera plodičev 30 mm (Jones in sod. 1983, Marini 1996).

Rezultati evolucije etilena, ki smo jo merili na CP in LP v letu 2008, so pokazali, da imajo

rastni regulatorji in SEN vpliv na količino etilena, ki se sintetizira. Najvišje razlike v

količini etilena smo zabeležili predvsem v terminu 8 DAT, čeprav se je višja sinteza etilena

nakazovala že 5 DAT. V primeru CP je apliakcija ETEF povzročila signifikantno višjo

sintezo etilena v terminu 5 DAT, ki je nato do termina 8 DAT strmo naraščala. V primeru

obravnavanj K, NAA, BA in SEN pa se evolucija etilena skozi celotno obdobje opazovanja


ni bistveno spremenila. Tudi pri LP smo nekoliko višje količine etilena izmerili pri

vzorcih obravnavanja ETEF v terminu 5 DAT, medtem ko ostala obravnavanja v tem času

še niso vplivala na sintezo etilena. Nato se je evolucija etilena med 5 in 8 DAT močno

povišala pri obravnavanju ETEF, nekoliko manjše povišanje je bilo opaziti pri

obravnavanju SEN, ki mu sledi K. Najmanjši vpliv na količino izmerjenega etilena v

terminu 8 DAT pa sta imeli obravnavanji NAA in BA.

Rezultati spremljanja evolucije etilena so v nekaterih delih nekoliko v nasprotju s

pričakovanji. Učinek ETEF je seveda bil pričakovan, glede na domnevo, da aplikacija tega

rastnega regulatorja močno vzpodbudi sintezo etilena (Yuan 2007) in da je abscizija, ki jo

povzroči ETEF posledica močnega zvišanja sinteze etilena (Dennis 2000). Prav tako se

omenja, da senčenje stimulira sintezo etilena (Taylor in Whitelaw 2001). Nekoliko

preseneča neznaten vpliv aplikacije NAA in BA na sintezo etilena, glede na dejstvo, da so

nekateri raziskovalci predhodno ugotovili povišano evolucijo etilena po tretiranju s tema

dvema rastnima regulatorjema (Curry 1991, Kondo in Mizuno 1989, Walsh in sod. 1979).

Čeprav je Greene s sod. (1992) podvomil, da je višja sinteza etilena, ki jo povzročita NAA

in BA razlog za začetek abscizije plodičev, saj je povečanje sinteze etilena, ki jo povzroči

aplikacija omenjenih rastnih regulatorjev, relativno majhno. Prav tako so v primeru NAA

in BA veliko verjetnejši drugi mehanizmi delovanja (Byers 2003).

Glede na terminski razpored merjenja evolucije etilena smo na podlagi predhodnih

raziskav pričakovali povečane vrednosti že v terminu 2 DAT, kar pa se v našem primeru ni

zgodilo. Najverjetnejši razlog za »zakasnelo« evolucijo etilena je v okoljskih dejavnikih.

Temperatura v času in nekaj dni po aplikaciji rastnih regulatorjev je najpomembnejši

okoljski dejavnik, ki vpliva na učinkovitost sredstva (Flore in Bukovac 1982, Olien in

Bukovac 1978, Jones in Kohen 1985). Prav tako je evolucija etilena močno odvisna od

temperature okolja, kar še posebej velja v primeru tretiranja z ETEF (Yuan 2007). V

primeru nižjih temperatur poteka sinteza etilena mnogo počasneje kot takrat ko so

temperature višje, zaradi tega se v našem primeru vrh evolucije etilena ni zgodil 2 DAT,

kot smo pričakovali, ampak se je evolucija etilena strmo povečala šele 8 DAT. Kot smo že

omenili, je v našem primeru v letu 2008 tretiranju z rastnimi regulatorji oz. senčenju


sledilo obdobje hladnejšega vremena. Zato upravičeno domnevamo, da so nižje

temperature okolice vplivale na počasnejšo sintezo etilena.

Samostojni podatki evolucije etilena nam ne povejo veliko o pomembnosti etilena v

procesu abscizije. V primeru, da rezultate evolucije etilena v letu 2008 povežemo z

rezultati spremljanja dinamike odpadanja plodičev v istem letu, pa postane vloga etilena

nekoliko bolj jasna. Abscizija CP se je v letu 2008 močneje pojavila samo pri

obravnavanju ETEF, medtem ko ostala obravnavanja skorajda niso povzročila odpadanja

CP. Večina CP obravnavanja ETEF, ki so bili podvrženi absciziji, je odpadla med 8 in 10

DAT. Domnevamo lahko, da je bilo intenzivno odpadanje CP obravnavanja ETEF

povezano z višjo evolucijo etilena, ki je bila opazna že 5 DAT in se je nato povečevala do

8 DAT. Pri obravnavanjih K, NAA, BA in SEN pa v CP nismo zabeležili močnejšega

povečanja evolucije etilena, prav tako pa je bila abscizija CP zelo majhna.

V primeru LP so plodiči pričeli odpadati že 5 DAT, in sicer najbolj intenzivno pri

obravnavanju ETEF, kjer je med 5 in 8 DAT odpadla velika večina LP, ki so bili podvrženi

absciziji. Podobno kot v primeru CP je bila tudi pri LP najvišja evolucija etilena izmerjena

pri obravnavanju ETEF. Dinamika odpadanja LP pri ostalih obravnavanjih je bila v

primerjavi z ETEF mnogo bolj zmerna, vendar se je izmed ostalih obravnavanj najbolj

intenzivno izrazila pri obravnavanju SEN. Če pogledamo evolucijo etilena iz LP, lahko

vidimo, da je SEN poleg ETEF najbolj vplivalo na višjo evolucijo etilena. Pri

obravnavanjih K, NAA in BA so LP konstantno odpadali med 8 in 22 DAT, prav tako pa

je bila evolucija etilena pri teh obravnavanjih najnižja oz. v primeru NAA in BA skorajda

ni bilo povišane sinteze etilena. Domnevamo lahko, da je dinamika odpadanja plodičev

povezana s količino etilena, ki se sintetizira v plodičih, čeprav količina etilena in sama

dinamika odpadanja nimata neposrednega vpliva na delež plodov, ki bodo podvrženi

absciziji oz. na jakost redčenja. Višja evolucija etilena torej pozitivno vpliva na sam potek

procesa abscizije, ki se v tem primeru odvija hitreje kot v primeru nizke sinteze etilena,

vendar količina sintetiziranega etilena ni v povezavi s končnim deležem plodičev, ki bodo

odpadli. Ta trditev se sklada z domnevo, da je etilen pomemben dejavnik, ki lahko pospeši

razvoj abscizijskih procesov (Brown 1997, Sexton in Roberts 1982). Vendar se tudi v


primeru nizke evolucije etilena abscizija izvrši, vendar sam proces očitno poteka

počasneje.

Spremljanje dinamike odpadanja plodičev v letu 2009 je pokazalo precej primerljive

rezultate glede na poskus v predhodnem letu. Tudi v letu 2009 so LP pričeli odpadati ≈3

dni prej kot CP. Prav tako so bili CP najbolj podvrženi absiziji pri obravnavanju ETEF,

nekoliko manj pa je na odpadanje CP vplivalo SEN. Pri K, NAA in BA pa skorajda ni bilo

odpadanja CP. Tudi v primeru LP je bila dinamika odpadanja močno podobna rezultatom

iz leta 2008. Ugotovili smo, da je tretiranje z ETEF povzročilo intenzivno odpadanje LP

med 5 in 10 DAT, prav tako so relativno intenzivno odpadali tudi LP obravnavanja SEN.

Pri obravnavanjih K, NAA in BA pa je večina LP odpadla šele med 10 in 15 DAT. Tudi v

tem letu smo ugotovili, da dinamika odpadanja nima vpliva na končni delež plodov, ki

odpadejo v tem obdobju.

Kljub obsežnemu pregledu literature nisem uspel zaslediti podobnih znanstvenih objav,

kjer bi se primerjala dinamika odpadanja plodičev po tretiranju z rastnimi regulatorji oz.

senčenju, saj se običajno spremlja oz. ovrednoti le končni učinek posameznega sredstva na

abscizijo plodičev. Predstavljeni rezultati prikazujejo, kako pomembno vlogo ima

evolucija etilena pri razvoju abscizije, vendar kljub temu ni možno potrditi, ali je etilen

ključni faktor za potek abscizije, saj se ta izvede tudi, če je sinteza etilena zelo nizka.

Glede na močno povečanje evolucije etilena, ki ga povzroči aplikacija ETEF, ter na

posledično kratkotrajno intenzivno odpadanje plodičev, se postavlja vprašanje ali se v

primeru aplikacije ETEF abscizija izvrši zaradi velike količine sintetiziranega etilena ali

kot posledica inhibicije rasti plodičev, ki smo jo ugotovili na podlagi spremljanja prirasta

plodičev. Ali je torej inhibicija rasti plodičev hkrati posledica visoke evolucije etilena in

vzrok za začetek ascizijskih procesov? Glede na terminski razvoj visoka evolucija etilena

ne vpliva na prirast plodičev, saj se je količina etilena v vzorcih plodičev značilno povečala

šele v terminih 5 in 8 DAT, medtem ko je bila inhibicija rasti plodičev opazna že 2 DAT, v

terminu 5 DAT pa se je rast plodičev že skorajda zaustavila. Zaviralni učinek na rast

plodičev po tretiranju z ETEF je bil opazen zelo zgodaj v raziskovanju tega rastnega

regulatorja (Ebert in Bender 1986), zaradi tega se je predvidevalo, da ETEF vsaj delno


vpliva na abscizjio preko inhibicije rasti plodičev. Glede na to lahko na podlagi naših

rezultatov domnevamo, da je aplikacija ETEF v prvi fazi povzročila inhibicijo rasti

plodičev, šele nato je visoka evolucija etilena, ki je bila najverjetneje prav tako posledica

delovanja ETEF, povzročila hiter razvoj abscizijskih procesov, ki so privedli do

intenzivnega odpadanja plodičev. Če je naša domneva pravilna, bi lahko rekli, da tudi v

primeru ETEF začetek abscizije ni sprožen preko stimulirane sinteze etilena, ampak se

proces abscizije prične kot posledica inhibicije rasti plodičev.

S spremljanjem ekspresije genov MdACO1, MdACS5A in MdACS5B, za katere se

domneva, da sodelujejo v procesu sinteze etilena v plodičih (Li in Yuan 2008), smo želeli

podrobneje spremljati razvoj etilena po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenju. Večina

dosedanjih raziskav je spremljala ekspresijo omenjenih genov po aplikaciji rastnih

regulatorjev, ki so znani kot promotorji ali inhibitorji sinteze etilena (Ruperti in sod. 2002,

Tonutti in sod. 1997). Glede na dejstvo, da so LP mnogo bolj podvrženi absciziji v

primerjavi s CP (Bangerth 2000), je bil naš poskus zasnovan z namenom spremljanja razlik

v izraženosti omenjenih genov med dvema tipoma plodičev z različnim abscizijskim

potencialom. Kot kažejo rezultati, je bila takšna zasnova smiselna, saj smo med LP in CP

ugotovili nekatere pomembne razlike tako v izraženosti genov, kot tudi pri merjenju ostalih

parametrov.

Aplikacija rastnih regulatorjev oz. SEN je mnogo bolj vplivalo na ekspresijo MdACO1 v

primerjavi z MdACS5A in MdACS5B, kar se je pokazalo tudi že v nekaterih predhodnih

raziskavah (Zhu in sod. 2008, Zhu in sod. 2010). Medtem ko smo v letu 2008 8 DAT v

plodičih izmerili tudi do nekaj tisočkratno povečanje ekspresije MdACO1, pa so bile

razlike med obravnavanji v primeru MdACS5A in MdACS5B veliko manjše. Kljub temu

pomembnosti teh dveh genov ne gre izključevati, saj je Wang s sod. (2002) domneval, da

imajo, geni odgovorni za sintezo ACS, vlogo regulatorja in so limitirajoči dejavnik pri

sintezi etilena. Tudi v letu 2009 se je ekspresija MdACO1 odvijala na mnogo višjem nivoju

v primerjavi z MdACS5A in MdACS5B. Kot smo predvidevali, pa so se tudi v tem letu

pokazale pomembne razlike med ekspresijo genov, povezanih s sintezo etilena v CP v

primerjavi z LP. Ugotovili smo, da ima samo aplikacija z ETEF vpliv na višjo ekspresijo


MdACO1 v CP, medtem ko se je v LP ekspresija MdACO1 povečala tudi pri obravnavanjih

NAA, BA in SEN. Tak rezultat sovpada z dejanskim odpadanjem plodičev, ki je bilo v

primeru CP prisotno samo pri obravnavanju ETEF. Na podlagi tega rezultata lahko

potrdimo, da je ekspresija MdACO1 dober indikator abscizije oz. prisotnosti abscizijskih

procesov (Dal Cin in sod. 2007, Dal Cin in sod. 2009). Višja ekspresija MdACO1 je bila v

LP prisotna pri vseh obravnavanjih z izjemo K. Signifikantno je izstopala ekspresija

tarčnega gena po tretiranju z ETEF, vendar so tudi NAA, BA in SEN statistično značilno

vplivali na ekspresijo tarčnega gena v primerjavi s K-obravnavanjem. Če pa povežemo

rezultate ekspresije z ostalimi meritvami, ki smo jih izvajali lahko ugotovimo, da

ekspresija MdACO1 ni v korelaciji z deležem plodičev, ki dejansko odpadejo. Veliko bolj

se ekspresija MdACO1 v LP ujema z dinamiko odpadanja plodičev. Kot smo že ugotovili

je intenzivnejša dinamika odpadanja plodičev povezana z višjo sintezo etilena za katero pa

je najverjetneje odgovorna povečana ekspresija MdACO1 (Bonghi in sod. 2000, Dal Cin in

sod. 2005). Višja ekspresija tega gena v terminu 4 DAT pri obravnavanjih ETEF in SEN je

možen vzrok za intenzivno odpadanje LP, ki je sledilo med 5 in 10 DAT. Nasprotno pa so

LP obravnavanja NAA pričeli množično odpadati šele med 10 in 15 DAT. Prav pri

obravnavanju NAA smo večjo ekspresijo MdACO1 zabeležili šele 7 DAT.

Predpostavljamo lahko, da ima MdACO1 preko vpliva na sintezo etilena pomembno vlogo

v razvoju abscizije, vendar še vedno ostaja odprto vprašanje glede njegove vloge v

začetnih stopnjah abscizije.

Čeprav so se spremembe ekspresije MdACS5A in MdACS5B v vzorcih plodičev dogajale

na precej nižjem nivoju, jih ne smemo spregledati. Kljub temu, da se domneva, da imata

MdACS5A in MdACS5B pomembno vlogo pri sintezi etilena v plodičih jablane pa jima na

podlagi naših rezultatov ne moremo pripisati ključne vloge. Dal Cin s sod. (2005) je po

aplikaciji BA opazil samo aktivnost MdACS5B, medtem ko je Zhu s sod. (2008) 4 DAT z

NAA ugotovil močno povečanje ekspresije MdACS5A in MdACS5B. Isti avtor pa je v

nekem drugem eksperimentu v opazovanju omenjenih dveh genov skozi 7 dnevno obdobje

zabeležil le manjše povečanje aktivnosti (Zhu in sod. 2010). Takšni podatki nam vlivajo

sum, da sta MdACS5A in MdACS5B pomembna dejavnika v procesu abscizije, vendar

njuno izražanje ni tako nedvoumno, kot v primeru MdACO1. V skladu s predhodnimi


objavami tudi naši rezultati namigujejo na vključenost MdACS5A in MdACS5B v sintezo

etilena v plodičih. V primeru CP je bilo nekaj višjo aktivnost obeh genov opaziti pri

obravnavanju ETEF takoj po aplikaciji (1 DAT), ki pa se je nato zmanjševala. Nekoliko

večji vpliv na ekspresijo obeh genov so imela obravnavanja NAA, BA, ETEF in SEN v

primeru LP za katere vemo, da so bili bolj podvrženi absciziji. V obeh opazovanih letih je

bila ekspresija tako MdACS5A, kakor tudi MdACS5B pri obravnavanjih, ki so vplivala na

močnejše odpadanje plodičev, nekoliko povišana v primerjavi s K-obravnavanjem.

Podobno kot v primeru MdACO1 se tudi ekspresija MdACS5A in MdACS5B ni odvila takoj

po aplikaciji, ampak šele 4 DAT oz. pozneje.

Spremljanje ekspresije s sintezo etilena povezanih genov na AZ je pokazalo, da samo

ETEF vpliva na višjo ekspresijo MdACO1, MdACS5A in MdACS5B. V letu 2008 je bila

ekspresija vseh treh opazovanih genov 8 DAT povišana v vzorcih AC in AL. Tudi v letu

2009 smo zabeležili podobne rezultate, saj se je ekspresija vseh opazovanih genov v

vzorcih AZ povišala šele v terminu 7 DAT, medtem ko so bile ekspresije tarčnega gena v

terminih 0, 1 in 4 DAT pri vseh obravnavanjih na začetnem nivoju. Zanimiva je tudi

ugotovitev, da nismo opazili bistvenih razlik med ekspresijo v tkivu AL v primerjavi z AC.

Edina manjša razlika, ki smo jo opazili, je bila, da so se pri obravnavanju ETEF vsi

opazovani geni v obeh letih izrazili na višjem nivoju v vzorcih AC v primerjavi z AL. V

našem poskusu nismo uspeli potrditi rezultatov Dal Cina s sod. (2005) in Zhu s sod.

(2008), ki sta dokazala povečano ekspresijo MdACO1, MdACS5A in MdACS5B v tkivu AZ

po tretiranju z NAA, čeprav je treba poudariti, da je v obeh primerih šlo za zelo majhno

povečanje ekspresije tarčnih genov. Razlog za to, da je samo ETEF vplival na ekspresijo

opazovanih genov v AZ, je lahko hiter razvoj abscizijskih procesov pri tem obravnavanju,

saj večja aktivnost genov sovpada s pričetkom odpadanja plodičev, ki se je pri

obravnavanju ETEF pričelo ≈5 dni prej kot pri ostalih obravnavanjih. Drugi dejavnik, ki je

lahko sprožil ekspresijo na AZ, pa je močno povečanje MdACO1 v plodičih, kar bi lahko

bil vzrok za večjo aktivnost tudi v tkivu AZ.


6 SKLEPI

Etilen ima ključno vlogo v procesu abscizije plodičev predvsem iz vidika intenzivnosti

razvoja abscizije. Rezultati so pokazali, da je razvoj procesov, povezanih z abscizijo

mnogo hitrejši v primeru višje sinteze etilena oz. višje ekspresije genov MdACO1 in

MdACS5A. S povečano ekspresijo genov, odgovornih za sintezo etilena, je povezana

intenziteta odpadanja plodičev. Domnevamo lahko, da je vloga etilena ključna v smislu

vodenja procesa abscizije, medtem ko je njegova vloga pri sprožitvi procesa, ki velja za

ključen dejavnik, še vedno nejasna.

S pomočjo poskusov v letih 2008 in 2009 smo potrdili, da aplikacija NAA, BA in ETEF v

fazi premera plodičev ≈10 mm vpliva na povečano abscizijo plodičev, kar pozitivno vpliva

na kakovost dozorelih plodov in zmanjša možnost pojava alternance. Učinkovitost

omenjenih rastnih regulatorjev se je v obeh letih pokazala v večjem številu plodičev, ki so

odpadli iz posameznih dreves v primerjavi s K-drevesi. Podoben učinek je možno doseči

tudi z redukcijo svetlobe (3-dnevno senčenje), vendar je učinkovitost odvisna od zunanjih

dejavnikov. Domnevamo lahko, da imajo višje temperature v času SEN pozitiven vpliv na

abscizijo, medtem ko nizke temperature izničijo učinek, ki ga dosežemo z redukcijo

svetlobe. V skladu z našo hipotezo so se CP in LP različno odzvali na aplikacijo rastnih

regulatorjev oz. SEN. Nedvoumno je, da so LP veliko bolj podvrženi absciziji, ki jo

izzovemo s pomočjo rastnih regulatorjev oz. SEN. To trditev smo uspeli potrditi z več

meritvami, in sicer je bila izraženost genov, odgovornih za sintezo etilena v LP povišana v

primerih obravnavanj NAA, BA, ETEF in SEN, medtem ko je v primeru CP samo ETEF

vplival na večjo ekspresijo omenjenih genov. Skladno s tem so CP v večjem obsegu

odpadali samo pri obravnavanju ETEF, medtem ko so LP bili podvrženi absciziji v primeru

vseh obravnavanj. Glede na pretekle objave so bile razlike v odzivnosti CP in LP

pričakovane, ob tem pa nam je uspelo dokazati, da so razlike prisotne tudi na genetskem

nivoju.


Glede vpliva rastnih regulatorjev oz. SEN na izraženost genov, odgovornih za sintezo

etilena, smo ugotovili, da ima ETEF nedvomno največji vpliv na ekspresijo MdACO1,

MdACS5A in MdACS5B. Za ETEF je znano, da vpliva na višjo evolucijo etilena in prav

zaradi te lastnosti smo ga uvrstili v naš poskus, saj smo na ta način dokazali povezavo med

etilenom in opazovanimi geni. Tretiranje z ETEF je povzročilo močno ekspresijo MdACO1

gena v plodičih, poleg tega pa je edino aplikacija ETEF vplivala na večjo izraženost genov

v tkivu AZ. Prav tako smo samo v primeru obravnavanja ETEF zabeležili večjo izraženost

MdACO1 v CP, medtem ko ostala obravnavanja niso vplivala na ekspresijo omenjenega

gena v CP. Domnevamo lahko, da je abscizija plodičev po tretiranju z ETEF posledica

močno povišane sinteze etilena, čeprav ne smemo zanemariti vpliva na inhibicijo rasti

plodičev, ki smo jo prav tako dokazali in bi tudi lahko bila potencialen vzrok za začetek

abscizijskih procesov.

Redukcija svetlobe oz. SEN je vplivalo na višjo izraženost MdACO1 v vzorcih LP,

medtem ko na izraženost v CP in MdACS5A ter MdACS5B SEN ni imelo vpliva. Podobno

lahko zaključimo tudi pri obravnavanjih NAA in BA, kjer je večja ekspresija MdACO1 bila

zabeležena le v tkivu LP. Prav tako sta NAA in BA vplivala še na nekoliko povečano

ekspresijo MdACS5A in MdACS5B v tkivu LP, medtem ko sta imela zanemarljiv vpliv na

izraženost opazovanih genov v tkivu AZ. Na podlagi rezultatov lahko ugotovimo, da sta

imela tako aplikacija rastnih regulatorjev, kakor tudi SEN vpliv na izraženost genov,

odgovornih za sintezo etilena. Izmed opazovanih genov so bile največje razlike opažene

pri MdACO1, čeprav to ne izključuje potencialne pomembnosti MdACS5A in MdACS5B.

Gen MdACO1 se je pokazal kot ustrezen indikator abscizije plodičev, saj je v večini

primerov večji izraženosti tega gena sledilo močnejše odpadanje plodičev. Vendar

relativna kvantifikacija, ki smo jo izvedli, ni ustrezen inštrument za napovedovanje jakosti

odpadanja plodičev. Izkazalo se je, da je ekspresija tarčnega gena povezana z

intenzivnostjo poteka abscizije, ki pa ne vpliva na končni delež plodičev, ki so bili

podvrženi absciziji. Torej delež plodov, podvrženih absciziji, ni sorazmeren ekspresiji

tarčnega gena, ki smo jo izračunali z relativno kvantifikacijo.


7 POVZETEK

Kljub temu da je naravni mehanizem junijskega odpadanja plodičev pri jablani (Malus

domestica Borkh.) dobro razvit, je potrebno za doseganje redne rodnosti in boljše

kakovosti plodov uporabljati tehnološke ukrepe, s katerimi dodatno vzpodbudimo

odpadanje plodičev. Uveljavljena metoda za redčenje plodičev je škropljenje dreves z

rastnimi regulatorji, čeprav mehanizem delovanja omenjenih sredstev še vedno ni jasen.

Pomemben dejavnik pri razvoju abscizijskih procesov je tudi rastlinski hormon etilen,

vendar zaenkrat njegova vloga še ni popolnoma raziskana. Podobno kot z rastnimi

regulatorji (NAA, BA in ETEF) lahko na abscizijo vplivamo tudi s senčenjem.

Namen raziskave je bil podrobneje proučiti vlogo etilena v procesu abscizije plodičev ter

ugotoviti, ali je prisotnost etilena neodvisna od dejavnika, s katerim sprožimo abscizijo

(rastni regulatorji, senčenje). Proučevali smo povezavo med ekspresijo genov, odgovornih

za evolucijo etilena (MdACO1, MdACS5A in MdACS5B), in dejansko frekvenco odpadanja

oz. deležem plodov, ki so bili podvrženi absciziji. Glede na dejstvo, da so lateralni plodiči

(LP) bolj podvrženi abscizijskim procesom v primerjavi s centralnimi plodiči (CP) smo

želeli ugotoviti, ali obstajajo razlike tudi pri izraženosti opazovanih genov.

Za izvedbo raziskave smo v jablanovem nasadu na sorti 'Zlati delišes' zasnovali dvoletni

poljski poskus v poskusnem nasadu Kmetijskega inštituta Slovenije na Brdu pri Lukovici.

Poskus je bil razdeljen na dva dela, od katerih je vsak zajemal 8 naključnih blokov s 5

obravnavanji. Tretiranje z rastnimi regulatorji in senčenje smo opravili, ko je bil povprečen

premer plodičev ≈10 mm. V obeh letih smo imeli sledeča obravnavanja: 1. K (netretirano),

2. NAA (15 mg l-1), 3. BA (150 mg l-1), 4. ETEF (500 mg l-1) in 5. SEN (3 dni, 96 %

redukcija fotosintetsko aktivnega sevanja). V času trajanja poskusa smo na drevesih oz.

plodičih opravljali različne meritve, in sicer: prirast plodičev, frekvenco odpadanja

plodičev, evolucijo etilena, vzorčenje tkiva za genetske analize in končno vrednotenje

pridelka po posameznem drevesu. Evolucijo etilena smo spremljali v terminih 0, 2, 5 in 8

dni po tretiranju (DAT), in sicer smo koncentracijo etilena v vzorcih določili s plinsko


kromatografijo (GC). V letu 2008 smo vzorce za genetske analize vzorčili 0 in 8 DAT,

medtem ko v letu 2009 v terminih 0, 1, 4 in 7 DAT. Za genetske analize, ki smo jih

opravili v laboratorijih Kmetijskega inštituta Slovenije, smo vzorčili tkivo CP in LP ter

tkivo abscizijske cone obeh tipov plodičev. Najprej smo iz vzorcev izolirali celokupno

RNA, nato pa smo za opazovanje izražanja genov MdACS5A, MdACS5B in MdACO1

uporabili kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qPCR). V času tehnološke zrelosti

smo še ovrednotili pridelek po posameznem drevesu.

Nanos NAA, BA in ETEF je v letih 2008 in 2009 povzročil večjo abscizijo plodičev v

primerjavi s K. Podoben učinek smo v letu 2009 dosegli s SEN, medtem ko v letu 2008

SEN ni vplivalo na abscizijo plodičev. Potrdili smo, da so bili absciziji mnogo bolj

podvrženi LP pri vseh obravnavanjih, medtem ko je nekoliko večjo abscizijo CP

povzročila samo aplikacija ETEF.

Spremljanje priraščanja plodičev po aplikaciji rastnih regulatorjev in senčenju je pokazalo,

da ETEF najmočneje zavira rast plodičev, tudi v primeru ko ti niso podvrženi kasnejši

absciziji. Medtem pa NAA, BA, in SEN zavrejo predvsem rast plodičev, ki so pozneje

podvrženi absciziji. Neglede na obravnavanje pa smo ugotovili, da je rast plodičev pred

abscizijo v vseh primerih zavirana oz. zaustavljena. To pomeni, da je tudi rast plodičev oz.

njeno zaviranje pokazatelj abscizije.

Evolucija etilena iz plodičev je bila različna med posameznimi obravnavanji, prav tako pa

je imel vpliv tudi tip plodičev. Tako smo v primeru CP najmočnejšo evolucijo etilena

izmerili pri obravnavanju ETEF, ki se je povišala v terminu 5 in 8 DAT, medtem pa ostala

obravnavanja niso povzročila večje evolucije etilena v CP. Nasprotno pa smo pri LP, poleg

obravnavanja ETEF, povečano evolucijo etilena izmerili tudi pri ostalih obravnavanjih,

kjer je bila najvišja v terminu 8 DAT, medtem ko je bila evolucija etilena pri obravnavanju

ETEF povišana že v terminu 5 DAT. Rezultati spremljanja frekvence odpadanja plodičev

so pokazali, da se je v primeru večje sinteze etilena odpadanje plodičev začelo prej kot v

primerih, ko je bila evolucija etilena manjša. Tako so najhitreje in tudi najintenzivneje

odpadali LP obravnavanja ETEF, ki so mu sledili LP obravnavanja SEN, medtem ko je


bilo odpadanje pri obravnavanjih NAA, BA in K bolj zmerno in se je terminsko pričelo

nekoliko kasneje. Kljub temu pa višje evolucije etilena ne moremo povezati z večjim

deležem plodičev, ki so bili podvrženi absciziji, ampak velja pozitivna povezava samo

glede intenzivnosti odpadanja.

Največje razlike med termini in obravnavanji smo na genetskem nivoju ugotovili pri

izraženosti gena MdACO1, medtem ko so bile spremembe v primeru MdACS5A in

MdACS5B veliko manjše. Največje spremembe v ekspresiji opazovanih genov je

povzročilo tretiranje z ETEF, ki je edino vplivalo na večjo izraženost MdACO1 v tkivu CP,

prav tako pa je edino ETEF vplival na močnejšo ekspresijo vseh opazovanih genov v tkivu

AZ. V vzorcih LP so vsa obravnavanja povzročila večjo ekspresijo MdACO1 v primerjavi

z LP K-dreves. Izraženost MdACO1 v tkivu plodičev se je izkazala kot dober indikator

abscizijskih procesov, čeprav ekspresija tarčnega gena, ki smo jo izračunali pri relativni

kvantifikaciji, ni sovpadala z deležem plodov, ki so bili podvrženi absciziji. Veliko bolj je

povišana ekspresija MdACO1 sovpadala s frekvenco odpadanja plodičev, kar potrjuje

domnevo, da etilen pospešuje potek abscizijskih procesov.


8 SUMMARY

In spite of the fact that the natural mechanism of June drop is well developed in apple

(Malus domestica Borkh.), in order to obtain regular bearing and higher amount of the

most valuable fruit, thinning as a technological measure cannot be avoided. The use of

plant growth regulators is an established measure for fruit set regulation, although the

mode of action of regulators is unclear. An important factor in the development of

abscission process is the gaseous hormone ethylene, but until now its role has not been

fully explored yet. Similarly as with growth regulators, abscission can be induced by

shading.

The aim of our research was to analyze the role of ethylene in the fruitlet abscission

process and to find out if ethylene was involved in abscission regardless of factors which

induced the process (growth regulators, shading). We also studied the relation between the

expression of genes related to ethylene biosynthesis (MdACO1, MdACS5A and MdACS5B)

and actual abscission dynamics, and the amount of abscised fruitlets. Taking into account

that lateral fruitlets (LF) are more subjected to abscission in comparison with the king

fruitlets (KF) we wanted to find out if there were differences between LF and KF also in

the case of expression of observed genes.

In the experimental orchard of Agricultural Institute of Slovenia situated at Brdo near

Lukovica, a two-year field trial was designed involving the apple variety ‘Golden

Delicious’. The experiment was divided into two groups, and each group consisted of a

complete randomized block experiment with eight replications and five treatments (K,

NAA, BA, ETEF and SEN). During the experiment, different measurements were

performed on trees and fruitlets, namely: fruit growth, abscission dynamics, ethylene

evolution, sampling of tissue for molecular analysis and evaluation of yield per tree at

harvest. The ethylene evolution was observed 0, 2, 5 and 8 days after treatment (DAT) and

it was based on gas chromatography (GC). The samples for molecular analysis were

collected in 2008 at 0 and 8 DAT, but in 2009, sampling dates were 0, 1, 4, and 7 DAT.


The molecular analyses were performed in the laboratory of the Agricultural Institute of

Slovenia. In the first step, the total RNA was isolated from each sample and then, after

conducting quantitative polymerase chain reaction (qPCR), we assessed the expression of

MdACS5A, MdACS5B and MdACO1.

The application of NAA, BA and ETEF, in 2008 and 2009, effectively increased the

number of abscised young fruits. Similar effect was achieved in 2009 by shading, but not

in 2008. We believe that the most probable reason for ineffectiveness of shading in 2008

were relatively low temperatures when measurements took place. We also confirmed that

LF were more subjected to abscission while in the case of KF only the ETEF treatment

induced it.

The strongest nonselective inhibiting effect on fruit growth was recorded after the ETEF

application while NAA, BA and SEN inhibited mostly fruitlets which were later subjected

to abscission process. Results of ethylene evolution showed that, next to treatment, the type

of fruitlets (i.e. KF or LF) was an important factor. In the case of KF only ETEF enhanced

the ethylene evolution, since in the case of LF also NAA, BA, and SEN influenced the

ethylene biosynthesis.

The greatest differences between sampling dates and treatments were recorded in the

expression of MdACO1 while changes in the expression of MdACS5A and MdACS5B were

at a much lower level. The greatest influence on the expression of the observed genes was

caused by the ETEF treatment, which was the only treatment that increased MdACO1 in

the tissues of KF. Similarly, only the ETEF treatment increased the expression of all

observed genes in the abscission zone tissue. In the case of LF, all treatments, except the

K, enhanced the expression of MdACO1. The expression of MdACO1 in fruitlet tissue was

found to be a reliable indicator of abscission, although the amount of the target gene was

not related with the amount of the abscised fruitlets. The increased expression of MdACO1

was more coincidental with the abscission dynamic.


9 LITERATURA

1. Abeles FB. 1973. Ethylene in plant biology. New York, Academic Press.

2. Abeles FB, Morgan PW, Saltveit ME. 1992. Ethylene in plant biology, 2nd edn.

New York Academic Press.

3. Addicott FT. 1982. Abscission. Univ. California Press, Berkeley, USA.

4. Alexander L, Grierson D. 2002. Ethylene biosynthesis and action in tomato: a

model for climacteric fruit ripening. J. Expt. Bot., 53(377): 2039-2055.

5. Arteca NR. 1995. Plant growth substances. Chapman&Hall, New York, 45-222.

6. Bangerth F. 1978. The effect of a substituted amino acid on ethylene biosynthesis,

respiration, ripening and preharvest drop of apple fruits. J. Amer. Soc. Hort. Sci.,

103: 401-404.

7. Bangerth F. 2000. Abscission and thinning of young fruit and their regulation by

plant hormones and bioregulators. Plant Growth Regulat., 31: 43-59.

8. Beruter J, Droz P. 1991. Studies on locating the signal for fruit abscission in the

apple tree. Scientia Hortic., 46: 201-214.

9. Black BL, Bukovac MJ, Hull J. 1995. Effect of spray volume and time of NAA

application on fruit size and cropping of Redchief ‘Delicious’ apple. Sci. Hort., 64:

253-264.

10. Blanke MM. 2008. Source-sink relationships in apple trees. V: Hudina M. Zbornik

referatov 2.slovenskega sadjarskega kongresa z mednarodno udeležbo. Strokovno

sadjarsko društvo Slovenije, Ljubljana 2008: 27-29.

11. Blanpied GD, Wilde MH. 1968. A study of the cells in the outer flesh of

developing McIntosh apple fruits. Bot. Gaz., 129: 178-183.

12. Blecker AB, Kende H. 2000. Ethylene: a gaseous signal molecule in plants. Annu.

Rev. Cell Dev. Biol., 16: 1-18.

13. Bonghi C, Tonutti P, Ramina A. 2000. Biochemical and molecular aspects of

fruitlet abscission. Plant growth regulation, 31: 35-42.


14. Bound SA, Jones KM, Oakford MJ, Tichon M. 1993. Assesing interactive effects

between cytolin and ethephon on cropping red 'Delicious'. J. Hort. Sci., 68: 209-

213.

15. Brown KM. 1997. Ethylene and abscission. Physiol. Plant, 100: 567-576.

16. Burns JK, Hartmond U, Kender JW. 1999. Acetolactate synthase inhibitors increase

ethylene production and cause fruit drop in citrus. HortScience, 34(5): 908-910.

17. Byers ER. 2003. Flower and fruit thinning and vegetative fruit balance. V: Ferre

DC in Warrington IJ. Apples. Cabi publishing, Cambridge: 437-458.

18. Byers RE, Lyons CG, Yoder KS, Barden JA, Young RW. 1985. Peach and apple

thinning by shading and photosynthetic inhibition. J. Hort. Sci., 60: 465-472.

19. Byers RE, Barden JA, Polomski RF, Young RW, Carabaugh DH. 1990. Apple

thinning by photosynthetic inhibition. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 115: 14-19.

20. Byers RE, Carabaugh DH, Presley CN, Wolf TK. 1991. The influence of low light

on apple fruit abscission. J. Hort. Sci., 66(1): 7-17.

21. Callejas R, Bangerth F. 1997. Is auxin export of apple fruit an alternative signal for

inhibition of flower bud induction? Acta Hort., 463: 271-277.

22. Corelli Grappadelli L, Lakso AN, Flore JA. 1994. Early season patterns of

carbohydrate partitioning in exposed and shaded apple branches. J. Amer. Soc.

Hortic. Sci., 119: 596-603.

23. Curry EA. 1991. NAA-induced ethylene and ACC in Delicious spur tissues -

changes with temperature and time. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 116(5): 846-850.

24. Dal Cin V, Danesin M, Boscetti A, Ramina A. 2005. Ethylene biosynthesis and

perception in apple fruit abscission. J. of Exper. Botany, 56: 2995-3005.

25. Dal Cin V, Rizzini FM, Botton A, Tonutti P. 2006. The ethylene biosynthetic and

signal transduction pathways are differently affected by 1-MCP in apple and peach

fruit. Postharvest Biol. Technology, 42: 125-133.

26. Dal Cin V, Boscetti A, Dorigoni A, Ramina A. 2007. Benzylaminopurine

application on two different apple cultivars (Malus domestica) displays new and

unexpected fruitlet abscission features. Annals of Botany, 99: 1195-1202.


27. Dal Cin V, Danesin M, Botton A, Boscetti A, Dorigoni A, Ramina A. 2008.

Ethylene and preharvest drop: the effect of AVG and NAA on fruit abscission in

apple (Malus domestica Borkh.). Plant Growth Regul., 56(3): 317-325.

28. Dal Cin V, Velasco R, Ramina A. 2009. Dominance induction of fruitlet shedding

in Malus x domestica (L. Borkh): molecular changes associated with polar auxin

transport. BMC Plant Biol., 9: 139.

29. Davenport TL, Morgan PW, Jordan WR. 1976. Stress-induced foliar abscission: no

enhance ethylene production by leaf petioles. Plant Physiol., 57: 97.

30. Davies PJ. 2004. Plant hormones; Biosynthesis, Signal Transduction, Action!

Dordrecht, Cluwer Academic Publisher: 9.

31. Dennis FG. 2000. The history of fruit thinning. Plant growth regulation, 31: 1-16.

32. Dennis FG. 2002. Mechanisms of action of apple thinning chemicals. HortScience,

37(3): 471-474.

33. Dickson RE. 1991. Assimilate Distribution and Storage. V: Raghavendra AS.

Physiology of Trees. New York, John Wiley & sons: 51-85.

34. Domoki M, Gyorgyey J, Biro J, Pasternak TP, Zvara A, Bottka S, Puskas LG,

Dudits D, Feher A. 2006. Identification and characterization of genes associated

with the induction of embryogenic competence in leaf-protoplast-derived alfalfa

cells. Biochim. Biophys. Acta. 1759: 543-551.

35. Dong JB, Olson D, Silverstone A, Yang SF. 1992. Sequence of a cDNA coding for

a 1-aminocxclopropane-1-carboxylate oxidase homolog from apple fruit. Plant

Physiol., 98: 1530-1531.

36. Džuban T, Tojnko S, Lešnik M, Žežlina I, Kodrič I, Jančar M, Koron D, Solar A,

Berčič S, Hribar J, Korber V, Zadravec P, Vidovič S, Majcen HM, Vranac S,

Zidarič B. 2008. Tehnološka navodila za integrirano pridelavo sadja za leto 2008.

Ljubljana, MKGP, 58.

37. Ebert A, Bender RJ. 1986. Influence of an emulsifiable mineral oil on the thinning

effect of NAA, NAAM, Crabaryl and ethephon in the apple cultivar gala grown

under the conditions of Southern Brazil. Acta Hort., 179: 667-671.


38. Ebert A, Bangerth F. 1981. Relations between the concentration of diffusable and

extractable giberellin-like substances and the alternate-bearing behavior in apple as

affected by chemical fruit thinning. Scientia Hort., 15: 45-52.

39. Eberth A, Bangerth F. 1982. Possible hormonal modes of action of three apple

thinning agents. Scientia Hort., 16: 343-356.

40. Espley RV, Hellens RP, Putterill J, Stevenson DE, Kutty-Amma S, Allan AC.

2007. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MXB transcription

factor, MdMYB10. The Plant J., 49: 414-427.

41. Fallahi E, Willemsen KM. 2002. Blossom thinning of pome and stone fruit.

HortScience, 37(3): 474-477.

42. Faust M. 1989. Physiology of temperate zone fruit trees. John Wiley and sons, New

York, 338.

43. Flore JA, Bukovac MJ. 1982. Factors influencing absorption of 14C(2-chloroethyl)

phosphonic acid by leaves of cherry. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 107: 965-968.

44. Foley KP, Leonard MW, Engel JD. 1993. Quantitation of RNA using the

polymerase chain reaction. Technical Focus, 9: 380-5.

45. Fukui H, Inakawa S, Tamura T. 1984. Relation between early drop of apple fruit,

ethylene evolution and formation of abscission layer. J. Jpn. Soc. Hort. Sci., 53:

303-307.

46. Greene DW, Autio WR, Erf JA, Mao ZY. 1992. Mode of action of benzyladenine

whwn used as a chemical thinner on apples. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 117(5): 775-

779.

47. Greene DW. 2002. Chemicals, timing, and environmental factors involved in

thinner efficacy on apple. HortScience, 37(3): 477-481.

48. Greene DW. 2003. Endogenous hormones and bioregulators use in apples. V: Ferre

DC in Warrington IJ. Apples. Cabi publishing, Cambridge: 437-458.

49. Greene DW, Lakso AN, Robinson TL. 2004. Development and testing of a model

to rapidly predict apple thinner response. HortScience, 39(4): 793.

50. Harada T, Sunako T, Wakasa Y, Soejima J, Satoh T, Niizeki M. 2000. An allele oft

he 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene (Md-ACS1) accounts for the


low level of ethylene production in climacteric fruits of some apple cultivars.

Theor. Appl. Genet., 101: 742-746.

51. Hedden P, Thomas SG. 2006. Plant hormone signaling. Blackwell publishing,

Oxford, UK: 127.

52. Hull J. Plant Growth Regulators. Neobjavljeno interno gradivo.

53. Jones KM, Koen TB, Meridith RJ. 1983. Thinning Golden Delicious apples using

ethephon sprays. J. Hort. Sci., 58: 381-388.

54. Jones KM, Koen TB. 1985. Temperature effects on ethephon thinning of apples. J.

Hort. Sci., 60: 13-19.

55. Jones KM, Longley TB, Oakford MJ. 1988. Thinning `Golden delicious` apples

with naphthalene acetic acid in relation to spray concentration, volume and time of

day. J. Hort. Sci., 63: 27-30.

56. Jones KM, Bound SA, Gillard P, Oakford MJ. 1997. A working model of apple

thinning. Acta Hort., 463: 475-480.

57. Kende H. 1993. Ethylene biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.,

44: 283-307.

58. Kondo S, Takahashi Y. 1987. Effects of high temperature in night time and shading

in the daytime on the early drop of apple fruit 'Starking Delicious'. J. Jpn Soc. Hort.

Sci., 56: 142-150.

59. Kondo S, Mizuno N. 1989. Relation between early drop of apple fruit and

endogenous growth regulators and effects of MCLPB, GA3 plus GA4 and BA

sprays ob fruit abscission. J. Jpn. Soc. Hort. Sci., 58: 9-16.

60. Lakso AN, Wunsche JN, Palmer JW, Grappadelli LC. 1999. Measurement and

modeling of carbon balance of the apple tree. HortScience, 34: 1040-1047.

61. Lay-Yee M, Knighton ML. 1995. A full-lenght cDNA encoding 1-

aminocycloproprane-1-carboxylate synthase from apple. Plant Physiol., 107(3):

1017-1018.

62. Li L, Xu J, Xu ZH, Xue HW. 2005. Brassinosteroids stimulate plant tropisms

through modulation of polar auxin transport in Brassica and Arabidopsis. Plant

Cell, 17: 2738-2753.


63. Li J, Yuan R. 2008. NAA and ethylene regulate expression of genes related to

ethylene biosynthesis, perception, and cell wall degradation during fruit abscission

and ripening in 'Delicious' apples. J. Plant Growth Regul., 27(3): 283-295.

64. Li J, Zhu H, Yuan R. 2010. Profiling the expression of genes related to ethylene

biosynthesis, ethylene perception, and cell wall degradation during fruit abscission

and fruit ripening in apple. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 135(5): 391-401.

65. Libault M, Thibivilliers S, Bilgin DD, Radwan O, Benitez M, Clough SJ, Stacey G.

2008. Identification of four soybean reference genes for gene expression

normalization. The Plant Genome, 1: 44-54.

66. Lin Z, Zhong S, Grierson D. 2009. Recent advances in ethylene research. J. Expt.

Bot., 60 (12): 3311-3336.

67. Link H. 2000. Significance of flower and fruit thinning on fruit quality. Plant

Growth Regulat. 31: 17-26.

68. Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using

real-time quantitative PCR and the 2-∆∆Ct method. Methods, 25: 402-408.

69. Magein H. 1989. Growth and abscission dynamics of 'Cox's Orange Pippin' and

'Golden Delicious' apple fruits. J. Hort. Sci., 64(3): 265-273.

70. Marini RP. 1996. Chemically thinning spur Delicious apples with carbaryl, NAA,

and ethephon at various stages of fruit development. Hort technology, 6: 241-246.

71. McArtney SJ. 2002. Ethylene evolution from detached apple spurs in response to

chemical thinners. HortScience, 37(4): 662-665.

72. Morandi B, Zibordi M, Losciale P, Manfrini L, Pierpaoli E, Grappadelli L. 2011.

Shading decreases the growth rate of young apple fruit by reducing their phloem

import. Scientia Hortic., 127: 347-352.

73. Olien WC, Bukovac MJ. 1978. The effect of temperature on rate of ethylene

evolution from ethephon and from ethephon-treated leaves of sour cherry. J. Amer.

Soc. Hort. Sci., 103: 199-202.

74. Pfaffl MW. 2004. Quantification strategies in real-time PCR. V: An A-Z manual of

quantitative PCR. Ca USA. IUL Press, 87-112.

75. Rahemi M, Dennis FG, Andersen RL, Ozga JO, Yia RX. 1997. The role of ethylene

in apple fruit set. J. Hort. Sci., 72: 67-75.


76. Reid MS. 1985. Ethylene and Abscission. HortScience, 20(1): 46-50.

77. Roberts JA, Elliot KA, Gonzalez-Carranza ZH. 2002. Abscission, dehiscence and

other cell separation processes. Annu. Rev. Plant Biol., 53: 131-158.

78. Rosenfiled CL, KissE, Hrazdina G. 1996. MdACS-2 (accession no. U73815) and

MdACS-3 (accession no. U73816): two new 1-aminocyclopropane-1-carboxylate

synthases in ripening apple fruit. Plant Physiol., 112(4): 1735.

79. Ross GS, Knighton ML, Lay-Yee M. 1992. An ethylene-related cDNA from

ripening apples. Plant Mol. Biol., 19: 231-238.

80. Ruperti B, Bonghi C, Tonutti P, Ramina A. 1998. Ethylene biosynthesis in peach

fruitlet abscission. Plant Cell and Environment, 21: 731-737.

81. Ruperti B, Cattiveli L, Pagni S, Ramina A. 2002. Ethylene responsive genes are

differentially regulated during abscission, organ senescence and wounding in

peach. J. of Expt. Botany, 53: 429-437.

82. Rutledge RG, Côté C. 2003. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the

application of standard curves. Nucleic Acids Res., 31(16): e93.

83. Sato T, Kodo T, Akada T. 2004. Allelotype of a ripening-specific 1-

aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene defines the rate of fruit drop in

apple. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 129(1): 32-36.

84. Schneider GW, Lasheen AM. 1973. NAA and Sevin on composition, development

and abscission of apple fruit. HortScience, 8: 103-104.

85. Sexton R, Roberts JA. 1982. Cell biology of abscission. Annu. Rev. Plant Physiol.,

33: 133-162.

86. Stern RA, Flaishman MA. 2003. Benzyladenine effects on fruit size, fruit thinning

and return yield of 'Spadona' and 'Coscia' pear. Scientia Horticulturae, 98(4): 499-

504.

87. Stopar M, Black BL, Bukovac MJ. 1997. The effect of NAA and BA on carbon

dioxide assimilation by shoot leaves of spur-type 'Delicious' and 'Empire' apple

trees. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 122: 837-840.

88. Stopar M. 1998. Odvisnost odpadanja plodičev od asimilacijske sposobnosti

krošnje in plodičev jablane. Dokt. Disert., Ljubljana.


89. Stopar M, Lokar V. 2003. The effect of ethephon, NAA, BA and their

combinations on thinning intensity of 'Summerred' apples. J. Central European

Agr., 4.

90. Stopar M, Ambrožič TB, Brence A. 2008. Problematika količine in kakovosti

pridelave jabolk v Sloveniji. V: Hudina M. Zbornik referatov 2. Slovenskega

kongresa z mednarodno udeležbo. Ljubljana, Strokovno sadjarsko društvo

Slovenije: 151-157.

91. Sunako T, Ishikava R, Senda M, Akada S, Niizeki M, Harada T. 2000. Plant Gene

Register PGR 00-030. MdACS-5A (accession no. AB034992) and 5B (accession

no. AB034993), two wound-responsive genes encoding 1-aminocyclopropane-1-

carboxylate synthase in apple. Plant Physiol., 122(3): 620.

92. Tacken E, Ireland H, Gunaseelan K, Karunairetnam S, Wang D, Shultz K, Bowen

J, Atkinson RG, Johnston JW, Putterill J, Hellens RP, Schaffer RJ. 2010. The role

of ethylene and cold temperature in the regulation of the apple

POLYGALACTURONASE1 gene and fruit softening1[W][OA]. Plant Physiol., 153:

294-305.

93. Taylor JE, Whitelaw CA. 2001. Signals in abscission. New Phytologist, 151: 323-

339.

94. Tonutti P, Bonghi C, Ruperti B, Tornielli GB, Ramina A. 1997. Ethylene evolution

and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase gene expression during early

development and ripening of peach fruit. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 122: 642-647.

95. Unrath CR. 2002. Spray volume, canopy density, and other factors involved in

thinner efficacy. HortScience, 37(3): 481-483.

96. Vandenbussche F, Vriezen WH, Van Der Straeten D. 2006. Ethylene biosynthesis

and signaling: a puzzle yet to be completed. V: Hedden P in Thomas SG. Plant

hormone signaling. Oxford, UK, Blackwell Publishing: 125-146.

97. Velasco R, et al. 2010. The genome of the domesticated apple (Malus domestica

Borkh.). Nature Genetics, 42: 833-839.

98. Walsh CS, Swartz HJ, Edgerton LJ. 1979. Ethylene evolution in apple following

post-bloom thinning sprays. HortScience, 14: 704-706.


99. Wang KLC, Li H, Ecker JR. 2002. Ethylene biosynthesis and signaling networks.

Plant Cell, 14: 131-151.

100. Ward D, Marini RP. 1999. Growth and development of young apple fruits

following applications of ethephon plus carbaryl for thinning. HortScience, 34(6):

1057-1059.

101. Warrington IJ, Fulton TA, Halligan EA, de Silva HN. 1999. Apple fruit growth and

maturity are affected by early season temperatures. J. Amer. Soc. Hort. Sci.,

124(5): 468-477.

102. Wertheim SJ. 2000. Developments in the chemical thinning of apple and pear.

Plant growth regulation, 31: 85-100.

103. Westwood MN, Batjer LP, Billingsley HS. 1967. Cell size, number, and fruit

density of apples as related to fruit size position in cluster, and thinning method.

Proc. Amer. Soc. Hort. Sci., 91: 51-62.

104. Westwood MN. 1992. Temperate-Zone pomology. Timber press, Portland, 523.

105. Wismer PT, Proctor JTA, Elfving DC. 1995. Benzyladenine affects cell division

and cell size during apple fruit thinning. Amer. Soc. Hort. Sci., 120(6): 1096.

106. Williams MW, Edgerton LJ. 1981. Fruit thinning of apples and pears with

chemicals. U.S. Dept. Agr. Bul., Washington D.C., 289.

107. Williams ME, Torabinejad J, Cohick E, Parker K, Drake EJ, Thompson JE, Hortter

M, Dewald DB. 2005. Mutations in the Arabidopsis phospoinositide phosphatase

gene SAC9 lead to overaccumulation of PtdIns (4,5)P2 and constitutive expression

of the stress-response pathway. Plant Physiol., 138: 686-700.

108. Wiersma PA, Zhang H, Lu C, Quail A, Toivonen PMA. 2007. Survey of the

expression of genes for ethylene synthesis and perception during maturaton and

ripening of 'Sunrise' and 'Golden Delicious' apple fruit. Postharvest Biol.

Technology, 44: 204-211.

109. Zhou C, Lakso AN, Robinson TL, Gan S. 2008. Isolation and characterization of

genes associated with shade-induced apple abscission. Mol. Genet. Genomics, 280:

83-92.

110. Zhu H, Beers EP, Yuan R. 2008. Aminoethoxyvinylglycine inhibits fruit abscission

induced by naphthalene acetic acid and associated relationships with expression of


genes for ethylene biosynthesis, perception, and cell wall degradation in 'Delicious'

apples. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 133(6): 727-734.

111. Zhu H, Yuan R, Greene DW, Beers EP. 2010. Effects of 1.methycyclopropene and

naphthalene acetic acid on fruit set and expression of genes related to ethylene

biosynthesis and perception and cell wall degradation in apple. J. Amer. Soc. Hort.

Sci., 135(5): 402-409.

112. Zibordi M, Domingos S, Grappadelli L. 2009. Thinning apples via shading: an

appraisal under field conditions. J. Hort. Sci. Biotechnol. ISAFRUIT special issue:

138-144.

113. Yang SF, Hoffman NE. 1984. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher

plants. Annu. Rev. Plant Physiol., 35: 155-198.

114. Yuan R. 2007. Effects of temperature on fruit thinning with ethephon in 'Golden

Delicious' apples. Scientia Hort., 113: 8-12.

115. Yuan R in Burns JK. 2004. Temperature factors affecting the abscission response

of mature fruit and leaves to CMN-pyrazole and ethephon in 'Hamlin' oranges. J.

Amer. Soc. Hort. Sci., 129: 287-293.

116. Yuan R, Greene DW. 2000. Benzyladenine as a chemical thinner for 'McIntosh'

apples. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 125: 169-176.

Elektronski viri:

117. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (26.8.2011)

118. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome

(26.8.2011)

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome

ZAHVALA

Najprej bi se želel zahvaliti Kmetijskemu inštitutu Slovenije, ki mi je omogočil, ter Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije, ki je financirala, izvedbo mojega podiplomskega študija. Največja zahvala gre mojemu raziskovalnemu mentorju Dr. Mateju Stoparju, ki me je vpeljal v znanstveno raziskovalno delo, ter mi pomagal z nasveti glede zasnove poskusov, pisanja člankov, obdelave podatkov in še marsikaj. Poleg tega pa mi je bil vedno v pomoč tudi pri izvedbi poskusov in vzorčenju, kar še posebej cenim. Hvala tudi mentorju doc. Dr. Stanislavu Tojnku, ki mi je bil v veliko pomoč pri študijskem delu in pripravi doktorske disertacije. Sodelovanje je bilo vedno zgledno in konstruktivno, kar mi je prihranilo marsikatero skrb. Genetski del poskusa vsekakor ne bi bil na takšnem nivoju, če mi ne bi na pomoč priskočila Dr. Irena Mavrič Pleško, ki je pozorno spremljala moje delo v genetskem laboratoriju in bila vedno pripravljena odgovarjati na moja vprašanja. Hvala tudi Tomažu Sketu za nasvete in pomoč pri delu s plinsko kromatografijo. Zahvaliti se želim tudi vsem sodelavcem Oddelka za sadjarstvo in vinogradništvo, vključno z zaposlenimi v poskusnem nasadu Brdo pri Lukovici, za pomoč pri postavitvi poskusov ter za prijetno vzdušje na oddelku. Vsem, ki ste presodili, da bi se morali prebrati v zgornjih vrsticah se še posebej zahvaljujem in hkrati opravičujem. Velika zahvala gre tudi staršema za podporo, razumevanje in vzpodbudo skozi celotno obdobje mojega izobraževanja. Ker najlepše pride na vrsto vedno na koncu je zadnja zahvala namenjena ženi Maji ter hčerki Teji in sinu Vidu za razumevanje, veselje, srečo, ljubezen …

PRILOGE

Delovni življenjepis kandidata

Rojen sem bil 29. marca 1982 v družini, ki se je od takrat pa vse do danes preživljala

izključno s kmetijsko dejavnostjo. Po končani osnovni šoli, ki sem jo obiskoval v Središču

ob Dravi, sem postal dijak Srednje kmetijske šole Rakičan. Srednješolsko izobraževanje

sem zaključil leta 2001 z uspešno opravljeno maturo. Še istega leta sem pričel s študijem

na Fakulteti za kmetijstvo v Mariboru, univerzitetna smer Kmetijstvo. Poleg redne

udeležbe organiziranih oblik študija in opravljanja izpitov, sem bil v času študija aktiven

kot kontrolor ekološkega kmetovanja in nekaterih drugih standardov. V sklopu Inštituta za

kontrolo in certifikacijo sem se udeležil mnogih izobraževanj, simpozijev ter sejmov s

tematiko ekološkega kmetovanja. Dodiplomski študij sem z zagovorom diplomske naloge,

pod mentorstvom dr. Martine Bavec, uspešno zaključil leta 2007. Nato me je pot še istega

leta vodila na Kmetijski inštitut Slovenije, kjer sem se kot mladi raziskovalec, pod

mentorstvom dr. Mateja Stoparja, zaposlil na Oddelku za sadjarstvo in vinogradništvo.

Sočasno z zaposlitvijo sem se vpisal na bolonjski podiplomski doktorski študij kmetijstva

na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru, kjer sem kot pedagoškega

mentorja izbral dr. Stanislava Tojnka. Tematika s katero sem se ukvarjal v času

podiplomskega študija je bila fiziologija odpadanja plodičev pri jablani na katero se nanaša

tudi doktorska disertacija.

Osebna bibliografija

JURE KOLARIČ [29499]

Osebna bibliografija za obdobje 2000-2011

ČLANKI IN DRUGI SESTAVNI DELI

1.01 Izvirni znanstveni članek

1. KOLARIČ, Jure, MAVRIČ PLEŠKO, Irena, TOJNKO, Stanislav, STOPAR, Matej.

Apple fruitlet ethylene evolution and MdACO1, MdACS5A, and MdACS5B expression

after application of naphthaleneacetic acid, 6-benzyladenine, Ethephon, or shading.

HortScience. [Tiskana izd.], 2011, vol. 46, no. 10, str. 1-6. [COBISS.SI-ID 3653736]

1.02 Pregledni znanstveni članek

2. KOLARIČ, Jure. Abscission of young apple fruits (Malus domestica Borkh.): a review.

Agricultura. [Print ed.], mar. 2010, letn. 7, št. 1, str. 31-36, ilustr. [COBISS.SI-ID

3283560]

1.04 Strokovni članek

3. KOLARIČ, Jure. Biofach - sejem ekološke pridelave. Marib. agron., maj 2005, letn. 10,

št. 2, str. 15-17. [COBISS.SI-ID 3318376]

4. KOLARIČ, Jure. Kako do pravilnega kolobarja? : povzeto po predavanju prof. dr. Jürgen K. Friedel. Marib. agron., jan. 2006, letn. 11, št. 1, str. 6-7. [COBISS.SI-ID 3318120]

http://cobiss.izum.si/scripts/cobiss?command=DISPLAY&base=COBIB&RID=3653736




1.09 Objavljeni strokovni prispevek na konferenci

5. KOLARIČ, Jure. Abscizija kot fiziološki proces ter vpliv rastnih regulatorjev. V:

UNUK, Tatjana (ur.). Sadjarski posvet 2009 : monografija : Grad Hompoš, 10. marec

2009. Maribor: Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2009, str. 22-26.

[COBISS.SI-ID 2924904]

MONOGRAFIJE IN DRUGA ZAKLJUČENA DELA

2.11 Diplomsko delo

6. KOLARIČ, Jure. Vpliv kontaminiranih tal na vsebnost težkih kovin v nekaterih

zelenjadnicah in poljščinah : diplomsko delo, (Diplomska dela študentov Fakultete za

kmetijstvo Univerze v Mariboru, Univerzitetne diplomske naloge). Maribor: [J. Kolarič],

2007. VIII, 75 f., ilustr. [COBISS.SI-ID 2537004]

IZVEDENA DELA (DOGODKI)

3.15 Prispevek na konferenci brez natisa

7. KOLARIČ, Jure. Posredne koristi ekološkega sadjarstva : predavanje na Strokovnem

posvetu za pridelovalce ekološkega sadja, Ljubljana, 4. dec. 2009. 2009. [COBISS.SI-ID

3178600]

8. KOLARIČ, Jure. Fiziološke osnove odpadanja plodičev jablane : predavanje na posvetu Uravnavanje rodnosti v sadjarstvu, Kmetijski inštitut Slovenije, Ljubljana, 18. mar. 2010. 2010. [COBISS.SI-ID 3263080]

9. KOLARIČ, Jure. Fiziološke osnove odpadanja plodičev jablane : predavanje na strokovnem srečanju ekoloških pridelovalcev jabolk, Šentjanž na Dolenjskem, 9. apr. 2010. 2010. [COBISS.SI-ID 3281768]

10. KOLARIČ, Jure. Pomen sadjarstva za razvoj podeželja : predavanje v organizaciji Sadjarskega društva Idrija-Cerkno, Ljubljana, 16. apr. 2010. 2010. [COBISS.SI-ID 3284072]







Documents

EKSPRESIJA GENOV ZA EVOLUCIJO ETILENA TER ABSCIZIJA ... · Kolarič J. Ekspresija genov za evolucijo etilena … po tretiranju z rastnimi regulatorji in senčenjem. III Dokt. disertacija