EKOLOGIJA ANTIMIKROBNE REZISTENCIJE KROZ LANAC HRANE 

Snežana Bulajić Fakultet veterinarske medicine, Univerzitet u Beogradu 

 

1. UVOD 

Dostupnost  i  raznolikost  efikasnih  antimikrobnih  preparata, među  njima  antibiotika,  sredstava  za sanitaciju  i  dezinfekciju,  predstavlja  realnost  i  integralni  deo  našeg  kompleksnog makrobiološkog ekosistema ali i  međuzavisnog sistema hrane. S druge strane, urođena sposobnost mikroorganizama da mutiraju  i adaptiraju se na različite stresore  iz okoline  jeste  izazov konceptu bezbednosti hrane. Globalna upotreba antibiotika u humanoj  i veterinarskoj medicini, sektoru agrikulture  i akvakulture uspostavila  je  „darvinovski“  eksperiment  selekcije  i  preživljavanja  rezistentnih  uz  eliminaciju osetljivih entiteta u svim ekosistemima opterećenim antibioticima. Ono što antimikrobnu rezistenciju odvaja od drugih problema na polju bezbednosti hrane, jeste činjenica postojanja hemijskog “vozača” – antibiotika, koji predstavljaju glavnu snagu selekcije rezistentnih bakterija. 

U  svojoj  osnovi,  rezistencija  na  antimikrobne  preparate  je  urođena  (odnosi  se  na  fiziološko‐ anatomski kapacitet vrste),  ili  se uspostavlja mutacijom  i drugim genetičkim  izmenama,  ili pak kao privremena  adaptacija  na  sredine  opterećene  antibioticima.  Mehanizmi  rezistencije  su  veoma raznoliki,  kao  što  su  i  načini  delovanja  antibiotika  (Courvalin,  2005).  Antibiotici  inhibiraju  DNK replikaciju,  sintezu  proteina  ili  deluju  na  nivou  ćelijskog  zida  ili membrane.  Strategija  rezistencije bakterija  u  odnosu  na  antibiotike  podrazumeva  modifikaciju  ili  „overproduction“  ciljnog  mesta delovanja,  odsustvo  enzima  ili metaboličkih  puteva,  „efflux“ mehanizme,  enzimatsku  degradaciju, alteraciju  receptora  i  promene  u  permeabilnosti  membrane  (Cloete,  2003).  Bakterije  usvajaju  i iskustvo  adaptacije  na  stres  (rezistencija  koja  proizlazi  iz  izloženosti  subletalnim  stresorima),  ko‐selekcije (rezistencija na nesrodne antibiotike, ali čiji se geni rezistencije prenose zajedno), unakrsne rezistencije  („cross‐resistance“)  (rezistencija  na  antibiotike  čiji mehanizam  delovanja  podrazumeva isto  ciljno mesto),  ali  isto  tako  i  unakrsne  zaštite  („cross‐protection“),  gde  je  adaptacija  na  jedan stresogeni faktor povezana sa povećanom rezistencijom na drugi. Procena rizika prenosa rezistentnih klonova  bakterija,  ili  samih  gena  rezistencije  kroz  lanac  hrane  se  dodatno  usložnjava  usvajanjem činjenice da postoji ogromni  i veoma  raznoliki  „pool“ gena  rezistencije. Geni  rezistencije  su  široko rasprostranjeni  u  prirodi  i  prisutni  kod  velikog  broja  filogenetski  nesrodnih mikroorganizama  i  u različitim  nišama  (Riesenfeld  i  sar.,  2004;  Sundin,  2002).  Dva  glavna  faktora  su  odgovorna  za perzistenciju  rezistentnih entiteta u ekosistemima: preživljavanje  rezistentne bakterije  i održavanje genotipa  rezistencije. Od  posebne  važnosti  je  i prepoznavanje  rezervoara  rezistencije,  gde naučna javnost postiže konzensus naglašavajući značaj populacije komenzala, pre svega nepatogenih sojeva Escherichia coli i Enterococcus spp.  

2. ANTIMIKROBNA REZISTENCIJA KROZ LANAC HRANE 

Načini  kontaminacije  hrane  rezistentnim  bakterijama  i/ili  genima  rezistencije  su  mnogostruki. Kontaminacija  usledi  bilo  iz  okoline  (zemljište,  voda,  procesno  okruženje),  ili  usled  fekalne kontaminacije.  Sa  aspekta  antimikrobne  rezistencije  mikroorganizama  prisutnih  u  hrani,  naučna javnost definiše tri grupe rezistentnih entiteta: 

1. Uzročnici zoonoza  i bolesti prenosivih hranom‐ predstavljaju direktan hazard, kako u određenim uslovima uzrokuju klinički manifestna obolenja, a u slučaju njihove rezistencije, kompromitovana  je uspešna  antimikrobna  terapija.  Pored  toga,  po  kolonizaciji  intestinalnog  trakta,  uspostavljaju  se  u dotičnom  ekosistemu  i  u  direktnoj  komunikaciji  sa  autohtonom  mikroflorom  domaćina,  mogu izmenjivati  gene  rezistencije  (Salmonella  spp.,  Campylobacter  spp.,  Listeria  monocytogenes, enterohemoragični sojevi E. coli/E. coli O157/H7).  

2. Komenzali – ispoljavanje hazarda, u ovom slučaju, velikim delom zavisi od kapaciteta komenzalnih bakterija  ingestiranih  hranom  da  ostvare  kontakt  sa  populacijom  komenzala  i  patogena  poreklom ljudi i predaju determinate rezistencije tzv. indirektni hazard (nepatogeni sojevi E. coli, enterokoke, ali i streptokoke, stafilokoke, bacili, kao  i populacija anaerobnih bakterija koja se obično ne analizira – propionibakterije, laktobacili, bifidobakterije i leukonostok). 

3.  Industrijski  ili  tehnološki  sojevi  –  najvećim  delom  bakterije mlečne  kiseline,  koje  se  ciljano,  sa namerom,  dodaju matriksu  hrane  kao  starteri  u  vođenju  procesa  fermentacije,  ili  kao  probiotici. Primena takvih sojeva  isključuje mogućnost da  isti nose prenosive determinante rezistencije  (EFSA, 2007). 

U  eksperimentalnim  uslovima,  potvrđen  je  mehanizam  konjugacije  u  matriksu  hrane  –  transfer rezistencije na ampicilin  (posredovane plazmidom) sa Salmonella ser. Typhimurium na E. coli K12 u inokulisanom  sterilisanom mleku  i goveđem mesu  (Walsh  i  sar., 2008), kao  i  transfer determinanti rezistencije  sa bakterija mlečne  kiseline  (Enterococcus  faecalis,  Lactococcus  lactis) na potencijalno patogene sojeve (Listeria spp., Salmonella spp., Staphylococcus aureus i E. coli) (Toomey i sar., 2009) u fermentisanim proizvodima od mleka, gde je fermentacija izvedena sa bakterijama mlečne kiseline koje  su  poslužile  i  kao  donor  determinanti  rezistencije.  Značajan  nivo  konjugacije  i  mobilizacije plazmida  je  dokazan  između  sojeva  Bacillus  thuringiensis  u  mleku.  Transformacija,  kao  model preuzimanja egzogene DNK potvrđena je kod sojeva Bacillus subtilis inokulisanih u mleko (Kharazmi i sar.,  2002).  Pretpostavlja  se  da  je  transformacija  značajan  mehanizam  transfera  antimikrobne rezistencije  kod  Campylobacter  jejuni,  gde  se  gen  Cj1211,  odgovoran  za  sintezu  membranskog transporter proteina uključenog u transfer DNK kroz membranu, smatra ključnim igračem u prirodnoj transformaciji  Campylobacter  jejuni  (Jeon  i  sar.,  2008),  mada  kapsularni  polisaharidi  i lipooligosaharidi ograničavaju sam proces.  

U  koncentraciji  od  102  do  108/g  proizvoda,  100  g  sira  „isporuči“  konzumentu  104‐1010  živih, rezistentnih  sojeva  stafilokoka  ili  enterokoka.  U  ekološkim  dimenzijama,  potrošač  koji  redovno konzumira sir dva puta nedeljno, „opskrbi“ svoj organizam sa 1012 rezistentnih stafilokoka/enterokoka po godini. Ako svaka druga osoba u populaciji od 100 miliona ljudi usvoji ovu naviku, broj rezistentnih stafilokoka/enterokoka u toj populaciji približava se broju od 1020 po godini (Teuber i Perreten, 2000). Realno  možemo  očekivati  daleko  manji  broj,  kako  nisu  svi  proizvodi  opeterećeni  rezistentnim sojevima  bakterija  na  tom  nivou,  ili  uopšte  ne  sadrže  rezistentne  entitete  bakterija.  Ipak,  treba računati i na dodatnu izloženost konzumacijom sirovih proizvoda od mesa, ili putem kontaminiranog voća  i  povrća.  Situacija  je  takva  da možemo  očekivati  neočekivano.  Prisustvo  enterokoka  koji  se karakterišu visokim nivoom rezistencije na gentamicin dokazano je u siru dobijenom iz mleka jaka na planinama Himalaja pri nadmorskoj visini od 4000 metara. Rezistentni sojevi Staphylococcus aureus i koagulaza  negativnih  sojeva  stafilokoka  identifikovanih  kao  S.  xylosus,  S.  lentus,  S.  caprae,  S. epidermidis  i S. haemolyticus  izolovani su  iz sireva poreklom sirovog mleka  i  iz sirovih proizvoda od 

mesa  (Teuber  i  sar.,  1996). Najčešći  fenotipovi  rezistencije  stafilokoka,  okarakterisani  ujedno  i  na molekularnom nivou, su rezistencija na hloramfenikol, tetraciklin, eritromicin i linkomicin. U 15 (55%) od ukupno ispitanih 27 evropskih sireva proizvedenih od sirovog mleka, izolati  E. faecalis, E.  faecium i E. durans su pokazali rezistenciju na  jedan  ili više antibiotika: penicilin, cefalotin, furadoin, fucidin, eritromicin, tetraciklin i hloramfenikol (Sievers i sar., 1993).  Multipla rezistencija (rezistencija na dva i više  antibiotika),  u  istoj  studiji  je  utvrđena  kod  68%  izolata  enterokoka.  Ispitivanjem  profila rezistencije kod enterokoka izolovanih iz sireva sa područja Srbije (kiselo i slatkokoagulišući sirevi od sirovog i kuvanog mleka, sirevi u salamuri, kačkavalj, industrijski proizvedeni sirevi), 24,59% izolata je pokazalo  rezistenciju  na  antibiotike  koji  se  nalaze  u  širokoj  primeni  (Bulajić,  2007).  Prevalenca fenotipova  rezistencije  se  kretala  od  4,55%  (penicilin)  do  45,45%  (gentamicin).  Bakterije mlečne kiseline izolovane iz Somborskog sira izložene su testiranju antimikrobne osetljivosti u odnosu na 11 odabranih  antibiotika  (Bulajić  i Mijačević,  2011).  Primenom  disk‐difuzionog  testa,  kao  „screening“ procedure,  utvrđeni  su  različiti  profili  fenotipske  rezistencije,  a  prevalenca  je,  prema  opadajućem redosledu,  bila  sledeća:  rezistencija  na  linkomicin,  tetraciklin,  eritromicin,  penicilin,  vankomicin  i gentamicin.  Primenom  E‐  testa,  u  istoj  studiji,  određene  su  vrednosti  za  minimalnu  inhibitornu koncentraciju  (MIK) u odnosu na penicilin,  eritromicin  i  tetraciklin,  gde  autori  zapažaju  visok nivo rezistencije  kod pojedinih  izolata  laktokoka,  laktobacila  i  enterokoka  (pr.  visok nivo  rezistencije na eritromicin  – MIK≥256µg/mL  kod  jednog  izolata  Lactococcus  lactis  subsp.  lactis  i  jednog  izolata Lactobacillus  paracasei  subsp.  paracasei).  Prema  konzensusu  uspostavljenom  u  naučnoj  zajednici, kada određeni soj pokazuje višu rezistenciju u odnosu na specifični antibiotik nego drugi sojevi  iste taksonomske  jedinice,  postoji  snažna  indikacija  o  prisustvu  stečene,  prenosive  rezistencije,  i  time postoji  potreba  daljnih  analiza  u  cilju  potvrde  genske  baze  rezistencije,  a  time  i  pravilne  procene rizika (EFSA, 2008).  

U cilju procene rizika autohtonih sireva sa područja Srbije (sirevi dobijeni na tradicionalan način od sirovog mleka), populacija stafilokoka i bakterija mlečne kiseline je izložena ispitivanju antimikrobne osetljivosti  (Bulajić  i Mijačević, 2012). Od ukupno 83  izolata stafilokoka, 43  je pokazalo  rezistenciju bilo na penicilin, tetraciklin  ili eritromicin,  ili kombinaciju  istih antibiotika primenom disk‐difuzionog testa. Na osnovu evaluacije MIK vrednosti rezistentne subpopulacije stafilokoka poreklom autohtonih sireva, utvrđeno je da se 17 izolata karakteriše rezistencijom na tetraciklin, 20 izolata nosi rezistenciju na penicilin, dok rezistencija na eritromicin, usvajanjem mikrobioloških graničnih MIK vrednosti nije potvrđena. Rezistencija na penicilin, eritromicin  i  tetraciklin  je utvrđena  i  kod populacije bakterija mlečne kiseline (laktobacili i enterokoke), gde se na osnovu distribucije MIK vrednosti, pojedini izolati karakterišu  visokim  nivoom  rezistencije  na  ispitivane  antibiotike,  i  time  se  opravdano  postavlja sumnja na postojanje stečene, prenosive rezistencije. 

2.1. Uticaj tehnologija i tehnika konzervisanja na antimikrobnu rezistenciju 

Prerada hrane i tehnike konzervisanja primenjuju se u cilju inaktivacije patogena i redukcije saprofita kako  bi  proizvod  bio  održiv  u  deklarisanom  roku  upotrebe.  Zahtevi  informisanih  i  edukovanih potrošača su dobro artikulisani i postoji rastuća potreba za što manje procesiranim namirnicama, čije tržište  raste  kako  takvi  proizvodi  kombinuju  optimalne  senzorne  karakteristike  sa  maksimalno mogućim  očuvanjem  nutritivnih  sastojaka.  U  prehrambenoj  industriji,  primeri  takvih  procesnih tehnologija  podrazumevaju:  hlađenje,  acidifikaciju,  pakovanje  u modifikovanoj  atmosferi,  srednje temperature zagrevanja. U zavisnosti od kombinacija (tehnologija uspostavljanja višestrukih barijera‐ “multiple  hurdle  technology”), primenjene  tehnike  za  rezultat  imaju  kontrolu  rasta, uspostavljanje 

sredine  nepovoljne  za  rast  i  metaboličku  aktivnost  mikroorganizama,  uz  produženje  njihovog generacijskog vremena, smanjenje mikrobnog opterećenja matriksa hrane, ali  i pojavu stresiranih  i subletalno oštećenih ćelija (Rajkovic i sar., 2010). Odgovor na stres pokreće nekoliko mehanizama kod mikroorganizama: adaptaciju na stres, mehanizme popravke ćelija, ali i povećanu virulenciju (Wesche i  sar.,  2009).  McMahon  i  sar.  (2007a)  utvrđuju  da  subletalne  tehnike  konzervisanja  značajno modifikuju  fenotipsku  antimikrobnu  rezistenciju  patogena  –  E.  coli,  Salmonella  Typhimurium  i Staphylococcus  aureus,  na  način  da  subletalne  temperature  smanjuju  rezistenciju,  dok  uslovi povećane  koncentracije  soli,  i  time  smanjenje  aw  vrednosti,  kao  i  niže  pH  vrednosti  povećavaju fenotipsku rezistenciju. Slična zapažanja daju  i Ganjian  i sar. (2012), koji utvrđuju da Staphylococcus aureus  pokazuje  povećanu  fenotipsku  antimikrobnu  rezistenciju  po  izlaganju  subletalnim koncentracijama soli. Mehanizam koji  leži u osnovi promene fenotipske antimikrobne rezistencije, u većini slučajeva nije poznat, mada McMahon i sar. (2007b) utvrđuju da subletalni uslovi konzervisanja povećavaju  horizontalnu  transmisiju  putem  konjugacije  plazmida‐  nosioca  gena  rezistencije.  Isti autori zapažaju da pojedini sojevi patogena nastavljaju ekspresiju viših nivoa fenotipske antimikrobne rezistencije  i po uklanjanju stresora,  i time se postavlja hipoteza da subletalni sistemi konzervisanja hrane uzimaju učešća u razvoju i širenju antimikrobne rezistencije  kod patogena. 

Na  većini  procesne  opreme  u  industriji  hrane  mikrorganizmi  mogu  rasti  i  preživljavati  u  formi biofilmova.  Biofilmovi  se  definišu  kao  sesilne  zajednice  mikroorganizama  ireverzibilno  vezanih međusobno  ili  na  supstrat,  uklopljenih  u  vanćelijski  polimerni  matriks  koji  su  sami  formirali,  a pokazuju  izmenjeni fenotip u odnosu na stopu rasta  i transkripciju gena (Donlan  i Costerton, 2002). Rast  i razmnožavanje bakterija organizovanih u formaciji biofilma  je znatno usporenije, metaboličke potrebe znatno manje u odnosu na planktonične bakterije u tečnom medijumu,  i takav tzv. “prazan metabolizam” je osnova rezistencije i tolerancije na antibiotike, uz izrazitu međusobnu komunikaciju po  principu  “quorum  sensing”  što  olakšava  i  ubrzava  razmenu  genetičkog materijala.  Osim  toga, vanćelijski polimerni matriks predstavlja prepreku difuziji antibiotika, koji penetriraju veoma sporo, dajući time dovoljno vremena za ekspresiju gena antimikrobne rezistencije. Time  je stanje biofilma idealan  ekosistem  za  razmenu  determinanti  rezistencije,  za  koju  je  potvrđeno  da  se  odvija mehanizmima konjugacije i transformacije (Krol i sar., 2011; Hannan i sar., 2010). Luo i sar. (2009) su proučavali  uzročnu  vezu  između  konjugacije  i  stvaranja  biofilma  kod  Lactococcus  lactis.  Autori  su utvrdili  da  konjugacijski  sistem  odgovoran  za  transmisiju  biofilm‐formirajućih  elemenata  među populacijom  laktokoka,  ujedno  služi  i  kao  interni  signal‐pojačivač  u  promovisanju  diseminacije plazmida pAMβ1, nosioca gena antimikrobne rezistencije.  

Literaturni  podaci  ukazuju  i  na  unakrsnu  rezistenciju  na  antibiotike  i  hemijske  biocide  koji  se primenjuju  kao  dezinficijensi  u  industriji  hrane.  Nedavno  sprovedena  studija  osigurava  dokaz epidemiološke veze između rezistencije na kvarternarna amonijeva jedinjenja i povećane rezistencije na  amoksicilin  kod  kliničkih  izolata  E.  coli  (Buffet‐Battaillon  i  sar.,  2011).  Jednokratno  izlaganje određenim  biocidima  može  provocirati  selekciju  mutant  sojeva  Salmonella  Typhimurium  sa fenotipom  multiple  rezistencije  (Whitehead  i  sar.,  2011),  mada,  sasvim  sigurno,  veza  između antimikrobne rezistencije i rezistencije na biocide ne sledi jedinstven obrazac. 

3. KOMENZALI: NEPREPOZNATI, i često podcenjeni rezervoar antimikrobne rezistencije 

Nedavno  sprovedene  genomske  i  metagenomske  studije  na  izolatima  poreklom  ljudi,  životinja  i sredine vode ka otkriću velikog rezervoara novih i/ili nepoznatih gena rezistencije na antibiotike tzv. 

„intrinsic resistome“. Mehanizmi „intrinsic“  ili prirodne antimikrobne rezistencije su složene prirode, prastarog  porekla,  a  objašnjavaju  se  kao  rezultat  evolucione  adaptacije.  „Intrinsic“  antimikrobna rezistencija  je prirodni fenomen razvijen od strane antibiotik – produkujućih bakterija u cilju zaštite od  vlastitih  toksičnih  metabolita  i  time  povećanja  šanse  preživljavanja  u  visoko  kompetitivnim sredinama  (D'Costa  i  sar.,  2011). Uloga  antibiotika u ovim prirodnim  zajednicama  je, pre  svega, u međućelijskoj  komunikaciji  („cell  to  cell  signaling“)  i  uspostavljanju  homeostaze  bakterijskih zajednica. Time je produkcija antibiotika u mehanizmima koje generiše sama priroda kompenzovana postojanjem prirodno rezistentnih organizama u socijalno kohezivnoj ekološkoj populaciji (Cordero  i sar.,  2012).  Pojava  i  širenje  gena među populacijom patogena  ljudi  i  životinja  je  fenomen novijeg datuma uspostavljen mobilizacijom determinanti  rezistencije  iz prirodnog  „pool‐a“ gena uglavnom mehanizmima lateralnog transfera gena antimikrobne rezistencije. Kako je većina gena antimikrobne rezistencije  lokalizovana  u  prirodi  u  tzv.  „intrinsic  resistome“,  pojava  rezistencije  među  kliničkim izolatima predstavlja, slikovito  rečeno,  tek vrh  ledenog brega. Razumevanje ekologije antimikrobne rezistencije postavlja za osnovni cilj prepoznavanje  i potpunu  identifikaciju rezervoara determinanti rezistencije,  uz  karakterizaciju  mehanizama  prenosa  i  faktora  odgovornih  za  promovisanje  ovog scenarija. Prema tzv. “rezervoar teoriji” komenzali predstavljaju glavne rezervoare gena antimikrobne rezistencije. Tokom 90‐tih godina prošlog veka, Savez za razumnu upotrebu antibiotika (Alliance for Prudent  Use  of  Antibotics  –  APUA)  započinje  ispitivanje  komenzala  kao  mogućih  nosača  gena antimikrobne  rezistencije kroz njihov projekat “Rezervoari antimikrobne  rezistencije”  (Reservoirs of Antibiotic  Resistance‐ROAR)  (Marshall  i  sar.,  2009).  Savez  se  rukovodio  premisom  da  rezistencija “teče” od komenzala ka patogenima, i time komenzali mogu poslužiti kao barometar rezistencije kod kliničkih  izolata.  Hijerarhija  komenzala  i  veoma  tanka  granice  između  onih  koje  smatramo komenzalima i patogenima, predstavljena je na slici 1. 

Slika 1. Hijerarhija komenzala 

 

Sadašnja baza podataka ROAR projekta uključuje preko  1100  članaka, publikovanih u  više  od  260 časopisa,  podrazumevajući  profile  rezistencije  komenzala  sa  opisanih  preko  300  gena  rezistencije distribuiranih među vrstama koje predstavljaju 66 različitih rodova bakterija.  

4. STRATEGIJA KONTROLE – INTEGRISANI MONITORING 

Antimikrobna rezistencija predstavlja složen problem, i time efikasne kontrolne mere zahtevaju jasnu strategiju zasnovanu na razumevanju pojave, širenja, opstanka i cirkulacije antimikrobne rezistencije u svim ekosistemima. Rezistencija na antimikrobne agense je, pre svega, ekološki problem, i zahteva sveobuhvatni pristup po osnovnom ekološkom principu: “Sve  je  sa  svim ostalim u vezi.” U  svakom trenutku  trebamo  biti  svesni  činjenice  da  je  upotreba  antibiotika mač  sa  dve  oštrice. Na  osnovu postignutog  naučnog  konzensusa,  nameće  se  potreba  ulaganja  u  fundamentalne  studije  na  nivou ekosistema kako bi se postavio sistematski pristup pri istraživanju ekologije antimikrobne rezistencije i time  identifikovali glavni rezervoari gena rezistencije  i ključni mikrobni “igrači” unutar ekosistema, ali  i u potpunosti  razjasnili molekularni mehanizmi odgovorni  za  širenje  antimikrobne  rezistencije. Sasvim  sigurno,  neophodna  je  i  realna,  naučno  zasnovana  procena  rizika  kako  se  antimikrobna rezistencija  kroz  lanac  hrane  smatra  neospornim  biološkim  hazardom.  Detaljne  smernice  su predstavljene u Vodiču  za analizu  rizika antimikrobne  rezistencije  kroz  lanac hrane date od  strane Komisije  Codex  Alimentarius  (CAC,  2011).    Početnu  fazu  u  ovome  predstavljaju  tzv.  preliminarne aktivnosti koje  se odnose na uspostavljanje profila  rizika, a prethode  identifikaciji hazarda  i  samoj karakterizaciji  rizika.  U  ovoj  preliminarnoj  fazi  potrebne  su  sveobuhvatne  informacije  o  samom 

hazardu  (rezistentni mikroorganizam  i/ili determinante  rezistencije), antimikrobnom agensu na koji se uspostavlja  rezistencija,  i matriksu hrane u kojoj  se hazard antimikrobne  rezistencije, kao  takav, identifikuje.  Podaci  o  mikroorganizmu  koji  nose  gene  rezistencije  na  antimikrobne  agense podrazumevaju:  izvor  i  puteve  transmisije,  patogenost  pojedinih  sojeva,  karakteristike  rasta  i preživljavanje rezistentnih sojeva mikroorganizama u supstratu hrane, virulencija i njena povezanost sa rezistencijom, inaktivacija u matriksu hrane (D‐ vrednost, minimalna pH vrednost koja omogućava rast).  Podaci  o  karakteristikama  rezistencije  koji  ispoljava mikroorganizam  od  značaja  obuhvataju informacije o molekularnom mehanizmu rezistencije i  lokalizaciji determinanti, unakrsnoj rezistenciji i/ili  ko‐rezistenciji  na  druge  antimikrobne  agense,  kao  i  mogućnosti  transfera  determinanti rezistencije na druge mikroorganizme. Informacije su potrebne i o samom antimikrobnom agensu na koji se uspostavlja  rezistencija, gde  je neophodno prikupiti podatke o  formulacije agensa, njegovoj nameni, načinu  administracije  i  frekvenciji, potencijalnom ulozi unakrsne  i  ko‐rezistencije prilikom upotrebe  drugog  antimikrobnog  agensa,  trendovima  korištenja  u  agrikulturnom  i  sektoru akvakulture, kao i podaci o razvoju rezistencije kroz lanac hrane, ali i o značaju antimikrobnog agensa s obzirom na WHO listu antibiotika značajnih za humanu medicinu (WHO, 2007). Tek na  osnovu ovog kvantuma znanja pristupa se proceni rizika.  

4.1. PRIMER DANSKE – INTEGRISANI SISTEM MONITORINGA ANTIMIKROBNE REZISTENCIJE (Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Program – DANMAP) 

Danska  je prva zemlja, koja  je 1995. godine, na  inicijativu Ministarstva zdravlja  i Ministarstva hrane, poljoprivrede  i  ribarstva  Danske,  uspostavila  sistematski  i  kontinuirani  program  monitoringa potrošnje antimikrobnih preparata  i antimikrobne rezistencije kod životinja,  ljudi  i kroz  lanac hrane (Hammerum i sar., 2007). Glavne aktivnosti programa su usmerene na: 

1.  praćenje  potrošnje  antimikrobnih  preparata  kod  ljudi  i  životinja  u  uzgoju  namenjenih  za proizvodnju hrane 

2.  praćenje  pojave  antimikrobne  rezistencije  kod  bakterija  izolovanih  iz  životinja  namenjenih proizvodnji hrane, hrane životinjskog porekla i ljudi 

3. proučavanje povezanosti potrošnje antimikrobnih preparata i razvoja antimikrobne rezistencije 

4. identifikacija načina i mehanizama prenosa antimikrobne rezistencije 

Na način kako se praktično odvijaju aktivnosti programa, DANMAP sakuplja  i predstavlja podatke o potrošnji antimikrobnih preparata i pojavi rezistencije kod indikator mikroorganizama, patogena ljudi, životinja, uzročnika bolesti prenosivih hranom, ali i uzročnika zoonoza. Šematski prikaz uzorkovanja i protoka podataka u okviru DANMAP aktivnosti, predstavljen je na slici. 2. 

Slika 2. DANMAP‐ Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Program 

Izolati poreklom životinja 

Izolati se prikupljaju od zdravih životinja na klanici (Escherichia coli, enterokoke, Campylobacter spp.), ali i u dijagnostičke svrhe /Staphylococcus hyicus iz svinja, E. coli iz goveda i svinja sa kliničkom slikom dijareje).  Izolati  Salmonella  spp.  poreklom  kliničkih  i  subkliničkih  oboljenja  su  također  uključeni. Salmonella  izolati  poreklom  subklinički  inficiranih  svinja  i  živine  se  prikupljaju  na  farmi  kao  deo nacionalnog Salmonella monitoring programa. 

Izolati iz hrane životinjskog porekla 

Uzorci hrane se sakupljaju prilikom rutinske  inspekcije od strane nadležnih organa za veterinarstvo  i kontrolu  hrane  (Regional  Veterinary  and  Food  Control  Authorities)  kako  u  veleprodaji,  tako  i  u maloprodajnim objektima, u svrhu praćenja profila antimikrobne  rezistencije kod Salmonella spp.  i Campylobacter spp., ali i na zahtev DANMAP‐a, gde su ispitivanjima pokriveni i izolati enterokoka i E. coli. 

Izolati poreklom zdravih ljudi u zajednici 

Kako bi se pratio nivo rezistencije kod populacije zdravih  individua, nadzor  je započet 2002. godine, gde šema uzorkovanja podrazumeva po jedan izolat E. faecium, E. faecalis i E. coli za svaki od uzoraka fecesa, u slučaju da budu izolovani. 

Izolati poreklom pacijenata (oboljelih osoba) u zajednici, ali i bolničkim sredinama 

“Sabirni” centar, u ovom  slučaju, predstavlja Statens Serum  Institut, gde  se prikupljaju  i analiziraju izolati Salmonella i Campylobacter spp. poslati u cilju dijagnoze; izolati S. aureus iz uzoraka krvi , kao i svi izolati na meticilin‐rezistentnih S. aureus; izolati E. coli, koagulaza negativnih stafilokoka iz uzoraka krvi;  izolati  E.  coli  iz  uzoraka  urina;  izolati  Streptococcus  pyogenes  iz  kliničkog  materijala  (krv  i spinalna tečnost) – sve podatke o ovim izolatima osiguravaju laboratorije kliničke mikrobiologije, koje participiraju  u  okviru  Danske  grupe  za  nadzor  antimikrobne  rezistencije  (Danish  Study  Group  for Antimicrobial Surveillance).  

Posledice primene DANMAP programa 

Integrisani  pristup  u  monitoringu  antimikrobne  rezistencije  u  okviru  DANMAP  programa  dao  je sledeće rezultate: 

1. Zabrana upotrebe antimikrobnih preparata u svrhu promovisanja rasta; Danska je bila prva zemlja koja je 1995. godine zabranila upotrebu avoparcina kao promotora rasta na farmama svinja i brojlera; 1998. Danska zabranjuje upotrebu virginiamicina; Evropa, sledeći primer Danske, u julu 1999. godine, pored  virginiamicina,  zabranjuje  upotrebu  tilozina,  spiramicina  i  bacitracina;  Konačan  ishod  jeste zabrana  korištenja  svih  antimikrobnih  preparata  kao  promotora  rasta  na  nivou  čitave  Evropske zajednice od 1. Januara 2006. godine (European Union, 2003). 

2. Zabrana upotrebe avoparcina 1995. godine za posledicu je imala smanjenje pojave na vankomicin rezistentnih izolata E. faecium (VREF) poreklom od fecesa brojlera (slika 3). Deset godina posle, 2005. godine, svega 3% izolata E. faecium je rezistentno na vankomicin (DANMAP, 2005). Suprotno ovome, značajne promene u prevalenci VREF kod  svinja u prvoj godini po  zabrani avoparcina nisu uočene (slika  3).  Gotovo  svi  VREF  izolovani  iz  svinja  u  Danskoj  pripadaju  istom  klonu,  dok  VREF  izolati poreklom od brojlera su poliklonalni (Aarestrup, 2000). Geni koji kodiraju rezistenciju na glikopeptide /(vanA) i makrolide (ermB) kod VREF izolata svinja su lokalizovani na istom mobilnom DNK elementu, a kako  je upotreba makrolida  (tilozina) kao promotora  rasta značajno  smanjenja  tek 1998. godine, zaključak  jeste  da  je  perzistencija  VREF  među    populacijom  svinja  omogućena  nastavljenom upotrebom makrolida kako u promovisanju rasta, tako i u terapiji.  

Slika 3. Trend rezistencije na glikopeptide kod izolata E. faecium poreklom od svinja i brojlera i potrošnje avoparcina kao promotora rasta ‐ Danska za period 1994‐2005 

 

3. Uspostavljanje kontinuiranog programa monitoringa potrošnje antimikrobnih preparata – VetStat Monitoring Program 

U Danskoj,  svi antimikrobni preparati koji  se primenjuju kod  životinja,  sa  izuzetkom kokcidiostatika kod živine, su dostupni isključivo na recept. U avgustu 2002. godine Danska implementira tzv. VetStat program sa ciljem praćenja potrošnje antimikrobnih preaparata kod životinja koje su namenjene za proizvodnju hrane, uključujući serume i vakcine, ali i potrošnju kokcidiostatika, pokrivajući tri izvora – veterinari u praksi, farmacija, industrija stočne hrane. Podaci se sakupljaju na nivou farme i uključuju informacije  o  vrsti  i  starosti  životinje,  kategoriji  oboljenja,  identifikacioni  broj  farme,  broj  licence veterinara,  identifikacioni  broj  preparata,  količina  primenjenog  preparata  –  doza,  kao  i  datum primene. Svi prikupljeni podaci se konvertuju kako bi se definisale dnevne doze za životinje (“animal daily  doses”),  i  time  postoji mogućnost  poređenja  podataka  na  jednoj  farmi  sa  prosekom  za  celu zemlju.  Svake  godine,  nadležni  organi  za  veterinarstvo  i  kontrolu  hrane  uspostavljaju  granične vrednosti  za  potrošnju  antimikrobnih  preparata  kod  različitih  kategorija  svinja  (primer:  kategorija nerasta i krmača ‐ 5,2 dnevne doze/100 jedinki/dan). Ukoliko se prekorače granične vrednosti tokom perioda od 9 meseci, nadležni organi šalju upozorenje, odnosno “žuti karton” (“Yellow card”), kojima primoravaju  proizvođača‐farmera  da  u  saradnji  sa  veterinarima,  smanji  potrošnju  antimikrobnih preaparata.  Po  uspostavljanju  inicijative  žutog  kartona  (“Yellow  Card  Initiative”)  od  2010.  godine, potrošnja antimikrobnih preparata u uzgoju svinja je redukovana za 21% (DVFA, 2012).  

 

 

5. ZAKLJUČAK 

Naučna javnost je postigla konzensus o bliskoj vezi između obrazaca antimikrobne potrošnje i profila antimikrobne rezistencije kod životinja koje su namenjene za proizvodnju hrane, ali  i nivoa  i profila rezistencije  kroz  lanac  hrane  i  antimikrobne  rezistencije  uzročnika  bolesti  prenosivih  hranom  kod ljudi. Time postoji više nego opravdana potreba da  se na nacionalnom nivou uspostavi  integrisani pristup u monitoringu antimikrobne rezistencije.  

LITERATURA 

Courvalin,  P.  2005.  Antimicrobial  drug  resistance:  Prediction  is  very  difficult,  especially  about  the future. Emerg. Infect. Dis. 11(10) 

Cloete, T.E. 2003. Resistance mechanisms of bacteria  to  antimicrobial ncompounds.  Intl. Biodeter. Biodegrad. 51:277‐282 

Riesenfeld, C.S., Goodman, R.M., and Handelsman, J. 2004. Uncultured soil bacteria are the reservoir of new antibiotic resistance genes. Environ.Microbiol. 6: 981‐989 

Sundin, G.W. 2002. Distinct recent  lineages of the strA‐strB streptomycin‐resistance genes  in clinical and environmental bacteria. Curr. Microbiol. 45:63‐69 

EFSA: 2007. Opinion of  the Scientific Committee on a  request  from EFSA on  the  introduction of a Qualified  Presumption  of  Safety  (QPS)  approach  for  the  assessment  of  selected microorganisms referred to EFSA. The EFSA Journal 187 (2007) 1‐16 

Walsh,  C.;  Duffy,  G.;  Nally,  P.;  O’Mahony,  R.;  McDowell,  D.A.;  Fanning,  S.  Transfer  of  ampicillin resistance from Salmonella Typhimurium DT104 to Escherichia coli K12 in food. Lett. Appl. Microbiol. 2008, 46, 210–215. 

Toomey, N.; Monaghan, A.; Fanning, S.; Bolton, D.J. Assessment of antimicrobial resistance transfer between  lactic acid bacteria and potential foodborne pathogens using  in vitro methods and mating in a food matrix. Foodborne Pathog. Dis. 2009, 6, 925–933.  

Kharazmi, M.; Hammes, W.P.; Hertel, C. Construction of a marker rescue system in Bacillus subtilis for detection of horizontal gene transfer in food. Syst. Appl. Microbiol. 2002, 25, 471–477. 

Jeon, B.; Muraoka, W.; Sahin, O.; Zhang, Q. Role of Cj1211 in natural transformation and transfer of antibiotic resistance determinants in Campylobacer jejuni. Antimicrob. Agents Chemother. 2008, 52, 2699–2708  

Bulajić,  S,  Mijačević,  Z.  2011.  Antimicrobial  susceptibility  of  alactic  acid  bacteria  isolated  from Somborski cheese. Acta Veterinaria (Beograd), Vol. 61, No. 2‐3, 247‐258 

Bulajić S. 2007. Mogućnost primene enterokoka u proizvodnji sireva i njihov potencijal u prenošenju gena  rezistencije na  antibiotike. Doktorska disertacija.  Fakultet  veterinarske medicine Univerzite  u Beogradu 

Teuber, M. And Perreten, V. 2000. Role of Milk and Meat Products as Vehicles for Antibiotic‐resistant Bacteria. Acta vet. Scand. Suppl.93, 75‐87 

Teuber M, Perreten V, and Wirsching F. 1996. Antibiotikumresistente Bakterien: eine neue Dimension in der Lebensmittel‐mikrobiologie. Lebensmittel‐Techologie 29: 182‐199 

Sievers M, Teuber M, Wirsching F, Perreten V, Eisenring R, Fahndrich P, Schlaepfer S, Krusch U, Simm Ch  and  Lohmer  A.  1993.  Antibiotic  resistance  properties  of  enterococci  and  staphylococci  fro fermented food. FoodMicro 93, Book of Abstracts, pp. 191 

Bulajić  S, Mijačević Z. 2012. Antibiotic  resistance of  lactic acid bacteria and  staphylococci  isolated from  autochthonous  Serbian  cheese.  Biological  Food  Safety  and  Quality  –  Proceedings  of  the International Conference, October 4‐5, 2012, pp. 113‐115, Belgrade, Serbia 

Rajkovic,  A.;  Smigic,  N.;  Devlieghere,  F.  Contemporary  strategies  in  combating  microbial contamination in food chain. Int. J. Food Microbiol. 2010, 141, S29–S42. 

Wesche, A.M.; Gurtler, J.B.; Marks, B.P.; Ryser, E.T. Stress, sublethal injury, resuscitation, and virulence of bacterial foodborne pathogens. J. Food Protect. 2009, 72, 1121–1138. 

McMahon, M.A.S.; Xu, J.; Moore, J.E.; Blair, I.S.; McDowell, D.A. Environmental stress and antibiotic resistance in food‐related pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 2007a, 73, 211–217. 

McMahon, M.A.S.;  Blair,  I.S.; Moore,  J.E.; McDowell,  D.A.  The  rate  of  horizontal  transmission  of antibiotic resistance plasmids  is  increased  in food preservation‐stressed bacteria. J. Appl. Microbiol. 2007b, 103, 1883–1888. 

Ganjian, H.; Nikokar, I.; Tieshayar, A.; Mostafaei, A.; Amirmozafari, N.; Kiani, S. Effects of salt stress on the  antimicrobial  drug  resistance  and  protein  profile  of  Staphylococcus  aureus.  Jundishapur.  J. Microbiol. 2012, 5, 328–331. 

Donlan, R.M.;  Costerton,  J.W. Biofilms:  Survival mechanisms  of  clinically  relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15, 167–193. 

Król,  J.E.; Nguyen, H.D.;  Rogers,  L.M.;  Beyenal, H.;  Krone,  S.M.;  Top,  E.M.  Increased  transfer  of  a multidrug  resistance plasmid  in Escherichia  coli biofilms  at  the air‐liquid  interface.   Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, 5079–5088. 

Hannan, S.; Ready, D.; Jasni, A.S.; Rogers, M.; Pratten, J.; Roberts, A.P. Transfer of antibiotic resistance by transformation with eDNA within oral biofilms. FEMS Immunol. Med. Mic. 2010, 59, 345–349. 

Luo, H.L.; Wan, K.; Wang, H.H. High‐frequency conjugation system  facilitates biofilm  formation and pAM beta 1 transmission by Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microb. 2005, 71, 2970–2978.  

Buffet‐Bataillon,  S.;  Branger,  B.;  Cormier, M.;  Bonnaure‐Mallet, M.;  Jolivet‐Gougeon,  A.  Effect  of higher minimum  inhibitory concentrations of quaternary ammonium compounds  in clinical   E. coli isolates on antibiotic susceptibilities. J. Hosp. Infect. 2011, 79, 141–146. 

Whitehead, R.N.; Overton, T.W.; Kemp, C.L.; Webber, M.A. Exposure of Salmonella enterica serovar Typhimurium to high  level biocide challenge can select multidrug resistant mutants  in a single step. PLoS One 2011, 6, e22833:1–e22833:9. 

Marshall, BM., Ochieng, DJ and Levy, SB, 2009. Commensals: Unerapreciated Reservoir of Antibiotic Resistance, Microbe, Vol 4, Number 5, pp.231‐238 

Cordero,  O.  X.,Wildschutte,  H.,  Kirkup,B.,  Proehl,  S.,  Ngo,  L.,  Hussain,  F.,et  al.  (2012).  Ecological populations of bacteria act as socially cohesive units of antibiotic production and resistance. Science 337, 1228–1231.doi: 10.1126/science.1219385 

D’Costa, V. M.,  King, C.  E.,  Kalan,  L.,Morar, M.,  Sung, W. W.,  Schwarz, C.,  et  al.  (2011). Antibiotic resistance is ancient. Nature 477, 457–461. doi:10.1038/nature10388 

Codex Alimentarius Commission (CAC) 2011. Guidelines for risk analysis of foodborne antimicrobial resistance. CAC, Rome 

World  Health  Organization,  2007.  Critically  Important  Antimicrobial  for  Humane  Medicine: Categorization  for  the  Development  of  Risk  Management  Strategies  to  contain  Antimicrobial Resistance  due  to  Non‐Human  Antimicrobial  Use.  Report  of  the  Second  WHO  Expert  Meeting Copenhagen, 29‐31 May 2007 

Anette M.  Hammerum,  Ole  E.  Heuer,Hanne‐Dorthe  Emborg,  Line  Bagger‐Skjøt,Vibeke  F.  Jensen, Anne‐Marie Rogues, Robert L. Skov, Yvonne Agersø, Christian T. Brandt, Anne Mette Seyfarth,Arno Muller,  Karin  Hovgaard,  Justin  Ajufo,  Flemming  Bager,Frank  M.  Aarestrup,  Niels  Frimodt‐Møller, Henrik  C. Wegener,  and  Dominique  L. Monnet.  2007.  Danish  Integrated  Antimicrobial  Resistance Monitoring and Research Program, Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 13, No.11, November 2007 

European Union. EC regulation no. 1831/2003. On additives for use in animal nutrition. Official Journal of the European Union; 2003. 

Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Program. DANMAP‐2005—consumption of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, food and humans in Denmark. 2005 [cited 2006 Dec 1]. Available from http://www.danmap.org/pdffi les/danmap_2005.pdf 

DVFA  (Danish  Veterinary  and  Food  Administration).  2012.  Danish  Veterinary  and  Food  Admin‐istration.  The  Yellow  Card  Initiative.  http://www.foedevarestyrelsen.dk/english/Animal/ AnimalHealth/Pages/The‐Yellow‐Card‐Initiative‐on‐Antibiotics.aspx (accessed April 2012). 

Aarestrup  FM.  2000.Characteriyation  of  glycopeptide‐resistant  Enterococcus  faecium  (GRE)  from broilers and pigs in Denmark:genetic evidence that persistance of GRE in pig herds is associated with coselection by resistance to macrolides. J Clin Microbiol 2000:38:2774‐7